CN111920959A - 基于点击反应的ros响应型肝素类多糖纳米前药复合物、纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

基于点击反应的ros响应型肝素类多糖纳米前药复合物、纳米制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物、纳米制剂及其制备方法和应用，所述纳米前药复合物以亲水性肝素类多糖为基体，经功能化后通过点击反应按比例共价偶联两种疏水性抗肿瘤药物、共价结合靶向配体。与现有技术相比，本发明具有以下优点：所述方法避免过量前药原料的加入，不同药物原料比例可控，合成转化率高；所述前药复合物及纳米制剂具有肿瘤特异性、靶向性、释药迅速高效；所述前药复合物实现肿瘤治疗药物的多级联用策略，发挥不同治疗方式的协同治疗作用；所述前药复合物及纳米制剂具有活性强、水溶性好和稳定性高的优势；所述前药复合物及纳米制剂降低了肝素类多糖诱发的出血风险。

Description

基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物、纳米 制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种新型纳米前药复合物及纳米制剂，具体为基于点击 反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物、纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是目前人类的主要杀手之一，随着发病率、死亡率的逐年增加，急需寻求一种 安全、有效的治疗方式。目前，肿瘤治疗的手段有手术切除、放射治疗和化学治疗。然而， 手术治疗存在局限性和创伤性；放射治疗的副作用更会给患者带来极大的痛苦；化学治疗是 目前癌症治疗最常用的治疗手段，但是其普遍存在选择性差、药物溶解性不佳、肿瘤易产生 耐受等问题。因此会伴有严重的毒副作用以及单一药物治疗耐药现象，想单靠一种化疗药物 治愈肿瘤又兼顾患者的生存质量是难以实现的。不同化疗药物联合或者与光动力、光热治疗 手段联合应用到肿瘤治疗中，扬长避短，实现肿瘤治疗疗效最大化具有重要的意义。多种不 同机制药物联合治疗已经在临床广泛应用，而现有联合治疗给药方式往往需要患者同时摄入 不同药物，由于各药物生物分布与代谢位置存在差异，难以保证按给药比至肿瘤组织共同发 挥抗肿瘤作用，如何让不同药物依比例联合递送与释放在肿瘤治疗中具有重要的意义。
由于纳米前药可以增溶药物、提高药物稳定性、延长药物体内循环时间、增强病灶部位 药物富集、降低毒副作用等，受到了广泛的青睐，因此研究者们研发了越来越多的纳米前药 用于临床研究，并取得了阶段性的胜利。然而酯化、酰胺化等传统的前药合成方法往往需要 加入几倍过量的反应原料，存在合成转化率低、重现性差、反应原料浪费等导致成本增加问 题，而成本问题在昂贵的抗肿瘤药物中更显突出。而且由于不同药物的结构不同，导致位阻 和反应基团的活性等存在差异，因此加入过量不同药物共同反应时难以按理想的按投料比反 应，这使产物中不同药物的比例难以控制。并且传统前药的药物释放过程无肿瘤特异性、释 药过程缓慢，而肿瘤部位精准、快速的药物释放是纳米药物发挥显著抗肿瘤疗效和降低全身 毒副作用的关键。
肝素类多糖是一类亲水性糖胺聚糖大分子，具有良好的生物相容性和生物可降解性，它 能够结合并阻断微环境中的VEGF等促血管生成因子与血管内皮细胞上相应受体结合，抑制 内皮细胞向肿瘤趋化和血管生成。然而肝素类多糖含有许多连续的阴离子基团，易于结合抗 凝血酶激活抗凝血功能，因此肝素类多糖使用时存在出血风险，对羧基进行化学修饰可以降 低肝素类多糖的出血风险。肝素类多糖结构上有丰富的羧基和羟基，且二者易于进行化学修 饰，因此为通过共价接枝制备纳米粒和载药体系提供了良好的条件，但是肝素类多糖结构位 阻较大，通过传统合成方法反应效率低，而主反应效率低会导致多官能团的肝素类多糖中未 反应的官能团在催化剂作用下与他基团发生副反应。由于多肽类也是多官能团化合物，当肝 素类多糖与多肽通过传统合成方法偶联时难以在设计位点反应，并且多肽官自身能团之间或 多肽与肝素类多糖官能团之间的副反应会导致多肽结构改变，从而导致多肽失去治疗或靶向 活性。
点击化学(click chemisty)是有机化学中一类反应条件温和、高效的反应总称，具有反应 条件简单、反应专一性强、产率高、副产物无害、模块化反应的优点。由于点击反应具有很 强的特异性、对多种官能团耐受，将肝素类多糖进行衍生化得到点击模块，既可以实现肝素 类多糖与药物模块化反应，又可以避免肝素类多糖中多种官能团引起副反应。点击反应的反 应效率接近百分之百，无需加入过量原料药物即可高效反应，既可以降低成本，又可以实现 不同药物模块按比例与肝素类多糖模块拼接，形成肝素类多糖抗肿瘤纳米前药复合物。另外， 点击反应条件温和，可以避免采用高温、高压、酸、碱剧烈的反应条件对前药的敏感键结构 破坏。
发明内容
解决的技术问题：
本发明解决的技术问题之一：本发明提供了基于点击反应的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)响应型肝素类多糖纳米前药复合物的制备方法，以解决目前纳米前药合成转 化效率低、原料浪费及不同药物无法控制合成比例的技术问题。
本发明解决的技术问题之二：本发明提供一种能够在肿瘤组织高ROS条件下特异性释放 治疗药物、且释放效率高的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物及含有该 复合物的纳米制剂，以解决目前纳米前药或纳米制剂释药非肿瘤特异性及释药过程缓慢的问 题。
本发明解决的技术问题之三：本发明提供一种具有靶向活性的基于点击反应的ROS响应 型肝素类多糖纳米前药复合物及含有该复合物的纳米制剂，以解决现有纳米前药或纳米制剂 反应专一性弱，副反应多的问题。
本发明解决的技术问题之四：本发明提供了一种降低肝素类多糖诱发出血的方案，以解 决现有肝素类多糖高比例羧基的存在等导致的出血风险。
本发明解决的技术问题之五：本发明提供了含有纳米前药复合物的纳米制剂的制备方法， 以解决现有纳米制剂包封率低，且无法包载不同机制抗肿瘤药物的技术问题。
为了解决以上技术问题，本发明的设计思路为：本发明首先将肝素类多糖进行点击反应 官能团修饰形成肝素类多糖模块，再通过草酸酯结构将药物与另外的点击反应官能团偶联形 成具有ROS响应型的前药模块，然后利用点击反应将不同的ROS响应型前药模块与肝素类 多糖模块依比例共价得到新型ROS响应型肝素类多糖纳米前药。其疏水核心中高比例的输水 前药可以进一步通过疏水相互作用等作用力高效包载疏水药物，构建成新型ROS响应型纳米 前药复合物，而复合物中草酸酯结构在肿瘤ROS刺激下高效分解并释放游离药物。其能够大 大减少临床注射次数及剂量，减轻临床多次给药给患者造成的痛苦，提高患者依从性。制备 产率高，重现性好，显著增加疏水肿瘤治疗药物溶解性。
技术方案：基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物，所述纳米前药复合 物以亲水性肝素类多糖为基体，经功能化后通过点击反应共价偶联疏水性抗肿瘤药物、共价 结合靶向配体；其中，肝素类多糖、疏水性抗肿瘤药物及靶向配体的摩尔比为1:0.1-0.9:0.9-0.1， 且疏水性抗肿瘤药物为摩尔比为1:0-20的疏水性药物a和疏水性药物b。
优选的，所述肝素类多糖包括未分级肝素、低分子量肝素及脱硫酸化肝素；所述疏水性 抗肿瘤药物a或b包括肿瘤糖代谢抑制药物、MAPK通路抑制药物、肿瘤脂质代谢干扰药物、 抗血管生成药物、破坏DNA结构和功能药物、影响核酸生成药物、作用于核酸转录药物、作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂、作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物和 羧酸类小分子抗肿瘤药物；其中，肿瘤糖代谢抑制药物包括氯尼达明、双氯芬酸、3-溴丙酮酸、紫草素、脱氢表雄酮；MAPK通路抑制药物包括维罗非尼、司美替尼、安卓奎诺尔、东 莨菪内酯；肿瘤脂质代谢干扰药物包括阿司匹林、吲哚美辛、萘普生、布洛芬和美洛昔康； 抗血管生成药物包括瑞戈非尼、阿帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼；破坏DNA结构和功能药 物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、顺铂和卡铂；影响核酸生成药物包括5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤 和6-巯嘌呤；作用于核酸转录药物包括阿霉素、表阿霉素和吡柔比星；作用于DNA复制的 拓扑异构酶Ⅰ抑制剂包括羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康；作用于有丝分裂M期干扰微管 蛋白合成的药物包括长春新碱、紫杉醇和多西紫杉醇；羧酸类小分子抗肿瘤药物包括藤黄酸、 新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤及苯丁酸氮芥；所述靶向配体包括Plectin-1靶向 肽、RGD多肽、F3肽和叶酸。
