CN110339181A - 一种基于点击反应的pH响应型纳米制剂及其制法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于点击反应的pH响应型纳米制剂及其制法和应用，基于点击反应的pH响应型纳米制剂由疏水性羧酸小分子抗肿瘤药物通过席夫碱反应和点击反应与叠氮化肝素类多糖偶联形成两亲性偶联物，在水中可自组装成纳米制剂。点击反应简单环保、反应条件温和、产物易分离且产率高。pH响应型纳米制剂到达肿瘤酸性微环境后，席夫碱键断裂，得到羧酸衍生物中间体，其进一步重排得到羧酸小分子原型，能够很好的避免其他基团对羧酸分子活性的影响。此外，pH响应型纳米制剂可物理包载疏水性抗肿瘤药物，得到物理载药pH响应型纳米制剂，实现协同抗肿瘤疗效。

Description

一种基于点击反应的pH响应型纳米制剂及其制法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域的纳米制剂的制备，涉及一种基于点击反应的pH响应型纳米制剂及其制法和应用。
背景技术
癌症由于其发病机制复杂而难以治愈，成为全球第二大死因。癌症治疗主要包括化学治疗、手术治疗和放射治疗，但是都具有自身局限性。其中化学治疗药物大多缺乏选择性，对正常细胞也具有杀伤作用；手术治疗主要针对早期实体肿瘤，应用范围有限，放疗的治疗时间长，且毒副作用非常明显。目前，化疗在肿瘤治疗中应用最为广泛，但大多化学治疗药物水溶性差且缺乏选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生毒副作用，因此，纳米递药体系应运而生。对于两亲性偶联物纳米粒而言，疏水性药物可包载于纳米粒的疏水核心或共价结合到亲水端，从而提高其水溶性，同时借助EPR效应富集于肿瘤部位以增强肿瘤杀伤作用。
尽管聚合物药物载体研究取得较大进展，但纳米药物到达体内后很难以预期的速度于肿瘤部位特异性释放，不仅对正常组织造成毒性作用，而且可能引起耐药性问题，成为聚合物药物载体发展的阻碍，其临床应用受到了很大的限制。因此，科研工作者设计合成智能响应性药物载体，以期实现纳米药物在肿瘤细胞及组织的特异性释放，降低对正常组织的毒性作用，同时加强其肿瘤杀伤作用。智能响应性药物载体受到外界或自身环境刺激(包括温度、光和pH值等)时，其结构会发生相应变化，利用肿瘤组织与正常组织之间的差异，可以达到控制纳米药物在肿瘤部位特异性释放的目的。人体内不同部位pH值有所差异，血液及正常组织部位的pH值为7.4，肿瘤细胞增殖快且周围血管异常，氧气和营养供应不足，肿瘤组织为了适应缺氧环境从而上调了糖酵解速率，糖类不能进行完全分解，产生大量乳酸并堆积于肿瘤组织附近，使得肿瘤组织附近pH值低于正常组织pH值，pH为6.5～7.2，内涵体pH为5.0～6.0，溶酶体pH为4.0～5.0。因此，可以设计pH响应型纳米递药系统，借助于不同部位的pH值差异实现pH响应型释药。通过在亲水端与小分子药物疏水端引入酸敏感响应共价键，可构建酸敏感型聚合物前药，在肿瘤酸性微环境中实现酸敏感键的特异性断裂，药物载体结构破坏，从而在肿瘤部位适时、足量释药。pH响应型纳米递药体系可借助于EPR效应富集于肿瘤组织，其可经内吞进入肿瘤细胞内进一步降解发挥作用，或在肿瘤组织周围弱酸性环境下降解得到疏水性药物分子，经被动扩散进入肿瘤细胞，因而增强了对肿瘤组织的杀伤作用，并降低了对正常组织的毒性作用。
两亲性共聚物的酸敏感键断裂后，疏水性小分子抗肿瘤药物通常连接有残基，这些残基可能会降低药物活性或使其失活，影响药物抗肿瘤效果。重排反应(RearrangementReaction)是分子的碳骨架发生重排生成结构异构体的化学反应，是有机反应中的一大类，其通常涉及取代基由一个原子转移到同一个分子中的另一个原子上的过程。醌甲基重排是重排反应的一类，席夫碱键断裂后，进一步发生醌甲基重排，通过电子重排得到稳定的醌甲基结构，醌甲基结构消除即可得到抗肿瘤药物分子原型，可有效避免降解残基对抗肿瘤药物活性的影响。
经济社会飞速发展的同时，环境污染和资源枯竭的压力日益增加，绿色化学显得尤为重要。绿色化学的核心是利用化学原理从源头上消除工业对环境的污染，反应物最大化转化为产物。2001年，诺贝尔奖得主Sharpless提出点击化学(Click Chemistry)反应的概念，即运用高产率、高选择性的化学方法快速合成产物的模块化合成手段，其反应物易得、反应条件温和、合成反应快速、产率高、反应立体选择性强、产物易分离且对水和氧气不敏感。目前点击反应已应用于标记DNA排序、聚合物合成和材料表面修饰等领域，其典型代表为铜催化的炔基-叠氮环加成反应。
羧酸类小分子抗肿瘤药物储量丰富，具有多种抗肿瘤机制。如藤黄酸可通过上调细胞内促凋亡因子从而诱导细胞凋亡，通过抑制基质金属蛋白酶从而限制肿瘤细胞转移；熊果酸能够诱导肿瘤细胞凋亡、提高其抗侵袭性和抑制肿瘤细胞增殖，通过多种细胞信号通路发挥肿瘤杀伤作用；甲氨喋呤对单核巨噬细胞有特异性毒性，通过抑制二氢叶酸还原酶可干扰肿瘤细胞S期DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡。然而，羧酸类小分子抗肿瘤药物单独使用时水溶性差、静脉注射刺激性强且体内消除半衰期短，限制了其在临床上的应用。
肝素是一种硫酸化多糖，作为抗凝血剂在临床上广泛使用。低分子肝素是由普通肝素经降解得到的小分子量肝素片段。低分子肝素具有较好的抗血栓作用，且其抗血栓形成活性强于抗凝血活性，因此，在发挥抗血栓作用的同时其出血风险较小。肝素类多糖生物相容性好且生物半衰期长，为其临床应用奠定了良好的基础，然而，其单独使用时仍存在一定的出血风险，且肝素类多糖亲水，无法自组装成为纳米制剂。因此，需将其与疏水性抗肿瘤药物共价连接制备两亲性聚合物，在水中自组装得到纳米制剂，增强其抗肿瘤作用。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种基于点击反应的pH响应型纳米制剂及其制法和应用。借助席夫碱反应、酯化反应以及点击反应等将肝素类多糖和羧酸小分子连接起来，得到肝素类多糖修饰的pH响应型羧酸衍生物，即基于点击反应的pH响应型偶联物，其能在水溶液中自组装得到基于点击反应的pH响应型纳米制剂。
同时，可通过静电相互作用、π-π堆积作用和疏水驱动作用等分子间作用力在基于点击反应的pH响应型纳米制剂中包载疏水性抗血管生成药物、光敏剂及细胞毒药物等，构建物理载药pH响应型纳米制剂，提高疏水性抗肿瘤药物的水溶性，实现体内长循环作用，并可通过EPR效应富集于肿瘤部位。不同机制抗肿瘤药物联合后可发挥协同抗肿瘤效果，能够提高疏水性抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用，并降低其对正常细胞的毒副作用。同时，其能够减少临床注射次数及剂量，有效减轻临床多次给药给患者造成的痛苦，提高患者依从性。此外，其可与其他纳米体系共同组装成复合纳米制剂，通过联合不同抗肿瘤药物从而增强抗肿瘤效果，并可连接RGD多肽、F3肽和叶酸等主动靶向配体，实现纳米制剂对肿瘤部位的主动靶向性。
技术方案：本发明所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂，以疏水性羧酸类小分子抗肿瘤药物为基础，通过席夫碱反应得到酸敏感键，再通过酯化反应与羧酸类小分子的羧基偶联，最后通过点击反应与叠氮化肝素类多糖连接，得到基于点击反应的pH响应型偶联物，进而制备得到基于点击反应的pH响应型纳米制剂。
