CN115057922A - 一种小分子—纳米抗体偶联物临近效应的snacip诱导剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小分子—纳米抗体偶联物临近效应的SNACIP诱导剂及其制备方法与应用，属于细胞调控技术领域。临近诱导化学小分子CIP是通过诱导蛋白二聚而调控生物学进程，然而CIP无法直接调控内源的、无配结合位点的蛋白，存在内源蛋白背景活性的干扰，以及难以应用于药物开发等问题。本发明公开的SNACIP由纳米抗体靶头、小分子结合部、胞内递送模组及连接子共四部分组成。其中cRGT通用型诱导剂具有易穿膜、快速、可逆、调控彻底、计量依赖等优点；cRTC型诱导剂能够专一地调控细胞内某内源无序蛋白；双价纳米抗体版本的CTTC诱导剂适用于活体。SNACIP是新一代临近诱导调控分子，具有广泛和极重要的应用价值。

Description

一种小分子—纳米抗体偶联物临近效应的SNACIP诱导剂及其 制备方法与应用
技术领域
本发明属于细胞调控技术领域，具体涉及一种小分子—纳米抗体偶联物临近效应的 SNACIP诱导剂及其制备方法与应用。
背景技术
临近效应机制决定着诸多细胞进程的进行，包括蛋白—蛋白相互作用、信号级联放大、酶催化反应、翻译后修饰、以及受调控的蛋白降解等等。临近效应诱导化学分子(chemical inducers of proximity,CIPs)或者二聚化诱导化学分子(chemical inducersof dimerization, CIDs)使用双功能的小分子来诱导两个蛋白的二聚化，进而实现对细胞进程的调控，包括细胞信号转导、选择性细胞自噬、控制蛋白和细胞器的定位、轴突转运、细胞—细胞黏着，以及在细胞治疗中的应用等等。但是CIP分子一般需要通过外源基因表达的方式对待调控的蛋白融合表达一个额外的结合标签，因此CIP技术的缺点包括难以直接调控内源的蛋白和无配体结合位点的蛋白、存在内源的待调控蛋白的背景活性干扰，以及难以将CIP诱导剂转化为药物分子的问题，因为由于伦理因素以及风险问题在治疗干预过程中一般不允许对个体进行基因修饰和改造。
小分子—纳米抗体偶联物本身是难以穿膜的，所以不可以被直接用于调控胞内进程，需要同时将小分子—纳米抗体偶联物进行化学功能化改造使之能够穿膜。传统的胞内递送载体，例如线性的穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)，乃至其它更为新颖的胞内递送载体，例如工程化的C3蛋白毒素，大都是通过内吞的方式实现胞内递送的。内吞除了相对较慢之外，也不可避免地会伴随内体包埋及溶酶体降解等过程。而近期环状跨膜肽被发现可以通过非内吞的形式更为快速地将货物递送进细胞。纺锤体组装中的微管成核过程对于维持生命很重要，这个成核过程的失调也会涉及到多种疾病的发生。虽然直接跟微管相结合的微管靶向试剂(microtubule targeting agents，MTAs)已经在化疗中被成功用于癌症的治疗，但是发展调控微管成核过程的试剂仍然还极具挑战。微管成核过程涉及到多种蛋白复合物以及数种天然无序蛋白因子的协同作用，这些特征导致了发展相应的小分子调控试剂(例如结构指导的药物设计，structure-guided drug design，SGDD)非常困难。
发明内容
本发明的目的是发展一类新型的具有核心优势的胞内临近效应诱导剂用于调控细胞进程，且具有药物开发的价值。
本发明提供一种小分子纳米抗体偶联物临近效应的诱导剂，即SNACIP诱导剂，所述诱导剂是由小分子结合部、纳米抗体靶头、胞内递送模组和连接子组成，所述诱导剂的通式如下：小分子结合部—纳米抗体靶头—连接子—胞内递送模组。
进一步地限定，小分子结合部可以通过共价连接的方式而直接引入或者进入细胞之后基于翻译后修饰机制而间接引入；所述纳米抗体是单价纳米抗体或者双价纳米抗体；所述胞内递送模组为环状跨膜肽或线性跨膜肽。
进一步地限定，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸或Tat多肽序列。
进一步地限定，环状跨膜肽，其结构为含有cyclic(KrRrRrRrRrRE)模组或简称cR10*，其中K和E残基优选用酰胺键成环，C-端优选为-CONH2基团。
进一步地限定，Cys-(Gly)n-cyclic(KrRrRrRrRrRE)-NH2，其中n为零或自然数，r：L-Arg, R:L-Arg，其结构式示意如下：
Figure RE-GDA0003784716380000021
进一步地限定，Cys-(Gly)n-cyclic(KrRrRrRrRrRE)-NH2中，n＝5。
进一步地限定，所述纳米抗体是荧光蛋白纳米抗体或介导细胞进程进行的胞内靶点的纳米抗体。
进一步地限定，所述荧光蛋白纳米抗体为绿色荧光蛋白纳米抗体GBP或红色荧光蛋白纳米抗体RBP；所述介导细胞进程进行的胞内靶点的纳米抗体为细胞分裂通路相关靶点的纳米抗体、肿瘤细胞侵袭通路的相关靶点的纳米抗体、铁死亡各种通路相关靶点的纳米抗体或与细胞骨架功能有关的相关靶点的纳米抗体。
进一步地限定，所述小分子结合部是蛋白标签结合配体或蛋白翻译后修饰所能引入的胞内结合模组。
进一步地限定，所述蛋白标签结合配体为甲氧苄啶或氯己基；所述蛋白翻译后修饰所能引入的胞内结合模组为异戊二烯基或豆蔻酰基。
进一步地限定，所述连接子为二硫键、硫醚键或者肽键。
进一步地限定，所述小分体结合部为甲氧苄啶TMP，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸cR10*，所述连接子为可还原被切断的二硫键，即为cR10*-GBP-TMP。
进一步地限定，所述诱导剂为潜在型SNACIP诱导剂，在进入细胞之后即被转化为功能型的farnesyl-cRTC诱导剂，所述纳米抗体为TPX2结合蛋白TBP(TPX2 bindingprotein)，所述小分体结合部为能够被异戊二烯化的CAAX-box多肽序列，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸cR10*，所述连接子为马来酰亚胺与巯基反应而成的硫醚健，即为cR10*-TBP-CAAX。
进一步地限定，属于潜在型SNACIP诱导剂，在进入细胞之后即被转化为功能型farnesyl-CTTC诱导剂，所述纳米抗体为双价TBP纳米抗体，所述小分体结合部为为能够被异戊二烯化的CAAX-box多肽序列，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸cR10*，所述连接子为肽键-NHCO-，即为mCherry-CPP-2xTBP-CAAX。
本发明提供一种诱导细胞内二临近效应的方法，所述方法的步骤如下：
(1)选择细胞内目标蛋白识别的纳米抗体靶头；
(2)选择细胞内目标蛋白质或磷脂具有结合作用的小分子结合部或可以通过翻译后修饰引入小分子结合部；
(3)将步骤(1)的纳米抗体靶头与步骤(2)的小分子结合部进行化学偶联，获得偶联物或者将步骤(1)中的纳米抗体靶头与步骤(2)中的通过翻译后修饰引入的小分子结合部进行融合表达获得嵌合体；
(4)将胞内递送模组与步骤(3)获得的偶联物或者嵌合体通过化学方式偶联或者融合表达得到SNACIP诱导剂；
(5)将步骤(4)获得SNACIP诱导剂加入到细胞体系中诱导胞内临近效应过程。
本发明提供上述的SNACIP诱导剂在调控细胞进程中的应用
进一步地限定，所述应用为制备抑制肿瘤药物中的应用。
进一步地限定，所述应用为激活和去激活胞内蛋白中的应用。
一种调控细胞进程的试剂盒，包括上述的任何一种SNACIP诱导剂，用于调控细胞进程。
一种治疗肿瘤的纳米抗体药物，包括上述的任何一种SNACIP诱导剂通过靶向和去激活 TPX2而阻滞细胞分裂，进而实验对肿瘤增生的抑制。
一种治疗肿瘤的纳米抗体药物，包括上述的任何一种SNACIP诱导剂通过靶向和去激活 TPX2而阻滞细胞分裂，进而实验对肿瘤增生的抑制。
利用上述的任何一种SNACIP诱导剂通过靶向微管成核因子TPX2蛋白使之去激活而抑制细胞分裂的方法，以及由此所衍生的发展治疗肿瘤药物的手段。
利用上述的任何一种SNACIP诱导剂使用纳米抗体偶联物激活和去激活胞内蛋白的方法，将待调控蛋白定位到细胞膜功能区而实现激活，或者将待调控蛋白定位到细胞膜非功能区而实现去激活。
利用上述的任何一种SNACIP诱导剂调控铁死亡的方法，将GPX4定位到过氧化物酶体上，如PEX3序列上，从而诱导铁死亡，作为一种治疗肿瘤的新策略。
在本发明中具体展示了三个不同的SNACIP诱导剂，分别代表着不用的应用类型也具有各自的特点。
第一种是cR10*-GBP-TMP简称cRGT的诱导剂，能够快速穿膜(t1/2＝7.3min)，诱导胞内绿色银光蛋白GFP突变体和大肠杆菌二氢叶酸还原酶eDHFR之间的二聚化，进而实现对胞内细胞进程的调控。cRGT的特点在于它是一个通用型的调控细胞进程的SNACIP，具有快速、可逆、无洗的、计量依赖和调控完全等优越特征，这些将在实施例中提到。cRGT 能够可控细胞定位，可以调控细胞信号转导过程，调控胞内货物的转运以及目前的研究前沿和热点之一——铁死亡过程。
第二种是针对重要的微管成核过程而开发出来的潜在型SNACIP诱导剂 cR10*-TBP-CAAX，简称cRTC，借助于细胞的翻译后修饰机制，潜在型cRTC在进入细胞之后就能够被接上法尼基(farnesyl)，从而被转化为功能型的farnesyl-cRTC临近效应诱导剂。cRTC通过把内源的、无序蛋白也是微管关键成核因子TPX2定位到细胞膜非功能区而将TPX2去激活，抑制微管成核过程，阻滞细胞分裂，抑制癌细胞增殖。cRTC的价值在于第一个调控微管成核的调控剂并能抑制癌细胞增殖，也是一个直接调控内源无配体结合靶标的很要例子。
第三种是针对活体内使用的双价型SNACIP，mCherry-CPP-2xTBP-CAAX，简称CTTC。该诱导剂含有一个双价TBP纳米抗体，所以更适合于在活体中使用，CTTC在进入细胞之后也能被后修饰而转化为farnesyl-CTTC，去激活微管成核因子TPX2，抑制癌细胞增殖，并在活体内显示出抑制肿瘤增生的效果。这个结果证实了SNACIP诱导剂不仅能直接调控内源蛋白，还能够被开发成纳米抗体药物用于疾病的治疗。
尽管本发明展示了三种SNACIP分子，SNACIP技术的潜力还远不及此。对于第一种通用的cRGT型的SNACIP，GBP或者TMP可以被换成任何其它纳米抗体或者小分子配体，用于快速、无洗、近乎完全地调控诸多细胞学进程。对于第二种潜在型SNACIP，内源的靶标，无论使有配体结合还是无配体结合的，都可以被调控，进而研究它们的天然活性。对于第三种双价纳抗类型地SNACIP，更适合于活体中使用，可以用于指导发展新颖地那纳米抗体类生物制药用于治疗疾病。
有益效果：在本发明中，引入了可穿膜的小分子—纳米抗体偶联物临近效应诱导剂 (small molecule-nanobody conjugate inducers of proximity，SNACIPs)。SNACIP技术利用一个纳米抗体作为一个靶头来结合一个感兴趣的蛋白(protein of interest，POI)，以及一个化学小分子作为结合模组，包含胞内递送模组及连接子四部分组成，其通式如下：小分子结合部—纳米抗体靶头—连接子—胞内递送模组。
相比于传统的临近效应诱导化学小分子CIPs，SNACIPs诱导剂具有能直接调控内源的蛋白和无配体结合位点的蛋白、可以避免内源的待调控蛋白的背景活性干扰，能实现将 SNACIPs转化为纳米抗体药物进行治疗干预等核心优势。对于该发明中所公布的几个SNACIP例子而言，相应的有益效果如下：
A.对于cRGT这个SNACIP诱导剂，它能够快速穿膜(数分钟)，实现无洗的、可逆的、计量依赖的、彻底地方式调控细胞信号转导、细胞进程以及程序性死亡。
B.对于cRTC这个潜在型SNACIP，它在进入细胞后即可被转化为功能型farnesyl-cRTC 诱导剂，能够实现对内源的无序蛋白靶标进行调控。
C.对于CTTC这个双价型SNACIP，他在进入细胞后即可被转化为功能型farnesyl-CTTC 诱导剂，由于其含有双价纳米抗体，更适合在活体内使用，能够抑制肿瘤增生，可以被发展成相关的纳米抗体药物。
附图说明
图1：SNACIP诱导剂的总体结构示意图。SNACIP包含一个纳米抗体靶头，一个小分子结合部，一个胞内递送模组以及相应的连接子，其中小分体结合部可以直接通过化学连接的方式预先引入或者在进入活细胞中之后基于翻译后修饰机制而引入(潜在型SNACIP)。
图2：三个SNACIP诱导剂的结构示意图，分别为a)cR10*-GBP-TMP简称cRGT，b)cR10*-TBP-CAAX简称cRTC，c)mCherry-CPP-2xTBP-CAAX简称CTTC。
