CN103204923B

CN103204923B - 固相片段法制备卡培立肽

Info

Publication number: CN103204923B
Application number: CN201310093066.5A
Authority: CN
Inventors: 张文治; 刘建; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2013-03-21
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2033-03-21
Also published as: CN103204923A

Abstract

本发明公开了一种采用Fmoc路线固液结合片段法合成卡培立肽的方法，该方法中多个片段合成同时进行，合成周期减少了2/3，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于卡培立肽的大规模生产，使用本发明的方法得到的粗肽纯度为75%以上，总收率达到25%以上。

Description

固相片段法制备卡培立肽

技术领域

本发明涉及一种多肽的制备方法，具体地涉及卡培立肽的制备方法。

背景技术

卡培立肽（Carperitide），别名基因重组心房肽、卡哌利丁、Hamp、人脑利钠肽，它的适应症是急性心功能衰竭(包括慢性心功能衰竭加重)。卡培立肽药理学作用是通过刺激心肌伸展，由心室内颗粒合成的，然后通过冠状动脉分布全身，作用于血管平滑肌和肾脏等组织，调节血压和体内电解质平衡。卡培立肽为28个氨基酸组成的一种循环调节激素，起血管扩张和利尿作用。卡培立肽引起的血管舒张是由于与血管平滑肌的ANP(心房利钠多肽)受体结合，通过提高鸟苷酸环化酶的活性而实现的，提示可减轻心脏前、后负荷。

目前卡培立肽的合成方法分为两大类：一是基因重组，二是采用Boc路线液相或固相合成。ZL200510012425.5公开了采用基因重组技术生产卡培立肽的方法，CN102382188报道了一种采用固相Fmoc路线逐个偶联制备卡培立肽的方法，CA1245635A1报道的为采用Boc路线固相合成卡培立肽最后通过HF树脂切割、液相氧化、HPLC（高压液相色谱）纯化等步骤得到精肽，CA1245637A1报道的为采用基因重组技术生产卡培立肽，其它的专利文献如EP0440311A1、JP3004169A、US4673732A等都是或者采用基因重组技术生产卡培立肽或者采用Boc路线固相或液相方法合成得到精肽。采用基因重组技术，操作繁琐，投资大，药物纯度不高，存在较高的技术壁垒。采用Boc路线液相或固相合成，需要使用HF及大量使用TFA，由此带来对环境的严重污染。同时液相法存在操作周期长、操作繁琐等缺点，不利于大规模工业化生产。而采用固相Fmoc路线逐个偶联制备卡培立肽具有合成周期长、产率低的缺点。

为了克服上述缺点，本发明采用Fmoc路线固液结合片段法合成卡培立肽，具有操作简单、合成周期短、对环境友好的特点。

发明内容

本发明提供了一种采用Fmoc路线固液结合片段法合成卡培立肽的方法，申请人发现，采用该方法，多个片段合成同时进行，合成周期减少了2/3，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于卡培立肽的大规模生产。在一个实施方案中使用本发明的方法得到的粗肽纯度为75%以上，总收率达到25%以上。

本发明所述卡培立肽的序列为：

H-Ser¹-Leu²-Arg³-Arg⁴-Ser⁵-Ser⁶-Cys⁷-Phe⁸-Gly⁹-Gly¹⁰-Arg¹¹-Met¹²–Asp¹³-Arg¹⁴-Ile¹⁵-Gly¹⁶-Ala¹⁷-Gln¹⁸-Ser¹⁹-Gly²⁰-Leu²¹-Gly²²-Cys²³-Asn²⁴-Ser²⁵-Phe²⁶-Arg²⁷-Tyr²⁸-OH(S-S:7-23)

具体地，本发明所述方法包括如下步骤：

1）在固相载体上采用固相Fmoc路线分别合成4个侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’，然后将其分别裂解得到4个侧链全保护肽片段A、B、C和D，其氨基酸序列分别为，

片段A（1-10）：

Boc-Ser(R)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(R)-Ser(R)-Cys(Trt)

-Phe-Gly-Gly-OH，

片段B（11-16）：

Fmoc-Arg(pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-OH，

片段C（17-20）：Fmoc-Ala-Gln(Trt)-Ser(R)-Gly-OH，

片段D（21-22）：Fmoc-Leu-Gly-OH，和

在固相载体上采用固相Fmoc路线合成肽树脂片段E，其氨基酸序列为E（23-28）：Fmoc-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(R)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tBu)–Resin，