该pH响应型纳米制剂具有酸敏感性。
所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂其本身具有抗肿瘤活性，并物理包载疏水性抗肿瘤药物，得到物理载药pH响应型纳米制剂。
所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂，疏水性抗肿瘤药物包含破坏DNA结构和功能药物、影响核酸生成药物、作用于核酸转录药物、作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂、作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物、肿瘤脂质代谢干扰药物、光敏剂、抗血管生成药物；其中，破坏DNA结构和功能药物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、顺铂和卡铂；影响核酸生成药物包括5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤和6-巯嘌呤；作用于核酸转录药物包括阿霉素、表阿霉素和吡柔比星；作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂包括羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康；作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物包括长春新碱、紫杉醇和多西紫杉醇；肿瘤脂质代谢干扰药物包括阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、美洛昔康、塞来昔布和罗非昔布；光敏剂包括血卟啉单甲醚、苯并卟啉衍生物单酸环A、四间-羟基苯基二氢卟酚、初红紫素、竹红菌素、酞菁铝、酞菁锌、得克萨卟啉和金丝桃素；抗血管生成药物包括瑞戈非尼、阿帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。
所述的疏水性羧酸类小分子抗肿瘤药物包括藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤及苯丁酸氮芥；所述的肝素类多糖包括未分级肝素、低分子量肝素及脱硫酸化肝素。
所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的制备方法，其所述基于点击反应的pH响应型偶联物的制备包括如下步骤：
(1)将含有游离醛基和游离羧基的连接臂、含有游离羟基和游离炔基的连接臂溶于有机溶剂，冷却至0℃，加入活化剂，控制反应条件至反应完全，经柱层析分离纯化得到中间体I；
(2)将中间体I和含有游离氨基和游离羟基的连接臂溶于有机溶剂，惰性气体保护反应，控制反应条件至反应完全，减压蒸除溶剂，得到中间体II；
(3)将中间体II、羧酸类化合物溶于有机溶剂，0℃条件下加入活化剂，控制反应条件至反应完全，减压蒸除溶剂，得到中间体III；
(4)将叠氮化肝素类多糖溶于溶剂中，加入溶剂溶解的中间体III，在惰性气体保护下，加入碘化亚铜或五水硫酸铜和适量还原剂；控制反应条件至反应完全，使用离心或过滤除去不溶物后，用沉淀剂沉淀；通过收集沉淀的方法收集沉淀，加水复溶透析，采用干燥方法除去水分，即得基于点击反应的pH响应型偶联物。
步骤(1)中所述的含有游离醛基和游离羧基的连接臂包括对醛基苯甲酸、乙醛酸和邻醛基苯甲酸；所述的含有游离羟基和游离炔基的连接臂包括炔丙醇、3-丁炔-1-醇和炔雌醇；所述的含有游离羟基和游离炔基的连接臂与含有游离醛基和游离羧基的连接臂的摩尔比为1～5:1；所述的活化剂选自N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺；所述的活化剂与含有游离醛基和游离羧基的连接臂的摩尔比为1～5:1；所述的有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺中一种或几种的混合体系；
步骤(2)中所述的含有游离氨基和游离羟基的连接臂包括对氨基苄醇、对氨基苯乙醇和邻氨基苄醇；所述的含有游离氨基和游离羟基的连接臂是指其与中间体I的摩尔比为1～5:1；所述的有机溶剂包括乙醇、二氯甲烷和甲醇中一种或几种的混合体系；
步骤(3)中所述的羧酸类化合物包括藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤和苯丁酸氮芥；所述的羧酸类化合物与中间体II的摩尔比为1～5:1；所述的活化剂包括N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺；所述的活化剂是指其与中间体II的摩尔比为1～5:1；所述的有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇和甲醇中一种或几种的混合体系；
步骤(4)中所述的肝素类多糖选自未分级肝素、低分子量肝素和脱硫酸化肝素；所述的肝素类多糖与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的有机溶剂包括甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和甲醇中一种或几种的混合体系；所述的碘化亚铜与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的五水硫酸铜与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的还原剂包括抗坏血酸、氢化铝锂和硼氢化钠；所述的还原剂与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的沉淀剂为冰丙酮或冰乙醇；所述的收集沉淀的方法为离心或减压抽滤；所述的干燥方法包括真空干燥或冷冻干燥；
所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的制备方法，包括以下两种工艺：
工艺I：将基于点击反应的pH响应型偶联物与水按重量比(mg/mg)3～50:1000的比例混合制成溶液；将疏水性抗肿瘤药物用有机溶剂溶解；将抗肿瘤药物溶液缓慢滴加到基于点击反应的pH响应型偶联物溶液中，搅拌1～3h后，冰浴条件下探头超声10～40min；除去未反应小分子和有机溶剂，除去水分，即得物理载药pH响应型纳米制剂；
工艺II：将基于点击反应的pH响应型偶联物与水按重量比(mg/mg)3～50:1000的比例混合制成溶液；将疏水性抗肿瘤药物用有机溶剂溶解；将抗肿瘤药物溶液加入基于点击反应的pH响应型偶联物溶液中，冰浴条件下探头超声10～40min，室温条件下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，采用离心法除去未反应小分子，过0.8μm水系滤膜，后采用真空干燥或冷冻干燥除去水分，即得物理载药pH响应型纳米制剂。
工艺I和工艺II中疏水性抗肿瘤药物与基于点击反应的pH响应型偶联物的质量比(mg/mg)为1:2～10；工艺I中所述的有机溶剂选自甲醇和乙醇；工艺I中有机溶剂与水的体积比为1:2～10；工艺II中所述的有机溶剂选自二氯甲烷和乙醚；工艺II中有机溶剂与水的体积比为1:2～10。