图3：为设计、两步构建、以及生化表征通用型的SNACIP诱导分子—cRGT。a)cRGT分子的结构元素及其工作原理示意图。b)CysTMP化学小分子的结构元素示意图。c) Cys-cR10*的结构示意图(r:D-Arg，R:L-Arg)。d)双步构建cRGT(IV)，第一步是EPL，第二步是二硫键化反应。e)SDS-PAGE凝胶电泳法分析GBP-intein-CBD(I)。f)SDS-PAGE 凝胶电泳法分析EPL反应，显示了约80％的转化率。g)SDS-PAGE凝胶电泳法分析GBP-TMP (III)。h)非还原性SDS-PAGE法分析cRGT(IV)产物，显示出约45％的转化率(左侧)；还原性SDS-PAGE法(室温，10min)分析cRTC(IV)显示出cR10*胞内递送模组可以很容易地被还原性切除。i)体积排阻色谱SEC法分析1nmol的EGFP、eDHFR、或者GBP-TMP， SEC法使用Superdex 200Increase10/300GL柱子，流速为0.4ml·min-1，结果显示EGFP、 eDHFR、和GBP-TMP(III)的保留体积(retention volume，VR)分别为16.2ml、16.7ml、和18.4ml。j)SEC法分析1nmol的EGFP/GBP-TMP/eDHFR三元复合物(实线)显示了一个单峰(VR＝14.1ml)，而SEC分析1nmol的EGFP和1nmol的eDHFR混合物(虚线)显示出在无GBP-TMP存在下没有复合物形成。k)变性SDS-PAGE法分析在i)和j)实验中所用到的EGFP、eDHFR、GBP-TMP以及EGFP/GBP-TMP/eDHFR三元复合物。l)用荧光共振能量转移法(
Figure RE-GDA0003784716380000051
resonance energy transfer，FRET)进一步验证GBP-TMP诱导的 eDHFR和EGFP之间的二聚化过程原理流程图。m)光谱FRET图谱结果显示从EGFP供体到mScarlet-eDHFR之间的
Figure RE-GDA0003784716380000052
能量转移在GBP-TMP存在下发生而在单独GBP存在下不发生。在此实验中，略微过量的GBP-TMP或者GBP加入进5μM的EGFP和5μM的 mScarlet-eDHFR的还原性PBS溶液中(pH7.4，含1mM TCEP，3％glycerol，0.5M NaCl)，用一个荧光光度计记录其荧光光谱，激发波长设置为470nM。
图4：为HPLC和质谱MS鉴定Cys-cR10*环状跨膜肽。a)HPLC色谱图显示获得的 Cys-cR10*是高纯度的，达到99％。b)Cys-cR10*的质谱图谱。
图5：cRGT能实现分钟级的、无洗的、可逆的、计量依赖的、接近完全地调控EGFP 与eDHFR之间的胞内二聚化过程。a)该实验的原理流程示意图，使用一个双顺反子载体的质粒载体共表达EGFP-mito(绿色，线粒体定位；mito：线粒体定位多肽序列)和 mCherry-eDHFR(红色，主要胞浆定位)。b)HeLa细胞在未加入cRGT时(Pre)、加入24μM的cRGT后，以及加入10μM的TMP后的共聚焦显微镜影像(左)以及mCherry和 EGFP两个通道的PCC共定位统计分析。c)HeLa细胞用24μM的cRGT处理之后，记录随时间变化的二聚化过程。d)cRGT从第3min起就开始极性式地穿透细胞且诱导亚细胞局部的二聚化(黄色箭头所示)，8min内就已经产生了很强的二聚化效应。e)归一化的基于 PCC值的二聚化诱导程度随时间的变化曲线，曲线显示了半二聚化诱导时间t1/2为7.26± 0.53min。f)HeLa活细胞用梯度浓度的cRGT(0，3，6，12和24μM)处理1.5h，可以发现诱导产生了逐渐增加的二聚化程度；在添加24μM的cRGT之后接近完全的共定位发生了，显示了cRGT诱导二聚化的计量依赖特征。g)EGFP和mCherry通道间的统计学PCC 共定位分析(n>10)。h)不含cR10*的GBP-TMP无法诱导胞内的二聚化过程，即便将浓度加倍也无法发生，这个结果凸显了cR10*模组对于cRGT诱导胞内二聚化过程的重要性，同时也说明了cRGT产物中不含cR10*模组的GBP-TMP部分不影响cRGT对于胞内进程的调控。i)mCherry和EGFP两个通道间的统计学PCC分析。所有标尺：10μm。
图6：cRGT调控EGFP到不同亚细胞结构区域的定位。a)调控流程示意图(左)；cRGT(24μM，1.5h)将EGFP从胞浆中定位到mScarlet-eDHFR-mito所在的线粒体外膜上，定位过程非常完全，通过添加TMP(10μM，10min)，该定位调控过程被迅速可逆化(中)；两个荧光通道间的统计学PCC共定位分析(右)。b)调控流程示意图(左)；cRGT(24μM， 1.5h)将EGFP从胞浆中定位到mCherry-eDHFR-Rab1b所在的高尔基体上，通过添加TMP (10μM，10min)，该定位调控过程被迅速可逆化(中)；两个荧光通道间的统计学PCC 共定位分析(右)。c)调控流程示意图(左)；cRGT(24μM，1.5h)将EGFP从胞浆中定位到mCherry-eDHFR-Lamin A/C所在的细胞核膜上(中)；两个荧光通道间的统计学PCC 共定位分析(右)。缩写：mScarlet，mSca；mCherry，mChe；eDHFR，ED。所有标尺： 10μm。
图7：cRGT调控其它GFP突变体的效果和正交性，以及cRGT的胞内调控对于其它颜色的常用荧光蛋白的正交性验证。a)cRGT(24μM，1.5h)将GFP的另一个黄色荧光突变体mEYFP从胞浆中定位到mScarlet-eDHFR-mito所在的线粒体外膜上，定位过程非常完全，通过添加TMP(10μM，10min)，该定位调控过程被迅速可逆化。b)cRGT对于GFP的另一个很近的青色荧光突变体—mTurquoise2的调控是无效的，也就是说cRGT的调控对于 mTurquiose2荧光蛋白是正交的。c)验证cRGT对于其它常用的荧光蛋白的正交性的原理流程图。d-h)HeLa活细胞共表达了eDHFR-mito(线粒体定位)和TagBFP2，mTurquoise2， DsRed，mScarlet，或者mCherry后，用或者不用cRGT(24μM，1.5h)处理。共聚焦显微图片以及相应的PCC统计学分析结果显示均未诱导二聚化过程。除了e)图中使用 mito-tracker red来染色线粒体之外，其它的实验中均用mito-tracker green来染色线粒体。所有标尺：10μm。
图8：cRGT通过将信号蛋白Rac1定位到细胞膜PM内侧来激活细胞伪足形成过程中的信号级联放大过程。a)缺失了CAAX-盒子序列无细胞膜靶向定位能力的活性突变体EGFP-NES-Rac1Q61LΔCAAX(简写为：G-NES-Rac1，绿色，胞浆分布)与 mCherry-eDHFR-CAAX(红，细胞质膜定位)在活HeLa细胞中共表达；该HeLa细胞用cRGT 处理后将会使Rac1突变体定位到细胞膜功能区，继而诱导细胞伪足形成过程中的信号级联放大过程。b)代表性的活HeLa细胞共表达G-NES-Rac1和mCherry-eDHFR-CAAX，在未用cRGT处理时(Pre)，用24μM的cRGT处理后，以及加入终浓度10μM的TMP处理后的共聚焦显微照片。c)EGFP通道和mCherry通道间的统计学PCC共定位分析。d)未用cRGT处理时(Pre)，24μM的cRGT处理后，以及终浓度10μM的TMP处理后的细胞面积的统计学分析。e)代表性的共聚焦显微照片显示用一个具有可比性的CID分子 (TMP-Cl，10μM，1h)处理HeLa细胞后，洗去过量TMP-Cl之前(左)和洗去过量TMP-Cl 之后(右)是否将eDHFR-EGFP-NES-Rac1Q61LΔCAAX(缩写为：ED-G-NES-Rac1)定位到细胞膜上的显微图片。f)cRGT与TMP-Cl所诱导的二聚化后的细胞的划线分析的曲线对比。g)流程示意图比较基于cRGT的SNACIP的临近诱导系统与可比较的传统的CID系统之于调控胞内进程的调控。图片中的缩写：mCherry缩写为mChe或R；EGFP缩写为G； mTurquoise2缩写为mTurq或C；eDHFR缩写为ED；HaloTag缩写为HT。所有的标尺：10μm。
图9：TMP-Cl这个CIP分子所诱导的二聚化的程度稍逊一些。a)TMP-Cl的分子结构含有一个TMP模组用于结合eDHFR以及一个氯己基部分用于共价结合HaloTag。b)TMP-Cl 诱导eDHFR和HaloTag之间的二聚化过程。c)代表性的HeLa活细胞共表达了 HaloTag-mCherry-CAAX和eDHFR-EGFP-NES-Rac1(Rac1：Rac1Q61LΔCAAX的缩写)，在用或者未用TMP-Cl(10μM，1h，之后洗掉过量TMP-Cl，30min)处理的共聚焦显微照片。d)PCC统计学共定位分析显示了一个中等程度的共定位PCC数值，约0.7上下。标尺： 10μm。
图10：用cRGT实现近乎完全的多轮可逆调控胞内货物转运过程，以及用此SNACIP诱导剂研究驱动蛋白—胞内货物的相互特异性问题。a)流程图显示cRGT配合TMP抑制剂是如何实现多次可逆调控KIF5B-介导转运过氧化物酶体“货物”的；在此过程中，把KIF5B 的N-端马达区域(1-560)，即KIF5BN结合到一个对应的货物上，如过氧化物酶体，就可以激活KIF5BN，继而激发沿着微管的正向转运过程，一般说来就是朝向细胞的边沿区域。 b)代表性的共聚焦显微照片显示共表达了PEX3-mCherry-eDHFR(过氧化物酶体定位)和 KIF5BN-EGFP在未加入cRGT时(Pre)，加了24μM的cRGT后，加入了终浓度为10μM 的TMP后，以及洗掉TMP之后的影像。c)局部放大的(b)中的图片，清晰显示出单个过氧化物酶体以及被定位到过氧化物酶体上的KIF5B的细节。d)两个通道之间的统计学PCC 共定位分析。e-h)图b)中的影像图片的划线分析。i)研究KIF5B驱动蛋白的货物特异性问题的原理示意图。j)代表性的共聚焦显微照片显示HeLa活细胞共表达 mCherry-eDHFR-Rab5a(初级内体定位)和KIF5BN-EGFP在未加入cRGT时(Pre)，加入了24μM的cRGT后，以及加入了10μM的TMP之后的影像。k-m)对图j)的划线分析显示cRGT的确诱导了共定位，可是却没有产生初级内体朝着细胞边沿的明显的转运过程。n) 统计学PCC法分析两个荧光通道间的共定位过程。所有标尺：10μm。
图11：cRGT通过将GPX4调控到过氧化物酶体的表面而激活铁死亡过程。a)铁死亡通路的示意图，显示了GPX4因子对于保护细胞受到铁死亡影响的关键作用。b)流程图显示cRGT是如何将EGFP-GPX4定位到PEX3-mCherry-ED所在的过氧化物酶体表面而抑制 GPX4，进而激活细胞的铁死亡过程的。GPX4被定位到一个非功能区，同时其催化活性中心的硒半胱氨酸可能也容易被氧化失活而抑制了其负调控铁死亡发生的作用。c)HeLa活细胞共表达了PEX3-mCherry-eDHFR(实验组)或者PEX3-mCherry(对照组)、EGFP-GPX4 和TagBFP2-mito(线粒体荧光标签)的共聚焦显微照片。两组细胞均用cRGT(24μM，2h) 处理，实验组的细胞EGFP-GPX4被定位到过氧化物酶体上产生了铁死亡细胞的经典形态，包括线粒体变小以及细胞形态变得异常等等，而对照组没有发生GPX4被定位到过氧化物酶体上，同时线粒体仍然处于正常梭长的状态，且细胞形态也正常。d)两个荧光通道间的统计学PCC共定位分析。标尺：10μm。
图12：设计和制备一个潜在型SNACIP诱导剂—cRTC用于去激活细胞分裂中的微管成核因子TPX2的功能。a)TPX2是一个内在无序蛋白IDP，且在诸多癌细胞中过量表达，促进细胞的不受控分裂过程。b)潜在型SNACIP诱导剂cRTC的结构要素，以及其如何调控 TPX2功能的流程示意图。c)基于当量控制的串联生物正交反应策略实现快速一锅法高产率制备cRTC的反应流程，当cRTC进入细胞之后，还会通过后修饰机制而转化为一个功能型farnesyl—cRTC诱导剂(图中缩写如下：BCN：bicyclonornyne，可与叠氮基发生无铜催化点击反应；Mal：maleimide，可与半胱氨酸发生加成反应)。d)等温滴定量热法(ITC) 表征TBP纳米抗体与hTPX2蛋白之间的相互作用的滴定曲线以及相应的Wiseman Plot图。负值的滴定峰显示这个结合是一个放热过程，因而结合焓变ΔH为负值。通过Wiseman Plot 图可以推算出Kd＝1/Ka＝287nM，TBP与hTPX2的结合计量比为1：5。值得注意的是结合熵变ΔS也是负值，意味着结合过程涉及到大量的构象变化，这个结果与hTPX2作为一个高度无序的蛋白之特征相吻合。e-g)SDS-PAGE以及胶内荧光法分析cRTC(VII)终产物及其中间体。
图13：TBP-CAAX嵌合体的CAAX-盒子中的第17位半胱氨酸残基，即Cys17，负责被异戊二烯化翻译后修饰。a)CAAX-盒子的氨基酸序列。b)mScarlet-TBP-CAAX嵌合体 C-端最后四个氨基酸的顺序和相应的DNA测序结果。c)mScarlet-TBP-SAAX嵌合体C-端最后四个氨基酸的顺序和相应的DNA测序结果，结果显示负责被异戊二烯化的Cys17残基被突变了为Ser17后不能进行相应的异戊二烯化而实现细胞质膜定位。d)基于共聚焦显微照片和相应的划线分析(从左往右)，mScarlet-TBP-CAAX有很强的和清晰的细胞膜定位，与之相反mScarlet-TBP-SAAX突变体完全丧失了细胞膜的定位能力。e)mScarlet-TBP-CAAX 与mScarlet-TBP-SAAX的膜定位指数的统计学比较分析。质膜定位指数反应的是一个蛋白定位到细胞膜上的程度，大体上讲是定位到细胞膜和在胞浆中的相对比例，可以通过荧光强度分析而得到。标尺：10μm。
