CN1520306A - 用于组织修复的方法和器件 - Google Patents

用于组织修复的方法和器件 Download PDF

Info

Publication number
CN1520306A
CN1520306A CNA028078608A CN02807860A CN1520306A CN 1520306 A CN1520306 A CN 1520306A CN A028078608 A CNA028078608 A CN A028078608A CN 02807860 A CN02807860 A CN 02807860A CN 1520306 A CN1520306 A CN 1520306A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cfu
pearl
polymer
granule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028078608A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100339477C (zh
Inventor
J��A��ά����÷˹��
J·A·维尔克梅斯特
M����ķФ
蔡伟博
�������ɭ
J·A·M·拉姆肖
H·W·蒂森
张根源
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industrial Technology Research Institute ITRI
Original Assignee
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO, Industrial Technology Research Institute ITRI filed Critical Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Publication of CN1520306A publication Critical patent/CN1520306A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100339477C publication Critical patent/CN100339477C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

披露了用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，包括在受试者的存在病变或受损组织的部位，施用正常存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。当所述细胞和/或其合适的祖细胞是软骨细胞、胚胎干细胞和/或骨髓基质细胞时，本发明的方法适合治疗，例如，与原发性骨关节炎相关的关节软骨变性。还披露了用于治疗受试者中的病变或受损组织的具有组织样特征的器件，其中，所述器件包括正常存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒结合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质结合。