所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的制备及其相应物理载药纳米制剂的实现，其具体实施方案如下：
一、基于点击反应的pH响应型偶联物的制备
(1)将含有游离醛基和游离羧基的连接臂、适量含有游离羟基和游离炔基的连接臂溶于适量适当有机溶剂，冷却至0℃，加入适量活化剂，控制反应条件至反应完全，经柱层析分离纯化得到中间体I；
合成路线如下：
(CHO-R1-COOH：对醛基苯甲酸、乙醛酸和邻醛基苯甲酸；HO-R2-≡：炔丙醇、3-丁炔-1-醇和炔雌醇；活化剂：N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺)
(2)将中间体I和适量含有游离氨基和游离羟基的连接臂溶于适量适当有机溶剂，惰性气体保护反应，控制反应条件至反应完全，旋干除去有机溶剂，得到中间体II；
合成路线如下：
CHO-R1-COO-R2-≡+NH2-R3-OH→≡-R2-COO-R1-C＝N-R3-OH
(NH2-R3-OH：对氨基苄醇、对氨基苯乙醇和邻氨基苄醇)
(3)将中间体II、适量羧酸类化合物溶于适当有机溶剂，0℃条件下加入适量活化剂，控制反应条件至反应完全，减压蒸除溶剂，得到中间体III；
合成路线如下：
(R4-COOH：藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤和苯丁酸氮芥；活化剂：N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺)
(4)将叠氮化肝素类多糖溶于适量适当溶剂中，加入适量适当溶剂溶解的适量中间体III，在惰性气体保护下，加入适量碘化亚铜或五水硫酸铜和适量还原剂；控制反应条件至反应完全，使用离心或过滤除去不溶物后，用适量适当沉淀剂沉淀；通过收集沉淀的方法收集沉淀，加水复溶透析，采用适当干燥方法除去水分，即得基于点击反应的pH响应型偶联物。
(还原剂：抗坏血酸、氢化铝锂和硼氢化钠；R5：叠氮化未分级肝素、叠氮化低分子量肝素和叠氮化脱硫酸化肝素)
上述步骤(1)中所述的含有游离醛基和游离羧基的连接臂包括对醛基苯甲酸、乙醛酸和邻醛基苯甲酸；所述的含有游离羟基和游离炔基的连接臂包括炔丙醇、3-丁炔-1-醇和炔雌醇；所述的适量含有游离羟基和游离炔基的连接臂是指其与含有游离醛基和游离羧基的连接臂的摩尔比为1～5:1；所述的活化剂选自N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺；所述的适量活化剂是指其与含有游离醛基和游离羧基的连接臂的摩尔比为1～5:1；所述的适当有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺中一种或几种的混合体系；
上述步骤(2)中所述的含有游离氨基和游离羟基的连接臂包括对氨基苄醇、对氨基苯乙醇和邻氨基苄醇；所述的适量含有游离氨基和游离羟基的连接臂是指其与中间体I的摩尔比为1～5:1；所述的适当有机溶剂包括乙醇、二氯甲烷和甲醇中一种或几种的混合体系；
上述步骤(3)中所述的羧酸类化合物包括藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤和苯丁酸氮芥；所述的适量羧酸类化合物是指其与中间体II的摩尔比为1～5:1；所述的活化剂包括N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺；所述的适量活化剂是指其与中间体II的摩尔比为1～5:1；所述的适当有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇和甲醇中一种或几种的混合体系；
上述步骤(4)中所述的肝素类多糖选自未分级肝素、低分子量肝素和脱硫酸化肝素；所述的肝素类多糖与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的适当有机溶剂包括甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和甲醇中一种或几种的混合体系；所述的适量碘化亚铜是指其与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的适量五水硫酸铜是指其与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的还原剂包括抗坏血酸、氢化铝锂和硼氢化钠；所述的适量还原剂是指其与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的适当沉淀剂为冰丙酮或冰乙醇；所述的收集沉淀的方法为离心或减压抽滤；所述的适当干燥方法包括真空干燥或冷冻干燥。
二、基于物理载药pH响应型纳米制剂的制备
工艺I：将基于点击反应的pH响应型偶联物与水按重量比(mg/mg)3～50:1000的比例混合制成溶液；将疏水性抗肿瘤药物用有机溶剂溶解；将抗肿瘤药物溶液缓慢滴加到基于点击反应的pH响应型偶联物溶液中，搅拌1～3h后，冰浴条件下探头超声10～40min；除去未反应小分子和有机溶剂，除去水分，即得物理载药pH响应型纳米制剂；
工艺II：将基于点击反应的pH响应型偶联物与水按重量比(mg/mg)3～50:1000的比例混合制成溶液；将疏水性抗肿瘤药物用有机溶剂溶解；将抗肿瘤药物溶液加入基于点击反应的pH响应型偶联物溶液中，冰浴条件下探头超声10～40min，室温条件下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，采用离心法除去未反应小分子，过0.8μm水系滤膜，后采用真空干燥或冷冻干燥除去水分，即得物理载药pH响应型纳米制剂。
工艺I和工艺II中所述的疏水性抗肿瘤药物，疏水性抗肿瘤药物与基于点击反应的pH响应型偶联物的质量比(mg/mg)为1:2～10；工艺I中所述的有机溶剂选自甲醇和乙醇；工艺I中所述的有机溶剂，有机溶剂与水的体积比为1:2～10；工艺II中所述的有机溶剂选自二氯甲烷和乙醚；工艺II中所述的有机溶剂，其与水的体积比为1:2～10。
疏水性抗肿瘤药物包含破坏DNA结构和功能药物、影响核酸生成药物、作用于核酸转录药物、作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂、作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物、肿瘤脂质代谢干扰药物、光敏剂、抗血管生成药物；其中，破坏DNA结构和功能药物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、顺铂和卡铂；影响核酸生成药物包括5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤和6-巯嘌呤；作用于核酸转录药物包括阿霉素、表阿霉素和吡柔比星；作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂包括羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康；作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物包括长春新碱、紫杉醇和多西紫杉醇；肿瘤脂质代谢干扰药物包括阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、美洛昔康、塞来昔布和罗非昔布；光敏剂包括血卟啉单甲醚、苯并卟啉衍生物单酸环A、四间-羟基苯基二氢卟酚、初红紫素、竹红菌素、酞菁铝、酞菁锌、得克萨卟啉和金丝桃素；抗血管生成药物包括瑞戈非尼、阿帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。