图14：cRTC将TPX2定位到细胞膜上，并抑制了细胞增殖。a)HepG2活细胞共表达EGFP-CAAX(质膜标签)以及mScarlet-hTPX2(hTPX2标签)用或者不用cRTC处理(10 μM，1.5h)清楚地显示cRTC将hTPX2移位到了细胞膜上。b-c)相应的划线分析结果。d) 两个荧光通道间的统计学PCC共定位分析。e)超分辨荧光显微术显示了cRTC诱导剂清楚地定位在细胞膜上，同时把hTPX2靶向到细胞膜并形成了小的液滴或凝聚物(condensates)。 f)代表性的共聚焦显微图片显示cRTC-处理的(+cRTC，10μM，24h)和对照组HepG2细胞的EdU细胞增殖测试结果；cRTC处理的HepG2细胞的细胞核亮度降低，以及相比于对照组有更低的EdU阳性细胞数量比例，这些意味着细胞增殖活力的减少。g)HepG2的EdU 阳性比例统计学分析。h)EdU阳性的HepG2细胞的细胞核荧光强度的统计学分析。i-k) 相同于(f-h)的HeLa细胞的EdU细胞增殖实验测试分析结果。l)计算比较HeLa细胞处理或者未被cRTC处理的细胞各个周期所占的比例。黄色标尺：5μm，白色标尺：10μm。
图15：双价型SNACIP诱导剂CTTC也能够有效穿膜，并也可有效抑制细胞增殖，以及在活体内抑制肿瘤的增生。a)CTTC的结构元素包括一个串联的双价TBP纳米抗体模组，一个线性Tat穿膜肽(YGRKKRRQRRR)，一个C-端的CAAX-盒子，CTTC也可以在进入细胞之后被异戊二烯化而转化为功能性的farnesyl-CTTC之SNACIP诱导剂。b)CTTC(10 μM，2h，之后洗掉多余的CTTC)处理了HeLa细胞后发现CTTC也能够顺利穿膜且定位在细胞质膜上(左)并将hTPX2移位到细胞膜非功能区(右)。c)用10μM的CTTC处理(+CTTC) 和未用CTTC处理(control)的HeLa细胞的EdU细胞增殖测试结果。d)用10μM的CTTC 处理(+CTTC)和未用CTTC处理(control)的HeLa细胞的EdU阳性率统计学比较；误差线：标准差(standarddeviation，SD，n＝10)。e)通过对BALB/c裸鼠皮下注射合适5×106数量的HepG2肝癌细胞而建立小鼠肝癌异位移植瘤模型，用以评估CTTC对于肿瘤生长的抑制作用。当肿瘤开始稳定生长到0.7-0.9cm直径后，CTTC通过静脉注射到小鼠体内，注射过程每两天重复一次用以补偿CTTC在活体内的代谢消耗。f)CTTC—注射的、CPP—注射的、PBS—注射的、以及空白组的小鼠的肿瘤的体积每天随时间变化的曲线；误差线：标准误SEM。g)m)不同组别的小鼠的肿瘤体积平均值跟空白组小鼠的肿瘤体积平均值相差的绝对值随时间变化的情况，结果显示只有CTTC—注射的小鼠的肿瘤增长受到了抑制。标尺：白，10μm；青，50μm。
图16：CTTC临近诱导剂清晰地显示出相比于非SNACIP型的传统的双价纳抗嵌合体—CTT具有更好的肿瘤抑制效果。a)CTTC诱导剂包含一个CAAX-盒子区域用于被异戊二烯化，相反传统的双纳抗嵌合体CTT不含CAAX盒子，因而也不可能被转化为一个功能性的SNACIP诱导剂。b)异位肝癌移植瘤模型小鼠被注射了约0.08ml的22mg·ml-1(0.35mM) 的CTTC(n＝6)或20mg·ml-1(0.35mM)的CTT(n＝7)，每两天重复一次药物注射用以补偿代谢消耗并每天记录肿瘤的大小用以比较CTTC和CTT对于肿瘤的抑制效果的区别。
图17：利用非洲爪蟾卵无细胞体系来阐释TPX2的去激活如何影响纺锤体组装的机制。 a)纺锤体组装包含三个关键的通路：1)染色体介导的，2)中心体介导的，以及3)微管介导的纺锤体组装通路；每个通路都涉及到微管的成核过程以及指数型的微管数量的扩增。b)TPX2抗体包被的磁珠被制备之后用于免疫耗竭(immunodepletion，ID)新鲜制备的爪蟾卵提取物中的内源性TPX2，三轮免疫耗竭之后从免疫印迹(WB)结果可以看出，TPX2 被完全消除了。c)纺锤体组装测试显示无免疫耗竭(non-ID)的爪蟾卵提取物可以支持纺锤体的形成；TPX2耗竭(TPX2-ID)的爪蟾卵提取物不能支持双极纺锤体的形成，然而从染色体开始的微管成核活性在还极大地保持着，说明染色体介导的微管成核通路并未被抑制。d)基于微管的微管成核实验显示微管成核活性在TPX2-ID爪蟾卵提取物中相比与未 TPX2-ID的爪蟾卵提取物而言被极大地抑制了。e)微管成核活性的统计学分析。这里EB1 是一个微管的正极结合蛋白，因此EB1荧光点的数量可以用以定量分析微管的数目。误差线：标准差SD(n＝4或5)。对于c)或者d)，蓝色：爪蟾精子核染色体；绿色：EB1-mCherry；红色：HiLyte 647-tubulin，用于标记微管；所有标尺：10μm。
具体实施方式
哺乳动物细胞培养：从Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.(中国·武汉)购买 HeLa(Cat#CL-0101)和HepG2(Cat#CL0103)细胞，该细胞通过STR(短串联重复序列) 鉴定，并且在培养前证明没有HIV-1、HBV、HCV、支原体和其它微生物感染。其它需要的试剂，如用于细胞培养的DMEM和PBS，在使用前也需证实无支原体感染。细胞在5％二氧化碳的条件下培养，使用高糖(4.5g·L-1)Dulbecco's modified Eagle's全培养基(DMEM， Cat#SH30243.01购买自HyClone)，含有4mM左旋-谷氨酰胺、1×丙酮酸钠，以及添加有胎牛血清(胎牛血清、Cat#SV30087.03购买自HyClone)、1％非必需氨基酸(NEAA100×)和1％青—链霉素(100×)预混液。在细胞传代过程中，使用EDTA-胰蛋白酶(购买自HyClone， Cat#SH30042.01)和PBS磷酸盐缓冲液(Cat#SH30256.01购买自HyClone)消化细胞。HeLa 细胞以1：5～10的比例传代培养，而HepG2细胞以1：4～6的比例传代培养。
动物福利：小鼠在无特定病原体(specific pathogen-free，SPF)级洁净条件下饲养，并在哈尔滨工业大学动物伦理和使用委员会(Institutional Animal Care and useCommittee， IACUC/HIT)的批准下进行处理，许可号为IACUC-2021052。小鼠被饲养在受控的光照(12 小时光照/12小时黑暗周期)、温度(24±2℃)和湿度(50±10％)条件下，并喂食正常的食物以及自由饮水。关于爪蟾的饲养、维护和卵子采集均是经哈尔滨工业大学动物伦理和使用委员会(IACUC/HIT)的批准进行的，许可证号为IACUC-2020020。简单地说，雌性(2-3岁) 和雄性爪蟾饲养设备采购自凌云博际(北京·中国)，水质(去离子水、ID-H2O)、pH值(7.2)、温度(18℃)和电导率(1600μS/cm)等参数都按照制造商手册的建议设置，非洲爪蟾每周喂食合格的爪蟾饲料两次。纺锤体实验使用雄性爪蟾制备精子核，而雌性爪蟾用于诱导产卵。根据CSH Protocols(Shaidani et al.,2021)所表述的方法，依次向雌性非洲爪蟾注射适当量的孕母马血清促性腺激素PMSG(pregnant mare derum gonadotropin)和人绒毛膜促性腺激素 hCG(human choionic gonadotophin)，PMSG用来促进卵子成熟，而hCG促进诱导其排卵。
异种移植瘤小鼠模型的建立及药物治疗：免疫缺陷BALB/c裸鼠购买自辽宁长生生物技术有限公司，雌鼠在4-6周龄后注射HepG2细胞用以造瘤。注射前HepG2细胞在标准的Φ～85 毫米培养皿中培养，等细胞生长到处于指数期生长时进行细胞的收集，首先用10毫升PBS 漂洗细胞，之后加入1毫升胰蛋白酶，消化5-10min，使细胞脱壁，再加入3毫升PBS悬浮分离的细胞。细胞悬液在4℃下1000rpm离心8min，去除上清液，将细胞在新鲜制备的PBS/基质胶(Solarbio，Cat#M8370)的v/v＝1：1的混合物中重悬。最终的细胞浓度约为5000万个细胞每毫升。关于建立HepG2异源移植瘤小鼠模型，将0.1mlPBS/基质凝胶溶液中的～500万个HepG2细胞皮下注射到BALB/c裸鼠的腋下区域。1-2周内将会出现稳定的肿瘤。为了评价TPX2纳米抗体偶联物的有效性，我们使用pH 7.2的PBS(含额外的1mM TCEP、0.5M NaCl和3％甘油)缓冲液作为空白对照，将CTTC纳米抗体偶联药物溶解于该PBS缓冲液用于给药，通过尾静脉静脉给小鼠注射100μl。每天使用游标卡尺监测平均肿瘤大小 [Φ＝(ΦL+ΦS)/2]。肿瘤体积的计算公式如下：V＝1/6(πΦ3)。
质粒构建：质粒载体pTXB1、pET28a(+)、EGFP-C1、EGFP-N1等，都是从商业供应商处购买获得。这些载体可以进一步设计改造，如引入His6或His8的亲和标签，添加 TEV或TEV"的蛋白酶切位点，更改限制性酶切位点，或用mTagBFP2、mTurquoise 2、 mEYFP、DsRed、mScarlet或mCherry等取代EGFP而获得表达其它荧光蛋白的载体，以进行后续的克隆。关于克隆方法，我们采用亚克隆(subcloning)、Gibson组装或改进的Gibson 组装来构建所需的质粒。对于亚克隆，使用适当的限制性内切酶直接从载体质粒中切出相关片段，或使用perfusion高保真聚合酶(APExBIO，CAT#1032)从包含所需基因的质粒中进行 PCR扩增相应的基因片段，凝胶纯化，再用限制性内切酶来酶切。用T4 DNA连接酶将获得的基因片段连接到适当的载体中。涉及到多个片段插入的克隆方法可以通过逐步亚克隆法或多片段Gibson一步组装法来实现。大多基因是通过基因合成的手段而获得，基因换成服务由库美生物科学有限公司(中国·长春)提供。
这些基因包括大肠杆菌密码子优化的人源TPX2(即密码子优化的hTPX2)、大肠杆菌密码子优化的GFP纳米抗体(GBP)、mScarlet等。无密码子优化的人源TPX2基因扩增自质粒 pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-TPX2-3Flag，该质粒购买自和元科技(上海)有限公司 (Obio Technology(Shanghai)Co.,Ltd.，Cat#H10559)。编码人源KIF5B、Rac1、Rab1b、Rab5a等基因的质粒购自淼灵质粒共享平台。
转染：通常在Thermo Scientific 8孔皿(Cat#155409)或4孔皿(Cat#155382)
Figure RE-GDA0003784716380000111
中种细胞并进行瞬时转染。将DNA(0.25μg)溶解在12.5μl gibco的opti-MEM(Cat#31985-062)中，之后将入0.5μl的
Figure RE-GDA0003784716380000121
转染试剂(Cat#T202，诺唯赞生物技术有限公司Vazyme Biotech Co.,Ltd.，中国·南京)溶解于12.5μl的gibco opti-MEM中。两个溶液首先在室温下孵育5min。然后，将含有DNA的opti-MEM溶液转移到含有
Figure RE-GDA0003784716380000122
的opti-MEM中溶液中，轻轻混合混合物。将含有
Figure RE-GDA0003784716380000123
混合物的opti-MEM在室温下孵育5-10min(通常为7.5min)，并轻轻滴加入8孔皿，皿中有250μl 全DMEM培养基并接种有15000-20000个细胞。细胞在37℃下于5％二氧化碳下培养约2 小时，使细胞贴壁。然后，用新鲜温暖的全DMEM培养基置换掉之前的培养基，细胞在5％二氧化碳下37℃培养20小时以上。为了共转染多个质粒，本方案中使用的DNA的数量意味着质粒的总质量。
共聚焦显微镜和超分辨率成像：转染24小时后，对细胞进行共聚焦显微镜成像，使用上述8孔或4孔皿，使用无酚红DMEM培养基(REF：21063-29)，含额外的10％胎牛血清、1％丙酮酸钠、1％NEAA、1％青链霉素和15mM的HEPES-Na(最终pH7.0)，在5％二氧化碳下37℃培养，使用ZeissLSM880倒置扫描共聚焦显微镜观察。在大多数情况下，主要使用蔡司Plan-APOHROMAT 100×/1.4DIC油镜来显微成像，也可以使用蔡司 Plan-APOCHROMAT 60×/1.4DIC油镜；为了获取更大的视野，可使用蔡司 PlanAPOCHROMAT40×/0.95DICIII物镜(如EdU检测中)。获取的图像深度一般为12-bit，分辨率为512×512，一般扫描8次平均。405nm激光用于激发mTagBFP2、DAPI或Hoechest，用458nm激光激发mTurquoise2，488nm氩气激光激发EGFP或荧光素，514nm氩气激光激发mEYFP，HeNe 543nm激光激发在EdU实验中的Apollo567染料，HeNe激光543nm或 HeNe激光594nm激发mScarlet-I或者mCherry，HeNe激光647nm用于激发远红外的 HiLyte647。在大多数情况下，基本的成像设置参数是在“智能设置”(smart setup)功能的辅助下设置的。为了获得超分辨率图像，可使用Airyscan模块，用ChA通道一般以1024×1024 分辨率进行成像。