Description

用于组织修复的方法和器件
发明领域
本发明涉及用于治疗病变或受损组织，特别是治疗与原发性骨关节炎相关的关节软骨变性的方法和器件，和治疗通过由于运动损伤或创伤导致的其他关节软骨损伤的方法和器件。本发明还可应用于组织增大(例如，用于美容目的)。
发明背景
关节软骨被覆骨关节(例如膝关节)的骨骼，在这里，它可以保证低摩擦力的稳定运动，并且提供对压缩的耐受性和负荷分布。关节软骨表现为透明软骨的简单的、无血管的基质，但是，实际上它由根据基质形态学和生物化学组构成四个区域(即表层区、过渡区、中间区和钙化区)的、由软骨细胞和细胞外基质(ECM)形成的相对复杂的形式组成。反过来，上述每一个区又包括三个独立的区(即细胞周区、区域区、和区域间区)。软骨细胞占人类关节软骨体积的比例低于5％，因此，为了保持组织完整性(即大小和机械特性)，更换降解的ECM分子是必要的。ECM包括多种成分，这些成分包括胶原(主要是II型胶原)、糖蛋白、蛋白聚糖和组织液，它最多可占关节软骨组织重量的大约80％。所述胶原成分供给了ECM纤维网结构，而所述糖蛋白被认为有助于该结构的稳定性。蛋白聚糖包括大的聚集的单体(即聚集蛋白聚糖)，由它填充纤维间的空间，并且因为它所具有的吸水能力，它被认为造成了关节软骨弹性和负荷分布特性的大部分。最后，包括营养源和氧气的所述组织液，提供了具有抗压缩以及在变形之后恢复其规则形状的能力的关节软骨(有关综述参见Temenoff和Mikos，2000)。
由关节软骨变性或损伤导致的关节疼痛，是困扰所有年龄段的人群的疾病。其主要成因是原发性骨关节炎和创伤导致的软骨损失(Buckwalter和Mankin，1998)。最近，业已估算出仅在美国就以多达4300万人患有某种形式的关节炎(参见以下网站的“关节炎小册子”http：//orthoinfo.aaos.org/)，同时由运动损伤导致的软骨损伤也很常见。
不幸的是，并且部分由于它的复杂结构(Temenoff和Mikos，szpra)，关节软骨具有极低的自我修复能力，因此，关节软骨变性和损伤会持续多年时间，并且通常会导致进一步的变性(即继发性骨关节炎)。
关节软骨变性的治疗方案可以根据四条原则分类，即置换、缓解、切除和重建。关节软骨的置换包括使用假体或同种异体移植物。症状缓解可以通过截骨手术实现，这种手术切除了有缺陷的关节中骨骼之一的一部分，以便减轻负荷和张力。切除表示通过手术取出变性的关节软骨，并且随后连接健康的周围关节软骨组织。所述切除手术可能包括或不包括使用插入关节成形术，最后，重建表示治愈或再生所述关节表面，包括关节软骨和软骨下骨。重建可能包括试图增强自我修复(例如，通过使用诸如生长因子的药用制剂，或软骨下钻孔，摩擦或微型骨折，以便从骨髓中“募集”多能干细胞)，或者通过移植具有再生关节软骨能力的骨细胞或其他细胞再生新的关节表面。
为了开发合适的“重建”治疗，或者更确切地讲，包括再生新关节表面的治疗(有时称之为“生物学表面再生”)，近年来业已进行了大量研究。所述治疗与截骨术或假体置换相比，对患者的创伤较小，并且与使用同种异体移植物相比也具有优点。所述同种异体移植物可能不具有免疫耐受能力，并且可能含有外源病原体，或者多种同种异体移植物不可避免地会在所述患者的其他部位导致损伤。业已提出的一种“生物学表面再生”治疗，包括从患者的关节软骨生物活组织检查物中收获软骨细胞(Freed等，1999)。在培养物中扩增所述细胞，并且通过在骨膜瓣下注射，回输到所述患者体内。对所述骨膜瓣进行缝合，以便将扩增的软骨细胞保留在需要修复的部位。尽管在过去十年中，业已证实这种治疗方法在人类实验中表现出良好前景(Temenoff和Mikos，同上)，由于需要骨膜瓣，增加了对该技术的额外限制，并且将所述骨膜瓣缝合在注射软骨上方的动作，可能导致对相邻组织的损伤。另外，没有证据表明所述扩增的细胞保持了软骨细胞的表型和功能特征。实际上，它们可能分化成成纤维细胞样细胞，这种细胞能产生有机械缺陷的组织。
使用上述自体细胞系统和骨膜瓣的一种潜在的替代方案是使用预先成型的多孔支架，该支架接近所述病变或受损组织的所需形状和形式，并且业已接种过软骨细胞，并且培养了至少2-3周时间。然后将所形成的所述组织等同物移植到需要部位(Thomson等，1995)。用基于胶原的支架进行的最新研究一直充满着希望。不过，在本领域中进行的大多数现有研究是为了鉴定适合支架的合成聚合物材料，因为这种材料可以大量生产，并且可以克服有关不能从供体胶原中完全清除病原体的可能性的问题(Temenoff和Mikos，同上)，研究过的合成聚合物材料的具体例子是FIDA-批准的聚合物纤维、聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯(PLA)和聚(丙交酯-共乙交酯共聚物)(PLGA)。可以织成纱布的所述聚合物纤维是生物可以降解的，因此，与不可降解的聚合物相比，它所具有的优点是，它们的逐渐降解稳定地产生了供组织生长使用的空间，并且，其次，它们还消除了在重建关节软骨之后通过手术取出所述支架的必要性。
不过，支架的使用具有必须通过手术植入的显著缺陷。因此，其他研究小组致力于开发可以随软骨一起注射的聚合物，并且，这些聚合物随后在原位进行交联，形成支架基质。例如，可以混合并且注射血纤蛋白原和凝血酶，其中，形成了一种可降解的血纤蛋白网(Sims等，1998)，并且业已研究了藻酸盐，因为它可能与钙发生交联(Rodriguez和Vacanti，1998)。不过，业已发现藻酸盐是免疫原性的(Kulseng等，1999)，并且能引起比合成聚合物材料更强的炎性反应(Cao等，1998)。因此，业已用可注射的合成聚合物凝胶材料进行了研究，所述材料包括环氧乙烷和环氧丙烷共聚物PEO-共-PPO(Cao等，同上)，以及聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物(Hubbell，1998)。
本发明涉及组织再生的替代方法，特别是关节软骨再生，其中，将软骨细胞和/或其他合适的祖细胞与可生物再吸收的珠或颗粒结合或混合，以便给予受试者的需要组织再生的部位。据信，所述方法使它本身具有上文所讨论的生物可降解的聚合物支架的诸多优点，包括在需要时通过注射使用的能力。另外，尽管不希望受理论的约束，人们认为使用珠或颗粒，可以提供机械和空间填充优点，同时通过对压缩的物理支撑和抗性而促进组织再生。
发明公开
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，该方法包括给所述受试者的发生所述病变或受损组织的部位，施用正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且选择地与凝胶和/或成凝胶物质联合。
所述细胞和/或祖细胞可以通过简单地混合与所述珠或颗粒联合，因此，可能不必与所述珠或颗粒结合。可以通过在合适的容器中进行低剪切力搅拌，将所述细胞和/或祖细胞与所述珠或颗粒混合。所述凝胶和/或成凝胶物质，可以同时与所述细胞和/或祖细胞和珠或颗粒混合，或者依次混合。不过，所述细胞和/或祖细胞优选通过结合与所述珠或颗粒联合。这一目的可以通过在存在所述珠或颗粒的情况下扩增所述细胞和/或祖细胞而实现。
因此，在第二方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，该方法包括以下步骤：
(i)获得正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞和/或其合适的祖细胞，
(ii)在存在可生物再吸收的珠或颗粒条件下扩增所述细胞和/或祖细胞，以便所述扩增的细胞和/或祖细胞结合在所述珠或颗粒上，和
(iii)在存在所述病变或受损组织的部位给所述受试者施用在它上面结合了所述细胞和/或祖细胞的珠或颗粒，任选处于凝胶和/或成凝胶物质中。
本领域技术人员可以理解的是，在上面步骤(i)和(ii)之间，可以进行额外的扩增步骤。所述额外的扩增步骤可能包括在例如，单层中生长所述细胞。
本领域技术人员还可以理解的是，根本没有必要在存在所述珠或颗粒的条件下扩增所述细胞和/或祖细胞。相反，可以扩增所述细胞和/或祖细胞，并且随后结合在所述珠或颗粒上。
因此，在第三方面，本发明提供了用于治疗受试者的病变或受损组织的方法，该方法包括以下步骤：
(i)获得正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞和/或其合适的祖细胞，
(ii)扩增所述细胞和/或祖细胞，
(iii)将所述扩增的细胞和/或祖细胞与生物再生珠或颗粒连接，和
(iv)在存在所述病变或受损组织的部位给所述受试者施用在它上面结合了所述细胞和/或祖细胞的珠或颗粒，任选处于凝胶和/或成凝胶物质中。
所述细胞和/或祖细胞是经过选择的，以便它们是适合再生所述特定病变或受损组织类型(例如，要治疗的组织类型的成熟分化细胞)的类型。因此，举例来说，为了治疗病变或受损的皮肤，用于本发明方法中的细胞可以是成纤维细胞和/或其祖细胞。当要再生的组织是骨时，所述细胞可以是成骨细胞和/或其祖细胞，同时为了治疗脂肪组织，所述细胞可以是脂肪细胞和其祖细胞。
优选将本发明的方法用于治疗(例如修复)关节软骨变性或损伤。就此而言，关节软骨组织再生可以在关节软骨变性或损伤部位完成，并且逐渐降解所述可生物再吸收的珠或颗粒，以便在再生之后清除不需要的所述珠或颗粒。在本发明方法的这种应用中，所使用的细胞是软骨细胞和/或其祖细胞。另外，如上文所述，人们认为在组织再生进行的过程中，所述珠或颗粒提供了机械和空间填充优点。就是说，它们可以通过提供对骨关节的物理支撑，提供对关节软骨变性或损伤的承重缓冲，降低在关节运动期间的摩擦和抗压缩。另外，当所述珠或颗粒在凝胶和/或成凝胶物质中使用时，所述珠或颗粒似乎能阻止凝胶收缩，这种收缩有可能对组织缺陷的空间填充造成负面影响。
所述软骨细胞和/或祖细胞可以通过本领域公知的任何方法收获，不过，最方便的是通过组织活组织检查收获。合适的软骨祖细胞是未分化过的细胞，如胚胎干细胞和骨髓基质细胞。所述软骨细胞和/或祖细胞优选是从要治疗的受试者获得的。