本发明相对于现有技术具有如下的优点：
(1)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂在肿瘤部位降解后可进一步重排得到羧酸分子原型，不会影响羧酸类化合物的抗肿瘤活性。一般化学结合得到的偶联物降解后，羧酸类小分子端连接有降解残基，使得化合物分子结构发生改变，从而使羧酸类小分子的抗肿瘤活性降低甚至使其失活。在肿瘤微酸性条件下，此发明中两亲性偶联物中席夫碱键断裂，得到羧酸小分子衍生物，其进一步在过氧化氢作用下发生醌甲基重排，消除稳定的醌甲基结构，从而得到羧酸小分子原型，保证羧酸类化合物的抗肿瘤作用不受影响。
(2)本发明首先解决了席夫碱键在纯化过程中不稳定的问题。由于席夫碱键具有酸敏感性，在过柱纯化过程中易被酸性硅胶柱分解，因此，利用透析法除去未反应小分子进行纯化，简便易行，避免了酸性硅胶柱对席夫碱键的破坏，大大提高了羧酸小分子的接枝率。同时，本发明利用叠氮基团与炔基进行点击反应，其反应简单且产率高，有助于提高羧酸小分子的接枝率，从而增强其肿瘤杀伤作用。
(3)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂具有协同抗肿瘤作用。肝素类多糖具有抗血管生成作用，而羧酸小分子兼有促肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞转移的作用，共价结合后两种药物共同递送至肿瘤部位，能够实现协同肿瘤治疗作用。
(4)本发明中，疏水性羧酸小分子与肝素类多糖的羧基共价结合后，很好地解决了羧酸小分子在体内水溶性差和血管刺激性强的问题，从而为临床静脉给药创造了条件。而肝素类多糖修饰后的羧酸分子作为两亲性共聚物，在水性环境中会受到疏水作用驱动，形成以羧酸类小分子为疏水核心、肝素类多糖为亲水外层的两亲性偶联物纳米粒，极大地改善了疏水性羧酸类小分子的水溶性和刺激性，便于其在静脉注射给药中发挥作用。
(5)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂在体内能够实现长循环，从而更多的富集于肿瘤组织，增强抗肿瘤作用。由于作为亲水外层的肝素类多糖生物相容性好，基于点击反应的pH响应型纳米制剂不易被网状吞噬系统清除，在血液循环中稳定性较高，更多的纳米粒可利用EPR效应被动富集于肿瘤组织，提高抗肿瘤作用，同时降低对正常组织的毒副作用。
(6)本发明中得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂能有效降低抗肿瘤药物的毒副作用。由于此纳米递药体系具有长循环作用，具有被动靶向作用，且具有酸敏感性，使得药物最大程度富集于肿瘤组织并在肿瘤部位释放，大大降低了药物对于正常组织的毒副作用。同时，具有强刺激性的羧酸类衍生物位于疏水核心，避免了药物对于胃肠道和血管等的刺激。
(7)本发明中，利用含有游离氨基的叠氮化物盐酸盐连接臂的氨基与肝素类多糖的羧基共价结合，提高了静脉注射给药的安全性。肝素类多糖的羧基具有抗凝血作用，通过化学反应占据肝素类多糖的游离羧基，降低了肝素类多糖在全身给药中的抗凝血作用，有效提高了肝素多糖在静脉注射给药过程中的安全性。
(8)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可通过π-π堆积作用、疏水驱动作用和静电作用等分子间作用物理包载疏水性抗血管生成药物、光敏剂及细胞毒药物等，能够解决疏水性药物水溶性差、易被机体代谢及靶向性差的问题，并在原有肿瘤杀伤效果的基础上，实现协同抗肿瘤效果。同时，多种抗肿瘤药物联合于同一纳米体系中，可减少临床注射次数及剂量，能够有效减轻临床多次给药给患者造成的痛苦，提高患者依从性。
(9)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可与其他纳米体系共同组装成复合纳米制剂，通过联合不同抗肿瘤药物从而增强抗肿瘤效果，同时可有效减少临床注射次数，提高患者依从性。
(10)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可连接RGD多肽、F3肽和叶酸等靶向配体，实现纳米制剂对肿瘤部位的主动靶向性，靶向性纳米制剂可更多富集于肿瘤组织，增强纳米制剂对肿瘤组织的杀伤作用。在提高疗效的同时，其可减少抗肿瘤药物的给药剂量与给药次数，降低对正常组织的毒性作用。
(11)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可与其他药剂学可接受辅料配伍，制备成注射、口服等多途径给药的剂型，具有良好的应用前景。
有益效果：(1)本发明中得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂能够在肿瘤部位特异性释放。纳米药物到达肿瘤组织酸性微环境后，席夫碱键断裂，疏水性抗肿瘤药物释放出来，不仅可以降低对正常组织的毒性作用，增强对肿瘤组织的杀伤作用，而且能够改善耐药性等问题，为其临床应用奠定基础。(2)该基于点击反应的pH响应型纳米制剂在肿瘤部位降解后，可进一步重排得到羧酸分子原型，有效避免羧酸类小分子抗肿瘤药物连接其它基团后降低其活性或使其失活。(3)本发明利用叠氮基团与炔基进行点击反应，反应简单可行且绿色环保，此外，其反应条件温和、产率高、反应立体选择性强、产物易分离且对水和氧气不敏感。(4)肝素类多糖的羧基被叠氮化物盐酸盐连接臂的游离氨基占据，有效降低了肝素类多糖的抗凝作用，提高了静脉给药安全性。(5)基于点击反应的pH响应型偶联物为两亲性偶联物，在水性环境中可以通过自组装得到以疏水性羧酸小分子为疏水核心、以肝素类多糖为亲水外层的纳米递药系统。(6)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂具有协同抗肿瘤作用。肝素类多糖具有抗血管生成作用，而羧酸类小分子兼有促肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞转移的作用，经共价结合后二者共同递送至肿瘤部位，能够实现协同抗肿瘤作用。(7)基于点击反应的pH响应型偶联物通过π-π堆积作用、疏水驱动作用和静电作用等分子间作用，可用于包载疏水性药物，解决药物在体内水溶性差和刺激性强等问题。(8)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂在体内具有长循环作用，从而能够富集于肿瘤组织，增强抗肿瘤作用。(9)本发明采用透析法除去反应物与反应中间体，解决了席夫碱类化合物在柱分离纯化过程中不稳定的问题，此法简便易行，大大提高了反应产率。(10)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可物理包载疏水性抗血管生成药物、光敏剂及细胞毒药物等，能够改善疏水性药物溶解性，增强肿瘤杀伤效果，实现体内长循环作用，提高肿瘤患者依从性。(11)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可与其他纳米体系共同组装成复合纳米制剂，增强抗肿瘤效果，减少临床注射次数，提高患者依从性。(12)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可连接RGD多肽、F3肽和叶酸等靶头，使纳米制剂可更多富集于肿瘤组织，增强纳米制剂对肿瘤组织的杀伤作用。(13)本发明得到的基于点击反应的pH响应型纳米制剂可与其他药剂学可接受辅料配伍，制备成注射、口服等多途径给药的剂型，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步说明，但下述实施例并不限制本专利权利范围。