用SNACIP二聚化分子处理活细胞用于显微成像的操作：除非有特别注明，首先将细胞的DMEM全培养基更换为相应浓度的SNACIP二聚化分子的无酚红成像培养基，之后孵育给定时间后成像。对于cRGT来说，其浓度代表的是cRGT有效比例的浓度；成像前无需洗去过量的cRGT变可以实现近乎完全的二聚化调控。对于用TMP进行可逆调控，新鲜配置的含终浓度10μM的TMP的无酚红成像培养基用于置换之前的含有SNACIP二聚化分子的成像培养基，这可以产生快速的近乎完全的可逆调控，10min后开始显微成像。
EdU细胞增殖试验：EdU细胞增殖试验使用RiboBio(Cat#R11053.9)公司的EdU细胞增殖检测试剂盒进行。简单地说，是将在指数生长期的50×103HepG2或20×103HeLa细胞接种于8孔成像皿，并让其生长过夜。第二天早上，在每个孔中加入含有药物(如cRTC)的PBS溶液，终浓度为10μM，同时在对照细胞孔中加入相同体积的PBS溶液。第三天早上(一般为24小时后)，将最终浓度为50μM的EdU加入到所有成像孔中，在37℃5％二氧化碳下孵育2小时，此方法适用于一般的癌细胞系。然后用PBS(2×5min)漂洗每个孔以去除多余的 EdU，加入100μl细胞固定液(4％PMA溶解于PBS)，室温(room temperature，RT)孵育 30min。然后在每个孔中加入100μl的2mg·ml-1甘氨酸溶液，在室温下摇晃5min，以中和固定溶液。取出每个孔中的甘氨酸溶液，每个孔用200μl的PBS在室温下振荡5min漂洗。吸出PBS，每孔加入200μl的细胞膜穿透溶液(0.5％TritonX-100溶解于PBS)，在室温下振荡 10min。实验前用PBS(1×5min)再次洗涤固定后细胞。在通过点击反应进行荧光标记之前，根据试剂说明书，新鲜制备含有红色Apollo567染料(Cat#C10310-1)的1×Apollo标记溶液、催化剂和其他必要的试剂需要先准备好。例如，通过依次混合添加938μl的DI-H2O、50μl 的Apollo反应缓冲液(试剂B)、10μl的Apollo催化剂溶液(含Cu2+、缓冲液C)、3μl 的Apollo567染料(试剂D)和～9mg的Apollo添加剂(抗坏血酸钠盐，试剂E)便可以制备1ml 的1×Apollo标记溶液。每孔中加入200μl新鲜制备的1×Apollo标记溶液，避光环境夏在室温下摇晃30min以完成标记。去除标记溶液，再次用细胞膜穿透液(0.5％TritonX-100PBS) 洗涤每孔中的细胞(3×10min)。吸去渗透溶液，用PBS洗涤细胞(1×5min)。最后加入新鲜的PBS，标记后的细胞便可用于荧光共聚焦显微镜成像。
等温滴定量热法(ITC)：ITC测量使用的是GE Malvern的MicroCal ITC200设备。TPX2 纳米抗体和hTPX2蛋白均溶解在新鲜制备的pH7.2的PBS缓冲液中(含额外添加的1mM的TCEP、0.5M氯化钠和3％甘油)。将21μl的hTPX2溶液加入到样品池子中，注射器吸取51μM的TPX2C纳米抗体，2.0μl×18次注射进入样品池，每次间隔3min(除了第一次注射 0.8μl纳米抗体及用2.5min间隔时间)。滴定数据采用Origin软件进行处理，可以计算得出 Kd和结合的化学计量值等参数。
Figure RE-GDA0003784716380000131
共振能量传输(FRET)测量(图3I的测量方法)：由于EGFP和mCherry或mScarlet 的发射光谱与吸收光谱重叠，因此EGFP和mCherry或mScarlet组成一个FRET对。为了测量FRET，我们使用配备了96孔板的Molecular Device(MD)公司的SpectraMax i3x光谱仪。适当体积(100μl或200μl)的供体和受体荧光分子加入进96孔板中的样品孔。除非特别注明之外，激发光波长为470nm，发射光谱范围是490-750nm。
免疫消除(ID)(研究机理，图17)：在一个典型的ID实验中，根据厂家提供的流程，将32μl蛋白A/G磁珠(IP级)(YEASEN，Cat#36417ES03)与xTPX2多克隆抗体(～23μg)进行偶联包被。实验中所用的xTPX2多克隆抗体是使用xTPX2蛋白的C端片段免疫大白兔而得到xTPX2多克隆抗体，并通过蛋白A进行纯化，再使用抗原进行亲和纯化而得到。抗体偶联磁珠悬浮在32μl的CSF-XB缓冲液中，并均分成三等份。在加入爪蟾卵提取物之前，每部分的磁珠都先去除CSF-XB缓冲液。然后将30μl新鲜制备的爪蟾卵提取物与一部分磁珠混合，然后轻轻吹吸重悬磁珠。悬浮液在冰上孵育约10-15min，然后使用磁珠浓缩器 (magneticparticle concentrator，MPC)在5-10min内回收磁珠，得到第一轮免疫耗竭的爪蟾卵提取物。将这个免疫耗竭过程再重复两次，以完全耗尽提取物中的xTPX2。使用相同的ID抗体进行蛋白质印迹实验可用于确认xTPX2的完全消除。
爪蟾卵提取物中进行纺锤体组装实验和微管成核实验(研究机理，图17实验)：非洲爪蟾卵提取物是根据普遍采用的提取流程(Hannak&Head,Nat.Protoc.,2006,1,2305)使用新鲜排出的爪蟾卵在环境温度18℃时制备得到的。新鲜制备的爪蟾卵提取物中加入10mg·ml-1的LPC(亮肽素leupeptin、肽抑素pepstatin、糜蛋白酶素chymostatin，各最终浓度 20μg·ml-1)蛋白酶抑制剂和10mg·ml-1细胞松弛素D(最终20μg·ml-1)，不添加能量混合物 (energy mix)。然后，爪蟾卵提取物立即放在冰上直到使用。在制备爪蟾卵提取物后，也应立即进行免疫耗竭、纺锤体试验或微管成核试验。根据CSH protocols(Hazel&Gatlin,2018)，从雄性爪蟾提取制备精子核染色体。对于纺锤体试验，将0.25μl精子核、0.33μl2mg·ml-1的HiLyte647猪脑微管蛋白(Cytoskeleton，Cat#TL670M-A/B)、0.25μl的5mg·ml-1的EB1-mCherry、0.25μl的100μg·ml-1的DAPI加入到8μl提取物中。将爪蟾卵提取物混合物轻轻混合，然后装入具有样品通道的自制载玻片中。提取物混合物在18℃孵育，30min 后应出现纺锤体结构，可用高端共聚焦激光扫描显微镜进行观察。对于微管成核试验，将 0.3μlEB1/钒酸盐预混液(EB1-mCherry，1mg·ml-1，10mM钒酸钠)和0.33μl的2mg·ml-1的HiLyte647猪脑微管蛋白加入8μl提取物，轻轻混合，然后立即装入具有样品通道的自制载玻片中。提取物在18℃孵育，微管逐渐出现，用共聚焦激光扫描显微镜可观察成核过程。
环状细胞穿膜肽Cys-cR10*的设计与制备：环肽Cys-cR10*的特征在于一个环状rR环 (r＝D-Arg，R＝L-Arg)，一个(Gly)5的连接子，一个游离的N端半胱氨酸和一个含有-CONH2基团的C端。以Rink酰胺树脂进行固相多肽合成(solid phase peptide synthesis，SPPS)合成。合成R10片段后，进行分子内环化，通过缩合赖氨酸侧链(-NH2基团)和谷氨酸(-COOH基团)形成分子内酰胺键而成环。然后将Cys-(Gly)5部分依次添加到环状r10部分，最后对 Cys-cR10*进行去保护和纯化。Cys-cR10*环肽的纯度为98.8％，其结构通过质谱进行鉴定。 C84H160N50O19S，精确分子量：2205.28，摩尔质量M.W.：2206.56；测得的质荷比m/z736.4[M+3H]3+，552.6[M+4H]4+，442.3[M+5H]5+。
通用表达蛋白连接(EPL)方法：将需要用于EPL连接的蛋白用pTXB1质粒为一个融合嵌合体进行表达，该嵌合体C端会含有MxeGyrA内含肽，而需要表达蛋白的基因就被克隆进该pTXB1载体中。然后，融合表达的嵌合体纯化后交换进在缓冲液A(pH8.0的PBS， 0.5M氯化钠，3％甘油)中，浓度调整为8.5mg·L-1。开始连接反应时，加入1/4体积的pH8.0 的2-巯基乙磺酸钠(MENSNa，2M)母液为蛋白裂解试剂，加入1/4体积pH8.0的4-巯基乙酸 (MPAA，1.1M)母液作为催化剂，以加快连接速度。最后，将含有N端半胱氨酸的小分子试剂加入浓度为0.5-1mM的反应溶液中。将反应混合物在冰上孵育数天，采用SDS-PAGE监测连接过程，一般孵育2-4天后大部分蛋白会转化为连接产物。连接产物可以使用高亲和力的镍树脂FF(GenScript，Cat#)通过阶梯式梯度(0-500mM咪唑)重力柱进一步纯化。如果必要，可以使用几丁质树脂(NEB，Cat#S6651L)来进一步除去含有CBD-融合的非连接产物。
蛋白表达和纯化的通用步骤：pET28a(+)或基因工程改造后的pET28a(+)的载体，例如pET28b(TEV)，可作为载体用于大多数蛋白的表达，而pTXB1载体用于表达与内含肽—几丁质结合域(intein-CBD；CBD：chitin binding domain)标签融合的GFP纳米抗体，用于随后的表达蛋白连接(EPL)反应。这些表达蛋白的质粒首先用大肠杆菌Rosetta2a感受态细胞转化，按照质粒的抗性使用氨苄西林(100mg·L-1)或卡那霉素(50mg·L-1)琼脂糖平板筛选。用单个菌落接种50-100mL的LB培养基，培养基含有相应的100mg·L-1氨苄西林或50mg·L-1卡那霉素，首先在37℃以240rpm振荡8-12小时或振荡过夜预培养。接着使用30-50mL的预培养菌液进一步接种于～1.8L的新鲜的含有100mg·L-1氨苄西林或50mg·L-1卡那霉素的LB 培养基中，另外再添加额外的氯霉素(33mg·L-1)。接种的LB培养基的感受态细胞在37℃以180rpm的速度摇晃几个小时(通常为2-3小时)直到长到OD600(600nm处的吸光度) 到0.05～0.1之间后。然后加入0.5ml的1M的IPTG溶液(最终0.27mM)诱导蛋白表达，可以在37℃下表达3-5小时，或16℃过夜。有时，蛋白质的表达时间和温度需要通过实验进行条件优化，以达到较为理想的蛋白表达水平。
随后，通过离心(8000rpm，4℃，15min)收集细胞，用PBS(4700rpm，10min)洗涤一次。细菌颗粒在裂解缓冲液(pH8.0的PBS，含额外添加的0.5M氯化钠，3％甘油，根据情况加或者不加3mM的BEM，1mM的PMSF)中重悬。对于体积较少的细菌细胞悬液 (<40ml)，通常在冰上以80W超声30min或60W超声45min(1s超声后，间隔3s)进行裂解。对于批量处理或更大体积的细胞悬液，细胞通常使用超高压均质均浆机在4℃条件下 800-900bar压力下裂解2-3个循环，超高压均质均浆机需配备一个台式循环冷凝水机提供冷凝水。得到的裂解液进行高速离心(25000rpm，45min，4℃)，得到的上清液通过重力Ni-NTA 柱(2-5ml树脂填料)进行纯化。清洗标记蛋白，然后用咪唑进行梯度洗脱(50,100，...，直到 500mM)。另外，也可使用GE公司的AKTAPure配备HisTrapFF柱进行梯度洗脱(0→500mM 咪唑)，使用缓冲液A(pH8.0的PBS、含额外0.5M氯化钠、3％甘油、根据情况加或者不加 3mM的BEM)和缓冲液B(溶解了额外0.5M的咪唑的相同pH的A液)搭配而实现梯度洗脱。如果根据此步骤纯化的蛋白还需要进一步纯化，可以应用离子交换或体积排除色谱的方法。获得的蛋白质通常需要浓缩，使用缓冲液A进行缓冲液交换，分装后在液氮中快速冷冻，保存在80℃下。
关键小分子化合物的合成和表征：1H-NMR或13C-NMR核磁图谱是用400MHz或600MHz Bruker BioSpin GmbH磁共振波谱仪获得的。1H-NMR谱图的相关参数如下：化学位移δ以百万分之一(ppm)表示，裂分(multiplicities)以如下方式表示：s(singlet),d(doublet), t(triplet),q(quartet),dd(doublet of doublets),m(multiplet),or br(broadened)；偶合常数 (coupling constants)J以赫兹(Hertz或Hz)为单位；氢谱的积分(n)以nH来表示。高分辨质谱(high resolution mass spectra或HR-MS)使用Agilent6540Q-TOF质谱仪所获取，使用电喷雾电离模式(ESI).
