CN1256635A - 肽包被的植入物及其制备方法 - Google Patents

肽包被的植入物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1256635A
CN1256635A CN98805227A CN98805227A CN1256635A CN 1256635 A CN1256635 A CN 1256635A CN 98805227 A CN98805227 A CN 98805227A CN 98805227 A CN98805227 A CN 98805227A CN 1256635 A CN1256635 A CN 1256635A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
implant
cell
bag
acrylic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN98805227A
Other languages
English (en)
Inventor
H·赫斯勒
D·菲辛格
A·约克塞
J·迈耶
B·尼斯
M·堪特勒内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19755801A external-priority patent/DE19755801A1/de
Priority claimed from DE19818098A external-priority patent/DE19818098A1/de
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of CN1256635A publication Critical patent/CN1256635A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明描述了通过合成的细胞或组织选择性RGD肽之制备用于测定的包被层,使生物材料特别是植入物生物功能化的可能性,该包被层在体外可刺激那些在每种情况下旨在实现合适生物材料组织整合的主要细胞种类的粘附。

Description

肽包被的植入物及其制备方法
本发明涉及用于人体和动物体的植入物的一般特征，其由能选择性介导植入物所处特定环境中特异细胞粘附的肽类包被。特别是，本发明涉及RGD肽包被的植入物及其制备方法。
本发明建立于如下原则的基础之上：一般是通过手术植入合适组织中之后，选择的细胞种类对生物材料尤其是用于组织选择性的植入物的表面包被层的靶向粘附刺激，加速且增强了植入物的整合。
以这种方式，根据植入植入物的特异的组织环境，可用介导细胞粘附的不同的肽类尤其是RGD肽包被植入物的表面各个部分。
而且以这种方式，通过在植入物表面不同区域的不同肽类对不同细胞种类的特异性激活方法实现自组织化，组织工程中的携带器官再生生物学信息的“智能”生物杂交器官得以产生。
如果无不同或另外说明，以下术语“根据本发明的肽类”包括能介导细胞粘附的所有肽类。这些肽类之中尤其指的是依次含有精氨酸(R)、甘氨酸(G)和天冬氨酸(D)的那些(RGD肽)。合适的RGD肽和合适的不含有RGD的肽类的实例在下面会提到。此外还包括相应的不含有RGD序列但影响细胞粘附的肽类。在最广泛的意义上，本发明还包括在性质上与该肽类化合物有相同生物学活性的非肽类化合物。
根据本发明含义的生物材料或植入物被定义为为了恢复相应功能受损的天然组织的功能而将其引入人或动物体内的材料。它们包括例如髋部插入性假体(endoprostheses)、人工膝关节、颌植入物、筋腱替代物，皮肤替代物、血管修补物、心脏起搏器、人工心脏瓣膜、乳房植入物、斯滕特固定模、导管、分流管。
植入物在体内的整合行为仍被证明有问题。对于产生足以适合功能的组织/生物材料结合的机械稳定性而言，材料的组织整合常常进展得太慢以及太不完全。植入物表面的组成常常是造成此问题的原因，因为其不充分的界面相容性或生物相容性阻止了周围健康组织或细胞的活性吸收。这使稳定的组织-植入物边界层的形成复杂化，并且因此导致了不充分的组织整合，从而导致结合松散、组织重吸收、感染、炎症、变态反应、微血栓形成(再狭窄)。结果是必须进行用于替换植入物(例如髋部插入性假体、颌植入物、导管或外部固定器)的修正干预以及因此再次更新的手术干预(Malchau和Herberts，1996年Prognosis of the Total Hip Arthoplasty，63届美国矫形外科医生协会年会，Atlanta；Haddad等，1996年，骨与关节外科手术杂志(The Journalof Bone and Joint Surgery)78-B卷，546-549页；Collinge等，1996年，针道感染(Pin Tract Infections))。
而且，特别在髋部插入性假体的情况下，所谓无菌植入物的松散证明了存在问题，因为其中骨细胞和这样的骨组织没有如期望的那样与生物材料形成直接联系，但作为干扰成分的成纤维细胞和结缔组织却发生了这样的联系。结果是结缔组织而非骨组织顺着假体排列，其导致假体-结缔组织结合的稳定性不足以满足对人工髋关节力量传递的机械要求。结果，这可导致假体的松散(Pilliar等，1986年，整形诊断(Clin.Orthop)，208卷：108-113页)，并且同样需要修正。不期望粘附于植入物的细胞类型的另一实例为血小板，它能导致微血栓的形成并且因此损害植入物的整合(Phillips等，1991年，细胞(Cell)，65卷，359页)。
生物材料或植入物难以整合到体内，在完全替代器官的情况下有特别严重的影响，因为此处不同的细胞类型与植入物接触，并且以必要的整合为目标。在其它患者的帮助下，为了避免极端复杂化的移植过程，组织工程学领域中越来越频繁地试图利用所谓生物杂交器官，完成例如肝、胰、肾和脾的功能衰竭的治疗，这些生物杂交器官由活细胞包被的载体材料组成并能作为功能单位进行移植。在大多数情况下，为达此目的，将有功能的健康细胞在体外包被或包入可吸收或不可吸收的膜囊内，并且作为人工生物杂交器官或中空器官移植入患者体内。(例如：Lim等，1980年，科学(Science)210卷，908-912页；Altman等，1982，Horm.Met.Res.Suppl.12卷，43-45页；Zekorn等，1989，移植进展(Transplantation Proceedings)21卷，2748-2750页；Altman等，1982，Horm.Met.Res.Suppl.12卷，43-45页；EP0 504781 B1)。然而，经常发生如下所述的问题：与植入物营养供应缺乏相关的纤维鞘的形成、由于细胞从囊中释放导致的免疫防御反应以及因材料表面血栓形成而形成的血块。
已知通过用介导细胞粘附的肽类包被生物材料/植入物可刺激其组织整合。为达此目的，一方面，含有三肽氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的那些肽类或其非肽类似物，及另一方面，如已知的作为许多蛋白质、细胞外基质(例如I型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白玻连蛋白、巢蛋白、骨桥蛋白、血小板反应蛋白)或血凝级联反应(纤维蛋白原、范德华因子)的组成成分的不含RGD的肽类(参见下文)或其非肽类似物介导细胞粘附，能起真核细胞粘附的中心识别模式的作用(例如：Pierschbacherhe和Ruoslahti，1984年，自然(Nature)，309卷，30-33页；Yamada，1991年，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，266卷：12809-12812页)。根据本发明定义的序列被细胞表面其各自的受体，即整联蛋白识别并与其结合。由于大量不同的整联蛋白介导细胞与相应蛋白质的粘附，一种细胞的整联蛋白表达模式对于它们与这些蛋白质粘附的特性很重要。一些多为短链的肽含有能选择性并特异性地只与某种整联蛋白结合的合适序列，这些肽用于测定的设计与合成使靶向激活只表达该整联蛋白的那些细胞种类成为可能。因此，例如已知RGD肽选择性与αv整联蛋白受体结合并因之能优先刺激带有αvβ3和αvβ5的细胞(成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞)的结合(粘附)，而不会同时刺激非期望的细胞种类，例如带有αIIbβ3的血小板的粘附(Haubner等，1996年，7，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc)118卷，7461页)。相反地，其他RGD肽类显示相反的效应并优先与αIIbβ3整联蛋白受体结合，因此表现出例如对于血小板的选择性(Phillips等，1991，细胞，65卷，359页)。
已经知道用根据本发明定义的通过合成得到的肽类进行植入物表面的包被。在这种情况下，肽类通过吸附或共价结合或多或少地附着于材料表面。例如在DE1 97 06 667中，描述了涉及骨的替代材料的生物材料，其基于一种表面通过吸收作用包被带有RGD氨基酸序列的肽的多孔聚合材料。在WO91-05036中，还公开了金属假体，尤其是钛或钛合金，其表面与也含有RGD序列的肽类共价结合。Valentini等(1997年5月，生物材料协会第23届年会协议，New Orleans，美国)描述了RGD肽与含有氟化乙烯基丙烯(ethylenepropylene)中间层的钛镙钉的共价结合。Rezania等在同一会议上报告了二氧化硅或二氧化钛表面通过与氨基功能性有机硅烷共价结合进行包被，然后通过异源双功能性交联体完成与含巯基的RGD肽的共价结合。
然而，这些技术性解决方案未涉及需要获得其表面特异包被了根据本发明定义的肽类的植入物或生物材料，从而使其选择性地适应于相关植入物周围组织之特定细胞类型。
因此，期望能以如下方式修饰生物材料，即为达到其组织整合的目的，只排列或优先排列特定的组织或细胞种类，它们在植入物植入体内后，与例如髋部插入性假体的骨细胞或皮肤的上皮细胞、毛发或牙齿替代物的上皮细胞积极地起作用，然而同时阻止干扰此过程的细胞种类与植入物的选择性相互作用，例如促进微血栓或结缔组织囊形成的血小板或成纤维细胞。
用根据本发明定义的那些肽(或其非肽类类似物)包被植入物还是期望的和吸引人的策略，这些肽专一或至少优先刺激有对应互补性整联蛋白的那些所选细胞类型的粘附，结果导致相应的所选组织体内合成的加速。
就完全生物杂交器官(皮肤、血管、尿道、膀胱、食管、胰、肝、脾、肾)的开发而言，以进行不同细胞体内加工的、靶向的、空间限定的和协同的方式，用根据本发明定义的不同细胞选择性肽类包被植入物不同的表面部分，在各种情况下能刺激某一器官所期望的不同的细胞种类是决定性的进步。