实施例1：藤黄酸-脱硫酸化肝素衍生偶联物的制备
称取对醛基苯甲酸、炔丙醇和N,N-二甲基-4-吡啶胺置于茄形瓶中，炔丙醇与对醛基苯甲酸的摩尔比为1.2:1，N,N-二甲基-4-吡啶胺与对醛基苯甲酸的摩尔比为1:1，溶于20mL二氯甲烷中，将混合物用橡胶塞封口，冷却至0℃，并在该温度下搅拌10min，加入DCC，DCC与对醛基苯甲酸的摩尔比为1.5:1，使混合物升温至室温，反应过夜。采用TLC监测反应完全程度，反应完全后，抽滤除去DCC，减压蒸除溶剂二氯甲烷，加适量硅胶于30℃制砂，经柱层析分离纯化得中间体I。
称取中间体I和对氨基苄醇置于茄形瓶中，对氨基苄醇与中间体I的摩尔比为1.5:1，溶于2mL乙醇，N2保护下，室温反应6h。TLC监测反应完全程度，反应完全后，得到中间体II。
称取中间体II、藤黄酸和N,N-二甲基-4-吡啶胺置于茄形瓶中，藤黄酸与中间体II的摩尔比为1.2:1，N,N-二甲基-4-吡啶胺与中间体II的摩尔比为1:1，溶于2mL二氯甲烷中，0℃下加入DCC，DCC与中间体II的摩尔比为1.5:1，室温反应24h。TLC监测反应完全程度。反应完成后过滤DCC，减压蒸除溶剂，得到中间体III。
称取叠氮化脱硫酸化肝素加入1mL甲酰胺中，60℃溶解15min，降至室温后，滴加入2mL甲醇溶解的中间体III中，叠氮化脱硫酸化肝素与中间体III的摩尔比为1:1，N2保护下，加入五水硫酸铜和抗坏血酸，五水硫酸铜与中间体III的摩尔比为1:2，抗坏血酸与中间体III的摩尔比为1:4，室温下搅拌24h。停止反应后，加入22mL冰丙酮沉淀产物，3000rpm离心5min，产物用纯水复溶，在纯水中透析48h后，3000rpm离心5min，过0.8μm水系滤膜，冷冻干燥，即得pH响应型藤黄酸-脱硫酸化肝素衍生偶联物。
实施例2：新藤黄酸-低分子量肝素衍生偶联物的制备
称取乙醛酸、3-丁炔-1-醇、N,N-二异丙基乙胺和4-吡咯烷基吡啶置于茄形瓶中，3-丁炔-1-醇与乙醛酸的摩尔比为2:1，N,N-二异丙基乙胺与乙醛酸的摩尔比为3:1，4-吡咯烷基吡啶与乙醛酸的摩尔比为2:1，溶于20mL乙醇中，将混合物用橡胶塞封口，冷却至0℃，并在该温度下搅拌10min，加入DCC，DCC与乙醛酸的摩尔比为1.5:1，使混合物升温至室温，反应过夜。采用TLC监测反应完全程度，反应完全后，抽滤除去DCC，减压蒸除溶剂乙醇，加适量硅胶于30℃制砂，经柱层析分离纯化得中间体I。
称取中间体I和对氨基苯乙醇置于茄形瓶中，对氨基苯乙醇与中间体I的摩尔比为1.2:1，溶于2mL二氯甲烷，N2保护下，室温下搅拌6h。TLC监测反应完全程度，反应完全后，得到中间体II。
称取中间体II、新藤黄酸和4-吡咯烷基吡啶置于茄形瓶中，新藤黄酸与中间体II的摩尔比为1.8:1，4-吡咯烷基吡啶与中间体II的摩尔比为1.2:1，溶于2mL乙醇中，0℃下加入DCC，DCC与中间体II的摩尔比为1.5:1，室温下反应24h。TLC监测反应完全程度。反应完成后过滤DCC，减压蒸除溶剂，得到中间体III。
称取叠氮化低分子量肝素加入1mL N,N-二甲基甲酰胺中，60℃溶解15min，降至室温后，滴加入3mL N,N-二甲基甲酰胺溶解的中间体III中，叠氮化低分子量肝素与中间体III的摩尔比为1:1，N2保护下，加入碘化亚铜和氢化铝锂，碘化亚铜与中间体III的摩尔比为1:4，氢化铝锂与中间体III的摩尔比为1:3，室温下搅拌24h。停止反应后，加入20mL冰乙醇沉淀产物，减压抽滤，真空干燥，即得pH响应型新藤黄酸-低分子量肝素衍生偶联物。
实施例3：熊果酸-未分级肝素衍生偶联物的制备
称取邻醛基苯甲酸、炔雌醇和1-羟基苯并三唑置于茄形瓶中，炔雌醇与邻醛基苯甲酸的摩尔比为1.5:1，1-羟基苯并三唑与邻醛基苯甲酸的摩尔比为1.5:1，溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺中，将混合物用橡胶塞封口，冷却至0℃，并在该温度下搅拌10min，加入DCC，DCC与邻醛基苯甲酸的摩尔比为1.5:1，使混合物升温至室温，反应过夜。采用TLC监测反应完全程度，反应完全后，抽滤除去DCC，减压蒸除溶剂N,N-二甲基甲酰胺，加适量硅胶于30℃制砂，经柱层析分离纯化得中间体I。
称取中间体I和邻氨基苄醇置于茄形瓶中，邻氨基苄醇与中间体I的摩尔比为1.8:1，溶于2mL甲醇，N2保护下，室温下搅拌6h。TLC监测反应完全程度，反应完全后，得到中间体II。
称取中间体II、熊果酸和1-羟基苯并三唑置于茄形瓶中，熊果酸与中间体II的摩尔比为2:1，1-羟基苯并三唑与中间体II的摩尔比为1:1，溶于2mL甲醇中，0℃下加入DCC，DCC与中间体II的摩尔比为1.5:1，室温下反应24h。TLC监测反应完全程度。反应完成后过滤DCC，减压蒸除溶剂，得到中间体III。
称取叠氮化未分级肝素加入0.5mL甲酰胺中，60℃溶解15min，降至室温后，滴加入1.5mL二甲基亚砜溶解的中间体III中，叠氮化未分级肝素与中间体III的摩尔比为1:1，N2保护下，加入五水硫酸铜和抗坏血酸，五水硫酸铜与中间体III的摩尔比为1:1，抗坏血酸与中间体III的摩尔比为1:2，室温下搅拌24h。停止反应后，加入12mL冰丙酮沉淀产物，3000rpm离心5min，产物用纯水复溶，在纯水中透析48h后，3000rpm离心5min，过0.8μm水系滤膜，冷冻干燥，即得pH响应型熊果酸-未分级肝素衍生偶联物。
实施例4：苯达莫斯汀-低分子量肝素衍生偶联物的制备
称取对醛基苯甲酸、炔丙醇和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐置于茄形瓶中，炔丙醇与对醛基苯甲酸的摩尔比为3:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与对醛基苯甲酸的摩尔比为2:1，溶于20mL二氯甲烷中，将混合物用橡胶塞封口，冷却至0℃，并在该温度下搅拌10min，加入DCC，DCC与对醛基苯甲酸的摩尔比为1.5:1，使混合物升温至室温，反应过夜。采用TLC监测反应完全程度，反应完全后，抽滤除去DCC，减压蒸除溶剂二氯甲烷，加适量硅胶于30℃制砂，经柱层析分离纯化得中间体I。
称取中间体I和对氨基苄醇置于茄形瓶中，对氨基苄醇与中间体I的摩尔比为1.5:1，溶于2mL乙醇，N2保护下，室温下搅拌6h。TLC监测反应完全程度，反应完全后，得到中间体II。