Figure RE-GDA0003784716380000161
反应流程式1|Cys-TMP的合成路线(1).i)DIEA,THF,RT,ON,90％；ii)TFA,DCM,RT,30min,99％；iii)HBTU,NHS,DIEA,DCM,2h,82％；iv)DIEA,THF,RT,ON,40％；v) tert-butyl4-bromobutylcarbamate,Cs2CO3,NaI·2H2O,DMF,RT,20h,32％；vi)TFA/DCM(1:2), RT,30min,then aq.Na2CO3,99％；vii)HATU,DIEA,DCM,RT,ON,57％；viii)TFA,2.5％w TIS,RT,1h,86％.Abbreviations:TMP,trimethoprim；DIEA,N,N-diisopropylethylamine；THF,tetrahydrofuran；RT,room temperature；ON,overnight；TFA,trifluoroacetic acid；DCM, dichloromethane；HBTU,2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate；NHS,N-hydroxysuccinimide；DMF,N,N-dimethylformamide；HATU, 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo(4,5-b)pyridinium3-oxide hexafluorophosphate；TIS,triisopropylsilane.
合成CysTMP(1)及相关中间体
Figure RE-GDA0003784716380000162
5-(2-(2-(2-(2-(tert-butoxycarbonyl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethylamino)-5-oxopentanoic acid(BocNH-PEG4-Glu-COOH,3).BocNH-PEG4-NH2(1.2g,4.11mmol),和戊二酸酐(468mg, 4.11mmol)一起溶解在无水四氢呋喃THF(21ml)中，之后加入DIEA(636mg,4.93 mmol)。反应于室温搅拌过夜。反应溶液分配在EtOAc/aq.NaH2PO4(2M)中，之后分离有机层，水层用乙酸乙酯EtOAc再萃取两次。所有有机层合并，用饱和食盐水brine洗一次，加入无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，硅胶柱层析(EtOAc/MeOH 8/1,Rf 0.4-0.6(拖尾),之后EtOAc/MeOH 5/1)得到1.5g产物，收率90％.1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ6.51(s,1H),5.16 (s,1H),3.63(br,8H),3.53(m,4H),3.44(m,2H),3.29(br,2H),2.37(t,J＝6.8Hz,2H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),1.94(m,2H),1.42(s,9H)；13C-NMR(CDCl3,101MHz):δ176.00,172.91,156.30, 79.53,77.36,70.61,70.50,70.29,69.95,40.41,39.33,35.32,32.92,28.51；HRMS:C18H35N2O8 + [M+H]+calc.407.2393,found 407.2393.
Figure RE-GDA0003784716380000171
5-(2-(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethylamino)-5-oxopentanoicacid
(H2N-PEG4-Glu-COOH,4).BocNH-PEG4-Glu-COOH(406mg,1mmol)溶解在无水二氯甲烷 DCM(2ml)中然后加入三氟乙酸(1ml)，反应于室温搅拌30min可使脱保护完成。DCM, TFA以及其它挥发性组分在高真空下被除去，得到～423mg脱保护产物 nTFA·H2N-PEG4-Glu-COOH(～1mmol)，几乎定量收率。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ7.94(br, 1H),7.90(br,1H),4.66(br,3H),3.79(m,2H),3.70(m,2H),3.62(m,6H),3.56(m,2H),3.43(br, 2H),3.21(br,2H),2.37(m,2H),2.29(m,2H),1.93(m,2H)；13C-NMR(CDCl3,101MHz):δ 176.88,174.36,77.36,70.33,70.22,69.96,69.89,69.75,39.94,39.48,35.12,33.09,20.98； HRMS:C13H27N2O6 +[M+H]+calc.307.1869,found 307.1868.
Figure RE-GDA0003784716380000172
(R)-2-(tert-butoxycarbonyl)-3-(tritylthio)propanoic acid N-hydroxysuccinimidyl ester (BocCys(Trt)-OSu,6).BocCys(Trt)-OH(464mg,1mmol)和HBTU(417mg,1.1mmol)一起溶解于无水二氯甲烷DCM(10ml)，室温RT搅拌10min。之后加入弱碱DIEA(206mg,1.6 mmol)，反应继续搅拌10min。最后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS(127mg,1.1mmol)，反应约2-3h。薄层色谱TCL(cyclohexane/EtOAc 2/1,Rf 0.4)显示反应完全。反应溶液分配于 EtOAc/aq.NaH2PO4(2M)中，然后分离有机层，水层再用乙酸乙酯EtOAc萃取一次。所有有机层合并，饱和食盐水洗一次，置于无水硫酸钠上干燥，过滤，减压浓缩，真空干燥而得到NHS酯产物。梯度硅胶柱层析(cyclohexane→cyclohexane/EtOAc 4/1,3/1,直到2/1)得到459mg白色泡沫状固体即为终产物，收率82％。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.67(d,J＝8.32Hz,1H),7.33(m,12H),7.26(m,3H),3.91(m,1H),3.32(s,2H),2.75(s,4H),1.38(s,9H)；13C-NMR(DMSO-d6,101MHz):δ169.60,167.00,154.83,143.94,129.00,128.15,126.89,78.93, 66.71,51.67,32.28,28.03,25.37；HRMS:C31H33N2O6S+[M+H]+calc.561.2059,found561.2057.
Figure RE-GDA0003784716380000181
(R)-5-(2-(2-(2-(2-(2-(tert-butoxycarbonyl)-3-(tritylthio)propanamido)ethoxy)ethoxy)eth oxy)ethylamino)-5-oxopentanoic acid(BocCys(Trt)-PEG4-Glu-COOH,7).BocCys(Trt)-OSu (440mg,0.78mmol)溶解于四氢呋喃THF(4.5ml)，之后将其逐滴加进搅拌着的 nTFA·H2N-PEG4-Glu-COOH(423mg,～1mmol)和DIEA(387mg,3mmol)之碱性四氢呋喃 THF(3.5ml)溶液.反应液在室温搅拌8h。之后反应液分配于EtOAc/aq.NaH2PO4(2M)中。分离有机层，水层用乙酸乙酯EtOAc再萃取两次。所有有机层合并，用2M aq.NaH2PO4洗四次，可基本除去NHS副产物以及过量的H2N-PEG4-Glu-COOH原料。有机层用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，梯度硅胶柱层析(EtOAc→EtOAc/MeOH 20/1,最后EtOAc/MeOH 15/1)而得到235mg白色泡沫状固体产物，产率40％.1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz):δ12.00(s,br,1H),7.84(t,J＝5.76Hz,1H),7.74(t,J＝5.40Hz,1H),7.36-7.20(m,15H),6.87(d,J＝8.36Hz,1H)；3.91(m,1H),3.48(m,10H),3.38(t,J＝5.92Hz,2H),3.17(m,4H),2.32 (d,J＝7.08Hz,2H),2.19(t,J＝7.44Hz,2H),2.09(t,J＝7.44Hz,2H),1.69(m,2H),1.37(s,9H)；13C-NMR(DMSO-d6,101MHz):δ174.16,171.70,170.08,144.32,129.08,128.02,126.75,78.37, 69.71,69.60,69.53,69.10,68.86,65.86,53.39,38.44,34.37,32.99,28.11,20.67；HRMS: C40H54N3O9S+[M+H]+calc.752.3581,found 752.3582.
Figure RE-GDA0003784716380000182
tert-butyl4-(4-((2,4-diaminopyrimidin-5-yl)methyl)-2,6-dimethoxyphenoxy)butylcarba mate(TMP-Bu-NHBoc,9).二甲氧苄啶酚,i.e.TMP-OH(8)可从甲氧苄啶TMP脱甲基而来，可参考文献(Chen et al.,Chem.Commun.2015,51,16537)。之后TMP-OH(1.1g,4mmol)、 4-Boc-1-bromobutylamine(1.06g,4.2mmol)、Cs2CO3(2.74g,8.4mmol)以及NaI·2H2O(0.6g, 4mmol)一起悬浮/溶解于无水DMF(20ml)。反应溶液在氩气保护下于室温搅拌20h。反应液分配于EtOAc/H2O，有机层分离后，水层用乙酸乙酯再萃取三次，所有有机层合并，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，梯度硅胶柱层析(EtOAc→CHCl3→CHCl3/MeOH 10/1)而得到粗产物。二次硅胶柱层析(CHCl3/MeOH 10/1,Rf0.4)得到570mg浅黄色高纯的固体产物，产率32％。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.51 (s,1H),6.77(t,J＝5.84,1H),6.54(s,2H),6.08(s,2H),5.69(s,2H),3.77(t,J＝7.25Hz,2H),3.71 (s,6H),3.52(s,2H),2.95(m,2H),1.53(m,3H),1.37(s,9H)；13C-NMR(DMSO-d6,101MHz):δ 162.22,162.19,155.69,155.58,152.85,135.86,134.64,105.86,105.78,77.28,72.02,55.82, 32.97,28.25,27.01,26.09；HRMS:C22H34N5O5 +[M+H]+calc.448.2560,found 448.2560.
Figure RE-GDA0003784716380000191
5-(4-(4-aminobutoxy)-3,5-dimethoxybenzyl)pyrimidine-2,4-diamine(TMP-Bu-NH2,10). TMP-Bu-NHBoc(186mg,0.416mmol)溶解于1ml的无水二氯甲烷DCM中，然后加入0.5ml 的三氟乙酸TFA，室温搅拌1h脱保护。真空除去DCM和TFA等挥发性组分得到144mg三氟乙酸盐产物。将产物分配于EtOAc/aq.Na2CO3，有机层分离，水层用乙酸乙酯再萃取多次，所有有机层合并，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，真空干燥得到 122克白色固体产物，产率几乎定量。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.51(s,1H),6.53(s, 1H),6.06(s,1H),5.67(s,1H),3.77(t,J＝6.36Hz,2H),3.71(s,6H),2.55(t,J＝6.72Hz,2H),1.61 (m,2H),1.45(m,2H)；13C-NMR(DMSO-d6,101MHz):δ162.24,162.17,155.72,152.86,135.60, 134.96,105.90,105.77,72.36,55.85,41.41,32.95,29.72,27.15；HRMS:C17H26N5O3 +[M+H]+ calc.348.2036,found 348.2036.
Figure RE-GDA0003784716380000192
(R)-tert-butyl 1-(2-(2-(2-(2-(5-(4-(4-((2,4-diaminopyrimidin-5-yl)methyl)-2,6-dimethoxyphenoxy)butylamin o)-5-oxopentanamido)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethylamino)-1-oxo-3-(tritylthio)propan-2-ylcarb amate(BocCys(Trt)-TMP,11).BocCys(Trt)-PEG4-Glu-COOH(75.2mg,0.1mmol)溶解于1ml 无水二氯甲烷DCM。之后加入42mg HATU(0.11mmol)和DIEA(36mg,0.28mmol)，反应液搅拌5-10min后加入TMP-Bu-NH2(35mg,0.1mmol)。反应液混合物在室温继续搅拌过夜而得到一个澄清溶液。反应液分配于EtOAc/aq.Na2CO3中，然后用乙酸乙酯萃取两次，所有有机层合并，依次用aq.NaH2PO4(2M)，aq.Na2CO3，饱和食盐水洗。之后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，梯度硅胶柱层析(CHCl3/MeOH 10/1,8/1,最后5/1,Rf(CHCl3/MeOH 5/1) ＝0.5)得到61.2mg淡黄色产物，产率57％。1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ7.84(t, J＝5.88Hz,1H),7.77(m,2H),7.49(s,1H),7.32(t,J＝7.5Hz,6H),7.28(d,J＝7.92Hz,6H),7.24(t, J＝7.08Hz,3H),6.92(d,J＝8.52Hz,1H),6.54(s,1H),6.38(br,2H),5.97(s,2H),4.12(s,2H),3.92 (m,1H),3.78(t,J＝6.0Hz,2H),3.70(s,6H),3.52(s,2H),3.47(br,4H),3.45(br,4H),3.19(m, 1H),3.12(m,1H),3.05(m,2H),2.04(m,2H),1.55(m,2H),1.53(m,2H),1.37(s,9H)；13C-NMR(DMSO-d6,151MHz):δ171.88,171.58,170.15,162.51,161.00,154.92,152.91, 144.35,135.28,134.88,129.12,128.08,128.79,106.31,105.88,78.39,72.00,69.74,69.63,69.56, 69.16,68.89,65.87,55.85,53.41,40.06,38.68,38.45,38.17,34.84,34.77,34.06,32.88,28.15, 27.16,25.76,21.63；HRMS:C57H77N8O11S+[M+H]+calc.1081.5427,found 1081.5471.