以上任一所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的制备方法，所 述方法首先以亲水性肝素类多糖为基体，通过酰胺化反应或酯化反应得到功能化肝素类多糖， 同时，将疏水性羟基类或羧基类小分子抗肿瘤药物经酯化反应与炔基或巯基基团连接；然后 经点击反应与功能化肝素类多糖偶联，最后通过点击反应与靶向配体共价结合，即可制得纳 米前药复合物。
优选的，所述方法的具体步骤如下：
S1、将亲水性肝素类多糖溶于有机溶剂A中，在0℃条件下采用羧基活化剂进行活化 0.5-2h，再加入含叠氮基的连接臂反应12-72h，反应结束后加入有机溶剂B沉淀产物，所得 沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透析或置于超滤管中超滤，干燥后得叠氮化修饰的 肝素类多糖；其中透析1-3d，超滤0.5-5h；
S2、取S1中叠氮化修饰的肝素类多糖溶于有机溶剂A中，在0℃条件下采用羧基活化剂 进行活化0.5-2h，再加入含马来酰亚胺基团的连接臂反应12-72h，反应结束后加入有机溶剂 B沉淀产物，所得沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透析或置于超滤管中超滤，干燥 后得叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖；其中透析1-3d，超滤0.5-5h；
S3、将含羧基的疏水性药物溶于有机溶剂C，冷却至0℃，加入氯化亚砜，反应完全后 经减压蒸馏，再溶于有机溶剂C，冷却至0℃，加入对羟基苯甲醇，反应完全后经柱层析分离纯化得到经羟基修饰的疏水性药物；
S4、将草酰氯溶于有机溶剂C，冷却至0℃，加入含炔基的连接臂，反应完全后经减压 蒸馏纯化得到中间体I；
S5、将中间体I分别溶于两份有机溶剂C，冷却至0℃，分别加入含羟基或经羟基修饰的 疏水性药物，反应完全后分别经柱层析分离纯化得到中间体IIa或IIb；
S6、将叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖溶于溶剂中，加入末端含巯基的靶向配 体、惰性气体保护下反应12-72h，反应结束后向体系中加入冷的有机溶剂B沉淀产物，所得 沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透析或置于超滤管中超滤，干燥后得具有靶向性的 叠氮化修饰的肝素类多糖；其中透析1-3d，超滤0.5-5h；
S7、将具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖溶于溶剂中，加入摩尔比为1:0-20的中间 体IIa和IIb、惰性气体保护下，加入碘化亚铜或五水硫酸铜及还原剂反应12-72h；反应结束 后向体系中加入冷的有机溶剂B沉淀产物，所得沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透 析或置于超滤管中超滤，干燥后得基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物； 其中透析1-3d，超滤0.5-5h。
以上方法合成路线的通式如下：
其中，叠氮化修饰的肝素类多糖合成路线的通式如下：
Figure BDA0002600193290000051
R1-COOH为肝素类多糖，R2-XH为含叠氮基团的连接臂，其中X为O或NH；
叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖合成路线的通式如下：
Figure BDA0002600193290000052
R3-COOH为叠氮化修饰的肝素类多糖，R4-XH为含马来酰亚胺基团的连接臂，其中X为O或NH；
经羟基修饰的疏水性药物合成路线的通式如下：
Figure BDA0002600193290000053
R5-COOH为含羧基的疏水性药物；
中间体I合成路线的通式如下：
Figure BDA0002600193290000054
R6-OH为含炔基的连接臂；
中间体II合成路线的通式如下：
Figure BDA0002600193290000055
R7-OH为含羟基或经羟基修饰的疏水性药物；
具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖合成路线的通式如下：
Figure BDA0002600193290000056
Figure BDA0002600193290000057
为叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖，R9-SH为末端含巯基的靶向配体； 基于点击反应的ROS响应型前药复合物合成路线的通式如下：
Figure BDA0002600193290000058
R10-N3为具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖，
Figure BDA0002600193290000061
为中间体II；
优选的，叠氮化修饰的肝素类多糖制备体系中肝素类多糖、羧基活化剂及含叠氮基团的 连接臂的摩尔比为1:2-20:1-8；叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖制备体系中肝素类多 糖、羧基活化剂及含马来酰亚胺基团的连接臂的摩尔比为1:2-20:1-8；中间体I制备中含炔基 的连接臂与草酰氯的摩尔比为1:1-8；中间体IIa或IIb制备中含羟基或经羟基修饰的疏水性药 物a或b与中间体I的摩尔比均为1:1-8；具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖制备体系中 叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖与末端含巯基的靶向配体摩尔比为1:0.1-0.9；基于 点击反应的ROS响应型前药复合物制备体系中具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖与中 间体II摩尔比为1:0.1-0.9。
优选的，有机溶剂A为甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、1-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰 胺中的至少一种；有机溶剂B为丙酮、乙醚或甲醇；有机溶剂C为二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、四氢呋喃或乙酸乙酯；羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟 基琥珀酰亚胺的混合物，或N,N’-羰基二咪唑，或N,N'-二环己基碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶 的混合物，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和4-二甲氨基 吡啶的混合物，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N,N-二异 丙基乙胺的混合物；沉淀处理方法为减压抽滤法或离心法；干燥方法为真空干燥、喷雾干燥 或冷冻干燥。
优选的，S1中含叠氮基的连接臂包括2-叠氮基乙胺、3-叠氮基丙胺、2-叠氮基乙醇、3- 叠氮基丙醇、3-叠氮基-2-甲基-1-丙醇、N-(2-氨基乙基)-2-叠氮基乙酰胺、2-叠氮基-N-(2- 羟乙基)乙酰胺、N-(3-氨基丙基)-2-叠氮基乙酰胺、2-叠氮基-N-(3-羟丙基)乙酰胺；含 叠氮基的连接臂与肝素类多糖的摩尔比为1-8:1；S2中含马来酰亚胺基团的连接臂包括N-(2- 氨基乙基)马来酰亚胺、N-(2-羟乙基)马来酰亚胺、N-(3-氨基丙基)马来酰亚胺、N-羟甲基马来 酰亚胺、N,N′-双(3-马来酰亚胺丙酰基)-2-羟基-1,3-丙二胺、N-(2-哌嗪基乙基)马来酰亚胺、 1,4-二马来酰亚胺-2,3-丁二醇、N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺；含马来酰亚胺基团的连接臂与 叠氮化修饰的肝素类多糖的摩尔比为1-8:1；S3中所述的含羧基的疏水性药物包括氯尼达明、 双氯芬酸、3-溴丙酮酸、藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤、苯丁酸氮芥、 阿司匹林、吲哚美辛、萘普生、布洛芬；S4中所述的含炔基的连接臂包括炔丙胺、炔丙醇、 5-己炔-1-胺、4-戊炔-1-胺、3-丁炔-1-胺、3-丁炔-1-醇、4-戊炔-1-醇、5-己炔-1-醇、6-庚炔醇、 7-辛炔醇；S5中含羟基或经羟基修饰的疏水性药物包括司美替尼、安卓奎诺尔、东莨菪内酯、 脱氢表雄酮、美洛昔康、长春新碱、紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、吡柔比星以 及对羟基苯甲醇修饰的氯尼达明、双氯芬酸、3-溴丙酮酸、藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯 达莫斯汀、甲氨喋呤、苯丁酸氮芥、阿司匹林、吲哚美辛、萘普生、布洛芬；S6中末端含巯 基的靶向配体包括末端修饰半胱氨酸的Plectin-1靶向肽、RGD多肽、F3肽和叶酸。
含有以上任一所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的纳米制 剂。
以上所述的纳米制剂的制备方法，所述方法具体为两种：