现在本发明描述了用根据本发明定义的合成得到的细胞或组织选择性RGD肽包被生物材料，尤其是所有可想象的器官植入物，使其生物功能化的可能性，这些肽在体外主要刺激发生粘附的细胞种类在各种情况下实现相应生物材料的组织整合，同时这些肽在体外不会刺激那些阻挠此过程的细胞种类的大多数的粘附。使用这样的包被，将生物材料/植入物植入体内后，可加速且增强其整合并且增加长期稳定性。
而且，有了用根据本发明定义的不同肽类包被植入物不同材料的表面部分这个概念，就有了所有的对于“智能”的、生物杂交的器官(“组织工程”)的开发的可能性，这种器官能携带用于选择性激活不同靶组织或靶细胞的生物学信息，并且因之能通过自组织化将其整合进体内，因此能增强组织整合或者甚至能首次使组织整合成为可能。
于是，本发明涉及适合于不同人和动物器官的植入物，它基本上由载体基质和基质周围的肽包被层组成，含有用于人或动物体内细胞之靶向粘附刺激的相同或不同肽类，在负责人或动物细胞粘附的整联蛋白受体上含有识别结合位点的序列，载体基质含有能结合在其表面的反应基团，能与所述肽层合适的功能性反应基团形成稳定地共价结合，此植入物在以下方面与众不同：所述的肽类以局部分化的方式排列在植入物表面，由于其相应地不同结构相关的细胞粘附刺激活性，在植入植入物的细胞特定区域中，它们特异地对应于与其邻接的组织细胞之天然不同的互补整联蛋白模式，方法是通过植入物表面呈现了经局部分化的并且有选择性的生物活性包被模式。
本发明还涉及制备合适于器官/组织的植入物的方法，此植入物以带有细胞粘附刺激肽类包被的表面之无机载体基质为基础，该肽对待紧邻植入物的组织之互补整联蛋白模型是有选择性的，其特征在于：通过本身已知的方法(i)体内待引入植入物的靶细胞或靶组织的整联蛋白受体结构是在体外测定的，(ii)选择或合成有合适互补结构的肽，并且(iii)该肽结合于植入物的相关表面。
特别地，本发明涉及有如下特征的方法及植入物/生物材料：该肽特别是RGD肽通过共价结合连接于植入物表面，如果需要，经由有支链的表面增大分子和/或分子锚定体；优选地使用能刺激携带αvβ3/αvβ5的细胞特别是例如成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞的粘附，并且不会同时刺激血小板或成纤维细胞粘附的RGD肽；采且的载体基质是由陶瓷、聚合物材料或金属或生物杂交器官或中空器官制成的成型或不成型部分。
在分子水平，基本上从以下成分设计根据本发明定义的肽类：
——与粘附相关的带有氨基酸序列的结构域(例如提到的RGD序列)，它可选择性地识别和结合所选细胞种类，
——间隔物，从而以细胞结合只可能从立体空间角度进行的方式给细胞提供细胞识别和带有识别序列的结构域，
——影响与生物材料或植入物表面有关的肽类衍生物稳定结合的锚定分子，
——任选地，根据本发明定义的肽类在与生物材料表面发生结合前，与产生表面增大效应的支链的分子结构(所谓的树状体(dendrimer)或触须(Tentakels))额外地偶联可增加细胞粘附。
生物材料或植入物表面根据本发明可理解为不仅仅是载体基质的直接表面，而且还可以是呈现为例如聚合物材料、天然或人工骨材料、蛋白质或蛋白衍生物的另外的包被层。
特别合适的载体基质是由陶瓷、金属、聚合物材料(例如PMMA)或优选的可吸收的骨替代物材料。由例如聚交酯尤其是外消旋D，L-聚交酯化合物、或可吸收的磷酸钙、或能引起原组织状态恢复的羟基磷灰石混合物以及诸如在WO 96/36562或EP 0 543 765中公开的这类物质制成的可吸收或可生物降解的材料尤其适合。依据使用的范围，胶原或琼脂也适合作为载体基质。
术语“生物杂交器官”理解为以任何方式(见上)载满活细胞或与其结合的常规无机基质。根据本发明，这还可理解为在植入缺陷组织的不同植入物的表面部分，其上没有细胞而且仅含有根据本发明定义的不同类型相应的肽类，这种相应排列能选择性地激活周围细胞。无细胞生物杂交器官的优点是能以节约成本以及可控制的方式产生携带了用于器官再生的生物学信息的“智能”生物相容性植入物。通过内源性再生过程的自组织化将这样的生物杂交器官整合进体内，这种方法能够避免例如因为移植了外源细胞或外源蛋白而经常发生的免疫学防御反应。
根据本发明，植入物通常存在于成型体或假体中，此处的成型体应该适应于特定的组织/骨缺陷。在生物杂交器官的情况下，假体可仅由如下组成：包被或未包被相应细胞和根据本发明定义的肽的膜或薄膜，或者其他例如在EP 0 504 781中公开的排列形式。
根据本发明能采用的合适的肽类为所有的肽类及其带有非肽取代物的化合物，只要这些肽类含有负责细胞粘附的结构域或氨基酸序列，并且经由它们的肽和非肽取代物能结合于植入物的表面。特别可能对应的肽是那些有RGD序列的肽。
无论如何下列优选的肽类和肽类化合物只意在示范而不意在限制，使用如下缩写：
Asp(D)＝天冬氨酸
Gly(G)＝甘氨酸
Arg(R)＝精氨酸
Tyr(Y)＝酪氨酸
Ser(S)＝丝氨酸
Phe(F)＝苯丙氨酸
Lys(K)＝赖氨酸
Dphe(f)＝D-苯丙氨酸
Pro(P)＝脯氨酸
Leu(L)＝亮氨酸
Ile(I)＝异亮氨酸
Val(V)＝缬氨酸
Glu(E)＝谷氨酸
Thre(T)＝苏氨酸
Ala(A)＝丙氨酸
(a)合适的含RGD肽类的实例：
RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，
GRGD(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，
GRGDY(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)
RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)，
GRGDS(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)，
RGDF(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸)，
GRGDF(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸)，
环RGDfK(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-赖氨酸)，
环RGDfKG(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸)，
(b)合适的含非RGD的肽类的实例：
LDV(亮氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)，
LGTIPG(亮氨酸-甘氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸)，
REDV(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)，
IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)，
YIGSRG(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸)，
LRE(亮氨酸-精氨酸-谷氨酸)，
PDSGR(脯氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-精氨酸)，
DGEA(丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸)，
RYVVLPR(精氨酸-酪氨酸-缬氨酸-缬氨酸-亮氨酸-脯氨酸-精氨酸)。
根据本发明定义的肽可为线性或环状。依据根据本发明选择的肽，上面提到的肽和肽序列也可在大约总共4到20个氨基酸的更长的范围内。同样，根据本发明带有D或L构型或C-和/或N-烷基化的氨基酸也包括在内。环肽根据本发明可理解为相互靠近经由酰胺键形成环的那些，优选分子中不存在游离羧基或氨基基团。根据本发明的RGD肽尤其优选，特别是选自上面提到的列出的那些肽，其中特别是以环状形式公开在DE-A-I 95 38 741中的对成骨细胞有特异性的五肤RGDfK，以及同样以环状形式存在的对血栓细胞有特异性的六肽RGDfKG。
例如在下列专列申请中描述了根据本明定义的相应的线性和环状肽类：EP 0 632 053、EP 0 655 462、EP 0 578 083、EP 0 770 622、DE1 95 38 741。特别是，那些与表达αvβ3和αvβ5整联蛋白的细胞种类(例如成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞)选择性结合，同时不与例如带有αIIbβ3的细胞种类(例如血小板)结合的肽类是合适的。如果肽类及其对应的衍生物不能以其他方式得到，可通过标准方法很容易地合成。
原则上，根据本发明定义的肽类可通过吸附或共价结合与生物材料的表面连接。在同一个植入物上使用不同的肽时，吸附的方法不太合适，因为使用此技术仅以不太满意的方式实现本发明所述的表面局部选择性分化包被。
肽类及其非肽类似物与载体表面大部分通过所谓分子锚定体的共价结合而发生偶联，这种方法为自知的并在如下文献中有描述，即例如Singer等(1987年，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)104卷：573页)；Brandley，Schnaar(1989年，发育生物学(Develop.Biol.)135卷：74页)；Massia，Hubbell(1990年，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)187卷：292页)；Hirano等(1991年，生物医学物质材料杂志(J.Biomed.Mat.Res.)25卷：1523页；Lin等，(1992年，生物材料(Biomaterial)13卷：905页)；Nicol等(1992年，生物医学材料研究杂志，26卷：393页；Dee等(1995年，组织工程学(Tessue Engin.)1卷：135页)，然而在这些情况下未以任何方式一般地和特别地探讨植入物的包被。
本发明涉及自身已知包被方法的新型应用以用于制备根据本发明的植入物，例如为了将提到的肽类(或其非肽类似物)与含丙烯酰基或异丁烯酰基锚定组分的表面偶联，根据本发明第一次采用的“Kevloc”方法(EP 0 712 621)，或者为了通过丙烯酰基或异丁烯酰基锚定组分将相应的肽类与相应的载体基质偶联，通常通过丙烯酰基/异丁烯酰基硅烷衍生物中间层(例如3-异丁烯酰基氧基丙基三甲氧基硅烷)，而根据本发明此处使用的“Silicoater”方法。类似的硅烷化方法的使用可能将根据本发明定义的肽类与载体基质或植入物的表面偶联，在DE-A 43 21005中描述了这种方法，它独创地对珍珠光泽色素包被进行了技术性教导，此包被法用于汽车和塑料工业中金属和塑料的水基包被系统。根据本发明，在另一相关文献中独创性描述的用含巯基基团的肽类包被金表面的方法(Heuvel等，1993年，分析生物化学(Analytical Biochem)215卷：23页)也是合适的。