在本发明第二和第三方面方法中的扩增步骤，优选通过本领域公知的任何方法扩增细胞和/或祖细胞5-2000倍，更优选扩增10-100倍。例如，扩增可以在合适的培养皿中通过细胞培养进行(如陪替氏培养皿，例如，使用或不使用琼脂凝胶)，不过，更优选的是在生物反应器中进行，其中，对培养基进行搅拌和通气。不过，所述扩增可以包括一个以上阶段。例如，软骨细胞和/或其祖细胞首先可以在合适的培养皿中生长成单层，其中，可以通过诸如纤连蛋白(Fn)和玻连蛋白(Vn)的血清粘附蛋白介导细胞扩散，然后在生物反应器中生长。如上文所述，扩增或部分扩增能够或不能够在存在可生物再吸收的珠或颗粒的条件下进行。另外，当在所述扩增或部分扩增期间存在珠或颗粒时，可以？出所述细胞和/或祖细胞，并且“重新接种”到可生物再吸收的珠或颗粒上。在这种情况下，首次提到的珠或颗粒不必是可生物再吸收的珠或颗粒。当所述扩增包括在所述生物反应器中培养时，常见的是将可生物再吸收的珠或颗粒添加到所述培养基中。不过，当所述扩增是在没有珠或颗粒的条件下进行时，正如通过以上说明可以看出的，随后必须将扩增的细胞和/或祖细胞结合到可生物再吸收的珠或颗粒上。
适合扩增用于所述第二和第三方面的方法中的细胞(例如软骨细胞)和/或祖细胞的简单的生物反应器是旋转烧瓶(spinner flask)。另外，所述细胞和/或祖细胞的扩增可以使用翻转型(tumbler-type)生物反应器进行(例如：SyntheconTM Inc.STLVTM Rotary CellCulture System)，该反应器可以装配或不装配内部浆叶，以便促进所述细胞、培养基和可生物再吸收的珠或颗粒(如果存在的话)的运动。
在使用软骨细胞时，在旋转烧瓶或翻转型生物反应器中培养，可以确保维持细胞表型。不过，当所述扩增包括在基本上静止的培养基中培养时，就可能必须采取避免软骨细胞去分化的步骤。在这两种情况下，所述培养基可能包括添加剂，如抗坏血酸或生长因子，它们能控制细胞生长和特征。
用于本发明方法中的可生物再吸收的珠或颗粒优选具有一定的大小，以便可以方便地进行注射。因此，所述可生物再吸收的珠或颗粒的直径或尺寸优选为大约20-2500微米，更优选具有大约50-200微米的平均粒度。合适的可生物再吸收的珠可以具有规则的形状(例如，球体，如微球体、卵形、片状或杆状形状)，或规则形状的混合物。另一方面，合适的可生物再吸收的颗粒通常包括多种不规则形状的颗粒，这些形状通常是通过压碎或粉碎固体物质产生的。
所述可生物再吸收的珠或颗粒可以由任何可以药用的聚合物组成，包括基于生物学的聚合物，如明胶和胶原(特别是I型和/或II型)，以及合成聚合物，如业已用于细胞支架的合成聚合物(即PGA，PLA和PLGA)，和基于生物学的聚合物和合成聚合物的混合物。另外，所述可生物再吸收的珠或颗粒可以由其他可以药用的非聚合物物质组成，包括骨颗粒(例如，压碎的骨和脱矿化的骨的颗粒)。另外，所述可生物再吸收的珠或颗粒可以由所述聚合物和非聚合物质的混合物组成。
所述可生物再吸收的珠或颗粒的大小和密度，优选使得所述珠或颗粒能够在旋转烧瓶或翻转型生物反应器中充分运动。这有助于细胞扩增，并且，在使用软骨细胞时，能保持软骨细胞表型。
所述可生物再吸收的珠或颗粒可以在合适材料中功能化或包被，以便增强细胞粘附(例如，与细胞表面抗原结合的抗体或其片段，或ECM蛋白，如I，II，VI，IX，XI型胶原等)和/或，当使用软骨细胞时，还可以用一种试剂包被，以便有助于保持表型(例如，II型胶原)。另外，所述珠或颗粒可以包括其他有益试剂，如生长因子(例如，TGFβ，EGF，FGF，IGF-1和OP-1等)，糖胺聚糖(GAGs)(例如，聚集蛋白聚糖，核心蛋白聚糖，双糖链蛋白聚糖，纤调蛋白聚糖)和亲水性化合物(例如聚赖氨酸，脱乙酰壳多糖，透明质素)。
将优选具有与它联合的合适的细胞和/或祖细胞的珠或颗粒包含在凝胶和/或成凝胶物质中给受试者使用。不过，作为补充或替代方案，具有与它联合的合适的细胞和/或祖细胞的珠或颗粒可以与合适的可以药用的载体(例如，生理盐水、无菌组织培养基等)组合使用。
合适的凝胶和/或成凝胶物质优选是可生物再吸收性的，并且是能确保所述珠或颗粒基本上保留在施用部位上的类型的。因此，所述凝胶和/或成凝胶物质包括粘性材料(例如，血纤蛋白和/或胶原，或转谷胺酰胺酶系统)，以便将所述凝胶或形成的凝胶粘附在所述施用部位周围。作为替代或补充方案，可以通过将含有所述珠或颗粒的凝胶和/或成凝胶物质捕集在组织内(例如真皮和/或脂肪组织)，或捕集在组织(例如骨膜瓣)或其他膜瓣(例如胶原膜)下面，将所述珠或颗粒基本上保留在施用部位。
合适的凝胶和成凝胶物质可以包括基于生物学的聚合物(即天然聚合物或处理过的天然聚合物)，如胶原溶液或纤维状悬浮液，透明质素或脱乙酰壳多糖(水解壳多糖)，或合成聚合物，如聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。所述凝胶和/或成凝胶物质还可以包括其他有益试剂，如生长因子(包括上文提到过的生长因子)、糖胺聚糖(GAGs)和亲水性化合物(例如上文所提到过的化合物)。
在所述第二和第三方面的方法中，与所述珠或颗粒结合的细胞和/或祖细胞在即将使用时可以是铺满的或亚铺满的。优选将平均大约3-500个细胞和/或祖细胞与每一个可生物再吸收的珠或颗粒结合。不过，所述数字可以根据所述珠或颗粒的特征(例如组成和大小)改变。为了施用，优选在每一立方厘米珠或颗粒上结合1×105-1×109个细胞和/或祖细胞。
可以在使用软骨细胞时，在所述软骨细胞业已开始分泌细胞外基质之前或之后，给所述受试者施用与所述珠或颗粒结合的软骨细胞。不过，后一种方案不太理想，因为所述细胞基质可能会导致聚集体的形成，这些聚集体不利于注射。
在本发明第三方面的方法中，首先扩增所述细胞和/或祖细胞，然后(即随后)与可生物再吸收的珠或颗粒结合。这一目的可以在合适的培养皿(例如培替氏培养皿)或组织培养烧瓶中实现。同样，可以在合适材料中对所述可生物再吸收的珠或颗粒进行功能化或包被，以便增强细胞粘附，和/或用有助于维持软骨细胞表型的试剂包被。所述珠或颗粒还可以包括其他有益试剂，如生长因子，糖胺聚糖(GAGs)和亲水性化合物。
在本发明第三方面的方法中，可以在步骤(iii)之后马上给所述患者使用具有结合的细胞和/或祖细胞的珠或颗粒，或者在进一步培养所述珠或颗粒上的细胞和/或祖细胞之后施用。
与所述珠或颗粒联合的细胞和/或祖细胞和凝胶和/或成凝胶物质的使用，优选是通过注射或关节内窥镜输送进行的。
本发明的方法主要是用于人类的，特别是与治疗关节软骨组织变性或损伤相关(例如膝关节、指关节、髋关节或其他关节)。不过，预计，该方法还可适用于兽医用途(例如，用于治疗赛马的关节软骨变性或损伤，以及用于治疗宠物的关节软骨变性或损伤)。
本发明还涉及可以手术植入受试者中以便治疗病变或受损组织的组织样器件的生产。
因此，在第四方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的具有组织样特征的器件，其中，所述器件包括正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。
所述器件可以通过将所述细胞和/或祖细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合培养一段足以形成组织样物质的时间而制备。所述细胞和/或祖细胞可以结合或不结合可生物再吸收的珠或颗粒。所述可生物再吸收的珠可以在植入所述器件之前完全降解，不过，所述珠或颗粒在移植时优选在所述器件内基本上是完整的。
在第五方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，所述方法包括将根据所述第四方面的器件植入所述受试者的存在所述病变或受损组织的部位。
本领域技术人员可以理解的是，可能与相同或不同类型珠联合的不同类型细胞的组合，可用于实现病变或受损组织的修复。
本领域技术人员还可以理解的是，本发明可用于组织增大(例如，治疗疤痕或面部皱纹)。
我们所使用的术语“结合”表示细胞和/或祖细胞可以粘附在可生物再吸收的珠或颗粒上的任何机制，以便结合在特定可生物再吸收的珠或颗粒上的基本上所有所述细胞和/或祖细胞保持与所述珠或颗粒的结合。所述机制包括通过抗体将软骨细胞和/或祖细胞与所述珠结合(它可能是与所述珠的共价结合)，或通过ECM蛋白(例如I，II，VI，IX，XI型胶原等)或其片段结合，这种结合也可以是与所述珠的共价结合。
我们所使用的术语“凝胶”表示能够推迟上述可生物再吸收的珠或颗粒沉降的任何粘性或半固体溶液或悬浮液(形成对比的是，可生物再吸收的珠或颗粒很容易从生理盐水中沉淀出来)。所述溶液或悬浮液优选在37℃下和大气压力下，在少于30秒的时间内不能流过#2Zahn杯(Gardco，Inc.)(放入#2 Zahn杯中的44ml溶液)。所述溶液或悬浮液更优选不能在37℃下，在大气压力下，在2分钟之后流过#4Zahn杯(Gardco，Inc.)，就是说，在在37℃下，在大气压力下在2分钟之后流过的溶液不到原始体积的5％(放入#4 Zahn杯中的44ml溶液)。
在本说明书中所使用的术语“包括”(comprise、comprises和comprising)意在用于表示包括所说的步骤、成分或特征或一组步骤、成分或特征，包括或不包括其他步骤、成分或特征或一组步骤、成分或特征。
在本说明书中所包括的有关文献、操作、材料、器件、或制品等的任何讨论都仅仅是为了提供本发明的文本。不应当认为以上事物中的任一种或全部构成现有技术基础的部分或在本申请的每一个权利要求的优先权日期之前，存在于澳大利亚或其他地方的与本发明相关领域的公知一般知识。
下面将通过以下非限定实施例和附图对本发明作进一步说明。
附图的简要说明
图1提供了软骨细胞在明胶珠(A)和PLGA珠(B)上生长的显微镜图象(实施例8和10)。
图2表示用RT-PCR评估细胞表型的结果，其中，PCR产物是通过在2％琼脂糖凝胶上电泳分析的(实施例20)。