方法一：将基于点击反应的ROS响应型前药复合物与水按重量比(mg/mg)3-50:1000的比 例混合制成溶液；将一定比例的疏水性光敏剂用适量有机溶剂溶解；将光敏剂溶液缓慢滴加 到基于点击反应的ROS响应型前药复合物溶液中，搅拌1-3h后，冰浴条件下探头超声10-40 min，即得物理载药基于点击反应的ROS响应型纳米制剂。
方法二：将基于点击反应的ROS响应型前药复合物与水按重量比(mg/mg)3-50:1000的比 例混合制成溶液；将一定比例的疏水性光敏剂用适量有机溶剂溶解；将光敏剂溶液加入基于 点击反应的ROS响应型前药复合物溶液中，冰浴条件下探头超声10-40min，室温条件下敞口 搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，采用离心法除去未反应小分子，采用真空干燥或 冷冻干燥除去水分，即得物理载药基于点击反应的ROS响应型纳米制剂。
优选的，所述光敏剂与纳米前药的质量比为1:2-10；其中方法一中有机溶剂选自二甲基 亚砜、N-甲基吡咯烷酮；工艺I中所述的适量有机溶剂是指有机溶剂与水的体积比为1:2-10； 工艺II中所述的有机溶剂选自二氯甲烷和无水乙醚；工艺II中所述的适量有机溶剂是指其与 水的体积比为1:2-10。
所述光敏剂包括酞菁、酞菁锌、酞菁铅、酞菁硅、酞菁钯、酞菁镍、酞菁铜、二氢卟吩e6、血卟啉单甲醚、苯并卟啉衍生物单酸环A、四间-羟基苯基二氢卟酚、初红紫素、竹红菌素、得克萨卟啉和金丝桃素。
以上所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物或所述的纳米制剂 在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的基于点击反应的ROS响应型前药复合物本身具有抗肿瘤 活性，并可物理包载疏水性光敏剂，与光动力或光热治疗联合治疗肿瘤。
有益效果：(1)本发明所述纳米前药复合物的制备方法通过点击反应将肝素类多糖和抗 肿瘤药物共价偶联，反应效率接近100％，避免过量前药原料的加入，能够按投药比例合成所 需前药，因而原料之间偶联效率高、无副反应，产率可观。
(2)本发明所述前药复合物实现肿瘤治疗药物的多级联用策略，且能够减少给药次数， 并根据临床治疗需要彼此组合、灵活选用共价结合或包载不同机制的肿瘤治疗药物；另外， 所述纳米制剂实现抗肿瘤代谢与光动力治疗联合，或与细胞毒药物、抗血管生成药物管、脂 质代谢干扰药物、疏水性蛋白药物联用，通过前药复合物将不同治疗方式整合发挥协同肿瘤 治疗作用。
(3)本发明所述前药复合物具有智能响应性。将前药与点击反应官能团通过草酸酯结构 偶联，在肿瘤微环境高水平ROS刺激下，复合物中草酸酯键分解得到游离药物，草酸酯分解 过程不可逆使反应效率更加迅速、高效。
(4)本发明所述前药复合物具有良好的肿瘤靶向活性。传统的靶向性多肽与肝素类多糖 共价偶联时，二者间多官能团存在交叉反应破坏多肽结构导致多肽活性降低甚至失活。而本 发明在多肽末端增加一分子半胱氨酸，后者的巯基可与马来酰亚胺衍生化的肝素类多糖通过 点击反应偶联，反应专一性强不与多肽或肝素类多糖中羧基、氨基或羟基发交联，且条件温 和不会导致多肽结构降解，从而避免对多肽结构破坏，实现多肽高效的靶向活性。
(5)本发明所述经羟基修饰的疏水性药物为在羧基末端药物中引入的对羟基苯甲醇结构， 可在草酸酯结构分解酚羟基暴露时发生醌甲基化重排，实现苯甲醇结构与药物中羧基断开释 放羧基末端药物。
(6)本发明所述前药复合物有效改善了天然活性疏水药物、化疗药物及光敏剂的水溶性 和稳定性。本发明将疏水性药物偶联于肝素类多糖，并可以通过物理方法包载化疗药物及光 敏剂，不仅可以提高天然活性疏水药物、化疗药物及光敏剂的水溶性，而且由于天然活性疏 水药物、化疗药物及光敏剂之间存在疏水相互作用、氢键相互作用和π-π相互作用，产生聚集 倾向，提高了化疗药物和光敏剂的荷载量和稳定性，使其在递送过程中不易泄露，实现血液 循环中较高的稳定性。
(7)本发明所述前药复合物降低了肝素类多糖诱发的出血风险。本发明中肝素类多糖中 羧基大部分被疏水小分子占据，降低负电荷并减少连续的阴离子基团，可有效降低肝素类多 糖的抗凝作用，提高静脉给药的安全性。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明 精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：基于点击反应的ROS响应型未分级肝素-氯尼达明-安卓奎诺尔前药复合物的制备
称取2mmol未分级肝素溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺，60℃溶解，氮气保护、冰浴条件 下加入N,N’-羰基二咪唑，活化未分级肝素羧基。冰浴活化1h后,加入溶解于N,N-二甲基甲 酰胺的2-叠氮基乙胺溶液5mL(未分级肝素:N,N’-羰基二咪唑:2-叠氮基乙胺的摩尔比依次 为1∶8∶5)，缓慢滴加到未分级肝素溶液中，反应48h后，加入5倍体积的冰乙醚沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中透析，真空干燥，即得叠氮化修饰的未分级肝素。称取适量叠氮化修饰的未分级肝素粉末溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护、冰浴条件下加入N,N’-羰基二咪唑，活化未分级肝素的羧基。冰浴活化0.5h后,加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺的N-(2-羟乙基)马来酰亚胺溶液5mL (叠氮化修饰的未分级肝素：N,N’-羰基二咪唑：N-(2-羟乙基)马来酰亚胺的摩尔比依次为1∶ 8∶2)，缓慢滴加到叠氮化修饰的未分级肝素溶液中，反应48h后，加入10倍体积的冰丙酮 沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声60min，超滤， 喷雾干燥，即得叠氮化、马来酰亚胺化修饰的未分级肝素。
将1mmol氯尼达明溶于10mL三氯甲烷，冷却至0℃，加入2mmol氯化亚砜，反应完全后经减压蒸馏，再溶于10mL三氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol对羟基苯甲醇，反应完全 后经柱层析分离纯化得到经羟基修饰的氯尼达明；
将2mmol草酰氯溶于10mL三氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol 3-丁炔-1-醇，室温反应 4h，经减压蒸馏纯化得到中间体I。
称取1mmol中间体I溶于10mL三氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol经羟基修饰的氯尼达明，室温反应4h，经柱层析分离纯化得到中间体IIa。
称取1mmol中间体I溶于10mL三氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol含羟基的安卓奎诺尔，室温反应4h，经柱层析分离纯化得到另一中间体IIb。
称取1mmol叠氮化、马来酰亚胺化修饰的未分级肝素溶于N,N-二甲基甲酰胺，称取0.2mmol末端修饰半胱氨酸的RGD多肽加入至体系，在氮气保护下反应12h。加入5倍体积 的冰乙醚沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中透析，真空干燥，即得具有靶向性的叠氮化修饰的未分级肝素。
称取1mmol具有靶向性的叠氮化修饰的未分级肝素溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，称 中间体IIa和IIb加入至体系(具有靶向性的叠氮化修饰的未分级肝素：中间体IIa：中间体 IIb的摩尔比依次为8∶3∶1)，在氮气保护下，加入0.1mmol碘化亚铜，加完后反应12h。加 入10倍体积的冰丙酮沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下 探头超声60min，超滤，喷雾干燥，即得基于点击反应的ROS响应型未分级肝素-氯尼达明- 安卓奎诺尔前药复合物。
实施例2：基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素-阿司匹林-藤黄酸前药复合物的制备
称取2mmol低分子量肝素溶于10mL甲酰胺，60℃油浴溶解，氮气保护、0℃条件下加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，活化低分子量肝素羧基。 0℃活化0.5h后,加入溶解于甲酰胺的2-叠氮基乙醇溶液5mL(低分子量肝素:1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐:N-羟基琥珀酰亚胺:2-叠氮基乙醇的摩尔比依次为1∶4∶4∶2)， 缓慢滴加到低分子量肝素溶液中，反应24h后，加入5倍体积的冰甲醇沉淀，抽滤得沉淀， 用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，超滤，冷冻干燥，即得叠 氮化修饰的低分子量肝素。