Figure RE-GDA0003784716380000201
(R)-N1-(2-(2-(2-(2-(2-amino-3-mercaptopropanamido)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-N5-( 4-(4-((2,4-diaminopyrimidin-5-yl)methyl)-2,6-dimethoxyphenoxy)butyl)glutaramide (CysTMP,1).BocCys(Trt)-TMP(25mg,0.023mmol)溶解于1ml of TFA，之后加入25μl的 TIS。室温下氩气保护反应1h。TFA和TIS等挥发性组分于真空下被除去，得到的产物分配于EtOAc/H2O。有机层用乙酸乙酯洗两次，浓缩，真空干燥得到白色泡沫状产物，产率 86％。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.54(t,J＝5.7Hz,1H,8.29(br,3H),7.84(t,J＝5.6Hz,1H), 7.77(t,J＝5.6Hz,1H),7.74(s,1H),7.64(s,br,2H),7.44(s,1H),6.60(s,2H),3.95(t,J＝5.6Hz, 1H),3.79(t,J＝6.28Hz,2H),3.73(s,6H),3.59(s,2H),3.51(br,4H),3.50(br,4H),3.39(t, J＝6.1Hz,2H),3.34(m,1H),3.26(m,1H),3.18(m,2H),3.06(m,2H),2.90(br,2H),2.05(m,4H), 1.68(m,2H),1.57(m,4H)；13C-NMR(DMSO-d6,101MHz):δ171.88,171.57,166.72,164.06, 154.28,153.06,139.77,135.33,132.79,108.92,106.30,71.99,69.71,69.58,69.53,69.09,68.71, 55.92,53.90,38.40,38.13,34.83,34.77,32.08,30.75,27.12,25.72,25.13,21.60；HRMS: C33H55N8O9S+[M+H]+calc.739.3807,found 739.3820.
合成临近效应化学诱导分子—TMP-Cl(14)
Figure RE-GDA0003784716380000202
反应流程式2|CIP化学分子TMP-Cl(14)的合成路线.i)Cs2CO3,DMF,RT,ON,Ar,54％yield.
Figure RE-GDA0003784716380000203
5-(4-((21-chloro-3,6,9,12,15-pentaoxahenicosyl)oxy)-3,5-dimethoxybenzyl) pyrimidine-2,4-diamine(TMP-Cl,14).二甲氧苄啶dimethoprim(TMP-OH，12)和 TsO-PEG5-Cl(13)根据之前报道的流程而合成(Chen,etal.Angew.Chem.Int.Ed.2017,56, 5916)。之后，TMP-OH(12，50mg，0.18mmol)与TsO-PEG5-Cl(13，97.2mg，0.19mmol) 和Cs2CO3(76.3mg，0.234mmol)加入进一个双颈圆底烧瓶，之后加入无水DMF(1.8ml)，反应悬浊液于氩气保护下于室温快速搅拌过夜，完成偶联反应。DMF在真空下被除去。加入少量甲醇溶解，然后抽真空，如此共重复约三次以较为彻底地除去DMF。干燥后的残渣分配进EtOAc/Na2CO3(aq.)中，之后分离出有机层。而水层用乙酸乙酯再萃取两次。所有有机层合并，之后用饱和食盐水洗两次，用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩之后用梯度硅胶柱层析(EtOAc:MeOH 10:1→8:1→DCM:MeOH 10:1)而得到60.4mg的白色固体产物，产率54％。核磁和质谱表征数据跟上述提到的文献一致。1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ7.50(s,1H),6.54(s,2H),6.11(s,2H),5.72(s,2H),3.90(t,2H,J＝5.1Hz),3.71(s,6H),3.63-3.69 (m,4H),3.56(m,2H),3.48-3.53(m,14H),3.45(m,2H),3.35(t,2H,t,J＝6.48Hz),1.70(m,2H), 1.47(m,2H),1.37(m,2H),1.29(m,2H).MS(ESI):C29H48O8N4Cl+[M+H]+,calcd.615.32, found 615.42.
合成叠氮基氰基苯并噻唑AzidoCBT(ACBT,17)
Figure RE-GDA0003784716380000211
反应流程式3|叠氮基氰基苯并噻唑ACBT(17)的合成路线.i)HATU,DIEA,DMF,RT,1day, 60％yield.
Figure RE-GDA0003784716380000212
3-(2-(2-(2-Azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)-N-(2-cyanobenzo[d]thiazol-6-yl)propenamide (ACBT,17).在一个彻底干燥的圆底烧瓶RBF中将azido-PEG3-acid(33.5mg,0.136mmol,15) 溶解于0.6ml无水DMF。加入HATU(57.5mg,0.136mmol)和DIEA(38mg,0.29mmol)，之后在氩气保护下搅拌数分钟，之后加入amino-CBT(20mg,0.113mmol,16)，室温搅拌反应1 天。反应液分配于EtOAc/NaH2PO4(2M)，分离有机层，水层用乙酸乙酯洗两次。所有有机层合并，饱和碳酸氢钠sat.Na2CO3洗一次，过滤，浓缩，硅胶柱层析(EtOAc,Rf0.25)得到 27.7mg粘稠状的带黄色的油状产物，产率60％。1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ10.47(s,1H), 8.76(t,J＝2.22Hz,1H),8.18(dd,J1＝8.94Hz,J2＝1.92Hz,1H),7.73(d,J＝9Hz,1H),3.73(td, J1＝6.24Hz,J2＝1.98Hz,2H),3.48-3.55(m,11H),3.33(s,2H),2.63(td,J1＝6.02Hz,J2＝1.98Hz, 2H)；13C-NMR(DMSO-d6,151MHz):170.05,147.55,139.71,136.79,134.92,124.83,120.65, 113.66,111.09,69.81,69.76,69.74,69.68,69.24,66.54,49.97,37.33；HRMS:C17H20N6O4SNa+ [M+Na]+calcd.427.1159,found 427.1151.
第一部分：通用型SNACIP诱导剂—cRGT的设计、制备、表征和细胞调控应用
实施例1：设计制备小分子纳米抗体偶联物SNACIP诱导剂的通用策略
SNACIP诱导剂结构通式：小分子结合部—纳米抗体靶头—连接子—胞内递送模组，示意图如图1所示。
按照如上结构通式通过融合表达手段搭配化学偶联方式制备相应的SNACIP诱导剂：
(1)小分子结合部的引入：如果是普通型的SNACIP诱导剂，那么小分子结合部应当通过化学偶联(bioconjugation)的方式引入，如果是潜在型的SNACIP诱导剂，那么小分子是利用了翻译后修饰的方式而引入的，那么纳米抗体上应当携带相应的翻译后修饰多肽序列。
(2)纳米抗体靶头的引入：可以用已知的纳米抗体序列表达出来，或者通过其它方式例如噬菌体展示技术制备新的纳米抗体。
(3)连接子：如果是环状跨膜肽或者其它无法用基因表达的跨膜组件，需要通过化学偶联的方式引入，连接子可以是共价键，包括硫醚键，二硫键；如果是多肽类线性跨膜肽如 Tat序列，可以通过直接融合表达的方式引入(多肽键)。
(4)胞内递送模组：环状跨膜肽是一个优异的跨膜组件；线性跨膜肽也可以，因为纳米抗体较小，还是有一部分的SNACIP诱导剂能够通过非胞吞途径进入细胞而释放在胞浆中而起效果。
胞内递送模组可以是如下一种：新的环状跨膜肽—cR10*，
Figure RE-GDA0003784716380000221
Cys-(Gly)n-cyclic(KrRrRrRrRrRE)-NH2，其中n为零或自然数，r：L-Arg,R:L-Arg，其结构
实施例2：设计三种不同特色的SNACIP诱导剂
(1)通用型SNACIP诱导剂—cRGT，可以实现对融合了GFP突变体或者eDHFR标签的蛋白的功能以及相应的细胞进程的调控，其结构元素如图2中的a。
(2)潜在型SNACIP诱导剂—cRTC，可以实现对内源的无序蛋白也是无配体结合蛋白靶标的直接调控，其结构元素如图2中的b。
(3)双价型SNACIP诱导剂—CTTC，更适合于在活体内部对蛋白的功能进行调控，具有发展成纳米抗体药物的潜力，其结构元素如图2中的c。
实施例3：设计、构建、以及生化表征通用型SNACIP诱导剂—cRGT
由于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是目前最为广泛使用的荧光蛋白 (fluorescents protein，FPs)之一，直接调控GFP融合的蛋白的功能将会是一种通用型的调控手段。此外，GFP也是一个荧光分子，也就意味着能够实现同时调控和成像显影感应区的蛋白(protein of interest)。目前尚未有高亲和力直接结合GFP蛋白的小分子配体被报道，因此GFP也是一个无小分子配体的靶标蛋白。
通用型SNACIP二聚化分子—cR10*-SS-GBP-TMP，或cRGT(图3a)：cRGT包含一个GFP结合蛋白(GFP binding protein，GBP，Kd＝1.4nM)的纳米抗体靶头，以及一个甲氧苄啶(trimethoprim，TMP)小分子配体靶头。由于甲氧苄啶能够与大肠杆菌二氢叶酸还原酶(E.coli.dihydrofolate reductase，eDHFR)高亲和力且可逆地结合，因而cRGT能够诱导GFP和eDHFR的二聚化。新的环状跨膜肽—cR10*，它通过一个可切断的二硫键而连接上GBP-TMP而得到cRGT。cR10*在协助cRGT穿过质膜(plasma membrane，PM)之后，在细胞内的还原性环境下，cR10*可以很快地从cRGT上被切除掉，进而避免cR10*对 GBP-TMP二聚化分子可能的影响(图3a，右)。其具体的合成方法如下：
首先合成CysTMP化学小分子，CysTMP用于将TMP配体引入到GBP纳米抗体上(Cys-TMP合成方法如反应流程式1)。CysTMP含有一个N-端半胱氨酸，一个水溶性的 PEG链，以及一个TMP部分用于结合eDHFR蛋白标签(结构如图3b)。与此同时，Cys-cR10* 环状跨膜肽也可通过经典多肽固相合成的方法合成出来(图4)，Cys-cR10*包含一个L-Cys 残基、一个(Gly)5链、以及cyclic(KrRrRrRrRrRE)环状跨膜肽(结构如图3c)。在制备了 CysTMP以及Cys-cR10*后，cRGT通过仅仅两步反应就可被快捷地构建出来(图3d)。
第一步是表达蛋白连接(expressed protein ligation，EPL)：CysTMP跟GBP-intein-CBD (内含肽—几丁质结合域(intein-CBD；CBD：chitin binding domain)标签融合的GFP纳米抗体)(图3e，嵌合体I)通过EPL反应而将TMP配体连接到GBP纳米抗体的C-端得到 GBP-TMP(图3f，嵌合体III)，在连接反应过程中CBD标签也会被切除(图3f，嵌合体 II)，反式镍柱纯化之后很容易得到纯的GBP-TMP(图3g)。
第二步是二硫键化反应：携带了半胱氨酸残基的GBP-TMP偶联物与Cys-cR10*跨膜肽通过二硫键共价结合，基于二硫键化反应就可构建出cR10*-SS-GBP-TMP产物，即cRGT(图3h，左，偶联物IV),在还原性环境下cR10*容易被切除而得到GBP-TMP(图3h，右)。
更为详细的制备步骤如下：
(1)Ni-NTA IMAC纯化GBP-Intein-CBD，并交换进pH 8.0缓冲液A中(PBS，0.5MNaCl,3％glycerol，含咪唑)；
(2)加入pH8.0的MENSNa(2M stock)至终浓度0.4M及pH8.0的MPAA(1.1M stock)至终浓度0.2M；
(3)加入CysTMP(25mM stock)至终浓度1mM，于冰上孵育1天；次日加入额外的终浓度1mM的CysTMP，于冰上再孵育2天；
(4)Ni-NTA IMAC纯化除去被切掉的intein以及一些未反应的GBP-Intein-CBD；
(5)与用缓冲液A预先平衡过的几丁质树脂(chitin resin)混合孵育，于4度旋转2小时后收集流出液；
(6)通过超滤交换进pH8.3的DTNP缓冲液中(50mM Na2HPO4，0.5M NaCl)，加入2当量的TCEP(20mM母液)孵育45min；
(7)加入10当量DTNP(100mM母液)孵育60min，之后超滤3次交换进pH9.0的二硫键化缓冲液(disulfidization buffer：50mM HEPES，0.5M NaCl)，超滤除掉过量的DTNP 等小分子；
(8)加入Cys-cR10*(25mM stock in DMSO)至终浓度1mM，冰上孵育30min；
(9)超滤1次将蛋白交换进PBS溶液中，得到cRGT纳抗偶联二聚化药物分子，测定浓度，分装，液氮冷冻后存于-80度冰箱。