称取中间体II、藤黄酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐置于茄形瓶中，藤黄酸与中间体II的摩尔比为3:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与中间体II的摩尔比为1.5:1，溶于2mL甲醇中，0℃下加入DCC，DCC与中间体II的摩尔比为1.5:1，室温下反应24h。TLC监测反应完全程度。反应完成后过滤DCC，减压蒸除溶剂得到中间体III。
称取叠氮化脱硫酸化肝素加入1mL甲酰胺中，60℃溶解15min，降至室温后，滴加入3mL N,N-二甲基甲酰胺溶解的中间体III中，叠氮化脱硫酸化肝素与中间体III的摩尔比为1:1，N2保护下，加入五水硫酸铜和硼氢化钠，五水硫酸铜与中间体III的摩尔比为1:5，硼氢化钠与中间体III的摩尔比为1:5，室温下搅拌24h。停止反应后，加入32mL冰丙酮沉淀产物，3000rpm离心5min，产物用纯水复溶，在纯水中透析48h后，3000rpm离心5min，过0.8μm水系滤膜，冷冻干燥，即得pH响应型肝素-藤黄酸衍生偶联物。
实施例5：载环磷酰胺的甲氨喋呤-未分级肝素衍生纳米制剂的制备
称取适量环磷酰胺溶于适量甲醇，称取适量甲氨喋呤-未分级肝素衍生纳米制剂溶于超纯水，室温搅拌30min，将环磷酰胺的甲醇溶液以5秒每滴的速度逐滴滴入甲氨喋呤-未分级肝素衍生偶联物溶液中，继续搅拌2h。环磷酰胺与甲氨喋呤-未分级肝素衍生纳米制剂的质量比为1:3。混合后冰浴下探头超声20min，除去小分子和有机溶剂，真空干燥，即得载环磷酰胺的甲氨喋呤-未分级肝素衍生纳米制剂。
实施例6：载阿霉素的甲氨喋呤-低分子量肝素衍生纳米制剂的制备
称取适量阿霉素溶于乙醇，称取适量甲氨喋呤-低分子量肝素衍生纳米制剂溶于超纯水，室温下搅拌30min，将阿霉素的乙醇溶液逐滴滴入。阿霉素与甲氨喋呤-低分子量肝素衍生纳米制剂的质量比为1:2。滴加速率为每分钟4滴，继续搅拌1.5h。冰浴条件下探头超声40min，转入透析袋，透析48h，过0.8μm水系滤膜，冷冻干燥，即得载阿霉素的甲氨喋呤-低分子量肝素衍生纳米制剂。
实施例7：载顺铂的苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂的制备
称取适量顺铂溶于二氯甲烷，称取适量苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素溶于超纯水。顺铂与苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂的质量比为1:5。冰浴下探头超声30min，室温下敞口搅拌过夜以除去有机溶剂。于4000rpm离心5min除去不溶性小分子，过0.8μm水系滤膜，冷冻干燥，即得载顺铂的苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂。
实施例8：苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素与甲氨喋呤-低分子量肝素复合纳米制剂的制备
称取适量苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素与甲氨喋呤-低分子量肝素溶于超纯水苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素与甲氨喋呤-低分子量肝素的质量比为1:1，搅拌1h，于4000rpm离心5min除去不溶性小分子，过0.8μm水系滤膜，冷冻干燥，即得苯丁酸氮芥-脱硫酸化肝素与甲氨喋呤-低分子量肝素复合纳米制剂。
实施例9：连接有F3肽靶头的苯达莫斯汀-低分子量肝素纳米制剂的制备
称取适量苯达莫斯汀-低分子量肝素加入1mL甲酰胺中，60℃溶解15min，降至室温后，滴加入1mL二甲基亚砜溶解的F3肽中，F3肽与苯达莫斯汀-低分子量肝素的质量比为8:1，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与苯达莫斯汀-低分子量肝素的质量比为10:1，N-羟基琥珀酰亚胺与苯达莫斯汀-低分子量肝素的质量比为10:1，室温下搅拌24h，停止反应后，加入16mL冰丙酮沉淀产物，3000rpm离心5min，产物用纯水复溶，在纯水中透析24h后，3000rpm离心5min，过0.8μm水系滤膜，冷冻干燥，即得连接有F3肽靶头的苯达莫斯汀-低分子量肝素纳米制剂。
实施例10：荧光分光光度计法评价基于点击反应的pH响应型纳米制剂的临界胶束浓度
配制浓度为6×10-6moL/L的芘溶液，分别取1mL芘溶液置于11个容量瓶中，挥干溶剂后分别加入纳米制剂水溶液，使其终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100.0、400.0、1000.0和2000.0μg/mL。水浴超声30min，于70℃下加热1h，冷却至室温，避光保存一晚。将发射波长设置为390nm，激发与发射狭缝宽度均为1.5nm。测量激发光谱的I338和I333，以其比值对纳米粒的对数浓度作散点图，两线交叉处即为CMC值。
表1基于点击反应的pH响应型纳米制剂的临界胶束浓度
实施例11：基于点击反应的pH响应型纳米制剂的溶解度
考察溶解度的方法：分别称取1mg疏水性羧酸小分子药物、基于点击反应的pH响应型偶联物或包载抗肿瘤药物的pH响应型纳米制剂溶于1mL水中。室温下每隔5min振荡30s，观察30min内能否溶解完全。如表2所示，将疏水性羧酸小分子共价连接到叠氮化肝素类多糖后，其在水中的溶解性得到显著提高，此外，包载于纳米制剂中的疏水性抗肿瘤药物的疏水性也得到提高。
表2基于点击反应的pH响应型纳米制剂的溶解度
注：“-”几乎不溶，“+”可溶，“++”易溶。
实施例12：基于点击反应的pH响应型偶联物固体和溶液状态的放置稳定性
将新藤黄酸-脱硫酸化肝素衍生偶联物在室温下储存，分别于0天、20天取1mg偶联物溶于1mL水中，测定其粒径及多分散系数(PDI)，以评价pH响应型新藤黄酸-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂的放置稳定性。如表3所示，固体状态pH响应型新藤黄酸-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂在室温下放置稳定性良好。
称取1mg苯达莫斯汀-脱硫酸化肝素衍生偶联物，溶于1mL纯水，分别于0h、24h和48h测定其粒径和PDI，借此评价pH响应型苯达莫斯汀-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂溶液的放置稳定性。如表4所示，此纳米制剂在溶液中稳定性良好。
表3新藤黄酸-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂(固体状态)的放置稳定性
表4苯达莫斯汀-脱硫酸化肝素衍生纳米制剂(溶液状态)的放置稳定性
实施例13：基于点击反应的pH响应型纳米制剂的接枝率