称取适量叠氮化修饰的低分子量肝素粉末溶于10mL甲酰胺中，氮气保护、0℃条件下加 入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，活化低分子量肝素羧基。 0℃活化0.5h后,加入溶解于甲酰胺的N-(3-氨基丙基)马来酰亚胺溶液5mL(叠氮化修饰的 低分子量肝素:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐:N-羟基琥珀酰亚胺:N-(3-氨基丙基) 马来酰亚胺的摩尔比依次为1∶4∶4∶1)，缓慢滴加到叠氮化修饰的低分子量肝素溶液中， 反应24h后，加入5倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心 10min，冰浴下探头超声40min，超滤，真空干燥，即得叠氮化、马来酰亚胺化修饰的低分子 量肝素。
将1mmol阿司匹林溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入2mmol氯化亚砜，反应完全后经减压蒸馏，再溶于10mL三氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol对羟基苯甲醇，反应完全 后经柱层析分离纯化得到经羟基修饰的阿司匹林；
将1mmol藤黄酸溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入2mmol氯化亚砜，反应完全后经减压蒸馏，再溶于10mL三氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol对羟基苯甲醇，反应完全后 经柱层析分离纯化得到经羟基修饰的藤黄酸；
将2mmol草酰氯溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol炔丙醇，室温反应2h，经减压蒸馏纯化得到中间体I。
称取1mmol中间体I溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol经羟基修饰的阿司匹林，室温反应3h，经柱层析分离纯化得到中间体IIa。
称取1mmol中间体I溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol经羟基修饰的藤黄酸，室温反应4h，经柱层析分离纯化得到另一中间体IIb。
称取1mmol叠氮化、马来酰亚胺化修饰的低分子量肝素溶于甲酰胺，称取0.2mmol末端 修饰半胱氨酸的F3肽加入至体系，在氮气保护下反应24h。加入5倍体积的冰丙酮沉淀，离 心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心5min，冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中透 析，真空干燥，即得具有靶向性的叠氮化修饰的低分子量肝素。
称取1mmol具有靶向性的叠氮化修饰的低分子量肝素溶于10mL甲酰胺中，称中间体IIa 和IIb加入至体系(具有靶向性的叠氮化修饰的低分子量肝素：中间体IIa：中间体IIb的摩 尔比依次为8∶5∶1)，在氮气保护下，加入五水硫酸铜和抗坏血酸，五水硫酸铜与中间体II 的摩尔比为1:8，抗坏血酸与中间体II的摩尔比为1:4，加完后反应12h。加入10倍体积的冰 丙酮沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声60min， 超滤，喷雾干燥，即得基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素-阿司匹林-藤黄酸前药复合 物。
实施例3：基于点击反应的ROS响应型脱硫酸化肝素-脱氢表雄酮-司美替尼前药复合物的制 备
称取2mmol脱硫化肝素溶于10mLN,N-二甲基乙酰胺中，60℃油浴溶解，氮气保护、冰 浴条件下加入N,N'-二环己基碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶，活化脱硫酸化肝素羧基。冰浴活化 2h后,加入溶解于甲酰胺与N,N-二甲基乙酰胺的混合溶剂(v:v＝1:1)的2-叠氮基-N-(2-羟乙基) 乙酰胺溶液5mL(脱硫酸化肝素:N,N'-二环己基碳酰亚胺：4-二甲氨基吡啶:2-叠氮基-N-(2- 羟乙基)乙酰胺的摩尔比依次为1∶10∶10∶3)，缓慢滴加到脱硫酸化肝素溶液中，避光反 应36h后，加入5倍体积的冰甲醇沉淀，抽滤得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min， 冰浴下探头超声30min，超滤，喷雾干燥，即得叠氮化修饰的脱硫酸化肝素。称取适量叠氮 化修饰的脱硫酸化肝素粉末溶于10mL甲酰胺中，氮气保护、冰浴条件下加入N,N'-二环己基 碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶，活化脱硫酸化的羧基。冰浴活化0.5h后,加入溶解于N,N-二甲 基乙酰胺的N-(3-氨基丙基)马来酰亚胺溶液5mL(叠氮化修饰的脱硫酸化肝素：N,N'-二环己 基碳酰亚胺：4-二甲氨基吡啶：N-(3-氨基丙基)马来酰亚胺的摩尔比依次为2∶8∶8∶1)，缓 慢滴加到叠氮化修饰的脱硫酸化肝素溶液中，反应72h后，加入10倍体积的冰丙酮沉淀，抽 滤得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，在蒸馏水中透 析，冷冻干燥，即得叠氮化、马来酰亚胺化修饰的脱硫酸化肝素。
将3mmol草酰氯溶于10mL乙酸乙酯，冷却至0℃，加入1mmol 3-丁炔-1-胺，室温反应 3h，经减压蒸馏纯化得到中间体I。
称取2mmol中间体I溶于10mL乙酸乙酯，冷却至0℃，加入1mmol含羟基的脱氢表雄酮，室温反应3h，经柱层析分离纯化得到中间体IIa。
称取2mmol中间体I溶于10mL乙酸乙酯，冷却至0℃，加入1mmol含羟基的司美替尼，室温反应4h，经柱层析分离纯化得到另一中间体IIb。
称取1mmol叠氮化、马来酰亚胺化修饰的脱硫酸化肝素溶于甲酰胺，称取0.2mmol末端 修饰半胱氨酸的RGD多肽加入至体系，在氮气保护下反应24h。加入5倍体积的冰乙醚沉淀， 离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心5min，冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中 透析，喷雾干燥，即得具有靶向性的叠氮化修饰的脱硫酸化肝素。
称取1mmol具有靶向性的叠氮化修饰的脱硫酸化肝素溶于10mLN,N-二甲基乙酰胺中， 称中间体IIa和IIb加入至体系(具有靶向性的叠氮化修饰的脱硫化肝素：中间体IIa：中间体 IIb的摩尔比依次为8∶3∶3)，在氮气保护下，加入五水硫酸铜和抗坏血酸，五水硫酸铜与 中间体II的摩尔比为1:8，抗坏血酸与中间体II的摩尔比为1:4，加完后反应24h。加入10 倍体积的冰乙醚沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，超滤，真空干燥，即得基于点击反应的ROS响应型脱硫酸化肝素-脱氢表雄酮-司美替尼前药复合物。
实施例4：基于点击反应的ROS响应型肝素-苯达莫斯汀-东莨菪内酯前药复合物的制备
称取1mmol肝素溶于10mL甲酰胺与1-甲基吡咯烷酮的混合溶剂(v:v＝1:1)中，60℃油 浴溶解，氮气保护、冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥 珀酰亚胺和4-二甲氨基吡啶，活化肝素羧基。冰浴活化2h后,加入溶解于甲酰胺与1-甲基 吡咯烷酮的混合溶剂(v:v＝1:1)的N-(2-氨基乙基)-2-叠氮基乙酰胺溶液5mL(肝素：1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺：4-二甲氨基吡啶:N-(2-氨基乙 基)-2-叠氮基乙酰胺的摩尔比依次为1∶4∶4∶2∶2)，缓慢滴加到肝素溶液中，反应结束后， 加入8倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴 下探头超声30min，在蒸馏水中透析，冷冻干燥，即得叠氮化修饰的肝素。称取叠氮化修饰 的肝素粉末溶于10mL 1-甲基吡咯烷酮中，氮气保护、冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺和4-二甲氨基吡啶，活化肝素的羧基。冰浴活化2h 后,加入溶解于1-甲基吡咯烷酮的N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺溶液5mL(叠氮化修饰的肝 素:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺：4-二甲氨基吡啶:N-(5- 氨基戊基)马来酰亚胺的摩尔比依次为1∶4∶4∶2∶2)，缓慢滴加到叠氮化修饰的肝素溶 液中，避光反应24h后，加入10倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm 离心10min，冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中透析，冷冻干燥，即得叠氮化、马来酰亚胺 化修饰的肝素。
将2mmol苯达莫斯汀溶于10mL乙醚，冷却至0℃，加入4mmol氯化亚砜，反应完全后经减压蒸馏，再溶于10mL乙醚，冷却至0℃，加入2mmol对羟基苯甲醇，反应完全后经柱 层析分离纯化得到经羟基修饰的疏水性药物；
将3mmol草酰氯溶于10mL乙醚，冷却至0℃，加入1mmol 4-戊炔-1-醇，室温反应3h，经减压蒸馏纯化得到中间体I。