以生物激活植入物为目的的本发明所概述的方法在此之前还未被应用于植入物的包被。
根据本发明经由合适的锚定分子将根据本发明定义的相应肽类偶联于植入物表面，即该肽通常不直接连接于植入物表面。锚定分子的插入在下面有更详细的定义，尤其有必要考虑靶细胞上与相应肽结合有关的生物学受体的立体空间性要求。
为此目的，植入物表面必须携带合适的官能团或反应单位使得植入物可能与锚定分子相应的官能团结合。在植入物表面上可得的官能团反过来依赖于实际载体基质的组成，其根据需要可以不同(金属、塑料、骨材料)。在金属植入物的情况下，例如通过用金蒸气沉积可能产生对锚定分子的SH基有反应性的表面层。如果合适可使用含硅烷的粘附促进剂(见下)，根据已知的方法(见上)硅烷化金属表面同样导致可掺入带有根据本发明的合适锚定分子的化合物的反应性表面。由天然骨或类似天然的骨材料(例如磷酸钙胶结剂)制成的植入物能与含反应性磷酸基团的锚定分子结合(原理在Chu，Orgel，1997年，生物偶合物化学(Bioconjuates Chem.)8卷：103页有描述)。根据本发明的锚定分子自身有反应性丙烯酸基团，能依次与以丙烯酸为基础的塑料(例如PMMA)制成的或与带合适的塑料包被层的其它材料制成的植入物进行偶联。
本发明意义上的锚定分子是以经修饰或取代的烷基链或烃链为基础的分子，这些链至少有两个不同的官能团，一个官能团通常是游离羧基基团(游离NH2基团)，它与根据本发明定义的肽特别是RGD肽的侧链上游离NH2基团(游离羧基基团)形成酰胺键(-CO-NH-)，另一个官能团优选含丙烯酸或异丁烯酸的基团或巯基基团，优选位于锚定分子碳链另一端与植入物表面直接或间接结合，这依赖于植入物表面的组成或需求。原则上，也可能使用其他官能团，它们在植入物表面或合适的中间层能直接与各自的反应基团反应以得到稳定的键。
如上面已提到的，本发明的锚定分子同时有间隔物的功能，即除了它们已概述的连接功能外，锚定分子具有合适的任选的经特异调整的长度，使得负责细胞粘附刺激的结构域与靶细胞有合适的距离，如此可能提高细胞结合或者甚至从立体空间上使细胞结合成为可能。
通过合成得到的肽与表达αvβ3/αvβ5整联蛋白的细胞种类(例如成骨细胞、硬骨细胞、内皮细胞)选择性结合的实例证实了细胞识别和带有相应氨基酸序列的结构域的生物学功能(Haubner等，1996年，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)118卷：7461-7472页)。
本发明优选的锚定分子有下列线性结构，根据本发明定义的肽类经由其氨基酸侧链之一，优选赖氨酸侧链的NH2基团与各自的锚定分子之游离羧基末端结合。
(i)巯基(酰胺基)羧酸衍生物：
-CO-(CH2)k-X-SH，
此处X为单键，或-CO-(CH2)l-，
k＝2至12并且l＝2至4；
(ii)丙烯酰胺羧酸衍生物：
-CO-(CH2)m-[NH-CO-(CH2)n]p-NH-CO-CH＝CH2
此处m，n＝2至8；p＝0至2，
(iii)丙烯酰胺基酰胺基三甘醇酸衍生物：
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)q-CO-(CH2)r-NH-CO-CH＝CH2
此处q＝1至3并且r＝2至8。
特别是优选下列特异性锚定分子类型：
(ia)   -CO-CH2-CH2-SH(巯基丙酸)
(ib)   -CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH(巯基乙酰胺琥珀酸)
(iia)  -CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2(丙烯酰胺己酸)
(iib)  -CO(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2(丙烯酰胺己酸酰胺己酸)
(iiia)  -CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2(丙烯酰胺己酸酰胺三甘醇酸)
(iiib)  -(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)2-CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2(丙烯酰胺己酸双酰胺三甘醇酸)
通常，根据本发明优选在线性碳链中至少有六个碳原子的任何锚定分子结构。作为事实，出人意料地发现为了获得与植入物加速的且增强的组织整合有关的最佳结果，有此长度的锚定分子特别有利。根据本发明，线性链中至少六个碳原子的指示涉及肽与植入物表面之间的分子总长度。因此如果将其它未提到的使链增长的偶联组分插于肽和植入物表面之间，上面显示的有较短链的(例如(ia)型)锚定分子结构也适合。
锚定分子以酰胺键形式通过标准方法经由羧基官能团连接于本发明定义的肽类，将所得典型肽-NH-CO-锚定分子结构连接于植入物，接着得到下面典型的构成物：肽-NH-CO-锚定分子-植入物(表面)。优选如下的相应植入物构成物：其组成成分包括上面个别提到的所定义的肽类之一，特别是RGD肽、上面个别提到的一般和特别定义的锚定分子之一，以及合适的表面反应性植入物。特别优选下列植入物：
环RGDfK NH-CO-巯基衍生物(类型：i)-植入物，
环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：ii)-植入物，
环RGDfK NH-CO-丙烯酸乙二醇衍生物(类型：iii)-植入物，
环RGDfKG NH-CO-丙烯酸乙二醇衍生物(类型：iii)-植入物，
其中完整的锚定蛋白分子的线性碳链至少含有6个碳原子。
这些之中特别优选的是：
环RGDfK NH-CO-巯基衍生物(类型：ib)-植入物
环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iia)-植入物
环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iib)-植入物
环RGDfK NH-CO-丙烯酸乙二醇衍生物(类型：iiia)-植入物
环RGDfKG NH-CO-丙烯酸乙二醇衍生物(类型：iiia)-植入物
环RGDfK NH-CO-丙烯酸乙二醇衍生物(类型：iiib)-植入物
通过标准方法制备这些优选结构，或者如在下面所述，或在同一天提交的申请者的平行申请中描述了制备方法，这些都涉及此类肽锚定物的结构。
如上面已讨论过的，为了将所述的细胞或组织选择性肽的衍生物锚定在根据本发明的生物材料表面，基本上遵循三条可选路线，对于携带各自RGD序列之结构域的分子识别模式，保留某个细胞类型和间隔物的选择性不变是可能的，然而依据提到的偶联变异体可改变分子锚定物，例如通过：
——巯基肽衍生物与金包被的生物材料表面(例如：(i)型锚定分子)的偶联；
——丙烯酰基肽(异丁烯酰基肽)衍生物与丙烯酸或异丁烯酸包被的生物材料表面(例如(ii)型或(iii)锚定分子)的偶联；
——使用丙烯酰基硅烷(异丁烯酰基硅烷)衍生物作为粘附促进剂或中间层(例如3-甲丙烯酰基氧丙基三甲氧硅烷)，丙烯酰基肽(异丁烯酰基肽)衍生物与硅烷包被的生物材料表面(例如(ii)或(iii)型锚定分子)的偶联。
对于与生物材料表面偶联的不同肽类变异体，通过根据本发明定义的肽与根据本发明定义的锚定分子一起合成可得到锚定分子关键性的最小长度，该锚定分子优选有6至24个碳原子的链长以及可选的不同疏水/亲水特性(例如在将合适的生物材料表面包被之后，根据本身自知标准的方法使用不同数量单位的-CH2-和/或酰胺己酸或乙二醇，接着体外测定细胞粘附以检测其生物学活性)。
以所述的方式，依据植入物的材料特性，在其与根据本发明的肽衍生物实际偶联之前，可选择合适的包被方法适于表面的条件。而且，依据旨在完成生生物材料/植入物整合的组织类型或细胞类型，可能用其它肽类进行包被，接着以靶定方式激活相应靶细胞种类的整联蛋白，例如源自上皮细胞(例如用于骨、颌、皮肤或毛发植入物)的α6β4整联蛋白，或源自血小板的αIIbβ3整联蛋白。αvβ3特异性RGD肽对内皮细胞和成骨细胞有选择性，作为结果，例如，它们适合于包被血管修补物或骨植入物。因此对于在骨、血管、牙齿、皮肤和毛发替代领域中的植入物，可能实现对于任何期望的器官之合适的生物激活的表面包被。
在能得到根据本发明的合适的植入物或生物杂交器官之前，为了能特异性及选择性包被植入所选组织的植入物，必须在体外检测系统中预先检测和测定适合于特定细胞类型的肽类的生物学活性。
通过常规的已知的组织免疫学方法，例如通过组织样品的免疫荧光性或免疫组织化学，需为此进行待植入植入物的靶组织或靶细胞之整联蛋白受体结构的分析。同时可知道并可得到用于此目的的必需的针对不同整联蛋白受体或其亚基的抗体，或能通过本身已知的标准方法，例如合适的免疫法对其进行相应地生产。
根据本发明定义的肽以不同浓度共价偶联于培养物表面，例如用小牛血清白蛋白(BSA)包被的聚苯乙烯。此测试支持材料在合适肽的测定中不起任何关键作用。同样，此处使用的偶联方法也不重要。由于实际的原因，通过在测试支持物上孵育和吸收该肽也能进行这些测定中的偶联。
接着，在合适的已包被的表面上调查了所选组织细胞培养物(例如成骨细胞)的粘附性，此粘附特性与体内天然组织中被激活的细胞的粘附特性相一致。选择用于粘附实验的合适的细胞培养物的准则是移植后体内靶细胞为可比较的整合表达模式，例如，通过荧光激活的细胞分拣器(FACS)检测荧光标记的针对αvβ3、αvβ5或αIIbβ3整联蛋白或者针对αv、αIIb、β3整联蛋白受体亚基或针对β5整联蛋白受体亚基抗体证实其αvβ3/αvβ5或αIIbβ3表达。对于体内有不同整联蛋白受体模型的其他靶细胞种类，相应地必须采用其他抗体。根据已知的标准方法例如合适的免疫法同时可知道以及得到或能生产这些抗体。
在用研究中的肽包被、BSA预处理的聚苯乙烯培养物表面接种并孵育不同的所选细胞种类，然后洗脱未粘附细胞。
不同的所选细胞种类在用根据本发明定义的不同肽类包被的测试表面之结合行为与阳性情况一致，这就是说如果在每种情况下有足够的特异性，会出现最大吸收率为大约60至100％接种细胞的滴定曲线，以及包被液中RGD肽浓度大约为5nM到5μM时半数最大细胞结合。
以相似的方法，如所述为了将合适的肽偶联于BSA预包被的聚苯乙烯表面，使用不同的粘附促进剂中间层锚定于经修饰或经调整的生物材料表面的策略是可能的。
作为总结，说明如下：
现有技术中的植入物有如下缺点：
——植入物不完整地、缓慢地整合于组织；
——组织的限制性接受；
——植入物/组织边界层功能稳定性不足；
——植入物缺乏刺激组织新生作用；
——植入物表面的非生理学特性；
作为这些问题的结果会导致：
——无菌植入物松散(例如纤维囊的形成)
——局部微血栓的形成
——感染
——炎症
——组织重吸收