图3表示在I型胶原凝胶中使用和不使用珠(凝胶)培养软骨细胞2周之后珠对凝胶收缩的影响(实施例28)。
图4表示使用具有I型胶原凝胶的在脱矿化骨颗粒上培养的软骨细胞形成新的组织的例子(实施例31)。
实施例1：软骨细胞分离
将新鲜软骨组织收集在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清中。在称重之后，将所述组织放入装有3-4ml DMEM的无菌培替氏培养皿中，并且用锋利的无菌手术刀解剖成1mm3的碎片。然后在37℃下，用溶解在PBS中的10％w/v胰蛋白酶消化1小时。每克组织使用大约2ml 10％w/v胰蛋白酶。通过离心(1000rpm，5分钟)，收集残余组织片，并且用PBS洗涤，然后用水洗涤(每克组织使用大约5-10ml)。然后每克组织使用2ml细菌胶原酶和透明质酸酶的混合物在37℃下进行第二个消化步骤过夜。所述消化混合物是通过以下方法制备的：将2毫克透明质酸酶(1520单位)和200μl胶原酶母液(取自3000单位/ml母液，在-70℃下保存在50mMtris，10mM CaCl2，pH 7.0的缓冲液中)添加到2ml DMEM中，并且过滤消毒。让消化过的组织通过75μm的尼龙细胞粗滤器，洗涤所述细胞，并且通过离心收集。通过对小的已知等份样品进行台盼兰计数，评估细胞数量和存活力。
实施例2：成纤维细胞分离
在除毛、并且用70％乙醇洗涤之后，将新鲜皮肤收集到DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清中。将所述组织放入装有3-4ml DMEM的无菌培替氏培养皿中，并且用锋利的无菌手术刀解剖成1mm3的碎片。让所述组织片放在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清中培养。使成纤维细胞迁移到组织培养塑料上。在所述组织培养塑料上可以见到细胞之后，除去所述组织，并且对所述细胞进行传代培养。用小的已知等份样品，通过台盼兰计数评估细胞数量和存活力。
实施例3：成骨细胞分离
将新鲜皮质骨收集到DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清中。将所述骨放入装有3-4ml DMEM的无菌培替氏培养皿中。在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清中培养所述骨碎片，以便成骨细胞迁移到组织培养塑料上。在所述组织培养塑料上可以见到细胞之后，取出所述骨，并且对所述细胞进行传代培养。用小的已知等份样品，通过台盼兰计数评估细胞数量和存活力。
实施例4：干细胞分离
从骨髓吸出液中收集成人间充质干细胞(MSC)。用无菌PBS洗涤所述骨髓2次，然后重新悬浮在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清中。然后将骨髓细胞层积在Perco11层上(1.073g/ml密度)，并且在以250g的速度离心30分钟之后收集细胞，并且转移到组织培养烧瓶中。用包括地塞米松、生长因子和细胞因子在内的各种添加剂筛选并且繁殖特定细胞系。
实施例5：单层细胞培养物
在组织培养塑料上，在DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清中，在37℃下，在5％二氧化碳气氛中培养按上述实施例1-4所披露的方法分离的细胞，如成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞和其他类型细胞。每隔2天添加培养基或更换培养基。让细胞生长至铺满，然后进行胰蛋白酶处理，并且作为单层重新铺平板到烧瓶中，或者转移到珠/颗粒上。
实施例6：在不可再吸收珠上培养细胞
用50μl加热到37℃的培养基(DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清)预洗涤诸如Cytodex珠(PharmaciaBiotech)的珠或颗粒，以便提供250-500cm2的表面积，然后放入125ml的旋转瓶内。将1×105个细胞，即新分离的细胞、以前传代的细胞或以前分离并且冷冻的细胞添加到所述珠或颗粒上。然后在37℃的孵育箱中(具有5％CO2)，以25rpm的速度搅拌所述旋转瓶，每30分钟间歇2分钟，共搅拌3小时，然后每30分钟间歇2分钟，再搅拌3小时。然后首先以45rpm的速度连续搅拌15分钟，再以50rpm的速度搅拌15分钟，以55rpm的速度搅拌15分钟，然后使用60rpm的最终速度。然后让细胞在该速度下生长直到获得90％的铺满度。根据原始接种物，通常需要5-8天时间。为了收集所述珠或颗粒上的细胞，以便释放和进一步接种或用于制备输送到患者体内或进一步处理，用37℃的热的PBS洗涤所述细胞和珠，并且通过离心收集。
实施例7：制备明胶珠
通过使用乳液方法合成明胶微颗粒。简单地讲，将明胶溶解在50mM乙酸中，达到20％(w/v)的浓度。将200ml橄榄油加热到37℃。以300rpm的速度搅拌加热的橄榄油。然后通过20号针头将40ml保持在37℃的明胶溶液加样到橄榄油上。将该溶液制备成含有10％w/w的天然胶原。搅拌该乳液90分钟。通过在4℃下搅拌30分钟使该乳液冷冻，以便使明胶颗粒硬化。将500ml溶解在PBS中的0.2％TritonX-100添加到所述乳液中，并且在室温下搅拌10分钟。然后将该混合物放入分离漏斗中，并且沉降1小时。收集底下部分的液体，并且在明胶微颗粒沉淀之后，小心掉去上部液体，并且用水漂洗所述颗粒2次。将500ml溶解在PBS中的0.1％的戊二醛添加到所述明胶微颗粒中，并且搅拌1小时，以便交联。然后用水漂洗交联过的明胶珠若干次，并且浸泡在乙醇中。倒掉乙醇，并且在真空条件下干燥所述明胶微颗粒。在接种细胞之前，用PBS对所述明胶珠进行再水合过夜，然后用软骨细胞培养基再水合。明胶微颗粒的平均粒度为大约110μm。
实施例8：在明胶珠上培养细胞
用50ml加热到37℃的培养基(DMEM/10％ FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清)预先洗涤具有250-500cm2表面积的明胶珠，然后放入125ml的旋转瓶内。将1×105细胞，即新分离的细胞、以前传代的细胞或以前分离并且冷冻的细胞添加到所述珠或颗粒上。然后在37℃的孵育箱(含有5％ CO2)中以25rpm的速度搅拌所述旋转瓶，每30分钟间歇2分钟，共搅拌3小时。然后以45rpm的速度搅拌，每30分钟间歇2分钟，再搅拌3小时，然后首先以45rpm的速度连续搅拌15分钟，然后以50rpm的速度搅拌15分钟，以55rpm的速度搅拌15分钟，然后以60rpm的最终速度搅拌，然后在该速度下让所述细胞生长到90％的铺满度，根据原始接种物，通常需要5-8天时间。为了收集所述珠或颗粒上的细胞，以便释放和进一步接种或用于制备输送到患者体内或进一步处理，用37℃的热的PBS洗涤所述细胞和珠，并且通过离心收集。图1A表示在将软骨细胞添加到所述明胶珠上7天之后在明胶珠上的细胞生长。
实施例9：PLGA珠和颗粒的制备
将聚(丙交酯-共-乙交酯)85∶15w/w(PLGA)溶解在四氢呋喃中，然后通过搅拌，乳化成含有1％聚乙烯醇的水溶液。通过使其沉淀收集PLGA珠，并且通过倾析用水洗涤5次。然后在真空条件下将所述珠干燥过夜。通常获得30-300微米范围内的珠，平均粒度为105微米。通过筛分将珠分离成80-120微米的较小的粒度范围。或者，通过使用溶解在500ml水中的1gPLGA悬浮液，在匀浆机中粉碎较大的颗粒，获得理想粒度范围内的PLGA颗粒。筛分提供了在理想粒度范围内的不规则形状的颗粒，例如50-250微米。通过在室温下，用1小时时间吸收溶解在明胶缓冲的盐溶液中的含有50μg/ml胶原的溶液中的I型或II型胶原，对PLGA珠和颗粒进行表面修饰。然后在磷酸缓冲的盐溶液中洗涤，除去结合松散的胶原。
实施例10：在PLGA珠上培养细胞
用50ml加热到37℃的培养基(DMEM/10％FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清)预先洗涤具有250-500cm2表面积的PLGA珠，然后放入125ml的旋转瓶内。将1×105细胞，即新分离的细胞、以前传代的细胞或以前分离并且冷冻的细胞添加到所述珠或颗粒上。然后在37℃的孵育箱(含有5％ CO2)中，以25rpm的速度搅拌所述瓶，每30分钟间歇2分钟，共搅拌3小时，然后以45rpm的速度搅拌，每30分钟间歇2分钟，再搅拌3小时，然后首先以45rpm的速度连续搅拌15分钟，然后以50rpm的速度搅拌15分钟，以55rpm的速度搅拌15分钟，然后以60rpm的最终速度搅拌。然后让所述细胞在该速度下生长到90％的铺满度，根据原始接种物通常需要5-8天时间。为了收集所述珠或颗粒上的细胞，以便释放和进一步接种或用于制备输送到患者体内或进一步处理，用37℃的热的PBS洗涤所述细胞和珠，并且通过离心收集。图1B表示在将软骨细胞添加到PLGA珠上14天之后在PLGA珠上的软骨细胞培养物。业已用山羊抗II型胶原抗体对软骨细胞进行了染色，以便显示II型胶原合成。
实施例11：骨颗粒的制备
对没有粘附组织、并且用磷酸缓冲的盐水(PBS)漂洗过的新鲜骨进行干燥，然后压碎并且研磨，以便提供颗粒，通过筛分分离颗粒，以便得到诸如能通过120微米筛子的组分，但是，该组份不能通过80微米的筛子。通过用甲醇、二氯甲烷和丙酮洗涤使所述颗粒脱脂。然后通过两次更换PBS洗涤颗粒，再用水洗涤并且干燥。通过在0.5MEDTA，pH 7.4中搅拌骨颗粒20小时制备脱矿化的骨颗粒。通过柔和离心分离，然后再重复该过程至少2次。
实施例12：在骨颗粒上培养细胞
按实施例10所述方法在骨颗粒上培养细胞，所不同的是用未处理过的和脱矿化的骨颗粒代替PLGA珠。
实施例13：在生物反应器中培养细胞