称取2mmol中间体I溶于10mL乙醚，冷却至0℃，加入1mmol对羟基苯甲醇修饰的苯达莫斯汀，室温反应3h，经柱层析分离纯化得到中间体IIa。
称取2mmol中间体I溶于10mL乙醚，冷却至0℃，加入1mmol东莨菪内酯，室温反应3h，经柱层析分离纯化得到另一中间体IIb。
称取1mmol叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素溶于甲酰胺与1-甲基吡咯烷酮的混合溶剂 (v:v＝1:1)，称取0.3mmol末端修饰半胱氨酸的Plectin-1靶向肽加入至体系，在氮气保护下 反应24h。加入5倍体积的冰甲醇沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心5min， 冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中透析，喷雾干燥，即得具有靶向性的叠氮化修饰的肝素。
称取1mmol具有靶向性的叠氮化修饰的肝素溶于10mL甲酰胺与1-甲基吡咯烷酮的混合 溶剂(v:v＝1:1)中，称中间体IIa和IIb加入至体系(具有靶向性的叠氮化修饰的肝素：中间 体IIa：中间体IIb的摩尔比依次为4∶1∶2)，在氮气保护下，加入碘化亚铜，碘化亚铜与中 间体II的摩尔比为1:8，加完后反应24h。加入10倍体积的冰乙醚沉淀，离心得沉淀，用适 量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，超滤，真空干燥，即得基于点 击反应的ROS响应型肝素-苯达莫斯汀-东莨菪内酯前药复合物。
实施例5：基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素-美洛昔康前药复合物的制备
称取1mmol低分子量肝素溶于10mL甲酰胺，60℃油浴溶解，氮气保护、冰浴条件下加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺，活化低分 子量肝素羧基。冰浴活化0.5h后,加入溶解于N，N-二甲基甲酰胺的2-叠氮基-N-(3-羟丙基) 乙酰胺溶液5mL(低分子量肝素：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：1-羟基苯并三 唑：N,N-二异丙基乙胺:2-叠氮基-N-(3-羟丙基)乙酰胺的摩尔比依次为1∶2∶2∶2∶2)， 缓慢滴加到低分子量肝素溶液中，反应72h后，加入8倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤得沉淀，用 适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，在蒸馏水中透析，冷冻干燥， 即得叠氮化修饰的低分子量肝素。称取适量叠氮化修饰的低分子量肝素粉末溶于10mL甲酰胺 中，氮气保护、冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑 和N,N-二异丙基乙胺，活化低分子量肝素的羧基。冰浴活化0.5h后,加入溶解于N，N-二甲基 甲酰胺的1,4-二马来酰亚胺-2,3-丁二醇溶液5mL(叠氮化修饰的低分子量肝素:1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：1-羟基苯并三唑：N,N-二异丙基乙胺:1,4-二马来酰亚胺-2,3- 丁二醇的摩尔比依次为1∶2∶2∶2∶2)，缓慢滴加到叠氮化修饰的低分子量肝素溶液中，反 应72h后，加入10倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min， 冰浴下探头超声60min，在蒸馏水中透析，冷冻干燥，即得叠氮化、马来酰亚胺化修饰的低分 子量肝素。
将3mmol草酰氯溶于10mL四氢呋喃，冷却至0℃，加入1mmol 6-庚炔醇，室温反应2h， 经减压蒸馏纯化得到中间体I。
称取2mmol中间体I溶于10mL四氢呋喃，冷却至0℃，加入1mmol含羟基的美洛昔康，室温反应2h，经柱层析分离纯化得到中间体IIa。
称取1mmol叠氮化、马来酰亚胺化修饰的低分子量肝素溶于甲酰胺与1-甲基吡咯烷酮的 混合溶剂(v:v＝1:1)，称取0.3mmol末端修饰半胱氨酸的Plectin-1靶向肽加入至体系，在氮 气保护下反应24h。加入5倍体积的冰乙醚沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm 离心5min，冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中透析，喷雾干燥，即得具有靶向性的叠氮化 修饰的低分子量肝素。
称取1mmol具有靶向性的叠氮化修饰的低分子量肝素溶于10mL甲酰胺与1-甲基吡咯烷 酮的混合溶剂(v:v＝1:1)中，称中间体IIa和IIb加入至体系(具有靶向性的叠氮化修饰的低 分子量肝素：中间体IIa：中间体IIb的摩尔比依次为2∶1∶0)，在氮气保护下，加入碘化亚 铜，碘化亚铜与中间体II的摩尔比为1:8，加完后反应24h。加入10倍体积的冰乙醚沉淀， 离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，超滤，真空 干燥，即得基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素-美洛昔康前药复合物。
实施例6：基于点击反应的ROS响应型未分级肝素-甲氨蝶呤-长春新碱前药复合物的制备
称取1mmol未分级肝素溶于10mL甲酰胺，60℃油浴溶解，氮气保护、冰浴条件下加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺，活化未分级肝 素羧基。冰浴活化0.5h后,加入溶解于甲酰胺的2-叠氮基-N-(3-羟丙基)乙酰胺溶液5mL(未 分级肝素：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：1-羟基苯并三唑：N,N-二异丙基乙胺: 2-叠氮基-N-(3-羟丙基)乙酰胺的摩尔比依次为1∶2∶2∶2∶2)，缓慢滴加到未分级肝素溶 液中，反应48h后，加入8倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm 离心10min，冰浴下探头超声30min，在蒸馏水中透析，冷冻干燥，即得叠氮化修饰的未分级 肝素。称取适量叠氮化修饰的未分级肝素粉末溶于10mL甲酰胺中，氮气保护、冰浴条件下加 入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺，活化叠 氮化修饰的未分级肝素的羧基。冰浴活化0.5h后,加入溶解于甲酰胺的N-羟甲基马来酰亚胺 溶液5mL(叠氮化修饰的未分级肝素:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：1-羟基苯 并三唑：N,N-二异丙基乙胺:N-羟甲基马来酰亚胺的摩尔比依次为1∶2∶2∶2∶2)，缓慢滴 加到叠氮化修饰的未分级肝素溶液中，反应结束后，加入10倍体积的冰丙酮沉淀，抽滤得沉 淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，在蒸馏水中透析，冷 冻干燥，即得叠氮化、马来酰亚胺化修饰的未分级肝素。
将2mmol 3-溴丙酮酸溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入4mmol氯化亚砜，反应完全后经减压蒸馏，再溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入2mmol对羟基苯甲醇，反应完 全后经柱层析分离纯化得到经羟基修饰的疏水性药物；
将2mmol草酰氯溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol炔丙胺，室温反应2h，经减压蒸馏纯化得到中间体I。
称取2mmol中间体I溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol对羟基苯甲醇修饰的甲氨蝶呤，室温反应2h，经柱层析分离纯化得到中间体IIa。
称取2mmol中间体I溶于10mL二氯甲烷，冷却至0℃，加入1mmol长春新碱，室温反应2h，经柱层析分离纯化得到另一中间体IIb。
称取1mmol叠氮化、马来酰亚胺化修饰的未分级肝素溶于甲酰胺，称取0.3mmol末端修 饰半胱氨酸的F3肽加入至体系，在氮气保护下反应24h。加入5倍体积的冰甲醇沉淀，离心 得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心5min，冰浴下探头超声20min，在蒸馏水中透析， 喷雾干燥，即得具有靶向性的叠氮化修饰的未分级肝素。
称取1mmol具有靶向性的叠氮化修饰的未分级肝素溶于10mL甲酰胺中，称中间体IIa 和IIb加入至体系(具有靶向性的叠氮化修饰的未分级肝素：中间体IIa：中间体IIb的摩尔 比依次为10∶5∶3)，在氮气保护下，加入碘化亚铜，碘化亚铜与中间体II的摩尔比为1:8， 加完后反应24h。加入10倍体积的冰乙醚沉淀，离心得沉淀，用适量蒸馏水复溶，3000rpm离心10min，冰浴下探头超声30min，超滤，真空干燥，即得基于点击反应的ROS响应型未 分级肝素-甲氨蝶呤-长春新碱前药复合物。