——修正
通过本发明得到的方法或因此产生的植入物可大部分消除这些问题。根据本发明的主体优点在于：
——与靶组织/靶细胞的整联蛋白表达模式互补的粘附肽类之制备用于测定(made-to-measure)的设计；
——实现组织新生同时不引起阻断此过程的细胞粘附的靶细胞之细胞粘附的选择性刺激；
——依靠新型肽类锚定分子的高稳定性的包被层；
——植入物整合进组织过程的加速和加强。
有可能显示肽的细胞识别序列与未包被的材料表面之间关键性的立体空间绝对最小距离为2至3.5nm，优选2.5至3.5nm。最小距离为3.0至5.0nm能得到最大包被率(80-100％)。附图简述：
图1：FACS(荧光激活细胞分拣器)通过抗αvβ3和αvβ5整联蛋白的荧光偶联抗体对原代人成骨细胞整联蛋白组成的分析。
X轴：荧光强度(计数)
Y轴：细胞计数
M21：αvβ3和αvβ5阳性对照
M21：αvβ3和αvβ5阴性对照
HOB：原代人成骨细胞的培养物
ROB：原代大鼠成骨细胞的培养物图2：MC3T3 H1成骨细胞经由BSA与包被不同RGD肽的聚苯乙烯测试表面的粘附。
X轴：包被溶液中RGD肽的浓度(μM)，
Y轴：细胞包被的程度(％)；
上层曲线：环RGDfK NH-CO-CH2-CH2-S-(硫代SMPB)
(“巯基肽1-SMPB衍生物”)，SMPB＝琥珀酰亚胺基4-(对-顺丁烯二酰胺苯基)丁酸；
中上层曲线：环-RGDfKb NH-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-S-(硫代SMPB)(“巯基肽2-SMPB衍生物”)
中下层曲线：环RGDvE CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-S(硫代SMPB)(“巯基肽3-SMPB衍生物”)
下层曲线：巯基肽对照：环-RβADfk-NH-CO-CH2-CH2-S-(硫代SMPB)图3：成骨细胞与用巯基肽1-SMPB衍生物包被的测试表面的粘附(见图2下面)：
X轴：包被溶液中肽的浓度(μM)，
Y轴：细胞包被的程度(％)，
上层曲线：MC3T3 H1小鼠成骨细胞；
中上层曲线：原代人骨原细胞；
中层曲线：原代人成骨细胞；
中下层曲线：αvβ3阴性对照细胞M21L
下层曲线：原代大鼠成骨细胞图4：成骨细胞与包被巯基肽1-SMPP衍生物(包被溶液中10μM)的测试表面的粘附(见图2)
X轴：粘附培养基中溶解的环RGDfK(无锚定分子)的浓度(μM)，
Y轴：细胞包被的程度(％)；
上层曲线：MC3T3 H1小鼠成骨细胞；
中层曲线：原代人成骨细胞；
下层曲线：原代大鼠成骨细胞。图5：成骨细胞与包被巯基肽1-SMPB衍生物(包被溶液中10μM)的测试表面的粘附(见图2)，
X轴：接种的细胞数/cm2；
Y轴：粘附的细胞数/cm2；
上层曲线：原代大鼠成骨细胞；
中上层曲线：MC3T3 H1小鼠成骨细胞；
中下层曲线：原代人成骨细胞；
下层曲线：BSA阴性包被。图6：成骨细胞与包被巯基肽1-SMPB衍生物(包被溶液中10μM)的测试表面的粘附(见图2下面)，
X轴：接种的细胞数/cm2；
Y轴：经计算的表面面积需求/细胞(μm2)
上层曲线：原代人成骨细胞；
中层曲线：MC3T3 H1小鼠成骨细胞；
下层曲线：原代大鼠成骨细胞。图7：成骨细胞与包被巯基肽1-SMPB衍生物(包被溶液中10μM)的测试表面的粘附(见图2下面)，
X轴：时间(分钟)
Y轴：细胞包被的程度(％)
上层曲线：MC3T3 H1小鼠成骨细胞；
中层曲线：原代人成骨细胞；
下层曲线：原代大鼠成骨细胞。图8：MC3T3 H1成骨细胞与包被不同RGD肽的骨胶结剂-PMMA表面的粘附：
X轴：包被溶液中RGD肽的浓度(μM)，
Y轴：细胞包被的程度(％)
上层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽3)
中上层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iib，丙烯酸肽2)
中下层曲线：环RGDfK  NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiib，丙烯酸肽4)
下层曲线：环RGDfk NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iia，丙烯酸肽1)。图9：MC3T3 H1成骨细胞与包被不同RGD肽的多孔PMMA/PHEMA表面的粘附：
X轴：包被溶液中RGD肽的浓度(μM)，
Y轴：细胞包被的程度(％)
上层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽3)
中层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiib，丙烯酸肽4)
下层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iib，丙烯酸肽2)。图10：MC3T3 H1成骨细胞与包被不同RGD肽的多孔PMMA/PlexY7H表面的粘附：
X轴：包被溶液中RGD肽的浓度(μM)，
Y轴：细胞包被的程度(％)
上层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽3)
中层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiib，丙烯酸肽4)
上层曲线：环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iib，丙烯酸肽2)图11：MC3T3 H1成骨细胞与包被不同分子长度的不同的RGD肽的骨胶结剂-PMMA或聚苯乙烯-BSA-SMPB表面的最大粘附：
X轴：RGD肽的分子长度(nm)
Y轴：包被的最大程度(％)。图12：MC3T3 H1成骨细胞与包被RGD肽环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽3)的V4A不锈钢表面的粘附。不锈钢表面对它们来说已预先用不同方法包被。
X轴：包被溶液中RGD肽的浓度(μM)，
Y轴：细胞包被的程度(％)
上层曲线：Kevloc包被
中层曲线：Silicoater包被
下层曲线：色素包被。图13：MC3T3 H1成骨细胞在包被RGD肽环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽3)的骨胶结剂-PMMA表面上的增生。
X轴：培养时间(天)
Y轴：细胞计数；
上层曲线：包被溶液中100μM的肽
中层曲线：包被溶液中1μM的肽
下层曲线：包被溶液中0.1μM的肽。图14：MC3T3 H1成骨细胞和血小板与包被RGD肽环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽3)的骨胶结剂-PMMA表面的粘附。
X轴：成骨细胞单独和血小板单独接种在带有包被溶液中100μM、10μM和1μM不同肽浓度的表面
Y轴：细胞计数(405nm处的吸收)图15：MC3T3 H1成骨细胞和血小板与包被RGD肽环RGDfKGNH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽5)的骨胶结剂-PMMA表面的粘附。
X轴：成骨细胞单独和血小板单独接种在带有包被溶液中100μM、10μM和1μM不同肽浓度的表面
Y轴：细胞计数(405nm处的吸收)图16：MC3T3 H1成骨细胞、血小板以及成骨细胞/血小板混合物与包被RGD肽环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽3)的骨胶结剂-PMMA表面的粘附。
X轴：成骨细胞单独、血小板单独以及成骨细胞/血小板混合物接种在带有包被溶液中100μM肽浓度的表面
Y轴：细胞计数(405nm处的吸收)图17：M细胞3T3 H1成骨细胞、血小板以及成骨细胞/血小板混合物与包被RGD肽环RGDfKG NH-CO-丙烯酸衍生物(类型：iiia，丙烯酸肽5)的骨胶结剂-PMMA表面的粘附。
X轴：成骨细胞单独、血小板单独以及成骨细胞/血小板混合物接种在带有包被溶液中100μM肽浓度的表面
Y轴：细胞计数(405nm处的吸收)。
下列实施例不意在限制地阐明了本发明。实施例1：
(a)根据源自DE1 95 38 741的方法，合成带有与锚定物巯基丙酸的环RGD肽(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys) (→环RGDfK NH-CO-巯基衍生物类型：ia)。用类似的方法进行生物学上非活性的对应的环RβADfK衍生物以及无锚定分子的环RGDfK衍生物的合成。
(b)通过固相肽合成(Merrfield，Angew.Chem.，1985年，97卷：801页)及其后的环化(例如根据Zimmer等，1993年，Leibigs化学年鉴(Leibigs Ann.Chem.)：497页)得到环(R(Pbf)GD(tBu)fK(Z)(Pbf＝五甲基苯并呋喃磺酰基；tBu＝叔丁基)。通过标准方法学选择性去除顺式保护基团之后，用0.1mmol环(R(Pbf)GD(tBu)fK)与5ml含0.2mmol琥珀酸酐(sa)的二甲基甲酰胺反应，延伸赖氨酸侧链以得到环(R(Pbf)GD(tBu)fp[sa-K]。
(c)按如下方法合成带有锚定物巯基乙酰胺基琥珀酸的环RGD肽(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)(→环RGDfK NH-CO-巯基衍生物类型：ib＝环(RGDf[巯基-sa-K])：在60℃将10mmol半胱氨酸盐酸盐和1当量的三苯基甲醇溶于冰醋酸，用1.1当量的BF3醚合物搅拌处理。搅拌50分钟后，用饱和的NaHCO3溶液中和混和物并用乙酸乙酯抽提。将源自抽提物的油性残留物溶于叔丁醇以转化成盐酸盐，用稀盐酸调节至pH＝2并将其冷冻干燥。收率99％。根据标准方法使用EDCLxHCL，将这样得到的结构单位与环(R(Pbf)GD(tBu)f[sa-K])偶联并去除侧面保护基团。
(d)按如下方法合成带有锚定物丙烯酰胺己酸的环RGD肽(Arg-Gly-Asp-Dphe-Lys)(→环PGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物类型：iia＝环(RGDf[丙烯酸-ahx-K])：
分别合成丙烯酸锚定系统并将其作为活性酯偶联于肽侧链。为完成此步，将10mmol 6-氨基己酸和1.8当量氢氧化钙悬浮于水中，并在0℃时加入1.2当量丙烯酰氯。滤去不溶性氢氧化钙并用浓盐酸将滤液酸化到pH为2。从乙酸乙酯中重结晶已沉淀的产物。收率：65％。10mmol结晶6-丙烯酰胺己酸悬浮在50ml二氯甲烷中，用1当量N-羟基琥珀酰亚胺处理，并在0℃加入1.2当量EDClxHCl。搅拌1小时后，加10μl冰醋酸终止反应。用冰冷的、饱和的碳酸钠溶液以及用水抽提几次，然后，在硫酸钠上干燥抽提物。收率：52％。此时出现的活性酯与DMF中的环(R(Pbf)GD(tBu)fK)偶联，并用标准步骤除去侧链保护基团。