接枝率检测方法：采用紫外可见分光光度法，测定疏水性羧酸小分子最大吸收波长处的吸光度，按照公式(1)计算接枝率，其中m1为疏水性羧酸小分子的含量(g)；m2为称取的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的质量(g)，M1为疏水性羧酸小分子的平均分子量，M2为叠氮化肝素类多糖的平均分子量。结果见表5。
载药量检测方法：采用紫外分光光度法，测定疏水性羧酸小分子最大吸收波长处的吸光度，按照公式(2)计算载药量，结果见表5。
表5基于点击反应的pH响应型纳米制剂的接枝率和载药量
实施例14：高效液相法检测pH响应型低分子量肝素-藤黄酸衍生纳米制剂的体外释放行为
精密称取2mg、2mg低分子量肝素-藤黄酸衍生偶联物，分别溶于2mL pH 7.4磷酸盐缓冲液和2mL pH 4.5磷酸盐缓冲液中，得到浓度为1mg/mL的低分子量肝素-藤黄酸衍生偶联物溶液。在37℃条件下振荡，于4h、8h、24h和48h分别取300μL溶液，加入2.7mL色谱甲醇，超声30min以破坏纳米粒结构，随后将处理的溶液加入至超滤管(MWCO＝3000)中，10000rpm离心30min，取0.5mL滤液，采用0.22μm有机滤膜进行过滤，进行HPLC分析，计算降解分数。
表6低分子量肝素-藤黄酸偶联物纳米制剂的酸敏感性考察
表7pH4.5组低分子量肝素-藤黄酸偶联物纳米制剂降解情况
pH 4.5组低分子量肝素-藤黄酸偶联物纳米制剂的降解分数显著大于pH 7.4组，说明其具有酸敏感性。进一步考察pH 7.4及pH 4.5组降解产物藤黄酸衍生物及藤黄酸所占百分比，二者比例呈互补趋势，表明低分子量肝素-藤黄酸偶联物先降解为藤黄酸衍生物，随后发生重排得到终产物藤黄酸。
实施例15：MTT法检测基于点击反应的pH响应型纳米制剂对小鼠黑色素瘤(B16F10)细胞的抑制作用
B16F10细胞用不同pH DMEM培养基于37℃、5％CO2的条件下培养，将细胞密度稀释至5×104个/mL，接种于96孔板上，每孔加入100μL，将培养板转入培养箱中继续培养24h。弃培养基，用PBS清洗，分别加入200μL用培养基稀释过的不同浓度基于点击反应的pH响应型纳米制剂(n＝6)，继续培养48h后，每孔加入40μL四甲基偶氮唑蓝(2.5mg/mL)进行染色，继续培养4h，弃去培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜溶解，于摇床上振荡10min使结晶物充分溶解；在λ＝490nm波长处测定各制剂组吸光度，通过酶标仪读出每孔的样品吸光度，按公式(3)计算B16F10细胞存活率，利用SPSS软件计算其对B16F10肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)。
表8基于点击反应的pH响应型纳米制剂对B16F10细胞的抑制活性
肝素与羧酸小分子物理混合组在pH 7.4和pH 6.5时的细胞毒性无显著性差异。而基于点击反应的pH响应型纳米制剂在pH 6.5条件下的细胞毒性显著高于pH 7.4组。
实施例16：基质胶实验评价基于点击反应的pH响应型纳米制剂的体内抗血管生成作用
将基质胶置于4℃冰箱中融化过夜，将500μL基质胶与12.5μL bFGF分别加入125μL纳米粒(肝素类多糖浓度为5mg/mL,羧酸小分子浓度为0.8mg/mL)用作纳米制剂组，物理混合组操作同上。基质胶在常温下易凝固，操作应在冰上进行。将基质胶皮下注射给6周雄性小鼠，10s后拔出针头，10天后处死小鼠，采用Drabkin试剂盒定量血红蛋白，以考察基质胶内血管生成情况，分别加入2mL低渗裂解缓冲液，匀浆后于10000rpm离心10min，取1.5mL上清液加2mL Drabkin’s试剂，轻轻混匀后于室温孵育15min，以Drabkin’s试剂作为空白，测定各组540nm波长下的吸光度值，将阳性对照组光度值为A100％，阴性对照组吸光度值记为A0％，按公式(4)计算相对血红蛋白含量。
表9基于点击反应的pH响应型纳米制剂的相对血红蛋白含量
采用Matrigel plug实验考察基于点击反应的pH响应型纳米制剂对体内血管生成的影响，与物理混合组相比，二者共价偶联后得到的纳米制剂组相对血红蛋白含量显著降低，说明其具有更强的抗血管生成作用。
实施例17：APTT法检测基于点击反应的pH响应型偶联物的抗凝活性
采用活化部分凝血活酶时间(APTT)法检测基于点击反应的pH响应型偶联物的抗凝活性。将血液置于含有10％0.109M枸橼酸钠抗凝液的管中，轻轻混匀，4000rpm离心5min，取上层血浆。将0.1mL浓度为20μg/mL的样品溶液与0.4mL血浆混合，加入0.1mL37℃预温的APTT试剂，0.1mL 37℃预温的氯化钙溶液，记录血浆凝固时间(n＝3)。如表10所示，结果表明羧酸类小分子与叠氮化肝素类多糖共价连接后，凝血时间能缩短至正常范畴内，证明羧酸内小分子的引入能够降低叠氮化肝素类多糖的抗凝活性，增加其静脉注射的安全性。
表10基于点击反应的pH响应型偶联物的抗凝活性
采用APTT法检测基于点击反应的pH响应型纳米制剂的抗凝活性，结果表明肝素组存在出血风险，而与羧酸小分子共价结合后得到的纳米制剂无出血风险，说明羧酸小分子修饰后得到的纳米制剂能够降低出血风险，提高静脉注射的安全性。
实施例18：紫外分光光度计法评价pH响应型低分子量肝素-藤黄酸衍生纳米制剂的溶血风险
称取2mg藤黄酸，配制1mg/mL的GA溶液，分别稀释至0.4、0.2、0.15、0.1、0.06和0.02mg/mL，将等体积0.9％氯化钠注射液与血红细胞悬液混合，记为0％溶血，将等体积纯水与血红细胞悬液混合，记为100％溶血。于37℃水浴孵育1h，3000rpm离心10min，用紫外分光光度法测量各浓度制剂上清液在540nm处的吸光度，减去同浓度样品溶液在540nm处的吸收值，以消除样品溶液自身吸收产生的影响，制剂组与对应样品组的吸收值差值即为Asample，按公式(5)计算样品溶血率(Hemolysis)。
同上，测定低分子量肝素及低分子量肝素-藤黄酸衍生纳米制剂的溶血率，以考察纳米制剂的安全性。
表11低分子量肝素-藤黄酸衍生纳米制剂的溶血风险考察
低分子量肝素组具有一定抑制溶血的作用，游离藤黄酸组的溶血作用较强且具有浓度依赖性，而藤黄酸与低分子量肝素共价偶联得到的纳米制剂在考察浓度范围内溶血率符合正常标准范畴，证明其能降低藤黄酸的溶血风险，为其临床应用提供了前期支持。

Claims (10)

1.一种基于点击反应的pH响应型纳米制剂，其特征在于以疏水性羧酸类小分子抗肿瘤药物为基础，通过席夫碱反应得到酸敏感键，再通过酯化反应与羧酸类小分子的羧基偶联，最后通过点击反应与叠氮化肝素类多糖连接，得到基于点击反应的pH响应型偶联物，进而制备得到基于点击反应的pH响应型纳米制剂。
2.根据权利要求书1所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂，其特征在于该pH响应型纳米制剂具有酸敏感性。
3.根据权利要求书1所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂，其特征在于其本身具有抗肿瘤活性，并物理包载疏水性抗肿瘤药物，得到物理载药pH响应型纳米制剂。