实施例7：载二氢卟吩e6的基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素-藤黄酸-紫杉醇纳米制剂 的制备
称取适量二氢卟吩e6溶于二甲基亚砜中。18mg基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素- 藤黄酸-紫杉醇前药复合物溶于3mL蒸馏水。将二氢卟吩e6溶液交替缓慢逐滴加入基于点击反 应的ROS响应型低分子量肝素-藤黄酸-紫杉醇前药复合物水溶液中，剧烈搅拌0.5h后、高压匀 质0.5h。使用旋转蒸发仪去除大部分有机溶剂，蒸馏水透析8h除去残留有机溶剂，喷雾干燥 除去水分，即得二氢卟吩e6的基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素-藤黄酸-紫杉醇纳米制 剂。
实施例8：载酞菁锌的基于点击反应的ROS响应型未分级肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素纳米制剂的 制备
称取适量酞菁锌溶于1-甲基吡咯烷酮中。18mg基于点击反应的ROS响应型未分级肝素-苯 丁酸氮芥-阿霉素前药复合物溶于3mL蒸馏水。将酞菁锌溶液交替缓慢逐滴加入基于点击反应 的ROS响应型未分级肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素前药复合物水溶液中，剧烈搅拌0.5h后、水浴超 声30min。超滤1h，冷冻干燥除去水分，即得载酞菁锌的基于点击反应的ROS响应型未分级肝 素-苯丁酸氮芥-阿霉素纳米制剂。
实施例9：载血卟啉单甲醚的基于点击反应的ROS响应型肝素-熊果酸-表阿霉素纳米制剂的制 备
20mg的基于点击反应的ROS响应型肝素-熊果酸-表阿霉素前药复合物溶于3mL蒸馏水。加 入血卟啉单甲醚粉末，剧烈搅拌2h，冰浴探头超声1h。真空干燥除去水分，即得载血卟啉单 甲醚的基于点击反应的ROS响应型肝素-熊果酸-表阿霉素纳米制剂。
实施例10：基于点击反应的ROS响应型纳米制剂的制备及表征
1.载药基于点击反应的ROS响应型纳米制剂的制备：称取载药基于点击反应的ROS响应型纳 米制剂粉末溶解于双蒸水中，室温下搅拌5min即得。
2.粒径。将制备得到的载药基于点击反应的ROS响应型纳米制剂溶液，使用激光粒径测定仪 分别测定其粒径。
3.取代度。精密称取基于点击反应的ROS响应型前药复合物10mg，加水溶解并定容至10mL； 吸取1mL，用甲醇稀释并定容至10mL，水浴超声3min破乳后，利用紫外分光光度计，于疏水 药物最大吸收波长处测定其吸收度。代入标准曲线中，即可计算出疏水药物的含量。取代度 可以通过以下公式计算得到：
Figure BDA0002600193290000161
此公式中，c为疏水药物的含量(g)，由标准曲线计算所得；m为称取的肝素多糖衍生物的质 量(g)；M1为疏水药物的平均分子量，M2为未分级肝素、低分子量肝素、肝素或脱硫酸化肝 素的单元平均分子量。
4.载药量。精密称取多元组合物10mg，加水溶解并定容至10mL；吸取1mL，用DMSO稀释并定容至10mL，水浴超声3min破乳后，利用紫外分光光度计，于药物最大吸收波长处测定其吸光度。代入标准曲线中，即可计算出多元组合物中药物的含量。靶向多元组合物的载药量可以通过以下公式计算得到：
载药量DL(％)＝(纳米粒中的药物质量/纳米粒的质量)×100％
以上结果见表1，由结果可以看出，多元组合物粒径在160nm左右，较小的粒径有助于 促进纳米粒在血液循环中通过渗透滞留作用更多的积蓄于肿瘤组织。疏水药物取代度载60％ 左右，如此高的取代度可为后续包载光敏剂药物提供较大空间，具有很好的载药潜力。由载 药量可以看出，光敏剂的载药量均在20％左右，和文献中报道的载药量～5-10％相比，有极大 的提高。
表1肝素类多糖-疏水性药物a-疏水性药物b纳米制剂的表征
Figure BDA0002600193290000171
1组为载酞菁锌的基于点击反应的ROS响应型未分级肝素-阿霉素-阿司匹林纳米制剂；2 组为载苯并卟啉衍生物单酸环A的ROS响应型低分子量肝素-东莨菪内酯-双氯芬酸纳米制剂； 3组为载酞菁的ROS响应型脱硫化肝素-脱氢表雄酮-萘普生纳米制剂；4组为二氢卟吩e6的 基于点击反应的ROS响应型低分子量肝素-藤黄酸-紫杉醇纳米制剂；5组为载酞菁锌的基于 点击反应的ROS响应型未分级肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素纳米制剂；6组为载血卟啉单甲醚的 基于点击反应的ROS响应型肝素-熊果酸-表阿霉素纳米制剂；7组为载酞菁硅的基于点击反 应的ROS响应型低分子量肝素-美洛昔康纳米制剂。
实施例11：基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖衍生纳米制剂的稳定性
将载酞菁锌的基于点击反应的ROS响应型纳米制剂和载四间-羟基苯基二氢卟酚的基于 点击反应的ROS响应型纳米制剂配制成1mg/mL的水溶液，室温放置，测定0h、24h和48h 的粒径和多分散系数，以此评价基于点击反应的ROS响应型纳米制剂溶液的放置稳定性。结 果显示，基于点击反应的ROS响应型纳米制剂粒径和多分散系数变化较小，说明基于点击反 应的ROS响应型纳米制剂具有良好的稳定性。具体结果见表2：
表2基于点击反应的ROS响应型纳米制剂稳定性评价结果
Figure BDA0002600193290000181
实施例12：基于点击反应的ROS响应型纳米制剂的溶解性
分别称取1g不同的基于点击反应的ROS响应型纳米制剂溶解在1mL水中。室温下每隔5min 震荡1min，观察1h内是否能完全溶解。结果显示，将疏水药物通过点击反应共价连接到肝素 类多糖上可以显著提高疏水药物的溶解性。同时将光敏剂包载于基于点击反应的ROS响应型 纳米前药复合物中，可以大大提高光敏剂的溶解性。具体结果见表3：
表3基于点击反应的ROS响应型纳米制剂溶解性评价结果
Figure BDA0002600193290000182
Figure BDA0002600193290000191
注“-”几乎不溶，“+”可溶，“++”易溶。
实施例13：相对血红蛋白含量测定评价基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖衍生纳米制剂 的抗血管生成活性
将基质胶与血管生长因子以及不同的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖-疏水前药复 合物混合，分别皮下注射于雄性小鼠腋下，10天后处死小鼠，分离出基质胶加入低渗溶液缓 冲液，匀浆，10000rpm离心10min，取上清1.5mL，加入2.0mL的Drabkin’s试剂，室温下孵育 15min。然后使用紫外分光光度计测定各组在540nm波长下的吸光度值。以阳性对照组的吸光 度值为100％，阴性对照组的吸光度值为0％，按如下公式计算相对血红蛋白含量(Relative Hemoglobin,RHb)。结果可以看出，肝素类多糖和疏水药物偶联后，可显著提高肝素类多糖 的抗血管新生活性。具体结果见表4。
RHb(％)＝(Asample-A0％)/(A100％-A0％)×100％
表4基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖衍生纳米制剂抗血管生成活性评价结果
Figure BDA0002600193290000192
实施例14：MTT法检测基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖衍生纳米制剂对细胞的抑制作 用
取对数生长期且状态良好的PANC-1贴壁细胞，以5000个/孔密度接种于96孔板中，37℃孵 育，吸去培养液，靶向组加入叠氮聚糖37℃孵育3d。吸去培养基分别加入含不同浓度的基于 点击反应的ROS响应型纳米制剂100μL，37℃孵育4h，光照组于630nm近红外光500mW/cm2下照射3min后，37℃继续孵育20h，40μL加入四甲基偶氮唑蓝(2.5mg/L)继续孵育4h，吸去 各孔培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜，震摇5min后，用酶标仪测570nm处的吸光度(OD)， N＝6。按照以下公式计算细胞存活率。并以存活率结果计算基于点击反应的ROS响应型纳米 制剂对PANC-1细胞的半数抑制率IC50。结果见表。结果表明，多基于点击反应的ROS响应型 纳米制剂有较强的肿瘤抑制作用。具体结果见表5。
Viability(％)＝Asample/Acontrol×100％
其中，Asample为加药组的吸光度值，Acontrol为空白对照组的吸光度值。
表5基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖衍生纳米制剂对细胞的抑制作用评价结果
Figure BDA0002600193290000201
实施例15：高效液相法检测ROS响应型低分子量肝素-吲哚美辛-美洛昔康前药复合物的体外 释放行为
精密称取两份2mg ROS响应型低分子量肝素-吲哚美辛-美洛昔康前药复合物，分别溶于 2mL 0.1mM过氧化氢和2mL 1mM过氧化氢中，得到浓度为1mg/mL的ROS响应型低分子量肝素-吲哚美辛-美洛昔康前药复合物溶液。在37℃条件下振荡，于4h、8h、24h和48h 分别取300μL溶液，加入2.7mL色谱甲醇，超声30min以破坏纳米粒结构，随后将处理的 溶液加入至超滤管(MWCO＝3000)中，10000rpm离心30min，取0.5mL滤液，采用0.22μm 有机滤膜进行过滤，进行HPLC分析，计算降解分数。