(e)按如下方法合成带有锚定物丙烯酰胺己酸-酰胺己酸的环RGD肽(Arg-Gly-Asp-Dphe-Lys)(→环-RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物类型：iib＝环(RGDf[丙烯酸-ahx-ahx-K])：
对于丙烯酸锚定系统的合成，将10mmol氨基己酸溶于水配制的磷酸钠缓冲液(pH8)并冷却至0℃。将2mmol丙烯酰胺己酸活性酯(见(d))溶于乙醇/氯仿中并缓慢加入。用稀氢氧化钠使pH恒定在8。蒸馏去除有机溶剂后，用浓盐酸将水相酸化到pH2.6，滤去已沉淀的固体，用水清洗并在五氧化二磷上干燥。收率：70％。此时出现的丙烯酸锚定系统通过本身已知的方法用EDClxHCl与肽侧链偶联，去除保护性基团。
(f)按如下方法合成带有锚定物丙烯酰胺己酸-酰胺三甘醇酸的环RGD肽(Ary-gly-Dphe-lys)(→环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物类型：iiia＝环(RGDf[丙烯酸-ahx-tEG-K])：
通过固相肽合成(见上)制备丙烯酸锚定系统。丙烯酰胺己酸(见上)作为最后一个成分进行偶联。收率：97％。此时出现的丙烯酸锚定系统通过本身已知的方法使用EDClxHCl与肽侧链偶联，去除保护基团。
(g)按与(f)类似的方法合成带有锚定物丙烯酰胺己酸-酰胺三甘醇酸的环RGD肽(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys)(→环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物类型：iiib＝环(RGDf[丙烯酸-ahx-tEG-tEGK])。收率：85％。
(i)按与(f)类似的方法合成带有锚定物丙烯酰胺己酸-酰胺三甘醇酸的环RGD肽(arg-Gly-DPhe-Lys-Gly)(→环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物类型：iiia＝环(RGDf[丙烯酸-ahx-tEG-KG])。收率：81％。实施例2：
按照Singer等，1987年，细胞生物学杂志104卷：573页或Ruoslahti等(1982年，酶学方法(Methods.Enzymol.)，82卷：803-831页)已建立的方法，将带有硫代琥珀酰亚胺基4-(对-顺丁烯二酰胺苯基)丁酸(硫代-SMPB)的根据本发明的肽与预先用小牛血清白蛋白(BSA)包被的聚苯乙烯培养物表面共价偶联。
为完成此步，用每孔250μl pH＝8.3的PBS(磷酸缓冲盐液)、2％BSA包被48孔板(Costar，“未经组织培养物处理的”，Art.No.3547)，并在室温孵育过夜以便在聚苯乙烯上产生BSA层。然后每孔用250μlpH＝8.3的PBS清洗板，并将其在室温与每孔含100μg/ml SMPB的pH＝8.3的250μl PBS溶液一起孵育1小时。每次用250μl pH＝8.3的PBS清洗孔，共三次。对于包被溶液的制备，制备有下列终浓度的合适的巯基RGD肽的溶液(pH＝8.3的PBS中)：1nm、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM和1mM。每孔加入250μl包被溶液后，在室温下孵育48孔板，然后用pH＝8.3的PBS清洗三次。每孔加入250μl溶于pH＝7.4的PBS中5％浓度的BSA溶液，之后在室温孵育2小时，用pH＝7.4的PBS清洗以封闭非特异性细胞结合位点。用与阳性样品相同的5％浓度BSA溶液处理的包被层之聚苯乙烯表面作为阴性包被对照。然后在上面提到的RGD包被的肽类表面上考察得自三个不同种类的四种细胞培养物的粘附：
——源自成年患者股骨骨松质头的原代人成骨细胞(Singgelkow等，1997年，骨(Bone)20卷：231页)；
——源自成年患者骨髓的原代人骨原细胞(Vilamitjana-Amedee等，1993年，体外细胞发育生物学(In Vitro Cell Dev.Biol.)29卷：699页)；
——源自新生大鼠颅盖的原代成骨细胞，其制备和培养按照Yagiela和Woodbury的方法(1977年，解剖记录(AnatomicalRecord)，188卷：287-305页)进行。
——得自新生小鼠颅盖的成骨细胞系MC3T3 H1(Heermeier等，1995年，细胞与材料，5卷：309-321页)，以及
——作为αvβ3/αvβ5整联蛋白阴性对照的人黑素瘤细胞系M21L。
采用这些细胞种类进行粘附实验前，在Becton-Dickenson荧光激活细胞分拣器(FACS)的协助下通过荧光标记的针对αvβ3或αvβ5受体的抗体以及针对整联蛋白亚基αv、β3、和β5的抗体证实其整联蛋白的表达。此种情况下可见该整联蛋白的强表达(图1)。
如上述将所述细胞种类以48,000个细胞/cm2的接种密度接种于RGD肽类包被的Costar 48孔板，然后在37℃、95％大气湿度和5％CO2下孵育1小时。接着用pH＝7.4的PBS洗去实验中未粘附的细胞。
根据Landegren(1984年，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，67卷：379-388页)的方法，使用合适的标准曲线，通过测定细胞酶N-乙酰胺基己糖苷酶活性间接对已粘附细胞进行定量。
用αvβ3或αvβ5选择性巯基肽1-(硫代SMPB)衍生物、巯基肽2-(硫代SMPB)的衍生物包被经BSA预处理的聚苯乙烯细胞培养物的表面，可导致强且剂量依赖性地刺激经培养的小鼠MC3T3 H1成骨细胞的粘附(见图2)。与此相反，生物学无活性的巯基肽对照无明显作用，结果显示了整联蛋白-RGD肽相互作用的高选择性和高特异性。与相应的巯基肽1和2衍生物相比，较低αvβ3/αvβ5选择性的巯基肽3-(硫代SMPB)(环RGDvE-酰胺半胱氨酸-酰胺己酸：Delforge等，1996年，分析生物化学年刊，242卷，180页)也显示了明显较弱的作用。
不同细胞种类与巯基肽1-(硫代SMPB)衍生物或巯基肽2-(硫代SMPB)衍生物包被的BSA预处理的聚苯乙烯表面的结合行为与下列结果一致：滴定曲线最大吸附率为大约70％(原代大鼠成骨细胞)、大约80％(原代人成骨细胞和原代人骨原细胞)以及大约90-100％(MC3T3 H1小鼠成骨细胞)的接种细胞，以及包被溶液中RGD肽浓度为50-1000nM时有半数最大细胞结合(图3)。与此相反，αvβ3/αvβ5阴性对照细胞(M21L)没有显示任何显著的细胞粘附。对于所采用的所有成骨细胞培养物对5％BSA包被的表面无显著细胞粘附，与其相比，所述的细胞吸附率上升大约20-40倍。
所提到的成骨细胞培养物相似的行为证实了粘附刺激效应是成骨细胞特异性的而不依赖于细胞种属。
在粘附培养基中加入经溶解的环RGDfK，能完全抑制上面提到的成骨细胞细胞培养物与包被巯基肽1-硫代SMPB衍生物的经BSA预处理的聚苯乙烯表面结合(图4)。此结果证明观察到的细胞粘附现象由RGD肽单独介导。
原代人成骨细胞或MC3T3 H1细胞的细胞粘附对提到的包被巯基肽1，2(硫代SMPB)的、经BSA预处理的聚苯乙烯表面的依赖性可产生一条饱和曲线(图5)。然而在BSA阴性包被层上未能发现显著的细胞粘附。在最大细胞接种密度的情况下，每个已粘附细胞平均表面积经计算为大约200到500μm2，这在此表面上产生平均大约15到25μm的细胞-细胞间距(图6)。因为成骨细胞直径大约是10到15μm，所以很明显肽包被层使细胞粘附位点达到表面被成骨细胞浓密包被的数量，在该表面细胞一个紧接着一个排列。细胞在提到的表面上发生粘附的时间过程显示了依赖于细胞类型的细胞的快速粘附，大约45到60分钟可完成(图7)。此处与原代细胞培养物(人，大鼠)相比，细胞系(例如MC3T3 H1)显示了更加快速的粘附动力学。在这些实验中未发现使用的两种巯基肽衍生物有显著不同。实施例3：
为了调查不同锚定分子长度，以及因之产生的细胞识别RGD序列和材料表面之间的距离对成骨细胞粘附程度的影响，用不同长度的分子间隔物制备四种不同的丙烯酸RGD肽(环RGDfK NH-CO-丙烯酸衍生物类型：iia、iib、iiia、iiib)。
如实施例1指示的或相当于Pless等，1983年，生物化学杂志，258卷：2340-2349页或Gurrath等，1992年，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)210卷：911-921页的方法进行环RGD肽的合成。
这些肽对应的锚定物长度大约为2.6nm(丙烯酸肽1，iia型)、3.5nm(丙烯酸肽2，iib型)、3.7nm(丙烯酸肽3，iiia型)和4.2nm(丙烯酸肽4，iiib型)。
为了将这些肽共价偶联到多聚化PMMA(多聚甲丙烯酸甲基酯)表面，从三种不同的PMMA组分制备不同的有孔合适形状的颗粒(直径：10mm；高：2mm)。
——对应于产品说明(40g粉末+20ml液体)的PMMA基础上的骨胶结剂(Merck KGaA，德国，许可号5181.00.00)。
——10g颗粒大小为0.5-0.6mm(Biomet)的PMMA/PHEMA颗粒(聚甲丙烯酸羟甲基酯)与1.3ml HEMA溶液(68.6％HEMA，29.4％TEGMA[三乙二醇二甲丙烯酸酯]，2％tBPB[过苯甲酸叔丁基酯])混合，并通过此方式与多孔支持材料粘附。
——10g颗粒大小为0.7-2mm的PMMA颗粒(Plex Y7H，Rhm，德国)与1.5ml甲丙烯酸甲基酯(MMA)溶液(68.6％MMA，29.4％TEGMA，2％tBPB)混合，并通过此方式与多孔支持材料粘附。
为了将丙烯酸肽共价偶联到预先多聚化的PMMA成型颗粒，在每种情况下制备溶于DMSO/0.2％樟脑醌(w/v)终浓度为100μM的丙烯酸肽1、2、3和4的储备液。然后，通过用异丙醇/0.2％樟脑醌(w/v)稀释，制备每种情况下有0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM和10μM终肽浓度的系列浓度。在日光和室温下孵育成型颗粒2小时，然后在干燥状态贮于4℃。使用前，用pH7.4的PBS清洗样品以去除未结合肽，并在pH7.4的PBS中贮于4℃过夜。
封闭非特异细胞结合方法如下：每个成型颗粒加入250μl溶于pH7.4的PBS的5％浓度BSA溶液，接着在室温孵育2小时，并用pH7.4的PBS清洗一次。
用异丙醇/0.2％樟脑醌(w/v)溶液替代肽溶液来处理的PMMA成型颗粒，作为阴性对照。
接着，考查得自新生小鼠颅顶的MC3T3 H1系成骨细胞与上述肽包被表面的粘附(Heermeier等，1995年，细胞与材料，5卷：309-321页)。