通过体积排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)证实了GBP-TMP纳米抗体偶联物的确能够诱导EGFP和eDHFR之间的二聚化。可以看到，在GBP-TMP的存在下，可以形成稳定的EGFP/GBP-TMP/eDFHR三元复合物，而没有GBP-TMP的存在下，eDHFR 和EGFP无法形成蛋白复合物(图3i-k)。我们进一步通过荧光共振能量转移(
Figure RE-GDA0003784716380000241
resonance energytransfer，FRET)手段证实了这个二聚化过程，可以看到EGFP荧光蛋白供体(donor) 和mScarlet-eDHFR荧光蛋白受体(acceptor)在GBP-TMP的存在下的而相互作用(图3l-m)。
实施例4：cRGT能够快速进膜并实现无洗的(no-wash)、可逆的、计量依赖的以及彻底地调控胞内EGFP和eDHFR之间的二聚化
用一个双顺反子载体实现HeLa活细胞共表达EGFP-mito和mCherry-eDHFR，并用以测试cRGT调控胞内二聚化的效果(图5a)。HeLa细胞用24μM的cRGT处理1.5h，不用洗直接用于显微成像分析。可以发现cRGT把mCherry-eDHFR从胞浆当中定位到了 EGFP-mito所在的线粒体上(mito：线粒体定位多肽序列)，通过放大的高分辨共聚焦图片以及接近1.0的Pearson相关系数值(图5b)可以看到这个定位调控非常彻底，这个可以被归功于形成了稳定的EGFP/GBP-TMP/eDHFR三元蛋白复合物(图3i-k)。这个很高的共定位数值相比于此前报道的可相比的CID系统(PCC：0.65-0.75)显示出cRGT是一个优异的二聚化分子。由于甲氧苄啶(TMP)是一个已知的eDHFR蛋白标签的抑制剂，我们加入终浓度为10μM的TMP到细胞培养基中，数分钟内可诱导去二聚化过程，显示出cRGT诱导的二聚化系统也是可逆的(图5b)。
我们后续研究了cRGT进入细胞并诱导二聚化的动力学过程(图5c)。我们发现cRGT可以快至3min内进入细胞，在8min内已经诱导了明显的胞内二聚化过程(图5d)。动力学研究显示了cRGT诱导最大程度二聚化的t1/2＝7.26±0.53min(图5e)，这个速率几乎可以跟最有效的化学CID体系相比拟。因此cRGT是一个很优异的二聚化分子，可以用来调控和解析快速的生物学过程，以及调控低浓度的靶标蛋白。
胞浆中的mCherry-eDHFR被定位到线粒体的过程是具有浓度依耐性的，其中24μM的 cRGT是一个最理想的浓度(图5f-g)。与此相反，不携带cR10*模组的GBP-TMP纳米抗体偶联物无法诱导胞内的二聚化过程，即便将其浓度提升到24μM的两倍，即48μM时也无法诱导胞内二聚化，这个实验说明了cR10*模组之于cRGT高效的胞内递送的必要性(图 5h-i)。
实施例5：cRGT调控EGFP到不同胞内结构的定位
诸多细胞进程是由蛋白在细胞内的动态分布而实现调控的。我们验证了cRGT可以调控 EGFP到不同亚细胞结构区域的定位，包括线粒体，高尔基体和细胞核膜亚细胞区域。在 HeLa细胞中共表达mScarlet-eDHFR-mito(线粒体定位)和EGFP(胞浆中分布)，cRGT (24μM，1.5h)将EGFP从胞浆中定位到mScarlet-eDHFR-mito所在的线粒体外膜上，定位过程非常完全，通过添加TMP(10μM，10min)，该定位调控过程被迅速可逆化(图6a)。在HeLa细胞中共表达mCherry-eDHFR-Rab1b(高尔基体定位)和EGFP，之后用cRGT(24 μM，1.5h)处理，可以发现EGFP从胞浆中被定位到mCherry-eDHFR-Rab1b所在的高尔基体上，通过添加TMP(10μM，10min)，该定位调控过程也被迅速可逆化(图6b)。在 HeLa细胞中共表达mCherry-eDHFR-LaminA/C(细胞核内膜定位)和EGFP，之后用cRGT (24μM，1.5h)处理发现EGFP从胞浆中被定位到mCherry-eDHFR-Lamin A/C所在的细胞核膜上(图6c)。通过统计学PCC和划线分析方法更进一步证实了这个结果(图6d-e)。
实施例6：cRGT也能调控GFP的突变体黄色荧光的mEYFP的定位，同时对其它常用荧光蛋白具有生物正交性
黄色荧光蛋白mEYFP以及青色荧光蛋白mTurquoise2是GFP荧光蛋白很接近的突变体。我们发现mEYFP的定位能够有效被cRGT调控(图7a)，而mTurquoise2的定位却无法被调控(图7b)。这是一个有趣的现象，但是也可以被合理地解释：GFP中的Asn146 作为一个与GBP的Asn99残基起着关键氢键相互作用的残基，它在EGFP和mEYFP中被保留了下来，然而在mTurquoise2中却被突变为Ile146。利用没有融合荧光蛋白的 eDHFR-mito，我们进一步证实了cRGT二聚化分子之于其它常用的荧光蛋白来说是完全正交的，这些荧光蛋白包括mTagBFP2、mTurquoise2、DsRed、mScarlet和mCherry，从光谱范围从蓝色跨越到深红色(图7c-h)。因此cRGT是一个多面手，能够调控EGFP、mEYFP 以及eDHFR所融合的感兴趣的蛋白，同时也对其它的荧光蛋白具有很好的正交性。
实施例7：cRGT将Rac1定位到细胞膜上而实现对细胞信号转导的调控过程
将蛋白定位到细胞膜是一种激活信号级联反应的通用方法。为此，我们打算用cRGT 来调控信号转导的过程。Rac1-介导的信号转导过程在细胞伪足形成过程中扮演关键角色，这个过程也在癌细胞的转移和侵袭中起到重要作用，为此我们设计通过使用cRGT将Rac1 定位到细胞膜上而实现激活相应的细胞伪足形成过程中的信号转导过程(图8a)。我们发现cRGT能够将Rac1的活性突变体清晰地定位到细胞质膜功能区，同时也诱导了细胞形态的显著变化，细胞显示出一种非常延伸式的形态，同时也产生了不少新形成的伪足(图8b，右下方，白色箭头所示)。在加入10μM的TMP之后，这个过程被完全可逆了(图8b-c)。用cRGT处理之后，细胞的平均面积从1500μm2增加到2500μm2，而在加入TMP之后细胞的平均面积又显著缩小了(图8d)。相较与一个具有可比性的化学诱导二聚化分子—TMP-Cl， cRGT可以诱导更为彻底的细胞定位，显示出SNACIP二聚化系统具有优异的动态范围(图 8e-f，图9，TMP-Cl合成方法如反应流程式2所示)。因此基于cRGT的SNACIP临近诱导系统相比传统的CID化学小分子在研究生物系统过程中具有独特优势。
实施例8：cRGT通过将驱动蛋白定位到胞内货物上而调控和研究马达蛋白—货物专一性问题
接下来我们进一步用SNACIP来研究生物学问题。马达蛋白—货物之间的专一性是胞内转运过程中的一个重要问题。然而很多相关的问题尚不清楚。为此，我们首先展示了驱动蛋白介导的货物转运过程可以实现“关”-“开”-“关”-“开”的多次可逆调控，这个过程可以通过洗去培养基中的TMP小分子抑制剂而实现，更进一步地凸显出SCNACID技术的优越可逆性 (图10a-c)。驱动蛋白可以被很彻底被定位到过氧化物酶体“货物”上，也可以从“货物”上被释放下来。这个过程实现了对过氧化物酶体“货物”沿着微管向细胞边沿微管正极方向地可逆转运调控(图10b-h)。我们对比了过氧化物酶体和初级内体这两种不同的胞内“货物”，发现过氧化物酶体而非初级内体是KIF5B马达蛋白可被高效转运“货物”(图10i-n)。
实施例9：cRGT通过调控GPX4而激活铁死亡进程
铁死亡是近期被发现的一种非细胞凋亡形式的程序性细胞死亡方式，具有铁依赖特性，并且也伴随着线粒体的形态变化以及脂质活性氧(ROS)的增加。目前推测靶向铁死亡是一种新的杀死耐药性癌细胞的有前途的方法，因为癌细胞表现出一种比正常细胞更高的铁死亡依耐性。受此启发，我们着眼于用cRGT来激活铁死亡过程。在诸多的铁死亡相关因子中，谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)被认为是最为重要的因子之一，起到保护细胞膜被过氧化伤害的作用(图11a)。此外，最近的一项研究表明，通过基因组层面的CRISPR筛选发现了不少过氧化物酶体组分，包括PEX3，也对铁死亡敏感性有促进作用。因此我们预测将铁死亡抑制剂GPX4定位到过氧化物酶体表面的PEX3上可以抑制GPX4的功能同时激活铁死亡进程(图11b)。我们发现cRGT(24μM，2h)处理的活HeLa细胞能够将EGFP-GPX4 高效定位到PEX3-mCherry-eDHFR所在的过氧化物酶体表面，同时伴随着明显的线粒体形态的变化以及细胞形态的变化(图11c-d)。可以观察到比正常形态线粒体更小的异形的带凝缩状的线粒体，以及非正常形态的细胞(图11c)。这些现象与经典的铁死亡细胞的特征完全相符，说明cRGT快速地激活了癌细胞中的铁死亡过程。
第二部分实施例：潜在型SNACIP诱导剂—cRTC的设计、制备、表征和细胞调控应用
实施例10：调研和选择TPX2这个关键微管成核因子作为内源靶标来设计相应的SNACIP诱导剂用于抑制细胞分裂过程。
内源的无配体结合蛋白是传统CID手段难以调控的靶标蛋白。在这些无配体结合靶标蛋白中，天然无序蛋白(intrinsically disordered proteins，IDPs)是一个主要类别，由于IDPs 的重要生物学功能，他们目前受到越来约高的重视。微管成核是细胞骨架领域的一个重要问题。微管成核子(microtubule nucleator)—γTuRC，即gamma-微管蛋白环状复合物的结构已经被解析，然而微管成核过程中的其它诸多关键因子，如augmin复合物和属于IDP类别的数个成核因子的结构仍然是迷。更进一步，关键微管成核因子的对于细胞分裂来说是至关重要的，严格的基因调控方法如基因敲除会直接导致细胞的分裂受阻和死亡，无法建立相应的基因敲除细胞系，从而不适合用来研究成核因子对于细胞功能的作用。
内在无序蛋白TPX2是一个微管成核的关键调控因子，其介导纺锤体组装过程中Ran 信号通路；作为一个癌蛋白，TPX2在诸多癌细胞中过量表达，其中就包括最难以治愈的肝癌(图12a)。鉴于此，我们拟设计出一种潜在型SNACIP诱导剂来调控TPX2的功能。潜在型SNACIP二聚化分子的特点在于其包含一个基因编码的待修饰多肽序列，这个多肽序列可以巧妙利用活细胞内的内源翻译后修饰(post-translational modification，PTM)机器而引入一个小分子结合模组到待修饰多肽序列上，进而将潜在SNACIP二聚化分子转化为一个功能性的SNACIP调控分子。这个策略可以大大便利SNACIP二聚化分子的构建，使共价引入cR10*成为唯一的主要生物共轭步骤。
实施例11：设计制备和表征潜在型SNACIP调控剂—cRTC用于调控肿瘤不受控分裂过程中的微管成核因子蛋白—hTPX2
为此设计和构建了潜在型SNACIP诱导剂—cR10*-TBP-CAAX，或cRTC，它的特征在于包含一个人源TPX2(hTPX2)结合蛋白(TBP)的纳米抗体，在TBP纳米抗体的N-端有一个环状cR10*跨膜肽，其C-端有一个CAAX盒子多肽序列，CAAX盒子能够在活细胞内被异戊二烯化(图12b，左侧)。这里，异戊二烯转移酶催化的CAAX盒子的异戊二烯化是一个研究得较为成熟的翻译后修饰机制。一旦cRTC穿透了细胞，它将会被转换成具有功能性的farnesyl—cRTC的SNACIP诱导剂，并会锚定在细胞质膜内侧上；与此同时，TBP 纳米抗体会招募内源的hTPX2蛋白到非功能性的细胞质膜区域，消耗或者减少胞浆中的 TPX2的水平，进而抑制细胞增殖(图12b，右侧)。
我们通过噬菌体展示技术成功地筛选出了TPX2的纳米抗体。我们通过TEV蛋白酶切制备用于噬菌体展示的hTPX2抗原。由于在大肠杆菌中，hTPX2本身难以实现良好表达，因此我们首先构建了一个pET28b(TEV)_hTPX2-TEV-EGFP-His8质粒，含有一个EGFP标签，可以有效促进hTPX2的表达。该质粒具有一个C末端的His8标签，在hTPX2的C端有一个EGFP标签和一个TEV酶切位点。hTPX2-TEV-EGFP-His8按照前面所述的通用蛋白表达方案用大肠杆菌表达。更具体步骤如下。在加入IPTG诱导后，大肠杆菌Rosetta 2a在30℃下过夜培养。先后将大肠杆菌离心、裂解、再次高速离心和梯度Ni-IMAC纯化后，得到溶解于pH8.0缓冲液A+(即含额外3mM的BME的A液)中的hTPX2-TEV-EGFP-His8。随后加入适当量的TEV蛋白酶，蛋白溶液在2℃孵育过夜，酶切hTPX2-TEV-EGFP-His8，使 hTPX2与EGFP-His8断裂开。蛋白溶液再次进行Ni-IMAC纯化，首先用不含咪唑的缓冲液 A+洗脱hTPX2。酶切后的含His8的片段和His标签融合的蛋白酶与镍柱结合更紧密，因此只能在更高浓度的咪唑下才能被洗脱下来，从而更hTPX2分离开来。将hTPX2蛋白组分合并，超滤浓缩，以PBS缓冲液为洗脱液，采用Superdex200 10/300increase GL柱进行体积排阻色谱。hTPX2的PBS溶液合并超滤浓缩后，分装，液氮中快速冷冻，在-80℃下保存，随后用于羊驼纳米抗体筛选。为了定量蛋白质浓度，通常将1μl的蛋白质样品用DS-11FX(+) DeNovix分光光度计/荧光计进行测量。通过测量A280，利用M.W.以及摩尔消光系数ε即可测得较为准确的蛋白质浓度：c(mg·ml-1)＝[A280×M.W.(g·mol-1)]/ε(L·mol-1·cm-1)。