表6低分子量肝素-吲哚美辛-美洛昔康前药复合物的ROS敏感性考察
Figure BDA0002600193290000211
表7 1mM过氧化氢组低分子量肝素-吲哚美辛-美洛昔康纳米制剂降解情况
Figure BDA0002600193290000212
1mM过氧化氢组低分子量肝素-吲哚美辛-美洛昔康纳米制剂的降解分数显著大于0.1mM 过氧化氢组，说明其具有ROS。进一步考察0.1mM过氧化氢及1mM过氧化氢组降解产物美 洛昔康衍生物、美洛昔康、吲哚美辛衍生物以及吲哚美辛所占百分比，发现吲哚美辛衍生物 与游离吲哚美辛比例呈互补趋势，表明低分子量肝素-吲哚美辛-美洛昔康纳米制剂中吲哚美 辛先降解为吲哚美辛衍生物，随后发生重排得到终产物吲哚美辛，而美洛昔康则直接降解为 游离药物。
实施例16：ROS响应型低分子量肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素/酞菁锌对胰腺癌的抗肿瘤作用
将BxPC-3荷瘤小鼠随机分为5组，6只/组，分组和给药剂量如下：(1)生理盐水；(2)游离阿霉素+苯丁酸氮芥+酞菁锌(0.5mg/Kg)；(3)低分子量肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素；(4)低分子量肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素包载酞菁锌(0.5mg/Kg)。分别在0、3、6日尾静脉注射给药，在1、4、7日用500mW/cm2670nm激光器照射肿瘤5min。从第一天给药之后，每天使 用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，根据公式计算出肿瘤体积大小。停药后第14天安乐死，
Figure BDA0002600193290000221
其中，IR代表抑瘤率，Wcontrol指对照组平均瘤重，Wtest指给药组平均瘤重。
结果表明，和生理盐水组相比，低分子量肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素包载酞菁锌组能够明显抑 制肿瘤生长，抑瘤率高达96％，而游离酞菁锌+苯丁酸氮芥+阿霉素、低分子量肝素-苯丁酸氮 芥-阿霉素的抑瘤率分别是65％、50％，显著低于低分子量肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素包载酞菁 锌组。说明低分子量肝素-苯丁酸氮芥-阿霉素包载酞菁锌组具极其显著的体内抗肿瘤治疗疗 效。
实施例17：ROS响应型未分级肝素-阿霉素-司美替尼/二氢卟吩e6对乳腺癌的抗肿瘤作用
将MCF-7荷瘤小鼠随机分为5组，6只/组，分组和给药剂量如下：(1)生理盐水；(2)游离阿霉素+司美替尼+二氢卟吩e6(1mg/Kg)；(3)未分级肝素-阿霉素-司美替尼；(4)未 分级肝素-阿霉素-司美替尼包载二氢卟吩e6(1mg/Kg)。给药24h后，使用630nm近红外激 光器，功率为500mW/cm2照射肿瘤部位5min。分别在0、3、6日分别尾静脉注射给药，在1、 4、7日用500mW/cm2630nm激光器照射肿瘤5min。从第一天给药之后，每天使用游标卡尺 测量肿瘤的长度和宽度，根据公式计算出肿瘤体积大小。停药后第14天安乐死，解剖出肿瘤， 称重，根据公式计算肿瘤生长抑制率(IR)评价其抑瘤效果。
Figure BDA0002600193290000222
其中，IR代表抑瘤率，Wcontrol指对照组平均瘤重，Wtest指给药组平均瘤重。
结果表明，和生理盐水组相比，未分级肝素-阿霉素-司美替尼包载二氢卟吩e6组能够明显抑制 肿瘤生长，抑瘤率高达91％，而游离二氢卟吩e6+阿霉素+司美替尼、未分级肝素-阿霉素-司美 替尼的抑瘤率分别是62％、47％，显著低于未分级肝素-阿霉素-司美替尼包载二氢卟吩e6组。 说明未分级肝素-阿霉素-司美替尼包载二氢卟吩e6组具极其显著的体内抗肿瘤治疗疗效。
实施例18：ROS响应型肝素-熊果酸-表阿霉素/血卟啉单甲醚对食管癌的抗肿瘤作用
将Eca-109荷瘤小鼠随机分为5组，6只/组，分组和给药剂量如下：(1)生理盐水；(2) 游离熊果酸+表阿霉素+血卟啉单甲醚(1.5mg/Kg)；(3)肝素-熊果酸-表阿霉素；(4)肝素- 熊果酸-表阿霉素包载血卟啉单甲醚(1.5mg/Kg)。给药24h后，使用630nm近红外激光器， 功率为200mW/cm2照射肿瘤部位10min。分别在0、3、6日分别尾静脉注射给药，在1、4、 7日用200mW/cm2630nm激光器照射肿瘤10min。从第一天给药之后，每天使用游标卡尺测 量肿瘤的长度和宽度，根据公式计算出肿瘤体积大小。停药后第14天安乐死，解剖出肿瘤， 称重，根据公式计算肿瘤生长抑制率(IR)评价其抑瘤效果。
Figure BDA0002600193290000231
其中，IR代表抑瘤率，Wcontrol指对照组平均瘤重，Wtest指给药组平均瘤重。
结果表明，和生理盐水组相比，肝素-熊果酸-表阿霉素包载血卟啉单甲醚组能够明显抑制肿 瘤生长，抑瘤率高达94％，而游离血卟啉单甲醚+熊果酸+表阿霉素、肝素-熊果酸-表阿霉素的 抑瘤率分别是66％、54％，显著低于肝素-熊果酸-表阿霉素包载血卟啉单甲醚组。说明肝素- 熊果酸-表阿霉素包载血卟啉单甲醚组具极其显著的体内抗肿瘤治疗疗效。
实施例19：ROS响应型脱硫酸化肝素-东莨菪内酯-双氯芬酸/苯并卟啉衍生物单酸环A对黑 色素瘤的抗肿瘤作用
将B16荷瘤小鼠随机分为5组，6只/组，分组和给药剂量如下：(1)生理盐水；(2)游离东莨菪内酯+双氯芬酸+苯并卟啉衍生物单酸环A(3mg/Kg)；(3)脱硫酸化肝素-东莨菪内酯-双氯芬酸；(4)脱硫酸化肝素-东莨菪内酯-双氯芬酸包载苯并卟啉衍生物单酸环A(3mg/Kg)。 给药24h后，使用630nm近红外激光器，功率为200mW/cm2照射肿瘤部位10min。分别在0、 3、6日分别尾静脉注射给药，在1、4、7日用200mW/cm2630nm激光器照射肿瘤10min。 从第一天给药之后，每天使用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，根据公式计算出肿瘤体积大小。停药后第14天安乐死，解剖出肿瘤，称重，根据公式计算肿瘤生长抑制率(IR)评价其 抑瘤效果。
Figure BDA0002600193290000232
其中，IR代表抑瘤率，Wcontrol指对照组平均瘤重，Wtest指给药组平均瘤重。
结果表明，和生理盐水组相比，脱硫酸化肝素-东莨菪内酯-双氯芬酸包载苯并卟啉衍生物单 酸环A组能够明显抑制肿瘤生长，抑瘤率高达90％，而游离苯并卟啉衍生物单酸环A+东莨菪 内酯+双氯芬酸、脱硫酸化肝素-东莨菪内酯-双氯芬酸的抑瘤率分别是61％、52％，显著低于 脱硫酸化肝素-东莨菪内酯-双氯芬酸包载苯并卟啉衍生物单酸环A组。说明脱硫酸化肝素-东 莨菪内酯-双氯芬酸包载苯并卟啉衍生物单酸环A组具极其显著的体内抗肿瘤治疗疗效。

Claims (10)

1.基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物，其特征在于，所述纳米前药复合物以亲水性肝素类多糖为基体，经功能化后通过点击反应共价偶联疏水性抗肿瘤药物、共价结合靶向配体；其中，肝素类多糖、疏水性抗肿瘤药物及靶向配体的摩尔比为1:0.1-0.9:0.9-0.1，且疏水性抗肿瘤药物为摩尔比为1:0-20的疏水性药物a和疏水性药物b。
2.根据权利要求1所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物，其特征在于，所述肝素类多糖包括未分级肝素、低分子量肝素及脱硫酸化肝素；所述疏水性抗肿瘤药物a或b包括肿瘤糖代谢抑制药物、MAPK通路抑制药物、肿瘤脂质代谢干扰药物、抗血管生成药物、破坏DNA结构和功能药物、影响核酸生成药物、作用于核酸转录药物、作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂、作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物；其中，抗肿瘤糖代谢药物包括氯尼达明、双氯芬酸、3-溴丙酮酸、紫草素、脱氢表雄酮；MAPK通路抑制药物包括维罗非尼、司美替尼、安卓奎诺尔、东莨菪内酯；肿瘤脂质代谢干扰药物包括阿司匹林、吲哚美辛、萘普生、布洛芬和美洛昔康；抗血管生成药物包括瑞戈非尼、阿帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼；破坏DNA结构和功能药物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、顺铂和卡铂；影响核酸生成药物包括5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤和6-巯嘌呤；作用于核酸转录药物包括阿霉素、表阿霉素和吡柔比星；作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂包括羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康；作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物包括长春新碱、紫杉醇和多西紫杉醇；羧酸类小分子抗肿瘤药物包括藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤及苯丁酸氮芥；所述靶向配体包括Plectin-1靶向肽、RGD多肽、F3肽和叶酸。