4.根据权利要求书3所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂，其特征在于疏水性抗肿瘤药物包含破坏DNA结构和功能药物、影响核酸生成药物、作用于核酸转录药物、作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂、作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物、肿瘤脂质代谢干扰药物、光敏剂、抗血管生成药物；其中，破坏DNA结构和功能药物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、顺铂和卡铂；影响核酸生成药物包括5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤和6-巯嘌呤；作用于核酸转录药物包括阿霉素、表阿霉素和吡柔比星；作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂包括羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康；作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物包括长春新碱、紫杉醇和多西紫杉醇；肿瘤脂质代谢干扰药物包括阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、美洛昔康、塞来昔布和罗非昔布；光敏剂包括血卟啉单甲醚、苯并卟啉衍生物单酸环A、四间-羟基苯基二氢卟酚、初红紫素、竹红菌素、酞菁铝、酞菁锌、得克萨卟啉和金丝桃素；抗血管生成药物包括瑞戈非尼、阿帕替尼、索拉非尼和舒尼替尼。
5.根据权利要求书1所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂，其特征在于所述的疏水性羧酸类小分子抗肿瘤药物包括藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤及苯丁酸氮芥；所述的肝素类多糖包括未分级肝素、低分子量肝素及脱硫酸化肝素。
6.根据权利要求书1所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的制备方法，其特征在于所述基于点击反应的pH响应型偶联物的制备包括如下步骤：
(1)将含有游离醛基和游离羧基的连接臂、含有游离羟基和游离炔基的连接臂溶于有机溶剂，冷却至0℃，加入活化剂，控制反应条件至反应完全，经柱层析分离纯化得到中间体I；
(2)将中间体I和含有游离氨基和游离羟基的连接臂溶于有机溶剂，惰性气体保护反应，控制反应条件至反应完全，减压蒸除溶剂，得到中间体II；
(3)将中间体II、羧酸类化合物溶于有机溶剂，0℃条件下加入活化剂，控制反应条件至反应完全，减压蒸除溶剂，得到中间体III；
(4)将叠氮化肝素类多糖溶于溶剂中，加入溶剂溶解的中间体III，在惰性气体保护下，加入碘化亚铜或五水硫酸铜和适量还原剂；控制反应条件至反应完全，使用离心或过滤除去不溶物后，用沉淀剂沉淀；通过收集沉淀的方法收集沉淀，加水复溶透析，采用干燥方法除去水分，即得基于点击反应的pH响应型偶联物。
7.根据权利要求书6所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的含有游离醛基和游离羧基的连接臂包括对醛基苯甲酸、乙醛酸和邻醛基苯甲酸；所述的含有游离羟基和游离炔基的连接臂包括炔丙醇、3-丁炔-1-醇和炔雌醇；所述的含有游离羟基和游离炔基的连接臂与含有游离醛基和游离羧基的连接臂的摩尔比为1～5:1；所述的活化剂选自N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺；所述的活化剂与含有游离醛基和游离羧基的连接臂的摩尔比为1～5:1；所述的有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺中一种或几种的混合体系；
步骤(2)中所述的含有游离氨基和游离羟基的连接臂包括对氨基苄醇、对氨基苯乙醇和邻氨基苄醇；所述的含有游离氨基和游离羟基的连接臂是指其与中间体I的摩尔比为1～5:1；所述的有机溶剂包括乙醇、二氯甲烷和甲醇中一种或几种的混合体系；
步骤(3)中所述的羧酸类化合物包括藤黄酸、新藤黄酸、熊果酸、苯达莫斯汀、甲氨喋呤及苯丁酸氮芥；所述的羧酸类化合物与中间体II的摩尔比为1～5:1；所述的活化剂包括N,N-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N,N-二异丙基乙胺；所述的活化剂是指其与中间体II的摩尔比为1～5:1；所述的有机溶剂包括二氯甲烷、乙醇和甲醇中一种或几种的混合体系；
步骤(4)中所述的肝素类多糖选自未分级肝素、低分子量肝素和脱硫酸化肝素；所述的肝素类多糖与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的有机溶剂包括甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和甲醇中一种或几种的混合体系；所述的碘化亚铜与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的五水硫酸铜与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的还原剂包括抗坏血酸、氢化铝锂和硼氢化钠；所述的还原剂与中间体III的摩尔比为1～5:5；所述的沉淀剂为冰丙酮或冰乙醇；所述的收集沉淀的方法为离心或减压抽滤；所述的干燥方法包括真空干燥或冷冻干燥。
8.根据权利要求书3所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的制备方法，其特征在于包括以下两种工艺：
工艺I：将基于点击反应的pH响应型偶联物与水按重量比(mg/mg)3～50:1000的比例混合制成溶液；将疏水性抗肿瘤药物用有机溶剂溶解；将抗肿瘤药物溶液缓慢滴加到基于点击反应的pH响应型偶联物溶液中，搅拌1～3h后，冰浴条件下探头超声10～40min；除去未反应小分子和有机溶剂，除去水分，即得物理载药pH响应型纳米制剂；
工艺II：将基于点击反应的pH响应型偶联物与水按重量比(mg/mg)3～50:1000的比例混合制成溶液；将疏水性抗肿瘤药物用有机溶剂溶解；将抗肿瘤药物溶液加入基于点击反应的pH响应型偶联物溶液中，冰浴条件下探头超声10～40min，室温条件下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，采用离心法除去未反应小分子，过0.8μm水系滤膜，除去水分，即得物理载药pH响应型纳米制剂。
9.根据权利要求书8所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂的制备方法，其特征在于：
工艺I和工艺II中疏水性抗肿瘤药物与基于点击反应的pH响应型偶联物的质量比(mg/mg)为1:2～10；工艺I中所述的有机溶剂选自甲醇和乙醇；工艺I中有机溶剂与水的体积比为1:2～10；工艺II中所述的有机溶剂选自二氯甲烷和乙醚；工艺II中有机溶剂与水的体积比为1:2～10。
10.根据权利要求书1所述的基于点击反应的pH响应型纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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