接下来通过M13噬菌体展示技术来制备纳米抗体，筛选到了一个具有高结合力的纳米抗体TBP(TPX2binding protein)，之后将制备的TBP纳米抗体表达纯化，并用于ITC测量。首先克隆了pET28b(TEV)_His8-mCherry-TEV-TBP，并按照前面所述方案表达，IPTG诱导后30℃振荡培养过夜。纯化后的TBP纳米抗体用适当量的TEV蛋白酶在2℃下过夜实现彻底酶切。蛋白质溶液再次进行Ni-IMAC纯化，首先用无咪唑/A缓冲液洗脱TPX2纳米抗体并纯化用于后续分析。酶切下来的的His8-mCherry片段、His8融合的TEV蛋白酶和大多数杂质由于与镍柱有较高的结合亲和力而被去除，从而得到较高纯度的hTPX2纳米抗体。等温滴定量热法ITC揭示了TBP与hTPX2的结合Kd值为287nM，当量比为1：5。负值的ΔS 也意味着这个结合过程伴随着显著的构象变化(图12d)。这个TBP就被用于构建cRTC之 SNACIP诱导剂。
实施例12：设计制备和表征潜在型SNACIP调控剂—cRTC用于调控肿瘤不受控分裂过程中的微管成核因子蛋白—hTPX2
接下来从叠氮功能化的TBP-CAAX开始通过串联生物正交连接反应一锅法(one-pot) 而实现对cRTC的制备(图12c)。这个制备方案使后续异戊二烯化所必须的CAAX盒子中的半胱氨酸残基在整个连接过程中可保持完全不被影响而保持活性。首先，携带一个N-端半胱氨酸的Cys-TBP-CAAX(图12e，V)蛋白可以通过TEV酶切His8-TEV’-TBP-CAAX 而轻松得到。之后，Cys-TBP-CAAX(V)与双功能azidoCBT(ACBT，ACBT的合成方法如反应流程式3)基于CBT连接而偶联得到ACBT-TBP-CAAX(图12f，偶联物VI)。与此同时，Cys-cR10*与BCN-PEG2-Mal双功能连接子通过原位(in situ)Michael加成反应而得到cR10*-BCN，这个cR10*-BCN可以无需分离直接再跟ACBT-TBP-CAAX(VI)通过环张力促进的叠氮—炔加成(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)反应而一锅法得到cRTC(图12g)。整个连接反应过程在24h内可以完成。值得注意的是，CBT部分本身是可以产生荧光的，从而让后续分析cRTC的胞内定位和转运很容易。
在一个代表性反应中，前面所制备的Cys-TBP-CAAX蛋白首先交换进pH7.2的PBS溶液中(1.78mg·ml-1)，然后即可加入4μl的ACBT(～10mM，终浓度～0.5mM)。2度孵育过夜，SDS-PAGE证实Cys-TBP-CAAX标记完全，之后交换进缓冲液A+中，得到 ACBT-TBP-CAAX中间体(1.95mg·ml-1，71μl，97％产率)。与此同时，15μl的Cys-cR10* (25mM/DMSO，0.375μmol)和10μl的BCN-PEG2-maleimide(25mM/DMSO，0.25μmol) 依次加进80μl的PBS溶液中，室温孵育～1h可完成thiol-maleimide连接反应。3.9μl的原位连接产物cR10*-BCN(～24mM，～1.2eq)加入进ACBT-TBP-CAAX溶液，孵育数小时后即能完成无铜催化点击反应标记。之后交换溶液进PBS之后，得到cR10*-TBP-CAAX纳抗偶联二聚化分子(1.52mg·ml-1，73μl，80％产率)，简称cRTC。
实施例13：cRTC将hTPX2移位到细胞膜非功能区而抑制细胞增殖
cRTC诱导剂清楚地把hTPX2蛋白在HepG2细胞中定位到了细胞质膜区域(图14a-d)。我们仅仅把TBP-CAAX蛋白中的CAAX盒子里唯一一个Cys17残基突变为不可被异戊二烯化的Ser17，可以看到该蛋白地细胞膜定位完全消失了，这个结果证明了cRTC的CAAX盒子中的Cys17残基的确发生了异戊二烯化，从而是cRTC转化为具有功能性的farnesyl-cRTC 二聚化分子(图13)。超分辨荧光显微术显示了cRTC调控分子清楚地与hTPX2在细胞膜上有共定位，同时产生了极化性的凝聚体形成(condensate-formation)现象(图14e)，这个现象与TPX2在体外的相分离行为相吻合。
我们接下来研究了用cRTC对TPX2活性的调低，是否可以抑制细胞的增殖。EdU细胞增殖测试结果显示，cRTC处理的HepG2细胞的EdU阳性率降低(图14f-g)，细胞核荧光强度也明显降低(图14h)。另外一个广泛应用的HeLa细胞测试显示出更大的细胞活力的降低(图14i-k)。我们进一步分析了细胞周期的不同时期的比例变化。S-期就是EdU阳性的细胞，而分裂期(M-期)的细胞可以容易地从细胞独特的形态(哑铃型或者球形)鉴别出来。因此我们能够绘制一个HeLa细胞周期变化的柱状图，结果显示S-期的细胞比例大大降低，与此同时M-期的细胞在cRTC处理之后几乎彻底消失了(图14l)。因此，cRTC抑制了肿瘤细胞的分裂过程，这个应该是通过阻止细胞周期进入M-期而实现。
第三部分实施例：双纳抗型SNACIP诱导剂—CTTC的设计、制备、细胞调控以及活体层面的应用
实施例14：双价型CTTC的设计和制备
线性的穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)：例如Tat多肽序列。
基于以上结果，我们预测调控hTPX2的SNACIP诱导剂能够被发展为SNACIP临近诱导药物来抑制体内肿瘤的增生。为了将cRTC更好地适应为活体内的测试，我们设计和制备了一个双价纳米抗体版本的潜在型SNACIP调控分子—mCherry-CPP-2xTBP-CAAX (CTTC)，包括一个串联的双价TBP纳米抗体2xTBP(图15a)。双价纳米抗体相比于单价纳米抗体已经被证实具有更高的抗体亲和力以及更长的血清半衰期。为了制备如上双价型 CTTC诱导剂，把相应的基因克隆进pET28b质粒载体，其中N-端含有一个His8的融合标签，表达之后通过镍柱亲和纯化，之后再用分子筛纯化，便可得到相应的潜在型双价型CTTC 这个SNACIP诱导剂，可以用于活体治疗。其对照版本不含CAAX序列的CTT蛋白，即 mCherry-CPP-2xTBP用相同的方式可以被表达纯化得到。
实施例15：双价型CTTC能够穿膜并抑制癌细胞增殖
我们制备了CTTC这个SNACIP诱导剂，其结构元素包括一个双价的TBP纳米抗体，一个Tat线性细胞穿膜肽，以及一个CAAX—盒子多肽序列。CTTC在进入细胞之后，能够被异戊二烯化后修饰而引入法尼基这个基团，进而被转化为一个功能型的SNACIP(图15a)。可以发现HeLa细胞用CTTC处理之后(10μM，2h)，CTTC能够进膜并定位到细胞质膜上(图15b，左)，同时将hTPX2也移位到细胞质膜上(图15b，右)。根据EdU细胞增殖实验结果，10μM的CTTC处理之后的HeLa细胞的细胞核的亮度明显降低(图15c)，同时EdU阳性率也大大减少(图15d)。这些结果说明CTTC具有抑制癌细胞增殖的效果。
实施例16：双价型CTTC在活体层面抑制肿瘤生长
通过对小鼠腋下注射5百万个HepG2肝癌细胞，得到了肝癌移位移植瘤模型小鼠(hepatocarcinoma xenograft mice model)(图15e)。可以发现对照组(PBS)的肿瘤生长速率同空白组几乎一样，仅仅对于小鼠被注射了CTTC的实验组，肿瘤大小在给药后24h 内开始有所降低，同时相比于对照和空白组，肿瘤的生长也能在更长的时间周期内被抑制(图15f-g)。我们也设计和制备了一个非SNACIP型的传统双价纳抗嵌合体—CTT，它与CTTC 相比仅仅少了一个CAAX盒子，而无法被转化为farnesyl-CTT这个SNACIP诱导剂(图16a)。用了同一组新的小鼠肝癌移植瘤模型，CTTC清晰地显示了比CTT更强的肿瘤抑制效果(图 16b)。这些活体实验数据进一步证实了SNACIP技术可以调控内源性无配体结合靶标，继而用于药物发展的潜力。
实施例17：TPX2的SNACIPs诱导剂抑制细胞增殖的机理研究
M—期被认为是细胞分离过程中最关键的时期，而正确的双极纺锤体的组装决定了M—期是否能往前进行。目前已经被普遍接受的是纺锤体通过三种关键通路而组装的：1)基于纺锤体，2)基于中心体的，和3)基于微管三种通路(图17a)。通路i)和iii)是无法取代，必不可少的，而纺锤体仍然可以在没有中心体的存在下实现组装(如植物细胞纺锤体)。
非洲爪蟾无细胞体系已经成为一个研究纺锤体组装机制的强有力的体系，它有诸多优点，尤其是具有很好的生化可及性，也就是没有细胞质膜的障碍，任何调控试剂(如抗体) 都可以直接加入而干预相关的生化进程。通过免疫耗竭的方式可以得到完全耗竭了TPX2的爪蟾卵提取物(图17b)。我们发现TPX2耗竭的非洲爪蟾卵提取物虽然不能形成纺锤体，但是其微管成核过程却仍然很激烈，这说明染色体介导的微管成核通路还在，并未被明显抑制(图17c)，相反基于微管的成核通路却被极大地抑制了(图17d-e)。因此我们得出结论，TPX2的SNACIP诱导剂通过抑制微管成核通路而使双极纺锤体无法正确组装，从而阻断了M—期的进行，进而使细胞分裂和增殖被抑制。

Claims (15)

1.一种小分子纳米抗体偶联物临近效应的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂是由小分子结合部、纳米抗体靶头、胞内递送模组和连接子组成，所述诱导剂的通式如下：小分子结合部—纳米抗体靶头—连接子—胞内递送模组。
2.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，小分子结合部可以通过共价连接的方式而直接引入或者进入细胞之后基于翻译后修饰机制而间接引入；所述纳米抗体是单价纳米抗体或者双价纳米抗体；所述胞内递送模组为环状跨膜肽或线性跨膜肽。
3.根据权利要求2所述的诱导剂，其特征在于，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸，所述线性跨膜肽为Tat多肽序列，所述环状十聚精氨酸的结构式示意如下：n为零或自然数，
Figure RE-FDA0003784716370000011
4.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述纳米抗体是荧光蛋白纳米抗体或介导细胞进程进行的胞内靶点的纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的诱导剂，其特征在于，所述荧光蛋白纳米抗体为绿色荧光蛋白纳米抗体GBP或红色荧光蛋白纳米抗体RBP；所述介导细胞进程进行的胞内靶点的纳米抗体为细胞分裂通路相关靶点的纳米抗体、肿瘤细胞侵袭通路的相关靶点的纳米抗体、铁死亡各种通路相关靶点的纳米抗体或与细胞骨架功能有关的相关靶点的纳米抗体。
6.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述小分子结合部是蛋白标签结合配体或蛋白翻译后修饰所能引入的胞内结合模组。
7.根据权利要求6所述的诱导剂，其特征在于，所述蛋白标签结合配体为甲氧苄啶或氯己基；所述蛋白翻译后修饰所能引入的胞内结合模组为异戊二烯基或豆蔻酰基。
8.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述连接子为二硫键、硫醚键或者肽键。
9.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述小分体结合部为甲氧苄啶TMP，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸cR10*，所述连接子为可还原被切断的二硫键，即为cR10*-GBP-TMP，即cRGT。
10.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂为潜在型SNACIP诱导剂，在进入细胞之后即被转化为功能型的farnesyl-cRTC诱导剂，所述纳米抗体为TPX2结合蛋白TBP，所述小分体结合部为能够被异戊二烯化的CAAX-box多肽序列，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸cR10*，所述连接子为马来酰亚胺与巯基反应而成的硫醚健，即为cR10*-TBP-CAAX，即cRTC。
11.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，属于潜在型SNACIP诱导剂，在进入细胞之后即被转化为功能型farnesyl-CTTC诱导剂，所述纳米抗体为双价TBP纳米抗体，所述小分体结合部为为能够被异戊二烯化的CAAX-box多肽序列，所述胞内递送模组为环状十聚精氨酸cR10*，所述连接子为肽键-NHCO-，即为mCherry-CPP-2×TBP-CAAX，即CTTC。
12.一种诱导细胞内临近效应的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
(1)选择细胞内目标蛋白识别的纳米抗体靶头；
(2)选择细胞内目标蛋白质或磷脂具有结合作用的小分子结合部或可以通过翻译后修饰引入小分子结合部；
(3)将步骤(1)的纳米抗体靶头与步骤(2)的小分子结合部进行化学偶联，获得偶联物或者将步骤(1)中的纳米抗体靶头与步骤(2)中的通过翻译后修饰引入的小分子结合部进行融合表达获得嵌合体；
(4)将胞内递送模组与步骤(3)获得的偶联物或者嵌合体通过化学方式偶联或者融合表达得到诱导剂；
(5)将步骤(4)获得诱导剂加入到细胞体系中诱导胞内临近效应过程。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述小分体结合部是CysTMP；步骤(4)中所述胞内递送模组为Cys-cR10*。
14.权利要求权利要求1-11任一项所述的诱导剂在调控细胞进程中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述应用为一种调控铁死亡的方法，所述方法是将GPX4定位到过氧化物酶体上，从而诱导铁死亡；或为一种通过靶向微管成核因子TPX2蛋白使TPX2去激活而抑制细胞分裂的方法。
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