3.权利要求1或2所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的制备方法，其特征在于，所述方法首先以亲水性肝素类多糖为基体，通过酰胺化反应或酯化反应得到功能化肝素类多糖，同时，将疏水性羟基类或羧基类小分子抗肿瘤药物经酯化反应与炔基或巯基基团连接；然后经点击反应与功能化肝素类多糖偶联；最后通过点击反应与靶向配体共价结合，即可制得纳米前药复合物。
4.根据权利要求3所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的制备方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
S1、将亲水性肝素类多糖溶于有机溶剂A中，在0℃条件下采用羧基活化剂进行活化0.5-2h，再加入含叠氮基的连接臂反应12-72h，反应结束后加入有机溶剂B沉淀产物，所得沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透析或置于超滤管中超滤，干燥后得叠氮化修饰的肝素类多糖；其中透析1-3d，超滤0.5-5h；
S2、取S1中叠氮化修饰的肝素类多糖溶于有机溶剂A中，在0℃条件下采用羧基活化剂进行活化0.5-2h，再加入含马来酰亚胺基团的连接臂反应12-72h，反应结束后加入有机溶剂B沉淀产物，所得沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透析或置于超滤管中超滤，干燥后得叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖；其中透析1-3d，超滤0.5-5h；
S3、将含羧基的疏水性药物溶于有机溶剂C，冷却至0℃，加入氯化亚砜，反应完全后经减压蒸馏，再溶于有机溶剂C，冷却至0℃，加入对羟基苯甲醇，反应完全后经柱层析分离纯化得到经羟基修饰的疏水性药物；
S4、将草酰氯溶于有机溶剂C，冷却至0℃，加入含炔基的连接臂，反应完全后经减压蒸馏纯化得到中间体I；
S5、将中间体I分别溶于两份有机溶剂C，冷却至0℃，分别加入含羟基或经羟基修饰的疏水性药物，反应完全后分别经柱层析分离纯化得到中间体IIa或IIb；
S6、将叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖溶于溶剂中，加入末端含巯基的靶向配体、惰性气体保护下反应12-72h，反应结束后向体系中加入冷的有机溶剂B沉淀产物，所得沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透析或置于超滤管中超滤，干燥后得具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖；其中透析1-3d，超滤0.5-5h；
S7、将具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖溶于溶剂中，加入摩尔比为1:0-20的中间体IIa和IIb、惰性气体保护下，加入碘化亚铜或五水硫酸铜及还原剂反应12-72h；反应结束后向体系中加入冷的有机溶剂B沉淀产物，所得沉淀用水复溶、离心、上清置于透析袋中透析或置于超滤管中超滤，干燥后得基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物；其中透析1-3d，超滤0.5-5h。
5.根据权利要求4所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的制备方法，其特征在于，叠氮化修饰的肝素类多糖制备体系中肝素类多糖、羧基活化剂及含叠氮基团的连接臂的摩尔比为1:2-20:1-8；叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖制备体系中肝素类多糖、羧基活化剂及含马来酰亚胺基团的连接臂的摩尔比为1:2-20:1-8；中间体I制备中含炔基的连接臂与草酰氯的摩尔比为1:1-8；中间体IIa或IIb制备中含羟基或经羟基修饰的疏水性药物a或b与中间体I的摩尔比均为1:1-8；具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖制备体系中叠氮化、马来酰亚胺化修饰的肝素类多糖与末端含巯基的靶向配体摩尔比为1:0.1-0.9；基于点击反应的ROS响应型前药复合物制备体系中具有靶向性的叠氮化修饰的肝素类多糖与中间体II摩尔比为1:0.1-0.9。
6.根据权利要求4所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的制备方法，其特征在于，有机溶剂A为甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、1-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种；有机溶剂B为丙酮、乙醚或甲醇；有机溶剂C为二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、四氢呋喃或乙酸乙酯；羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物，或N,N’-羰基二咪唑，或N,N'-二环己基碳酰亚胺和4-二甲氨基吡啶的混合物，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和4-二甲氨基吡啶的混合物，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺的混合物；沉淀处理方法为减压抽滤法或离心法；干燥方法为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
7.根据权利要求4所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的制备方法，其特征在于，S1中含叠氮基的连接臂包括2-叠氮基乙胺、3-叠氮基丙胺、2-叠氮基乙醇、3-叠氮基丙醇、3-叠氮基-2-甲基-1-丙醇、N-(2-氨基乙基)-2-叠氮基乙酰胺、2-叠氮基-N-(2-羟乙基)乙酰胺、N-(3-氨基丙基)-2-叠氮基乙酰胺、2-叠氮基-N-(3-羟丙基)乙酰胺；含叠氮基的连接臂与肝素类多糖的摩尔比为1-8:1；S2中含马来酰亚胺基团的连接臂包括N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺、N-(2-羟乙基)马来酰亚胺、N-(3-氨基丙基)马来酰亚胺、N-羟甲基马来酰亚胺、N,N′-双(3-马来酰亚胺丙酰基)-2-羟基-1,3-丙二胺、N-(2-哌嗪基乙基)马来酰亚胺、1,4-二马来酰亚胺-2,3-丁二醇、N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺；含马来酰亚胺基团的连接臂与叠氮化修饰的肝素类多糖的摩尔比为1-8:1；S3中所述的含羧基的疏水性药物包括氯尼达明、双氯芬酸、3-溴丙酮酸、藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤、苯丁酸氮芥、阿司匹林、吲哚美辛、萘普生、布洛芬；S4中所述的含炔基的连接臂包括炔丙胺、炔丙醇、5-己炔-1-胺、4-戊炔-1-胺、3-丁炔-1-胺、3-丁炔-1-醇、4-戊炔-1-醇、5-己炔-1-醇、6-庚炔醇、7-辛炔醇；S5中含羟基或经羟基修饰的疏水性药物a或b包括司美替尼、安卓奎诺尔、东莨菪内酯、脱氢表雄酮、美洛昔康、长春新碱、紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、吡柔比星以及对羟基苯甲醇修饰的氯尼达明、双氯芬酸、3-溴丙酮酸、藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤、苯丁酸氮芥、阿司匹林、吲哚美辛、萘普生、布洛芬；S6中末端含巯基的靶向配体包括末端修饰半胱氨酸的Plectin-1靶向肽、RGD多肽、F3肽和叶酸。
8.含有权利要求1或2所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物的纳米制剂。
9.权利要求8所述的纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为：将纳米前药复合物与水按重量比3-50:1000制成溶液，将光敏剂用有机溶剂溶解后滴加到上述溶液中；搅拌反应1-3h后置于冰浴条件下探头超声10-40min，即制得纳米制剂；或，直接置于冰浴条件下探头超声10-40min，然后室温条件下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，采用离心法除去未反应小分子，采用真空干燥或冷冻干燥除去水分，制得纳米制剂。
10.权利要求1或2所述的基于点击反应的ROS响应型肝素类多糖纳米前药复合物或权利要求8所述的纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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