将实施例6或8或10或12所披露的结合有细胞的珠或颗粒放入生物反应器中，如SyntheconTM旋转式细胞培养系统的High AspectRatio容器，用DMEM/10％ FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清填充所述容器，并且排除气泡。在含有5％ CO2的潮湿孵育箱中继续培养，起始旋转速度为15rpm。然后根据所述珠或颗粒的性质和粒度进一步调整旋转速度，以便所述珠或颗粒既不会沉降，又不会碰撞容器边缘，但是在该培养容器内形成一个流体轨道。每隔1-2天更换或添加培养基。
实施例14：从单层培养物中取出并且转移细胞
将溶解在PBS中的37℃的热的0.3％ w/v胰蛋白酶直接添加到组织培养烧瓶中，每25cm2添加5ml。在放置5分钟之后，通过柔和的移液动作或通过柔和的机械动作使细胞与塑料分离。通过以1000rpm的速度离心5分钟，收集胰蛋白酶溶液中的细胞。然后除去上清液，并且将细胞柔和地重新悬浮在5ml培养基中。通过台盼兰方法对细胞进行计数。
实施例15：从聚合物珠上除去细胞
将6ml热的0.3％ w/v胰蛋白酶直接添加到收集的并且洗涤过的位于珠上的细胞中，并且在37℃下孵育10-15分钟，不进行搅拌。将20ml热的PBS添加到该混合物中，并且柔和地进行移液管吸入和排出，以便使细胞与珠或颗粒分离，所述颗粒的粒度大于70微米。通过70微米的滤膜将细胞和珠或颗粒转移到50ml试管中。通过以1000rpm的速度离心5分钟收集通过所述滤膜的细胞。除去上清液，并且将所述细胞柔和地重新悬浮在5ml培养基中。通过台盼兰方法对细胞进行计数。
实施例16：从明胶珠上除去细胞
将6ml热的0.3％w/v胰蛋白酶直接添加到收集的并且洗涤过的位于珠上的细胞中，并且在37℃下培养20分钟。通过酶消化所述明胶珠，将细胞释放到溶液中，而没有必要使用充分的机械搅拌。通过以1000rpm的速度离心5分钟收集细胞。除去上清液，并且将所述细胞柔和地重新悬浮在5ml培养基中。通过台盼兰方法对细胞进行计数。
实施例17：将细胞转移到再吸收珠上以便植入
将新分离的或以前在单层培养物中或在非再吸收珠或颗粒上或在再吸收珠或颗粒上传代的或以前分离的、培养的并且冷冻的诸如成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞或其他类型的细胞的细胞悬浮在加热到37℃的热培养基(DMEM/10％ FBS或含有100μg/ml青霉素和链霉素的自体血清)中，并且添加预先洗涤过的珠或颗粒上，如实施例7或9或11所述，并且通过逐渐加强的搅拌结合，如实施例6或8或10或12所述。
实施例18：通过alcian蓝染色评估细胞
在珠或颗粒上培养细胞(实施例6，8，10，12)的好处是能控制表型。对于关节软骨来说，所述表型是通过使用能够区分软骨细胞和去分化的纤维软骨细胞的多种组织化学和免疫组织化学标记监测的。Alcian蓝，即用于关节软骨的糖胺聚糖的常见染料是以溶解在3％乙酸中的pH2.5的2％过滤溶液形式制备的。在中性的缓冲甲醛中固定2-3分钟之后，在3％乙酸中孵育载玻片3分钟。在37℃下添加alcian蓝溶液至少20小时，用水漂洗载玻片，并且添加2分钟的中性红染料。在Histoclear中封固之前用乙醇漂洗。
实施例19：通过免疫组织化学染色评估细胞
通过特异性免疫学标记监测培养细胞的表型。对于关节软骨细胞来说，使用抗II型胶原的抗体监测正确表型，并且，用抗I型胶原抗体监测变化或去分化程度。如果用例如抗胶原抗体使细胞的基质生产染色的话，每天必须向培养物中添加最终浓度为50μg/ml的新的抗坏血酸，至少添加6天时间。在用热的PBS洗涤之后，用溶解在PBS中的50％(v/v)甲醇预先固定珠上的细胞1次，10分钟，用溶解在PBS中的冷的70％(v/v)甲醇固定2次，每次10分钟。最后用溶解在H2O中的70％(v/v)乙醇固定。可以将福尔马林或戊二醛用作替代固定试剂，以便与诸如Alcian蓝的蛋白聚糖染料一起使用。用PBS稀释第一抗体(例如，以1∶5的比例用PBS稀释山羊抗II型胶原)，并且在室温下添加1小时，然后在用PBS洗涤之后，在室温下添加用PBS稀释的FITC-偶联的抗体(例如，以1∶200的比例用PBS稀释的兔抗山羊FITC)1小时。用PBS稀释2次，然后将所述珠重新悬浮在封固培养基(例如90％甘油，10％ PBS，0.025％ DABCO)中。用Optiscan共聚焦显微镜收集荧光图象。
实施例20：通过原位杂交和RT-PCR评估细胞
用实施例19所述方法固定用于原位杂交表征的细胞。在原位杂交中，对于编码诸如I型胶原或II型胶原的mRNA来说，优选使用UTP-33P检测，按照Bisucci T，Hewitson TD，Darby IA，(2000)的方法：“cRNA探针，同位素和非同位素检测方法的比较”，Methods inMolecular Biology，123：291-303。使用由人胶原前α1(I)基因的372bp区组成的I型胶原核糖探针或由牛胶原α1(II)基因的200bp区组成的II型胶原核糖探针。
为了进行RT-PCR，将细胞(猪软骨细胞)以单层培养，并且按实施例5和实施例14的方法回收。通过涡旋搅拌在1ml RezolTM C & T(USA)中充分裂解细胞。将细胞裂解物转移到微型离心管中，并且在室温下孵育5分钟。然后让细胞裂解物与0.2ml氯仿剧烈混合，并且在室温下孵育2分钟。在4℃下以12,000xg的速度离心15分钟，然后将上部含水层转移到一个新的微型离心管中，并且添加等体积的异丙醇，并且柔和地混合。在室温下孵育该样品10分钟，并且在4℃下以12,000xg的速度离心10分钟。小心除去上清液，通过涡旋混合，用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，然后在4℃下以12,000xg的速度离心5分钟。然后小心除去乙醇，并且通过空气干燥RNA沉淀。将所述RNA沉淀溶解在20μl DEPC-处理过的水中。然后按照生产商的推荐方法(Life Technologies)，使用寡聚-dT引物和SUPERSCRIPTTMII将所述mRNA逆转录成cDNA。
将来自所述RT反应的2μl的等份样品用于扩增转录物，使用对分析基因特异的引物。PCR反应是这样进行的：在95℃下变性3分钟，然后在95℃下变性1分钟，在50℃下退火1分钟，并且在72℃下延伸1分钟，共进行35轮。用于分析基因的引物被设计成以下形式：
β-肌动蛋白： 5′-AACGGCTCCGGCATGTGC-3′(SEQ ID NO：1)和
              5′-GGGCAGGGGTGTTGAAGG-3′(SEQ ID NO：2)
I型胶原：     5′-GCTGGCCAACTATGCCTC-3′(SEQ ID NO：3)和
              5′-GAAACAGACTGGGCCAATG-3′(SEQ ID NO：4)
II型胶原：    5′-TGCCTACCTGGACGAAGC-3′(SEQ ID NO：5)和
              5′-CCCAGTTCAGGCTCTTAG-3′(SEQ ID NO：6)
SOX9：        5′-CCCAACGCCATCTTCAAG-3′(SEQ ID NO：7)和
              5′-CTTGGACATCCACACGTG-3′(SEQ ID NO：8)
聚集蛋白聚糖：5′-CTGTTACCGCCACTTCCC-3′(SEQ ID NO：9)
              和5′-GGTGCGGTACCAGTGCAC-3′(SEQ ID NO：10)
以上序列如图2所示。
实施例21：合成凝胶的制备
可生物再吸收的合适的凝胶是用一种前体生产的，该前体由PEO组成，PEO在其末端与诸如乙醇酸或乳酸的α-羟酸的寡聚物聚合，并且在所有的寡聚(α-羟酸)末端用可聚合的丙烯酸基团封端，使得所述前体能够通过短时间暴露于长波长紫外光聚合形成凝胶。
施例22：细胞和珠和合成凝胶混合物的制备
将实施例8所述从明胶珠基质中取出的细胞或从其他基质中取出的细胞与新的按实施例7方法制备的明胶珠或实施例9或实施例11所述的其他可生物再吸收的珠或颗粒混合，混合是在含有自体血清或胎牛血清的DMEM中完成的，并且与诸如实施例21的凝胶前体的合成凝胶前体混合，以便形成均匀混合物，所述凝胶是通过短时间接触紫外线形成的。
实施例23：生物学(胶原)凝胶制备
将4克I型胶原、II型胶原、或所述胶原的混合物溶解在1升50mM乙酸溶液中。在4℃下以9500rpm的速度将所述胶原溶液离心45分钟。收集上清液。将所述胶原溶液放入透析袋中，并且用25升1M乙酸透析2天，然后用25升水透析4天，多次更换水。通过将密封的透析袋悬挂在层流罩中1天时间浓缩所述胶原溶液。所述胶原溶液的最终浓度为大约20mg/ml(2％w/v)。
实施例24：细胞、珠和生物学凝胶混合物的制备
在除去实施例8所述的明胶珠基质或除去其他基质之后，将细胞与按实施例7所述方法制备的新的明胶珠或其他可生物再吸收的珠或颗粒混合，混合是在含有自体血清或胎牛血清的DMEM中进行的，并且与生物学凝胶或前体混合，如按实施例23方法制备的2％胶原溶液，以便形成细胞和珠或颗粒均匀混合的均匀混合物，凝胶的形成是通过在37℃下培养该混合物实现的。
实施例25：珠上的细胞和合成凝胶混合物的制备
通过让所述培养混合物沉淀，然后除去多余的培养基，收集与实施例8所述明胶珠基质附着或与其他可生物再吸收珠或颗粒附着的细胞。然后将所述珠上的细胞与合成凝胶前体混合，如实施例21所述前体，以便形成均匀混合物，通过短时间暴露于紫外线形成凝胶。
实施例26：珠上的细胞和生物学凝胶混合物的制备
通过让所述培养混合物沉淀，然后除去多余的培养基，收集与实施例8所述明胶珠基质附着或与其他可生物再吸收的珠或颗粒附着的细胞。然后将所述珠上的细胞与生物学凝胶或前体混合，如按实施例23所述方法制备的2％胶原溶液，以便形成均匀混合物。将9份胶原溶液与1份10 X DMEM和0.1份1N NaOH混合。将4份该混合物与1份软骨细胞-明胶珠复合物混合。凝胶形成是通过在37℃的孵育箱中孵育1小时完成的，或者对于植入的混合物来说，可以通过体温实现。