如上述，以48,000个细胞/cm2的接种密度将MC3T3 H1成骨细胞和RGD肽包被的PMMA成型颗粒一起接种于Costar48孔板内，然后在37℃、95％大气湿度和5％CO2孵育1小时。实验过程中用pH7.4的PBS清洗两次以去除未粘附细胞。
根据Landegren(1984年，免疫学方法杂志，67卷：379-388页)的方法，使用合适的标准曲线测定细胞酶N-乙酰胺基己糖苷酶的活性，间接对已粘附细胞的进行定量。
MC3T3 H1成骨细胞与提到的用丙烯酸RGD肽1(iia型)、2(iib型)、3(iiia型)和4(iiib型)包被的不同PMMA成型颗粒的结合行为，在每种情况下与一条滴定曲线相对应。最大吸附速率对于丙烯酸肽1为大约20％，对于丙烯酸肽2、3和4为大约80-100％。对于丙烯酸肽2、3和4，包被溶液中RGD肽浓度大约为1-10,000nM时发生半数最大细胞结合。
与未包被表面相比，所述的RGD肽包被的骨胶结剂成型颗粒之细胞吸附率增加大约1.5倍(丙烯酸肽1)以及大约5-15倍(丙烯酸肽2、3和4)(图8)。
与未包被的表面相比，所述的RGD肽包被的多孔PMMA/PHEMA粒之成型颗粒的细胞吸收率增加大约2-5倍(丙烯酸肽2、3和4)(图9)。
与未包被的表面相比，所述的RGD肽包被的多孔Plex Y7H粒之成型颗粒的细胞吸收率增加大约2-3倍(丙烯酸肽2、3和4)(图10)。
对于PMMA/PHEMA或对于PMMA-Plex Y7H样品，与PMMA胶结剂成型颗粒相比，可观察到如下结果：细胞粘附值有更大的变异度，以及成骨细胞对未包被样品有更强的粘附和对包被RGD肽的样品有恒定的最大粘附率。
对于丙烯酸肽2、3和4，相互之间比较以及与巯基肽1和2包被比较测试BSA对照，观察到非常相似的细胞粘附刺激，但最短的肽，丙烯酸肽1几乎无活性。从中可总结出RGD细胞识别序列与材料表面之间大约2.5-3.5nm的决定性最小距离是必须的，以使得在立体空间上能成功地进行细胞粘附(图11)。
丙烯酸肽3在骨胶结剂-PMMA载体上有较高活性，表明对于细胞粘附最佳的分子结构，这顾及到分子长度以及任选地隔离物中疏水/亲水分布或比率。实施例4：
为了测试成骨细胞与肽包被的金属表面的细胞粘附，提供了带有三种不同包被变异体的V4A不锈钢成型颗粒(7×7×1mm3)，并且在每种情况下依次用RGD将其包被。为了完成此步，首先为了清洁在60℃超声浴中孵育不锈钢成型颗粒15分钟，用去离子化水冲洗，在丙酮中孵育30分钟，用去离子化水再次冲洗并在60℃孵育2小时以干燥。
然后通过三种不同的方法包被不锈钢小板：
a.Kevloc法(Heraeus Kulzer GmbH，Wehrheim，德国)：
少量采用Kevloc引物溶液并在室温孵育3分钟。然后同样少量采用Kevloc结合溶液并在干燥炉中180℃20分钟将其激活。
因为此包被法直接在金属表面上得到游离丙烯酸基团，对于多聚化PMMA骨胶结剂，如实施例3中所述可直接共价偶联丙烯酸肽3，iiia型。
b.Sillicoater法(Heraeus Kulzer GmbH，Wehrheim，德国)：
少量采用Siliseal溶液并在室温干燥5分钟。然后同样少量采用Sililink溶液并在干燥炉中320℃3分钟将其激活。
为了在已包被的金属表面得到丙烯酸基团，将预处理的不锈钢成型颗粒浸入加热到75℃的去离子化水中，用氢氧化钠将pH调至大约8.00。搅拌1小时以上，定量加入1％3-甲基丙烯酰基氧丙基三甲氧基硅烷(Hüls AG，德国)直到pH为大约6.50。然后在75℃搅拌混合物1小时；此时pH为大约6.35。
对于多聚化PMMA骨胶结剂，如实施例3所述进行丙烯酸肽，iiia型的结合。
c.色素包被法(Merck KgaA，Darmstadt，德国)
根据DE-A 4321005中所述的硅烷化方法进行此包被法，该方法最初代表了珍珠光泽色素包被的技术性教导，此包被法用于汽车和塑料工业中金属和塑料的水基包被系统。
对于此，将不锈钢成型颗粒浸入加热到75℃的去离子化水中，用氢氧化钠将pH调至大约8.00，并且定量加入AlCl3溶液搅拌2小时以上。然后同样定量加入5％硅酸钠，搅拌2小时以上。在下面的步骤中，定量加入1％3-甲基丙烯酰基氧丙基三甲氧基硅烷搅拌1小时(HülsAG，德国)。然后在75℃搅拌混合物1小时；此时pH为大约6.40。
对于多聚化PMMA骨胶结剂，如实施例3所述进行丙烯酸肽，iiia型的结合。
通过三种不同方法用丙烯酸肽3(iiia型)包被不锈钢成型颗粒后，调查了MC3T3 H1系成骨细胞的粘附。为了完成此步，使用实施例3中所述的方法。
MC3T3 H1成骨细胞与V4A不锈钢成型颗粒的结合行为在每种情况下对应于一条滴定曲线，该成骨细胞用所说的丙烯酸肽3包被并使用三种不同的方法进行了预处理(图12)。
最大粘附率对于色素包被法为大约60％，对于Kevloc或Silicoater法为大约80％。对于所有三种不同的包被法，包被溶液中RGD肽浓度为大约1-100nM时发生半数最大细胞结合。与未包被对照相比，RGD肽包被的不锈钢成型颗粒上所述的细胞吸收率增加大约3到8倍。
对于Kevloc或Silicoater方法，每种情况只使用一种包被溶液(只有Kevloc引物，只有Kevloc结合剂，只有Siliseal，只有Sililink)可另外产生包被层。在此种情况下与各自的双包被层(Kevloc引物/结合剂，Siliseal/Sililink)相比，细胞粘附未观察到有显著差异。实施例5：
为了补充调查成骨细胞的粘附以及它们在RGD肽包被的表面的增生，进行如下步骤：
对于丙烯酸肽3(iiia型)与多聚化PMMA骨胶结剂成型颗粒的共价偶联，选择实施例3中所述的包被方法。
同样如实施例3中所述，MC3T3 H1小鼠成骨细胞与这些RGD肽包被的骨胶结剂成型颗粒粘附，但有两点不同：接种12,000个细胞/cm2而不是48,000个细胞/cm2，以及粘附时间为2小时而不是1小时。另外，在包被溶液中只调查了三种不同肽浓度：0.01μM、1μM和100μM。洗去未粘附细胞后，在含血清(10％)的培养基中于95％大气湿度以及5％CO2和37℃培养MC3T3 H1成骨细胞15天。在此期间，每周更换培养基两次，通过由Boehringer Mannheim，德国WTS-1测试确定第1、2、3、4、5、10和15天的细胞计数。此处可见每种情况下经培养的成骨细胞有典型的细胞增生指数期(图13)。得到的最大细胞计数直接依赖于包被溶液中RGD肽的浓度。这样培养15天后，每平方厘米分别有大约1,000,000个细胞(100μM肽)、大约550,000个细胞(1μM肽)、大约300,000个细胞(0.01μM肽)以及大约230,000个细胞(无肽的对照)。这样在100μM的最高肽浓度，与未包被样品比观察到细胞增生增加4到5倍。实施例6：
用于不同细胞选择性的RGD肽包被的材料以获得这样的植入物，其带有已局部分化的生物活性包被模式的模型，为多聚化PMMA骨胶结剂成型颗粒，它能刺激不同细胞种类粘附。将两种不同细胞选择性的RGD肽共价偶联到这些颗粒上。在此种情况下如实施例3所述，将对带有αvβ3和αvβ5整联蛋白的成骨细胞有选择性的丙烯酸肽3(iiia型)以及对αIIIbβ3阳性的血小板有选择性的丙烯酸肽5(iiia型)与PMMA成型颗粒连接。
a.第一部分实验中，用每种情况下包被溶液中浓度为100μM、10μM和1μM的丙烯酸肽3和5包被PMMA成型颗粒。然后如实施例3中所述，将RGD肽包被的材料与成骨细胞和血小板一起平行接种，测定它们的细胞粘附。
MC3T3 H1成骨细胞(350,000细胞/cm2)和人血小板(50万个细胞/cm2)在每种情况下平行接种到包被丙烯酸肽3和丙烯酸肽5的PMMA成型颗粒上，并如实施例3测定它们的细胞粘附。
按照Shattil和Brass(生物化学杂志，262卷：992-1000页，1987年)的方法制备人血小板。用此实验可能证明两种RGD肽的细胞选择性。
与αvβ3和αvβ5阴性血小板相比，αvβ3和αvβ5阳性成骨细胞优先粘附丙烯酸肽3(αvβ3和αvβ5选择性的)包被的PMMA成型颗粒(图14)。对于成骨细胞，此处发现经计算的吸收值(405nm)分别为大约6.0(对于包被溶液中有100μM肽)、大约2.0(对于10μM肽)或大约1.8(对于1μM肽)。然而对于血小板，发现显著较低的细胞粘附值，分别为大约3.0吸收值(对于包被溶液中有100μM肽)、大约1.5吸收值(对于10μM肽)或大约0.2吸收值(对于1μM肽)。然而，在丙烯酸肽5(αIIIbβ3选择性的)包被的PMMA成型颗粒上发现相反效应。在此种情况下，与αIIbβ3阴性的成骨细胞相比，αIIbβ3阳性的血小板优先粘附(图15)。
对于血小板，此处发现经计算的吸收值(405nm)分别为大约4.0(对于包被溶液中有100μM肽)、大约0.5(对于10μM肽)或大约0.2(对于1μM肽)。然而对于成骨细胞发现显著较低的细胞粘附值，分别为大约1.5吸收值(对于包被溶液中有100μM肽)、大约1.0吸收值(对于10μM肽)或大约0.2吸收值(对于1μM肽)。
b.在第二部分实验中，同样用丙烯酸肽3和5包被PMMA成型颗粒，但在每种情况下只用包被溶液中100μM的浓度。然后将这些RGD肽包被的材料与成骨细胞、血小板或成骨细胞/血小板混合物一起平行接种，测定它们的细胞粘附。如实施例3中所述，在每种情况下，将MC3T3 H1成骨细胞(350,000细胞/cm2)、人血小板(50万个细胞/cm2)以及细胞混合物(350,000细胞/cm2或50万个细胞/cm2)平行接种到丙烯酸肽3和丙烯酸肽5包被的PMMA成型颗粒上，并测定它们的细胞粘附。
与αvβ3和αvβ5阴性血小板(大约3.0吸收值)相比，αvβ3和αvβ5阳性的成骨细胞(大约6.0吸收值)优先粘附丙烯酸肽3包被的PMMA成型颗粒(图16)。如果将两种细胞类型混合接种，可得到与只接种成骨细胞的结果(大约6.5吸收值)一致的结果。
然而，在丙烯酸肽5(αIIIbβ3选择性)包被的PMMA成型颗粒上发现相反效应。与αIIbβ3阴性的成骨细胞(大约1.5吸收值)相比，αIIbβ3阳性的血小板(大约4.0吸收值)优先粘附(图17)。如果将两种细胞类型混合接种，可得到与血小板和成骨细胞各个值的总和(大约6.5吸收值)近似一致的结果。
这些结果证实，用不同细胞选择性的RGD肽包被植入物表面能用于产生这样的植入物，该植入物介导所选细胞种类优先粘附。在此种情况下，成骨细胞和血小板之间的比较显示
——与没有或仅有很小互补性整联蛋白的细胞相比，带有整联蛋白选择性的RGD肽包被的表面能显著地刺激有这些互补性整联蛋白的细胞种类的粘附。
——此效应在使用细胞混合物时仍然存在，并更加接近体内状态。

Claims (14)