其中，丝氨酸Ser的侧链保护基R=tBu或Trt；

2）将所述步骤1）得到的侧链全保护肽片段D与肽树脂片段E偶联得到肽树脂Ⅰ；

3）将所述步骤1）得到的侧链全保护肽片段C与所述步骤2）得到的肽树脂Ⅰ偶联得到肽树脂Ⅱ；

4）将所述步骤1）得到的侧链全保护肽片段B与所述步骤3）得到的肽树脂Ⅱ偶联得到卡培立肽肽树脂Ⅲ；

5）将所述步骤1）得到的侧链全保护肽片段A与所述步骤4）得到的肽树脂Ⅲ偶联得到卡培立肽肽树脂Ⅳ；

6）将所述步骤5）得到的卡培立肽肽树脂Ⅳ裂解得到卡培立肽线性肽；

7）将所述步骤6）得到的卡培立肽线性肽液相氧化，得到环化的卡培立肽。

本发明优选还包括卡培立肽的纯化步骤。所述纯化步骤可采用本领域已知的任意多肽纯化技术进行，优选采用反相高压液相色谱法。

发明人发现，在使用本发明的片段法合成卡培立肽的过程中，卡培立肽序列中5个丝氨酸Ser的侧链保护基可以用tBu或Trt或两者的任意组合。优选地，卡培立肽序列中第6位和第19位的丝氨酸的保护基为Trt，第1、5、25位的丝氨酸的保护基为tBu，这种组合可使得副产物最少，卡培立肽的纯度最高。

附图说明

图1(A)为线性卡培立肽粗肽的HPLC谱图，图1(B)为线性卡培立肽粗肽经H₂O₂氧化得到的环化卡培立肽粗肽HPLC谱图。

图2为使用HPLC检测卡培立肽醋酸盐精肽纯度的数据。

具体实施方式

本文的术语“肽树脂”是指多肽的C端连有树脂、N端的氨基连有Fmoc保护基的多肽树脂。

本文的术语“肽片段”是指上文提及的“肽树脂”脱除C端树脂露出游离羧基、N端的氨基连有Fmoc保护基的多肽。

本发明中所用缩写及其含义列于下表：

缩写及英文	含义
		Fmoc	9-芴甲氧羰基
Boc	叔丁氧羰基
		tBu	叔丁基
OtBu	叔丁氧基

Trt	三苯甲基
		NMP	N-甲基吡咯烷酮
DMSO	二甲基亚砜
		DMF	N,N-二甲基甲酰胺
DCM	二氯甲烷
		DBLK	20%六氢吡啶/DMF溶液
DIC	N,N-二异丙基碳二亚胺
		DIPEA	N,N-二异丙基乙胺
DMAP	4-二甲胺基吡啶
		PYBOP	六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
TBTU	O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
		HBTU	苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HOBT	1-羟基苯并三唑
		TFE	三氟乙醇
TFA	三氟乙酸
		PhSMe	苯甲硫醚
EDT	1,2-乙二硫醇
		PHOH	苯酚
TIS	三异丙基硅烷

所使用的原料氨基酸：

Fmoc-Tyr(tBu)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链叔丁基保护酪氨酸

Fmoc-Arg(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护精氨酸

Fmoc-Phe-OH代表：N-芴甲氧羰基苯丙氨酸

Fmoc-Ser(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护丝氨酸

Fmoc-Asn(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬酰胺

Fmoc-Cys(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护半胱氨酸

Fmoc-Gly-OH代表：N-芴甲氧羰基甘氨酸

Fmoc-Leu-OH代表：N-芴甲氧羰基亮氨酸

Fmoc-Gln(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护谷氨酰胺

Fmoc-Ala-OH代表：N-芴甲氧羰基丙氨酸

Fmoc-Ile-OH代表：N-芴甲氧羰基异亮氨酸

Fmoc-Asp(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬氨酸

Fmoc-Met-OH代表：N-芴甲氧羰基-甲硫氨酸

当氨基酸为Arg（精氨酸）时，侧链R=pbf(2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)；当氨基酸为Asp（天冬氨酸）时，侧链R=OtBu（叔丁氧基）；当氨基酸为Cys（半胱氨酸）、Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）时，侧链R=Trt（三苯甲基）；当氨基酸为Ser（丝氨酸）时侧链R=tBu（叔丁基）或R=Trt（三苯甲基）。

本发明提供了一种采用Fmoc路线固液结合片段法合成卡培立肽的方法，具体地包括如下步骤：

片段A（1-10）：

Boc-Ser(R)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(R)-Ser(R)-Cys(Trt)

-Phe-Gly-Gly-OH，

片段B（11-16）：

Fmoc-Arg(pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-OH，

片段C（17-20）：Fmoc-Ala-Gln(Trt)-Ser(R)-Gly-OH，

片段D（21-22）：Fmoc-Leu-Gly-OH，和

其中，丝氨酸Ser的侧链保护基R=tBu或Trt；

其中，在步骤1）中合成所述侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的固相载体为2-CTC树脂，所述树脂替代度范围为0.65-1.1mmol/g；合成所述肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或TBTU/HOBT/DIEA，优选TBTU/HOBT/DIEA；裂解所述侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的裂解液为TFE：DCM=1:4（V:V）。

在步骤1）中，合成肽树脂片段E所用的固相载体为wang树脂（wangresin）或2-CTC树脂，优选wang树脂；所述树脂替代度范围为0.3-0.6mmol/g，在所述树脂上连接第一个氨基酸所使用的偶联剂为：a)所用树脂为wang树脂时所用偶联剂为HOBT/DIC/DMAP；b)所用树脂为2-CTC树脂时所用偶联剂为DIEA，第二个氨基酸及之后氨基酸的偶联所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或TBTU/HOBT/DIEA，优选为HOBT/DIC。

在步骤2）、步骤3）和步骤4）中所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或HBTU/HOBT/DIEA，优选为HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO或其任意两者或两者以上的混合物，优选为NMP：DMF=1：1（V:V）。

在步骤5）中所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或HBTU/HOBT/DIEA，优选为HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO或其任意两者或两者以上的混合物，优选为NMP：DMSO=1：1（V:V）。

在步骤6）中用于裂解卡培立肽肽树脂Ⅳ的裂解液选自TFA:H₂O=95:5(V:V)、TFA:EDT:PHOH:H₂O=(90-95):(1-5):(1-3):(1-2)(V:V)或TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H₂O=(80-85):(1-5):(1-5):15:(1-5)(V:V)，优选为TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H₂O=80:5:5:5:5(V:V)，裂解时间为2-3.5小时，优选为2.5小时。

在步骤7）中用于氧化卡培立肽线性肽的物质选自DMSO、碘或H₂O₂，优选H₂O₂，反应溶液的pH为4.2-4.5。

本发明优选还包括卡培立肽的纯化步骤。所述纯化步骤可采用本领域已知的任意多肽纯化技术进行，优选采用反相高压液相色谱（RP-HPLC）法，具体地，使用的色谱柱为50×250mm反相C8柱，以0.1%TFA/乙腈为流动相，收集目的峰馏分后，经蒸发浓缩、冻干得到卡培立肽精肽。在一个实施方案中使用本发明方法得到的卡培立肽精肽纯度>99%。

提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明，所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：肽树脂A’的合成

称取替代度为0.65mmol/g的2-CTC树脂15.38g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.94gFmoc-Gly-OH（此处及后文所用氨基酸购自成都凯泰新技术有限公司）用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mlDIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20ml无水甲醇封闭1小时,用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护3分钟，换用新的DBLK继续脱除Fmoc保护7分钟，然后用DMF洗涤6次。

将8.92gFmoc-Gly-OH，4.46gHOBT，5.13mlDIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽片段A（序列（1-10））的顺序，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Boc-Ser(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到肽片段A（序列（1-10））的肽树脂A’。

实施例2：肽树脂A’的合成

称取替代度为1.09mmol/g的2-CTC树脂9.17g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.94gFmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.97mlDIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20ml无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护3分钟，换用新的DBLK继续脱除Fmoc保护7分钟，然后用DMF洗涤6次。

将8.92gFmoc-Gly-OH，4.46gHOBT，9.63gTBTU，10.45mlDIEA溶于60mlDMF，冰水浴下活化3分钟加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽片段A（序列（1-10））的顺序，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Boc-Ser(tBu)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到肽片段A（序列（1-10））的肽树脂A’。

实施例3：肽片段A的合成

将实施例2得到的肽树脂，加入圆底烧瓶中。按1克树脂10ml裂解液的比例配制裂解液（裂解液配比：TFE：DCM=1:4，V:V），将裂解液倒入烧瓶中，室温反应2.5h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液用旋转蒸发仪蒸干后，加入20mlDCM，将混合液滴加至200ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到侧链全保护肽片段A（序列（1-10））21.27g，纯度94.8%，收率93.7%。

实施例4：肽片段B的合成

参照实施例2和实施例3的方法，合成10mmol的肽片段B，得到侧链全保护肽片段B（序列（11-16））14.26g，纯度96.1%，收率93.3%。

实施例5：肽片段C的合成

参照实施例2和实施例3的方法，合成10mmol的肽片段C，得到侧链全保护肽片段C（序列（17-20））10.26g，纯度97.1%，收率96.1%。

实施例6：肽片段D的合成

参照实施例2和实施例3的方法，合成10mmol的肽片段D，得到侧链全保护肽片段C（序列（21-22））3.95g，纯度97.2%，收率96.4%。

实施例7：肽树脂E的合成

称取替代度为0.5mmol/g的WangResin（王树脂）20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，称取8.59gFmoc-Tyr(tBu)-OH、2.97gHOBT和0.21gDMAP用DMF溶解，冰水浴下加入3.42mlDIC活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应1.2小时后，加入20ml吡啶和22ml乙酸酐封闭12小时。用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin21.1g，检测替代度为0.38mmol/g。

用DBLK脱除Fmoc保护5分钟，换用新的DBLK继续脱除Fmoc保护7分钟，DMF洗涤6次，称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH9.73g，HOBT2.23g，用30mlDMF溶解，冰水浴下加入DIC2.57ml活化3分钟，加入到反应柱中反应2小时，按照肽树脂E的肽序，逐个偶联Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH；偶联完Fmoc-Cys(Trt)-OH后脱除Fmoc，备用。

实施例8：肽树脂I的合成

称取肽片段D8.20g，HBTU7.21g，HOBT2.70g，用30mlNMP/DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.29mlDIEA，活化3分钟，加入到装有实施例7得到的肽树脂E的反应柱中，室温反应2.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂I。

实施例9：肽树脂Ⅱ的合成

称取肽片段C21.35g，HBTU7.21g，HOBT2.70g，用30mlNMP/DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.29mlDIEA，活化3分钟，加入到装有实施例8得到的肽树脂I的反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂Ⅱ。

实施例10：肽树脂Ⅲ的合成

称取肽片段B30.57g，HBTU7.21g，HOBT2.70g，用30mlNMP/DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.29mlDIEA，活化3分钟，加入到装有实施例9得到的肽树脂Ⅱ的反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂Ⅲ。

实施例11：肽树脂Ⅳ的合成

称取肽片段A45.40g，HBTU7.21g，HOBT2.70g，用30mlNMP/DMF(体积比1:1)溶解，冰水浴下加入5.29mlDIEA，活化3分钟，加入到装有实施例10得到的肽树脂Ⅲ的反应柱中，室温反应3.5小时，用茚三酮监测反应终点，反应结束抽掉反应液，树脂用DMF洗涤3次，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂Ⅳ，甲醇收缩并真空干燥12h得到卡培立肽线性肽树脂65.5g，树脂增重45.5g，增重率93.0%。

实施例12：卡培立肽线性肽树脂的裂解

将实施例11得到的肽树脂Ⅳ65.5g，加入到1000ml烧瓶中，配制700ml裂解液TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H₂O=80:5:5:5:5，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到7000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到卡培立肽线性粗肽27.61g，粗肽收率112%，经质谱检测分子量为=3082。

实施例13：卡培立肽线性肽树脂的裂解

按实施例11的方法制备肽树脂Ⅳ65.5g，将其加入到1000ml烧瓶中，配制700ml裂解液TFA:EDT:PHOH:H₂O=92:3:3:2，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到7000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到卡培立肽线性粗肽26.38g，粗肽收率107%，经质谱检测分子量为=3082。

实施例14：卡培立肽线性粗肽的氧化（二硫键环化）

将实施例12得到的线性粗肽10.0g，加入到5L烧瓶中，用4L纯水将粗肽溶解完全，并用稀氨水将溶液pH调至4.2-4.5，加入5ml_H2O₂反应2h，HPLC跟踪监测反应基本完全后，加入稀醋酸至溶液pH=2.5-3.0终止反应，得到卡培立肽粗肽（图1）。

实施例15：卡培立肽粗肽的纯化

将实施例14得到的粗肽溶液减压过滤除去不溶物后，采用RP-HPLC系统，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。旋转蒸发浓缩，冻干得到卡培立肽醋酸盐精肽2.24g，HPLC检测纯度为99.64%（图2），总收率25.1%。

Claims

1.一种制备卡培立肽的方法，包括以下步骤：

1)在固相载体上采用固相Fmoc路线分别合成4个侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’，然后将其分别裂解得到4个侧链全保护肽片段A、B、C和D，其氨基酸序列分别为，

片段A：Boc-Ser(R)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(R)-Ser(R)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-OH，

片段B：Fmoc-Arg(pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-OH，

片段C：Fmoc-Ala-Gln(Trt)-Ser(R)-Gly-OH，

片段D：Fmoc-Leu-Gly-OH，和

在固相载体上采用固相Fmoc路线合成肽树脂片段E，其氨基酸序列为E：Fmoc-Cys(trt)-Asn(Trt)-Ser(R)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tBu)–Resin，

其中，丝氨酸Ser的侧链保护基R＝tBu或Trt；

2)将所述步骤1)得到的侧链全保护肽片段D与肽树脂片段E偶联得到肽树脂Ⅰ；

3)将所述步骤1)得到的侧链全保护肽片段C与所述步骤2)得到的肽树脂Ⅰ偶联得到肽树脂Ⅱ；

4)将所述步骤1)得到的侧链全保护肽片段B与所述步骤3)得到的肽树脂Ⅱ偶联得到卡培立肽肽树脂Ⅲ；

5)将所述步骤1)得到的侧链全保护肽片段A与所述步骤4)得到的肽树脂Ⅲ偶联得到卡培立肽肽树脂Ⅳ；

6)将所述步骤5)得到的卡培立肽肽树脂Ⅳ裂解得到卡培立肽线性肽；

7)将所述步骤6)得到的卡培立肽线性肽液相氧化，得到环化的卡培立肽。

2.权利要求1的方法，其中在步骤1)中合成所述侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的固相载体为2-CTC树脂，所述树脂替代度范围为0.65-1.1mmol/g；合成所述肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或TBTU/HOBT/DIEA；裂解所述侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的裂解液按体积比计为TFE:DCM＝1:4。

3.权利要求2的方法，其中合成所述肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的偶联剂为TBTU/HOBT/DIEA。

4.权利要求1的方法，其中在步骤1)中合成肽树脂片段E所用的固相载体为wang树脂或2-CTC树脂，所述树脂替代度范围为0.3-0.6mmol/g，在所述树脂上连接第一个氨基酸所使用的偶联剂为：a)所用树脂为wang树脂时所用偶联剂为HOBT/DIC/DMAP；b)所用树脂为2-CTC树脂时所用偶联剂为DIEA，第二个氨基酸及之后氨基酸的偶联所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或TBTU/HOBT/DIEA。

5.权利要求4的方法，其中第二个氨基酸及之后氨基酸的偶联所用的偶联剂为HOBT/DIC。

6.权利要求1的方法，其中，步骤2)、步骤3)和步骤4)所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO或其任意两者或两者以上的混合物。

7.权利要求6的方法，其中步骤2)、步骤3)和步骤4)所用的偶联剂为HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为按体积比计NMP：DMF＝1：1。

8.权利要求1的方法，其中，步骤5)所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为DMF、DCM、NMP、DMSO或其任意两者或两者以上的混合物。

9.权利要求8的方法，其中步骤5)所用的偶联剂为HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为按体积比计NMP：DMSO＝1：1。

10.权利要求1的方法，其中，按体积比计，步骤6)中用于裂解卡培立肽肽树脂Ⅳ的裂解液选自TFA:H₂O＝95:5、TFA:EDT:PHOH:H₂O＝(90-95):(1-5):(1-3):(1-2)或TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H₂O＝(80-85):(1-5):(1-5):15:(1-5)，裂解时间为2-3.5小时。

11.权利要求10的方法，其中按体积比计，步骤6)中用于裂解卡培立肽肽树脂Ⅳ的裂解液为TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H₂O＝80:5:5:5:5，裂解时间为2.5小时。

12.权利要求1的方法，其中在步骤7)中用于氧化卡培立肽线性肽的物质选自DMSO、碘或H₂O₂。

13.权利要求12的方法，其中在步骤7)中用于氧化卡培立肽线性肽的物质为H₂O₂。

14.权利要求1的方法，其中，片段A序列中从N端起第1、5和6位丝氨酸的保护基分别为tBu、tBu和Trt，片段C序列中丝氨酸的保护基为Trt，肽树脂片段E序列中丝氨酸的保护基为tBu。

15.权利要求1-14中任一项的方法，还包括卡培立肽的纯化步骤。

16.权利要求15的方法，其中纯化步骤采用反相高压液相色谱(RP-HPLC)法，收集目的峰馏分后，经蒸发浓缩、冻干得到卡培立肽精肽。