实施例27：细胞/珠/生物学凝胶混合物的体外培养
例如，将按实施例24方法制备的含有细胞和珠的生物学凝胶转移到24孔平板上，并且向每一种样品中添加1.5ml的软骨细胞培养基。每隔1天更换软骨细胞培养基，并且每天补充100μg/ml的抗坏血酸。为了进行体外评估，在3天、7天、14天、21天和28天之后，收集样品。
实施例28：珠上的细胞/生物学凝胶混合物的体外培养
将按实施例26方法制备的含有结合在珠上的细胞的生物学凝胶转移到细胞培养平板上，并且按实施例27所述方法在存在抗坏血酸的条件下培养。与所述珠联合的软骨细胞在所述凝胶中从第三天开始增殖，并且分泌新的II型胶原和糖胺聚糖的基质，与软骨细胞表型一致。如图3所示，所述珠的存在显著降低了凝胶收缩的速度和程度。
实施例29：细胞/珠/合成凝胶混合物的体外培养
将按实施例22所述方法制备的含有细胞和珠的合成凝胶转移到细胞培养平板上，并且按实施例27所述方法在存在抗坏血酸的条件下培养。
实施例30：珠上的细胞/合成凝胶混合物的体外培养
将按实施例25所述方法制备的含珠上的细胞的合成凝胶转移到细胞培养平板上，并且按实施例27所述方法在存在抗坏血酸的条件下培养。
实施例31：将细胞/珠/生物学凝胶混合物植入动物体内
将实施例24或26所述存在于I型胶原凝胶中的细胞和珠或珠上的细胞皮下注射到裸小鼠体内。在1个月和2个月之后处死动物，以便对所形成的新组织进行组织学和免疫组织学评估。来自裸小鼠的外植体表明，使用包括凝胶、具有I型胶原的修饰的凝胶和脱矿化的骨在内的多种珠可以生产关节软骨。使用I型胶原作为输送凝胶，在1个月内观察到了良好的组织形成，并且持续到2个月。实施例18、19和20所述的组织化学和免疫组织化学评估证实，具有正确的基质和软骨表型。图4表示使用具有I型胶原凝胶的脱矿化骨颗粒上的培养的软骨细胞的新组织形成的例子。
实施例32：将体外培养的材料植入动物体内
通过手术将细胞和珠或存在于生物学凝胶混合物中的珠上的细胞，例如成纤维细胞、软骨细胞或成骨细胞和如实施例27或28所述的存在于I型胶原凝胶中的明胶珠，皮下植入裸小鼠体内。在1个月和2个月之后处死动物，以便对所形成的新组织进行组织学评估。
实施例33：将珠上的细胞/合成的凝胶混合物植入动物体内
将存在于合成凝胶混合物中的细胞和珠或诸如实施例22或25所述的聚乙二醇-乳酸-乙醇酸/α-羟酸类型的珠上的细胞，皮下注射到裸小鼠体内。在1个月和2个月之后处死动物，以便对所形成的新组织进行组织学评估。
实施例34：用含有细胞的混合物修复软骨缺陷
使用细胞(软骨细胞)和珠或颗粒和凝胶的制剂。将该混合物，例如实施例26所述的存在于2％I型胶原混合物中的与明胶珠基质附着的软骨细胞装入带有针头的注射器中，所述针头具有足够大的直径，以便所述珠或颗粒能方便地通过，如22号针头。然后将该材料注射到在绵羊膝盖中形成的软骨缺陷内。还可以通过在植入的含有软骨细胞的材料上面附着一片自体骨膜将植入的材料保持在适当的位置。在伤口愈合之后，暂时保持膝关节不活动，以便所述胶原形成半固体凝胶。
实施例35：用含有细胞的混合物修复软骨缺陷
用实施例34所述方法，使用细胞(软骨细胞)和珠或颗粒和凝胶的制剂修复膝关节缺陷，所不同的是，使用实施例21所述的合成凝胶，凝胶的形成是通过在将所述材料放入软骨缺陷中之后短时间暴露于紫外光而完成的。还可以通过在植入的含有软骨细胞的材料上面附着一片自体骨膜将植入的材料保持在适当的位置。
实施例36：用体外培养的植入物修复软骨缺陷
使用细胞(软骨细胞)和珠或颗粒和凝胶的制剂。将该混合物，如实施例27所述的存在于2％I型胶原混合物中的与明胶珠基质结合的软骨细胞，在补充了抗坏血酸的细胞培养物中保持10天时间，以便形成含有软骨细胞和明胶珠的组织样材料。然后通过手术将所述组织样材料植入在绵羊膝关节中形成的软骨缺陷内。还可以通过在植入的含有软骨细胞的材料上面连接一片自体骨膜将植入的材料固定在原位。
实施例37：用含有细胞的混合物修复骨缺陷
按实施例34所述方法制备一种材料，但是将作为细胞成分的成骨细胞和压碎的骨颗粒注射到绵羊股骨的圆形缺陷。2个月之后通过组织学检查证实骨修复。
实施例38：用含有细胞的混合物修复骨缺陷
按实施例37所述方法制备含有成骨细胞、压碎的骨颗粒和I型胶原的材料，不过，其中添加了BMP2或其他生长因子。将该材料注射到绵羊股骨的圆形缺陷，并且在2个月之后通过组织学检查证实骨修复。
实施例39：用含有细胞的混合物修复组织缺陷
按实施例34所述方法制备一种材料，但是将作为细胞成分的成纤维细胞和明胶珠皮下注射到绵羊体内。在2个月之后通过组织学检查证实组织修复。
实施例40：用含有细胞的混合物修复组织缺陷
按实施例34所述方法制备一种材料，但是将作为细胞成分的脂肪细胞和明胶珠皮下注射到绵羊体内。在2个月之后通过组织学检查证实组织修复。
实施例41：用含有细胞的混合物修复组织缺陷
制备一种材料，它具有作为细胞成分的两种类型的细胞，成纤维细胞和脂肪细胞，按实施例39和40所述方法分别在明胶珠上培养，将所述材料混合在胶原凝胶中，并且皮下注射到绵羊体内。在2个月之后通过组织学检查证实组织修复。
参考文献：
Buckwalter，J.A.，Mankin，H.J.关节软骨：变性和骨关节炎，修复，再生和移植。AAOSInst.Course Lect.1998；47：487-504.
Cao Y.，Rodriguez A.，Vacanti M.，Ibarra C.，Arevalo C.，Vacanti C.在自体猪软骨的工程中使用聚乙醇酸、藻酸钙和pluronics。J Biomater Sci Polym Edn，1998；9：475-487.
Hubbell J.A.，用于组织工程和药物输送的合成生物可降解聚合物。Current Opinion in Solid State & Materials Science，1998；3：246-251.
Kulseng B，Skjak-Braek G，Ryan L，Andersson A，King A，Faxvaag A，Espevik T.藻酸微胶囊的移植。Transplantation，1999；67：978-984.
Freed，L.E.，Martin，I.，Vunjak-Novakovic，G.组织工程前沿：软骨形成的体外调控。Clinical Orthopaedics and RelatedResearch，1999；3675：S46-S58.
Rodriguez，A.M.，Vacanti，C.A.软骨的组织工程。In：Patrick Jr C.W.，Mikos，A.G.，McIntire L.V.editors.Frontiers in tissure engineering.
New York：Elsevier Science，1998；400-411.Sims，C.D.，Butler P.E.M.，Cao，Y.L.，Casanova，R.，Randolph，M.A.，Black，A.，Vacanti，C.A.，Yaremchuk，M.J.用血浆衍生的聚合物基质和软骨细胞通过组织工程产生的新软骨。Plast Reconstr.Surg 1998；101：1580-1585.
Temenoff，J.S.，Mikos，A.G.综述：再生关节软骨的组织工程。Biomaterials，2000；21：431-440.
Thomson，R.C.，Wake，M.C.，Yaszemski，M.J.，Mikos，A.G.用于再生器官的生物可降解的聚合物支架。Adv.Polym.Sci，1995；122：245-274.
本领域技术人员可以理解的是，在不超出广义披露的本发明构思和范围的前提下，可以对本发明的所述具体实施方案进行多种改变和/改进。因此，本发明的实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而不是限定性的。
                            序列表
<110>联邦科学及工业研究组织
<120>用于组织修复的方法和器件
<130>500219
<150>AU PR2896
<151>2001-02-05
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>1
aacggctccg gcatgtgc
18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>2
gggcaggggt gttgaagg
18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>3
gctggccaac tatgcctc
18
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>4
gaaacagact gggccaattg
20
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>5
tgcctacctg gacgaagc
18
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>6
cccagttcag gctcttag
18
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>7
cccaacgcca tcttcaag
18
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>8
cttggacatc cacacgtg
18
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>9
ctgttaccgc cacttccc
18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<400>10
ggtgcggtac cagtgcac
18

Claims (135)

1.一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，该方法包括给所述受试者的存在所述病变或受损组织的部位施用正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。
2.如权利要求1的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞通过结合而与所述珠或颗粒联合。
3.如权利要求1或2的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒是由可以药用的聚合物组成的。
4.如权利要求3的方法，其中，所述聚合物是选自明胶和胶原的基于生物学的聚合物。
5.如权利要求3的方法，其中，所述聚合物是选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
6.如权利要求3的方法，其中，所述聚合物是基于生物学的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自明胶和胶原，而所述合成聚合物选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
7.如权利要求1或2的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒由可以药用的非聚合物质组成。
8.如权利要求7的方法，其中，所述非聚合物质选自压碎的骨和脱矿化的骨。
9.如权利要求3-8中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒业已用合适的细胞粘附增强材料功能化或包被。
10.如权利要求3-9中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
11.如权利要求1-10中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的直径或尺寸为大约20-2500微米。
12.如权利要求11的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的平均粒度大约为50-200微米。
13.如权利要求1-12中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质是可生物再吸收的。
14.如权利要求13的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖的基于生物学的聚合物及其混合物。
15.如权利要求13的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
16.如权利要求13的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括基于生物学聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖及其混合物，而所述合成聚合物选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
17.如权利要求13-16中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
18.如权利要求13-17中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括粘性材料。
19.如权利要求1-18中任意一项的方法，其中，每个所述珠或颗粒与大约3-500个细胞和/或祖细胞联合。
20.如权利要求1-19中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是软骨细胞、胚胎干细胞和/或骨髓基质细胞。
21.如权利要求1-19中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成纤维细胞和/或其祖细胞。
22.如权利要求1-19中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是脂肪细胞和/或其祖细胞。
23.如权利要求1-19中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成骨细胞和/或其祖细胞。
24.如权利要求1-19中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是细胞类型和/或祖细胞类型的混合物。
25.如权利要求1-19中任意一项的方法，其中，与所述可生物再吸收的珠或颗粒和凝胶和/或成凝胶物质联合的所述细胞和/或其合适的祖细胞，是通过在所述存在病变或受损组织的部位将凝胶和/或成凝胶物质捕集在组织内或组织下施用的。
26.如权利要求1-19中任意一项的方法，其中，与所述可生物再吸收的珠或颗粒和凝胶和/或成凝胶物质联合的所述细胞和/或其合适的祖细胞是通过在所述存在病变或受损组织的部位将凝胶和/或成凝胶物质捕集在组织瓣或其他膜瓣下面使用的。
27.如权利要求25或26的方法，其中，所述细胞和/或合适的祖细胞是软骨细胞，而所述要治疗的病变或受损组织是关节软骨。
28.一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)获得正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞和/或其合适的祖细胞，
(ii)在存在可生物再吸收的珠或颗粒的条件下扩增所述细胞和/或祖细胞，以便所述扩增的细胞和/或祖细胞结合于所述珠或颗粒，和
(iii)在存在所述病变或受损组织的部位给所述受试者施用在它上面结合了所述细胞和/或祖细胞的珠或颗粒，任选处于凝胶和/或成凝胶物质中。
29.如权利要求28的方法，其中，步骤(ii)是在装有合适培养基的生物反应器中进行的，并且所述培养基是被搅拌的并且通气的。
30.如权利要求29的方法，其中，所述生物反应器是装有内部脉管的翻转型生物反应器，以便帮助所述细胞和/或祖细胞、培养基和可生物再吸收的珠或颗粒的运动。
31.如权利要求29的方法，其中，所述生物反应器是旋转烧瓶。
32.一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)获得正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞和/或其合适的祖细胞，
(ii)扩增所述细胞和/或祖细胞，
(iii)将所述扩增的细胞和/或祖细胞与生物再生珠或颗粒结合，和
(iv)在存在所述病变或受损组织的部位给所述受试者施用在它上面结合了所述细胞和/或祖细胞的珠或颗粒，任选处于凝胶和/或成凝胶物质中。
33.如权利要求28-32中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒由可以药用的聚合物组成。
34.如权利要求33的方法，其中，所述聚合物是选自明胶和胶原的基于生物学的聚合物。
35.如权利要求33的方法，其中，所述聚合物是选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的聚合物。
36.如权利要求33的方法，其中，所述聚合物是基于生物学的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自明胶和胶原，而所述合成聚合物选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
37.如权利要求28或32的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒由可以药用的非聚合物质组成。
38.如权利要求37的方法，其中，所述非聚合物质选自压碎的骨和脱矿化的骨。
39.如权利要求28-38中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒业已用合适的细胞粘附增强材料功能化或包被。
40.如权利要求28-39中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
41.如权利要求28-40中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的直径或尺寸为大约20-2500微米。
42.如权利要求41的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的平均粒度大约为50-200微米。
43.如权利要求28-42中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质是可生物再吸收的。
44.如权利要求43的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖的基于生物学的聚合物及其混合物。
45.如权利要求43的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
46.如权利要求43的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括基于生物学聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖及其混合物，而所述合成聚合物选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
47.如权利要求43-46中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
48.如权利要求43-47中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括粘性材料。
49.如权利要求28-48中任意一项的方法，其中，每个所述珠或颗粒与大约3-500个细胞和/或祖细胞结合。
50.如权利要求48-49中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是软骨细胞、胚胎干细胞和/或骨髓基质细胞。
51.如权利要求28-49中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成纤维细胞和/或其祖细胞。
52.如权利要求28-49中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是脂肪细胞和/或其祖细胞。
53.如权利要求28-49中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成骨细胞和/或其祖细胞。
54.如权利要求28-49中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是细胞类型和/或祖细胞类型的混合物。
55.如权利要求28-54中任意一项的方法，其中，步骤(ii)将所述细胞和/或祖细胞扩增了5-2000倍。
56.如权利要求55的方法，其中，步骤(ii)将所述细胞和/或祖细胞扩增了10-100倍。
57.如权利要求28-49中任意一项的方法，其中，与所述可生物再吸收的珠或颗粒和凝胶和/或成凝胶物质联合的所述细胞和/或其合适的祖细胞，是通过在所述存在病变或受损组织的部位将凝胶和/或成凝胶物质捕集在组织内或组织下施用的。
58.如权利要求28-49中任意一项的方法，其中，与所述可生物再吸收的珠或颗粒和凝胶和/或成凝胶物质联合的所述细胞和/或其合适的祖细胞是通过在所述存在病变或受损组织的部位将凝胶和/或成凝胶物质捕集在组织瓣或其他膜瓣下面使用的。
59.如权利要求57或58的方法，其中，所述细胞和/或合适的祖细胞是软骨细胞，而所述要治疗的病变或受损组织是关节软骨。
60.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述受试者是人类受试者。
61.一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的具有组织样特征的器件，其中，所述器件包括正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。
62.一种用于增大受试者中组织的具有组织样特征的器件，其中，所述器件包括正常情况下存在于要增大的组织中的类型的细胞和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。
63.如权利要求61或62的器件，其中，所述细胞和/或祖细胞通过结合而与所述珠或颗粒联合。
64.如权利要求61-63中任意一项的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒是由可以药用的聚合物组成的。
65.如权利要求64的器件，其中，所述聚合物是选自明胶和胶原的基于生物学的聚合物。
66.如权利要求64的器件，其中，所述聚合物是选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
67.如权利要求64的器件，其中，所述聚合物是基于生物学的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自明胶和胶原，而所述合成聚合物选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的聚合物。
68.如权利要求61-63中任意一项的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒由可以药用的非聚合物质组成。
69.如权利要求68的器件，其中，所述非聚合物质选自压碎的骨和脱矿化的骨。
70.如权利要求64-69中任意一项的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒业已用合适的细胞粘附增强材料功能化或包被。
71.如权利要求61-70中任意一项的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
72.如权利要求61-70中任意一项的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的直径或尺寸为大约20-2500微米。
73.如权利要求72的器件，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的平均粒度大约为50-200微米。
74.如权利要求61-73中任意一项的器件，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质是可生物再吸收的。
75.如权利要求74的器件，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖的基于生物学的聚合物及其混合物。
76.如权利要求75的器件，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
77.如权利要求74的器件，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括基于生物学聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖及其混合物，而所述合成聚合物选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
78.如权利要求61-77中任意一项的器件，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
79.如权利要求61-78中任意一项的器件，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括粘性材料。
80.如权利要求61-79中任意一项的器件，其中，每个所述珠或颗粒与大约3-500个细胞和/或祖细胞结合。
81.如权利要求61-80中任意一项的器件，其中，所述细胞和/或祖细胞是软骨细胞、胚胎干细胞和/或骨髓基质细胞。
82.如权利要求61-80中任意一项的器件，其中，所述细胞和/或祖细胞是成纤维细胞和/或其祖细胞。
83.如权利要求61-80中任意一项的器件，其中，所述细胞和/或祖细胞是脂肪细胞和/或其祖细胞。
84.如权利要求61-80中任意一项的器件，其中，所述细胞和/或祖细胞是成骨细胞和/或其祖细胞。
85.如权利要求61-80中任意一项的器件，其中，所述细胞和/或祖细胞是细胞类型和/或祖细胞类型的混合物。
86.一种用于治疗受试者中的病变或受损组织的方法，该方法包括将一种具有组织样特征的器件植入所述受试者中存在所述病变或受损组织的部位，其中，所述器件包括正常情况下存在于相当于所述病变或受损组织的健康组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。
87.一种用于增大受试者中组织的方法，该方法包括将一种具有组织样特征的器件植入所述受试者的要增大组织的部位，其中，所述器件包括正常情况下存在于要增大组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。
88.如权利要求86或87的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞通过结合而与所述珠或颗粒联合。
89.如权利要求86-88中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒是由可以药用的聚合物组成的。
90.如权利要求89的方法，其中，所述聚合物是选自明胶和胶原的基于生物学的聚合物。
91.如权利要求89的方法，其中，所述聚合物是选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
92.如权利要求89的方法，其中，所述聚合物是基于生物学的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自明胶和胶原，而所述合成聚合物选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
93.如权利要求86-88中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒由可以药用的非聚合物质组成。
94.如权利要求93的方法，其中，所述非聚合物质选自压碎的骨和脱矿化的骨。
95.如权利要求89-94中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒业已用合适的细胞粘附增强材料功能化或包被。
96.如权利要求86-95中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
97.如权利要求86-95中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的直径或尺寸为大约20-2500微米。
98.如权利要求97的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的平均粒度大约为50-200微米。
99.如权利要求86-88中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质是可生物再吸收的。
100.如权利要求99的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖的基于生物学的聚合物及其混合物。
101.如权利要求100的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
102.如权利要求99的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括基于生物学聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖及其混合物，而所述合成聚合物选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
103.如权利要求86-102中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
104.如权利要求86-103中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括粘性材料。
105.如权利要求86-104中任意一项的方法，其中，每个所述珠或颗粒与大约3-500个细胞和/或祖细胞联合。
106.如权利要求86-105中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是软骨细胞、胚胎干细胞和/或骨髓基质细胞。
107.如权利要求86-105中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成纤维细胞和/或其祖细胞。
108.如权利要求86-105中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是脂肪细胞和/或其祖细胞。
109.如权利要求86-105中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成骨细胞和/或其祖细胞。
110.如权利要求86-105中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是细胞类型和/或祖细胞类型的混合物。
111.如权利要求86-110中任意一项的方法，其中，所述受试者是人类受试者。
112.一种用于增大受试者中的组织的方法，该方法包括给所述受试者的要增大组织的部位施用正常情况下存在于要增大组织中的类型的细胞，和/或其合适的祖细胞，所述细胞与可生物再吸收的珠或颗粒联合，并且任选与凝胶和/或成凝胶物质联合。
113.如权利要求112的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞通过结合与所述珠或颗粒联合。
114.如权利要求112或113的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒包括可以药用的聚合物。
115.如权利要求114的方法，其中，所述聚合物是选自明胶和胶原的基于生物学的聚合物。
116.如权利要求114的方法，其中，所述聚合物是选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的合成聚合物。
117.如权利要求114的方法，其中，所述聚合物是基于生物学的聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自明胶和胶原，而所述合成聚合物选自聚乙交酯、聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
118.如权利要求112或113中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒由可以药用的非聚合物质组成。
119.如权利要求118的方法，其中，所述非聚合物质选自压碎的骨和脱矿化的骨。
120.如权利要求114-119中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒业已用合适的细胞粘附增强材料功能化或包被。
121.如权利要求114-120中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
122.如权利要求112-121中任意一项的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的直径或尺寸为大约20-2500微米。
123.如权利要求122的方法，其中，所述可生物再吸收的珠或颗粒的平均粒度大约为50-200微米。
124.如权利要求112-123中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质是可生物再吸收的。
125.如权利要求124的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖的基于生物学的聚合物及其混合物。
126.如权利要求124的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物的合成聚合物。
127.如权利要求124的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括基于生物学聚合物和合成聚合物的混合物，其中，所述基于生物学的聚合物选自胶原、血纤蛋白、透明质素、脱乙酰壳多糖及其混合物，而所述合成聚合物选自聚环氧乙烷和α-羟酸的可以光聚合的末端封端的嵌段共聚物。
128.如权利要求124-127中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质进一步由选自生长因子、糖胺聚糖和亲水性化合物的有益试剂组成。
129.如权利要求124-128中任意一项的方法，其中，所述凝胶和/或成凝胶物质包括粘性材料。
130.如权利要求112-129中任意一项的方法，其中，每个所述珠或颗粒与大约3-500个细胞和/或祖细胞结合。
131.如权利要求112-130中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是软骨细胞、胚胎干细胞和/或骨髓基质细胞。
132.如权利要求112-130中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成纤维细胞和/或其祖细胞。
133.如权利要求112-130中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是脂肪细胞和/或其祖细胞。
134.如权利要求112-130中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是成骨细胞和/或其祖细胞。
135.如权利要求112-130中任意一项的方法，其中，所述细胞和/或祖细胞是细胞类型和/或祖细胞类型的混合物。
CNB028078608A 2001-02-05 2002-02-04 用于组织修复的方法和器件 Expired - Fee Related CN100339477C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPR2896 2001-02-05
AUPR2896A AUPR289601A0 (en) 2001-02-05 2001-02-05 Method of tissue repair

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1520306A true CN1520306A (zh) 2004-08-11
CN100339477C CN100339477C (zh) 2007-09-26

Family

ID=3826922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028078608A Expired - Fee Related CN100339477C (zh) 2001-02-05 2002-02-04 用于组织修复的方法和器件

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20050089578A1 (zh)
EP (1) EP1365784A4 (zh)
JP (1) JP2004531297A (zh)
CN (1) CN100339477C (zh)
AU (1) AUPR289601A0 (zh)
CA (1) CA2437212A1 (zh)
NZ (1) NZ527565A (zh)
TW (1) TWI258372B (zh)
WO (1) WO2002062357A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100341569C (zh) * 2004-09-17 2007-10-10 温州三天制药有限公司 一种治疗前列腺增生症的复方蛋白酶药物及制备方法
CN103301562A (zh) * 2012-03-08 2013-09-18 财团法人工业技术研究院 酶处理方法、用于该方法之酶处理装置及包含该装置之试剂盒
CN109477071A (zh) * 2016-03-01 2019-03-15 牛津大学创新有限公司 细胞化支架的3d打印

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2365376C (en) 2000-12-21 2006-03-28 Ethicon, Inc. Use of reinforced foam implants with enhanced integrity for soft tissue repair and regeneration
AU2002950340A0 (en) 2002-07-23 2002-09-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Biodegradable polyurethane/urea compositions
US20040078090A1 (en) 2002-10-18 2004-04-22 Francois Binette Biocompatible scaffolds with tissue fragments
US8197837B2 (en) 2003-03-07 2012-06-12 Depuy Mitek, Inc. Method of preparation of bioabsorbable porous reinforced tissue implants and implants thereof
US8226715B2 (en) 2003-06-30 2012-07-24 Depuy Mitek, Inc. Scaffold for connective tissue repair
US10583220B2 (en) 2003-08-11 2020-03-10 DePuy Synthes Products, Inc. Method and apparatus for resurfacing an articular surface
US7316822B2 (en) 2003-11-26 2008-01-08 Ethicon, Inc. Conformable tissue repair implant capable of injection delivery
US7901461B2 (en) 2003-12-05 2011-03-08 Ethicon, Inc. Viable tissue repair implants and methods of use
US11395865B2 (en) 2004-02-09 2022-07-26 DePuy Synthes Products, Inc. Scaffolds with viable tissue
US8221780B2 (en) 2004-04-20 2012-07-17 Depuy Mitek, Inc. Nonwoven tissue scaffold
US8137686B2 (en) 2004-04-20 2012-03-20 Depuy Mitek, Inc. Nonwoven tissue scaffold
JP2006006545A (ja) * 2004-06-24 2006-01-12 Olympus Corp 骨軟骨補填材および骨軟骨補填材キット
CA2583308C (en) * 2004-10-08 2020-01-07 Georgia Tech Research Corporation Microencapsulation of cells in hydrogels using electrostatic potentials
AU2005304567B2 (en) 2004-11-12 2011-10-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research Photocrosslinkable poly(caprolactone fumarate)
AU2006226923B2 (en) * 2005-03-23 2011-10-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Photocrosslinkable oligo(poly (ethylene glycol) fumarate) hydrogels for cell and drug delivery
AU2006242487B2 (en) 2005-04-29 2011-12-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hydrophilic/hydrophobic polymer networks based on poly(caprolactone fumarate), poly(ethylene glycol fumarate), and copolymers thereof
AU2006254703B2 (en) * 2005-05-30 2010-12-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Preparation and use of basement membrane particles
JP2008541734A (ja) * 2005-05-30 2008-11-27 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 基底膜粒子の製造及び使用
JP5220724B2 (ja) * 2006-03-14 2013-06-26 ニューレン ファーマシューティカルズ リミテッド グリシル−２−メチルプロリルグルタミン酸塩の経口製剤
EP2021035B1 (en) * 2006-05-19 2020-08-05 Versitech Limited Cell-matrix microspheres, methods for preparation and applications
EP2201910B1 (en) * 2007-06-01 2013-04-03 Allergan, Inc. Biological tissue growth support trough induced tensile stress
US8697044B2 (en) 2007-10-09 2014-04-15 Allergan, Inc. Crossed-linked hyaluronic acid and collagen and uses thereof
PL2224934T3 (pl) * 2007-12-21 2012-12-31 Bone Therapeutics Sa Zastosowanie osteoblastów w leczeniu zapalnych chorób reumatycznych
US8293813B2 (en) * 2008-03-05 2012-10-23 Biomet Manufacturing Corporation Cohesive and compression resistant demineralized bone carrier matrix
EP3545979A1 (en) * 2008-07-02 2019-10-02 Allergan, Inc. Compositionsand methods for tissue filling and regeneration
GB0813659D0 (en) * 2008-07-25 2008-09-03 Smith & Nephew Fracture putty
EP3184552B1 (en) 2008-09-02 2020-08-12 Tautona Group LP Threads of hyaluronic acid, methods of making thereof and uses thereof
WO2010056336A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Howmedica Osteonics Corp. Cells for joint fluid
WO2010067904A1 (ja) * 2008-12-12 2010-06-17 国立大学法人東京大学 細胞の３次元階層的共培養法
US8663689B2 (en) * 2009-02-21 2014-03-04 Sofradim Production Functionalized adhesive medical gel
US20100249924A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Allergan, Inc. Bioerodible matrix for tissue involvement
EP2258413A1 (en) * 2009-06-04 2010-12-08 Université Catholique de Louvain Multi-dimensional biomaterial and method for producing the same.
WO2011051983A1 (en) * 2009-10-28 2011-05-05 Dmd Solofra S.P.A. In vitro bioengineered animal tissue fiber and its use in the textile industry
WO2011063140A2 (en) * 2009-11-18 2011-05-26 Affinergy, Inc. Implantable bone graft materials
CA2725728C (en) 2009-11-24 2014-01-28 University Of Connecticut Differentiation of human embryonic and induced pluripotent stem cells
US20110172180A1 (en) 2010-01-13 2011-07-14 Allergan Industrie. Sas Heat stable hyaluronic acid compositions for dermatological use
KR101744040B1 (ko) 2010-03-01 2017-06-07 후지필름 가부시키가이샤 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포로 이루어지는 세포 구조체
HUE043344T2 (hu) 2010-03-22 2019-08-28 Allergan Inc Térhálósított hidrogélek lágy szövet növelésére
US9005605B2 (en) 2010-08-19 2015-04-14 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8697057B2 (en) 2010-08-19 2014-04-15 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8883139B2 (en) 2010-08-19 2014-11-11 Allergan Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8889123B2 (en) 2010-08-19 2014-11-18 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8697056B2 (en) 2010-08-19 2014-04-15 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8709401B2 (en) 2011-02-25 2014-04-29 Howmedica Osteonics Corp. Primed stem cells and uses thereof to treat inflammatory conditions in joints
US20120263681A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Fujifilm Corporation Composition comprising cell and biocompatible polymer
US9408797B2 (en) 2011-06-03 2016-08-09 Allergan, Inc. Dermal filler compositions for fine line treatment
US20130096081A1 (en) 2011-06-03 2013-04-18 Allergan, Inc. Dermal filler compositions
US9393263B2 (en) 2011-06-03 2016-07-19 Allergan, Inc. Dermal filler compositions including antioxidants
RU2740454C2 (ru) 2011-06-03 2021-01-14 Аллерган Эндюстри, Сас Составы кожного наполнителя, включая антиоксиданты
US9662422B2 (en) 2011-09-06 2017-05-30 Allergan, Inc. Crosslinked hyaluronic acid-collagen gels for improving tissue graft viability and soft tissue augmentation
US20130244943A1 (en) 2011-09-06 2013-09-19 Allergan, Inc. Hyaluronic acid-collagen matrices for dermal filling and volumizing applications
US9569566B2 (en) * 2011-12-12 2017-02-14 Zam Research Llc Simulation and control system and method using contact, pressure waves and factor controls for cell regeneration, tissue closure and related applications
US9867939B2 (en) 2013-03-12 2018-01-16 Allergan, Inc. Adipose tissue combinations, devices, and uses thereof
US20140350516A1 (en) 2013-05-23 2014-11-27 Allergan, Inc. Mechanical syringe accessory
US9248384B2 (en) 2013-10-02 2016-02-02 Allergan, Inc. Fat processing system
US10029048B2 (en) 2014-05-13 2018-07-24 Allergan, Inc. High force injection devices
EP3200838B1 (en) 2014-09-30 2019-09-18 Allergan Industrie, SAS Stable hydrogel compositions including additives
JP2018507771A (ja) 2015-03-10 2018-03-22 アラーガン ファーマシューティカルズ ホールディングス （アイルランド） アンリミテッド カンパニー 多針注入器
RU2725968C2 (ru) 2016-04-08 2020-07-07 Аллерган, Инк. Аспирационно-инъекционное устройство
WO2018154813A1 (ja) * 2017-02-24 2018-08-30 株式会社セルシード 組織再生培養細胞シート、製造方法及びその利用方法
WO2018217630A1 (en) * 2017-05-21 2018-11-29 University Of Tennessee Research Foundation Methods and compositions for targeting tissue lesions
SG11202101902QA (en) * 2018-09-20 2021-04-29 Novadip Biosciences Biomaterial comprising adipose-derived stem cells and gelatin and method for producing the same

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL68218A (en) * 1983-03-23 1985-12-31 Univ Ramot Compositions for cartilage repair comprising embryonal chondrocytes
US5002890A (en) * 1988-11-29 1991-03-26 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Spiral vane bioreactor
US5618531A (en) * 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
US5206023A (en) * 1991-01-31 1993-04-27 Robert F. Shaw Method and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage
US5470582A (en) * 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
GB9210574D0 (en) * 1992-05-18 1992-07-01 Ca Nat Research Council Biotherapeutic cell-coated microspheres for wound/burn and prothesis implant applications
AU9313298A (en) * 1997-09-04 1999-03-22 Point Biomedical Corporation Injectable tissue reconstruction material
US6150505A (en) * 1997-09-19 2000-11-21 Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. Fibrin microbeads prepared from fibrinogen, thrombin and factor XIII
JP2001517494A (ja) * 1997-09-19 2001-10-09 リプロジェネシス・インコーポレーテッド 組織エンジニアリングのための改良されたヒドロゲル
US6179872B1 (en) * 1998-03-17 2001-01-30 Tissue Engineering Biopolymer matt for use in tissue repair and reconstruction
US6886568B2 (en) * 1998-04-08 2005-05-03 The Johns Hopkins University Method for fabricating cell-containing implants
US6378527B1 (en) * 1998-04-08 2002-04-30 Chondros, Inc. Cell-culture and polymer constructs
US6662805B2 (en) * 1999-03-24 2003-12-16 The Johns Hopkins University Method for composite cell-based implants
DE19937102A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-15 Universitaetsklinikum Freiburg Gewebeersatz und Verfahren zu seiner Herstellung
WO2001035932A2 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 The Regents Of The University Of Michigan Sustained drug delivery from structural matrices

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100341569C (zh) * 2004-09-17 2007-10-10 温州三天制药有限公司 一种治疗前列腺增生症的复方蛋白酶药物及制备方法
CN103301562A (zh) * 2012-03-08 2013-09-18 财团法人工业技术研究院 酶处理方法、用于该方法之酶处理装置及包含该装置之试剂盒
US9011917B2 (en) 2012-03-08 2015-04-21 Industrial Technology Research Institute Method for enzymatic treatment, device and kit used the same
CN103301562B (zh) * 2012-03-08 2015-08-26 财团法人工业技术研究院 酶处理方法、用于该方法之酶处理装置及包含该装置之试剂盒
CN109477071A (zh) * 2016-03-01 2019-03-15 牛津大学创新有限公司 细胞化支架的3d打印
US11549097B2 (en) 2016-03-01 2023-01-10 Oxford University Innovation Limited Phase transfer of a cargo laden scaffold

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004531297A (ja) 2004-10-14
AUPR289601A0 (en) 2001-03-01
CN100339477C (zh) 2007-09-26
TWI258372B (en) 2006-07-21
US20050089578A1 (en) 2005-04-28
US20090098177A1 (en) 2009-04-16
EP1365784A1 (en) 2003-12-03
WO2002062357A1 (en) 2002-08-15
CA2437212A1 (en) 2002-08-15
NZ527565A (en) 2005-04-29
EP1365784A4 (en) 2005-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100339477C (zh) 用于组织修复的方法和器件
US6378527B1 (en) Cell-culture and polymer constructs
CN1198628C (zh) 条件细胞培养基组合物及其应用方法
CN1471412A (zh) 用于修复和再生软骨和其它组织的组合物和方法
Hildner et al. Human adipose-derived stem cells contribute to chondrogenesis in coculture with human articular chondrocytes
CN101035890A (zh) 经物理/物理化学刺激处理的无定形细胞递送载体
CN1671426A (zh) 组织再生用支撑体及其制造方法
CN101084026A (zh) 含有生脂间充质干细胞的聚乙二醇－双丙烯酸酯(pegda)交联的水凝胶
CN1735685A (zh) 用未分化的间充质细胞治疗组织
CN1538850A (zh) 用于骨或软骨再生的bmp结合蛋白
CN101263224A (zh) 脂肪组织衍生的基质干细胞在治疗瘘中的用途
CN1652829A (zh) 关节软骨再生材料及其制造方法、关节软骨的再生方法及培养方法以及移植用人造关节软骨
Cao et al. 3D printed PCL/GelMA biphasic scaffold boosts cartilage regeneration using co-culture of mesenchymal stem cells and chondrocytes: In vivo study
CN1615162A (zh) 器官功能的增强
Setayeshmehr et al. Chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stromal cells on the [devitalized costal cartilage matrix/poly (vinyl alcohol)/fibrin] hybrid scaffolds
CN1897989A (zh) 水凝胶用于培养软骨细胞的用途
Chiang et al. Differences between chondrocytes and bone marrow-derived chondrogenic cells
Zhou et al. Meniscus regeneration with multipotent stromal cell therapies
CN1461220A (zh) 血管化组织移植物
CN1546654A (zh) 一种用骨基质凝胶构建组织工程软骨的方法
CN108138142A (zh) 繁殖用在移植中的间质干细胞（msc）的方法
CN101077426A (zh) 自体脂肪干细胞构建的组织工程化软骨
CN1655802A (zh) 生物粘附性定向体细胞治疗
CN1868420A (zh) 一种注射用人体软组织填充剂及其制备方法
CN101029303A (zh) 一种诱导干细胞向软骨分化的物质和方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Free format text: FORMER OWNER: FINANCIAL GROUP LEGAL PERSON INDUSTRIAL TECHNOLOGY INST.

Owner name: FINANCIAL GROUP LEGAL PERSON INDUSTRIAL TECHNOLOGY

Free format text: FORMER OWNER: COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION

Effective date: 20110714

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: VICTORIA, AUSTRALIA TO: TAIWAN, CHINA

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20110714

Address after: Taiwan, China

Patentee after: Industrial Technology Research Institute

Address before: Vitoria, Australia

Co-patentee before: Industrial Technology Research Institute

Patentee before: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070926

Termination date: 20160204