1.适合于不同人和动物器官的植入物，它基本上由载体基质和围绕此基质的肽包被层组成，该包被层含有用于人或动物体细胞靶向粘附刺激的相同或不同的肽，其在负责粘附人或动物细胞的整联蛋白受体上有识别结合位点的序列，载体基质含有能结合在其表面的反应性基团，能与该肽层合适的官能团形成稳定的共价键，该植入物特征在于通过植入物表面出现经局部分化的有选择性的生物活性包被层模式，该肽被排列在植入物表面，从而因为其对应于不同的结构相关的细胞粘附刺激活性，使它们特异地对应于组织细胞天然不同的互补整联蛋白模式，此组织细胞在待植入植入物的细胞特定区域与其邻接。
2.根据权利要求1的植入物，其特征在于该肽在锚定分子的协助下连接于植入物的表面。
3.根据权利要求2的植入物，其特征在于锚定分子由下列结构之一组成：-CO-(CH2)k-X-SH    (i)，
其中X是单键或-CO-NH-(CH2)l-，k＝2至12并且l＝2至4；-CO-(CH2)m-[NH-CO-(CH2)n]p-NH-CO-CH＝CH2    (ii)
其中m，n＝2至8；p＝0至2，-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)q-CO-(CH2)r-NH-CO-CH＝CH2(iii)
其中q＝1至3并且r＝2至8。
4.根据权利要求3的植入物，其特征在于锚定分子选自下列结构之一：-CO-CH2-CH2-SH-；    (ia)-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH；  (ib)-CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2；    (iia)-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2；    (iib)-CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2；  (iiia)-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)2-CO-(CH2)5-NH-CO-CH＝CH2(iiib)。
5.根据权利要求2至4任一项的植入物，其特征在于肽通过酰胺键经由锚定分子的羧基基团连接于植入物表面，并且锚定分子经由巯基或丙烯酸基团结合于植入物表面。
6.根据权利要求5的植入物，其特征在于这样的肽锚定分子连接于植入物表面，以使肽的细胞识别结构域与未包被材料表面之间立体决定性的绝对最小距离为2.5至3.5nm。
7.根据权利要求1至6的植入物，其特征在于肽能与表达αvβ3-αvβ5的细胞结合。
8.根据权利要求1至7任一项的植入物，其特征在于它含有带RGD氨基酸序列的肽。
9.根据权利要求8的植入物，其特征在于它含有环RGDfK序列的肽。
10.根据权利要求1至9任一项的植入物，其特征在于在该肽或肽锚定分子与载体基质之间，它含有引起表面增大效应的粘附促进中间层和/或支链分子，
11.根据权利要求1至10任一项的植入物，其特征在于载体基质是适当形状的陶瓷、高分子材料或金属，或是能由体内或体外与细胞集群可形成生物杂交器官的这些材料制成的有结构的形状。
12.制备根据权利要求1至11的植入物的方法，其特征在于
(i)通过体外测试系统测定待体内植入植入物的靶组织之整联蛋白受体结构，
(ii)选择或合成有合适互补结构的所述肽，并且
(iii)该肽直接或经由所述的锚定分子共价结合于植入物各自经任选修饰的表面，不同的肽在植入物表面的局部排列相应于靶细胞特定的预先测定的局部排列，此待植入物插入的靶细胞有互补的整联蛋白模式。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于通过免疫组织学活性抗体进行体外测定靶组织的整联蛋白受体结构。
14.根据权利要求12或13的方法，其特征在于通过已知用于其他包被类型的方法将所述的肽或肽锚定分子与植入物表面偶联。
CN98805227A 1997-05-22 1998-05-09 肽包被的植入物及其制备方法 Pending CN1256635A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19721352 1997-05-22
DE19721352.9 1997-05-22
DE19755801A DE19755801A1 (de) 1997-12-16 1997-12-16 Mit die Zelladhäsion vermittelnden Peptiden beschichtete Implantate und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE19755801.1 1997-12-16
DE19818098A DE19818098A1 (de) 1997-05-22 1998-04-23 Peptid-beschichtete Implantate und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE19818098.5 1998-04-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1256635A true CN1256635A (zh) 2000-06-14

Family

ID=27217395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN98805227A Pending CN1256635A (zh) 1997-05-22 1998-05-09 肽包被的植入物及其制备方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6280760B1 (zh)
EP (1) EP0983095B1 (zh)
CN (1) CN1256635A (zh)
AT (1) ATE277645T1 (zh)
AU (1) AU743878B2 (zh)
CA (1) CA2290481C (zh)
ES (1) ES2229499T3 (zh)
PL (1) PL337019A1 (zh)
WO (1) WO1998052619A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101817873A (zh) * 2010-03-11 2010-09-01 复旦大学 一种促进细胞黏附的多肽及其制备方法
CN103845759A (zh) * 2014-03-14 2014-06-11 国家纳米科学中心 一种组织工程界面修饰材料、其修饰方法及应用
CN106361280A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 孟玲 一种组合虹膜和皮层组织的生物光学成像装置采用的光学成像装置
CN109675098A (zh) * 2019-01-09 2019-04-26 山东大学 一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6312474B1 (en) * 1999-09-15 2001-11-06 Bio-Vascular, Inc. Resorbable implant materials
US6726718B1 (en) * 1999-12-13 2004-04-27 St. Jude Medical, Inc. Medical articles prepared for cell adhesion
JP2001190570A (ja) * 2000-01-14 2001-07-17 Science & Tech Agency 人工歯根
DE10040103A1 (de) * 2000-08-17 2002-02-28 Merck Patent Gmbh Peptid- und Peptidmimetika-Derivate mit Integrin-Inhibitor-Eigenschaften II
DE10040105A1 (de) * 2000-08-17 2002-02-28 Merck Patent Gmbh Peptid- und Peptidmimetika-Derivate mit Integrin-Inhibitor-Eigenschaften
WO2002040073A1 (en) 2000-11-20 2002-05-23 Université De Genève Endosseous implant
JP4043789B2 (ja) * 2001-01-24 2008-02-06 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 表面を修飾するための方法
US20040126900A1 (en) * 2001-04-13 2004-07-01 Barry Stephen E High affinity peptide- containing nanoparticles
MXPA04001074A (es) * 2001-08-07 2004-07-08 Sunesis Pharmaceuticals Inc Ligandos de bisulfuro y tiosulfonato y colecciones que comprenden estos ligandos.
US7371258B2 (en) 2001-10-26 2008-05-13 St. Jude Medical, Inc. Valved prosthesis with porous substrate
US20030185870A1 (en) * 2001-11-20 2003-10-02 Grinstaff Mark W. Interfacial biomaterials
US20030161938A1 (en) * 2002-02-22 2003-08-28 Bo Johnson Composition and method for coating medical devices
KR20030087430A (ko) * 2002-05-10 2003-11-14 장준혁 Ｔｉ 금속에 특이적으로 부착하는 올리고 펩타이드
US20030220696A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 Levine David Jerome Implantable porous metal
US20050074437A1 (en) * 2003-10-06 2005-04-07 Domonkos Horvath Device for the regeneration of tissue, specifically bone regeneration by means of callus distraction
KR101013999B1 (ko) * 2004-03-19 2011-02-14 재단법인서울대학교산학협력재단 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및임플란트
AU2005231458A1 (en) * 2004-04-05 2005-10-20 Medivas, Llc Bioactive stents for type II diabetics and methods for use thereof
DE102004025130A1 (de) * 2004-05-18 2005-12-08 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Körperschaft des Öffentlichen Rechts Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Sludgeablagerungen auf Materialien für Endoprothesen sowie Endoprothese
WO2006098744A2 (en) 2004-06-16 2006-09-21 Affinergy, Inc. Ifbm’s to promote attachment of target analytes
JP2006068378A (ja) * 2004-09-03 2006-03-16 Terumo Corp 血管内留置物
US7807624B2 (en) * 2006-01-11 2010-10-05 Affinergy, Inc. Methods and compositions for promoting attachment of cells of endothelial cell lineage to medical devices
US7531505B2 (en) * 2006-01-11 2009-05-12 Affinergy, Inc. Compositions and methods for promoting attachment of cells of endothelial cell lineage to medical devices
WO2008143733A2 (en) * 2007-03-02 2008-11-27 Dohney Eye Institute Biocompatible implants and methods of making and attaching the same
US20080305320A1 (en) * 2007-03-02 2008-12-11 Lucien Laude Nanoscale surface activation of silicone via laser processing
US20090053280A1 (en) * 2007-05-15 2009-02-26 Michael Joner Coating stents with cyclic rgd peptides or mimetics
CN101891800B (zh) * 2009-05-22 2012-09-12 首都医科大学 饱和脂肪链醇rgd五肽酯化合物及其合成方法和用途
CN101891801B (zh) * 2009-05-22 2012-09-05 首都医科大学 饱和脂肪链醇rgd五肽双酯化合物及其合成方法和应用
DE102009026622A1 (de) 2009-05-29 2010-12-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Formkörper mit eingebetteten Kopplungspartikeln für Biomoleküle
KR101681886B1 (ko) 2015-04-06 2016-12-12 서울대학교산학협력단 지르코니아 결합능을 가지는 펩타이드
DE202015006574U1 (de) * 2015-09-17 2015-11-13 Universität Leipzig Peptid zur Beschichtung von Oberflächen

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992000047A1 (en) * 1990-06-22 1992-01-09 Case Western Reserve University Process for controlling cell growth on surfaces
DE4228717A1 (de) * 1992-08-28 1994-03-03 Cassella Ag Imidazolidin-Derivate
US5641644A (en) * 1994-12-09 1997-06-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for the precise positioning of cells
US7008634B2 (en) * 1995-03-03 2006-03-07 Massachusetts Institute Of Technology Cell growth substrates with tethered cell growth effector molecules

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101817873A (zh) * 2010-03-11 2010-09-01 复旦大学 一种促进细胞黏附的多肽及其制备方法
CN103845759A (zh) * 2014-03-14 2014-06-11 国家纳米科学中心 一种组织工程界面修饰材料、其修饰方法及应用
CN106361280A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 孟玲 一种组合虹膜和皮层组织的生物光学成像装置采用的光学成像装置
CN109675098A (zh) * 2019-01-09 2019-04-26 山东大学 一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU7763898A (en) 1998-12-11
CA2290481A1 (en) 1998-11-26
PL337019A1 (en) 2000-07-31
WO1998052619A3 (de) 1999-03-18
ATE277645T1 (de) 2004-10-15
AU743878B2 (en) 2002-02-07
EP0983095B1 (de) 2004-09-29
EP0983095A2 (de) 2000-03-08
US6280760B1 (en) 2001-08-28
ES2229499T3 (es) 2005-04-16
WO1998052619A2 (de) 1998-11-26
CA2290481C (en) 2009-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1256635A (zh) 肽包被的植入物及其制备方法
CN1309428C (zh) 关节软骨再生材料及其制造方法、关节软骨的再生方法及培养方法以及移植用人造关节软骨
CN1098863C (zh) 光固化交联透明质酸凝胶、其制备方法和生物医学材料
JP5105360B2 (ja) 表面に骨組織形成促進ペプチドが固定されている骨移植材及び組織工学用支持体
CN1083455C (zh) 可光固化的葡糖氨基聚糖衍生物,其交联物及制法和应用
Rezania et al. Integrin subunits responsible for adhesion of human osteoblast‐like cells to biomimetic peptide surfaces
Hsiong et al. Cyclic arginine-glycine-aspartate peptides enhance three-dimensional stem cell osteogenic differentiation
Ku et al. The effect of the surface modification of titanium using a recombinant fragment of fibronectin and vitronectin on cell behavior
Sawyer et al. The effect of the addition of a polyglutamate motif to RGD on peptide tethering to hydroxyapatite and the promotion of mesenchymal stem cell adhesion
Jha et al. Controlling osteogenic stem cell differentiation via soft bioinspired hydrogels
CN1152938A (zh) 对在生物人工器官中被囊细胞的生长控制
CN1042162A (zh) 合成含有氨基酸和/或肽的接枝共聚物
CN1649899A (zh) 结缔组织刺激肽
CN1520306A (zh) 用于组织修复的方法和器件
CN1688543A (zh) 呋喃酮衍生物及其制备方法
CN1780851A (zh) 将分子递送到细胞的方法和载体复合物
CN1599749A (zh) 促进细胞粘附、生长和分泌的肽
CN1950114A (zh) 用于医疗物品的天然生物可降解的多糖涂层
Mas-Moruno Surface functionalization of biomaterials for bone tissue regeneration and repair
CN1561235A (zh) 具有骨诱导和骨传导特性的装置
CN1313158C (zh) 促进核酸转移的方法
JP2010088933A (ja) ペプチド被覆インプラントおよびその調製方法
EP4095234A1 (en) Method for controlling young's modulus of three-dimensional tissue body, method for producing three-dimensional tissue body, and three-dimensional tissue body
CN1968719A (zh) 生物功能性涂层
US7803905B2 (en) Bioactive peptide for cell adhesion

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication