CN109477071A - 细胞化支架的3d打印 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备液滴组件的方法，该液滴组件包括多个液滴，其中每个所述液滴包含：包含水凝胶化合物的水性介质；和设置在所述水性介质中的一个或多个生物细胞，该方法包括：在本体疏水介质中产生多个液滴，其中每个所述液滴包含：包含水凝胶化合物的水性介质；和设置在所述水性介质中的一个或多个生物细胞。本发明还涉及一种包括多个液滴的液滴组件，其中每个所述液滴包含：(i)包含水凝胶化合物的水性介质；(ii)设置在所述水性介质中的一个或多个生物细胞；和(iii)围绕所述水性介质的表面的两亲分子外层，其中所述液滴组件中的至少一个液滴与所述液滴组件中的至少一个其他液滴接触，在接触液滴之间形成作为界面的两亲分子层。

Description

细胞化支架的3D打印
技术领域
本发明涉及用于制备液滴组件的方法。还描述了包含多个液滴的液滴组件，以及可用于本发明方法的组合物。
背景技术
需要开发具有内在特性的组织，该组织可用于再生医学领域或作为药物筛选的经验模型。为了开发组织，各种类型的多个细胞必须在细胞相容性环境中以高密度进行空间排列，这样它们将增殖并再现所需组织的功能。生物打印提供了一种以从低到高的分辨率将异质细胞类型图案化的方式，具有取决于所述方法的从低到高的细胞密度。然而，高分辨率图案化通常以使用低细胞密度材料为代价。
在油包脂(lipid-in-oil)溶液中形成的水性液滴将被自发地涂覆在脂质单层中。当单层涂覆的液滴聚集在一起时，它们将通过脂质双层凝聚(Syeda et al,J.Am.Chem.Soc.130,15543–8(2008))。多个液滴可以通过这些液滴界面双层(DIB)凝聚、连接，形成可以以2D或3D生成的多分区网络(Villar et al,Science 340,48–52(2013)；Maglia et al,Nat.Nanotechnol.4,437–440(2009)；Elani et al,Lab Chip 12,3514–20(2012)；Villar et al,Nat.Nanotechnol.6,803–8(2011)；Elani et al,Chem.Sci.4,3332(2013))。
多重体(multisomes)是悬浮在本体水相中的水性液滴网络(Onoe et al,DrugDiscov.Today 20,236–246(2015))。它们能够通过使用可被弄破(当pH降低或温度改变时)的特定脂质混合物与体相相互作用。通过将金属环上的油包脂溶液悬浮在本体水相中，然后在油中形成液滴而制成这些结构。因此，所形成的所有多重体结构都是球状或椭球状结构。
WO2014/064459描述了包含水凝胶体的水凝胶网络，所述水凝胶体具有两亲分子外层。WO2014/087175描述了一种用于制备液滴组件的装置。
需要开发一种方法，该方法允许以可再现的方式制备3D细胞化支架，并且允许获得具有改善的体素分辨率和高细胞密度的精细结构的载有细胞(cell-laden)的支架。
发明内容
发明人开发了液包液(liquid-in-liquid)3D生物打印方法。令人惊讶的是，这种方法可以将多种细胞类型图案化为高分辨率、空间定义的架构(例如，如图2所示)。该方法相对于先前的方法具有显著的改善，并且允许制造具有高分辨率特征的高细胞密度液滴组件，同时保持细胞生物活性。通过本发明的方法制备的液滴组件用作可培养的细胞化支架，产生组织样材料。本发明的方法利用由具有补充物的培养基中的琼脂糖组成的独特生物油墨(bioink)。本发明的方法的一些优点如下所述。
有多种制备组织的方法，生物打印只是一种。将在下面讨论生物打印相对于其他组织制造技术的一般优点和本发明所要求保护的生物打印方法相对于当前生物打印机的特定优点。
本发明的方法优于类器官和球状体培养方法。诸如在盘中的器官形成(Lancasteret al,Science(80),345,1247125 1–9,2014)和球状体培养(Foty，R，J.Vis.Exp.20,4-7,2011)等方法仅依赖于在水凝胶或培养基中自然地重新分布和共同生长的细胞混合物。细胞的初始混合物由一定比例的分化的细胞类型或单个多能细胞系组成，所述单个多能细胞系将分化为异质系。虽然这些组织显示出天然特性，但它们只能生长到扩散限度内的尺寸，并且一组样品的架构可能不同。因此，研究人员几乎无法控制组织结构。本发明的生物打印方法提供了对环境内细胞接种的空间控制，这意味着将更好地限定组织的形状和架构。打印结构有可能比类器官大得多。
本发明的方法还具有优于载有细胞的微纤维和细胞片技术的优点。细胞片技术(CST)(Haraguchi，Y，RSC Adv.2,2184,2012)涉及在不存在培养水凝胶或支撑支架的情况下堆叠培养的细胞片。由于在构建期间它们保留细胞外膜(ECM)，所以CST结构可以形成具有内在特性的组织。然而，该过程很慢并且需要在堆叠之前对每层进行平行培养。单片内的图案化控制也有限。
载有细胞的微纤维(CLM)(Onoe，H，Drug Discov.Today 20,236-246,2015)是载有细胞的水凝胶纤维，典型地由微流体装置制成。这些纤维可以编织在一起形成3D结构。已经显示这些结构具有功能性组织特性并且已经被植入糖尿病小鼠中以释放胰岛素(Onoe，H，Nat.Mater.12,584-90,2013)。然而，该技术仅限于可编织的3D结构。
本发明的生物打印方法提供了对支架内的细胞放置的更高分辨率的空间控制，并且可以形成通过上述技术难以实现的形状或结构。因此，具有复杂的异质细胞架构的组织可能只能通过生物打印来实现。
特别地，本发明提供一种用于制备液滴组件的方法，所述液滴组件包括多个液滴，其中每个所述液滴包含：
水性介质，其包含水凝胶化合物；和
一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中，
所述方法包括：
在本体疏水介质中形成多个液滴，其中每个所述液滴包含：
水性介质，其包含水凝胶化合物；和
一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中。
本发明还提供一种包括多个液滴的液滴组件，其中每个所述液滴包含：
(i)水性介质，其包含水凝胶化合物；
(ii)一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中；和
(iii)两亲分子外层，其围绕所述水性介质的表面，
其中所述液滴组件中的至少一个液滴与所述液滴组件中的至少一个其他液滴接触，形成作为接触液滴之间的界面的两亲分子层。
本发明还提供一种组合物，包含：
(i)水性介质，该水性介质包含：
(a)水凝胶化合物；
(b)培养基；
(c)一种或多种含有二肽的化合物，和
(ii)一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中。
附图说明
图1显示了展示细胞网络的3D打印的示意图、显微照片和图表。
图2显示了展示使用3D打印方法将两种细胞类型高分辨率图案化的显微照片。
图3显示了含有HEK-293T细胞的打印网络的相转移和培养。
图4显示了展示网络内的打印HEK-293T细胞在7天内的发展的显微照片。
图5显示了生物油墨细胞密度对网络细胞密度的影响。
具体实施方式
本发明提供一种制备液滴组件的方法，该液滴组件包括多个液滴，其中每个所述液滴包含：包含水凝胶化合物的水性介质；和设置在所述水性介质中的一个或多个生物细胞，该方法包括：在本体疏水介质中形成多个液滴，其中每个所述液滴包含：包含水凝胶化合物的水性介质；和设置在所述水性介质中的一个或多个生物细胞。
如本文所用，术语“液滴”典型地是指任何结合体积的材料(其例如可以是液体或凝胶)。液滴的体积通常小于1.0L，例如小于0.1L。例如，体积小于500nL的结合体积水性介质是一个液滴。当首次产生时，液滴可具有大致球形特征(例如图1d所示)。然而，一旦与液滴组件中的其他液滴接触，液滴可采用各种形状。典型地，液滴的球形度(例如，与液滴相同体积的球体的表面积与液滴的实际表面积的比率)大于或等于0.5，例如大于或等于0.6。因此，液滴的最大外部尺寸(例如长度)通常小于或等于液滴的最小外部尺寸(例如宽度)的2.0倍。产生液滴通常包括将一定体积的水性介质设置在本体疏水介质中。术语“介质的液滴”通常等同于术语“介质的体积”。
液滴组件是液滴的集合，其通常以三维阵列排列(例如如图1e所示)。通常在液滴组件中，每个液滴与组件中的至少一个其他液滴接触。“液滴组件”也可以称为“[包含在液滴中的材料]的体积的组件”。通过本发明的方法生产的液滴组件可以具有任何尺寸。例如，液滴组件的最大外部尺寸可以是0.01mm至100.0mm。在一些情况下，液滴组件的最大外部尺寸可小于或等于10.0mm，例如小于或等于5.0mm。
水凝胶化合物是这样的化合物：水凝胶化合物的水溶液能够凝胶化以形成水凝胶。典型地，当水性介质的温度降低至低于某一温度(其是水性介质中水凝胶化合物的凝胶化温度)时，包含水凝胶化合物的水性介质将凝胶化以形成水凝胶。包含水凝胶化合物的水性组合物本身通常不是凝胶，而是自由流动的液体。只有一旦这种包含水凝胶化合物的水性组合物凝胶化后，所述水性组合物才是水凝胶。凝胶可以定义为“非流体胶体网络或聚合物网络，其由流体在其整个体积中扩展”。水凝胶可以定义为“溶胀剂(即流体)是水的凝胶”。
液滴组件也可以称为“支架”，特别是当液滴组件已经凝胶化时。通过该方法制备的液滴组件包括含有水凝胶化合物的水性介质，并且可以是未凝胶化的(即，水性介质保持为包含水凝胶化合物的自由流动液体)或凝胶化的(即，包含水凝胶化合物的水性介质凝胶化以形成水凝胶)。
本体疏水介质是任何体积的疏水介质，其体积大于水性介质液滴的体积。通常，本体疏水介质的体积大于或等于0.5mL或大于或等于1.0mL。例如，本体疏水介质的体积可能大于或等于10.0mL。疏水介质通常是疏水液体，例如基本上不与水混溶的液体。
水凝胶化合物可以是任何合适的水凝胶化合物。水凝胶化合物通常是聚合物。例如，水凝胶化合物可以是多糖、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、包含许多疏水基团的聚合物或其衍生物。水凝胶化合物通常是多糖。水凝胶化合物的例子包括琼脂糖、甲基纤维素和透明质酸。优选地，水凝胶化合物是琼脂糖。水凝胶的凝胶化温度通常小于20℃。例如，水凝胶化合物的胶凝化温度可小于或等于10℃或小于或等于5.0℃。凝胶化温度可以是如对浓度为10mg/mL的水凝胶化合物的水溶液所测定的。
水性介质中的水凝胶化合物的浓度通常为0.01mg/L至500.0mg/L。例如，水性介质中的水凝胶化合物的浓度可以为0.1mg/L至100.0mg/L、或0.5mg/L至30.0mg/L。
水性介质可以是包含水的任何液体介质。通常，水性介质是包含大于或等于80wt％的水或大于或等于90wt％的水的组合物。包含水凝胶化合物的水性介质通常包含溶解在水中的水凝胶化合物。水性介质可包含如本文所述的其他组分。
通常，水性介质还包含一种或多种稳定剂。稳定剂通常溶解在水性介质中。稳定剂是一种试剂(例如化合物)，其增加液滴组件的稳定性和/或改善细胞在液滴组件中的液滴内的分布。
一种或多种稳定剂通常选自含有二肽的化合物。优选地，一种或多种稳定剂选自用FMOC基团保护的二肽。FMOC基团是芴甲氧羰基基团。因此，用FMOC基团保护的二肽是式FMOC-X-X的化合物，其中每个X独立地是氨基酸并且每个破折号是肽键。这可以用下式表示，其中R'和R”是氨基酸中的可变基团。
例如，R'和R”可以独立地选自H、CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)(CH2CH3)和CH2Ph。优选地，R'和R”独立地选自H、CH3、CH(CH3)(CH2CH3)和CH2Ph。更优选地，一种或多种稳定剂是FMOC-异亮氨酸-甘氨酸(FMOC-IG)和/或FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FMOC-FF)。
水性介质中稳定剂的浓度通常为0.01mmol/L至100.0mmol/L。例如，一种或多种稳定剂的浓度可以为0.1mmol/L至10.0mmol/L，或0.5mmol/L至2.0mmol/L.
典型地，水性介质还包含细胞外膜蛋白(ECM)。ECM的例子包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。细胞外膜蛋白优选包含胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白。胶原蛋白可以是I至XIV型胶原蛋白中的任何一种，并且典型的是I型胶原蛋白。
水性介质中ECM的浓度通常为0.001mg/L至100.0mg/L。例如，水性介质中ECM的浓度可以为0.01mg/L至10.0mg/L，或0.1mg/L至1.0mg/L。
水性介质通常还包含培养基。培养基是适于培养生物细胞的任何水性介质，培养基是本领域技术人员公知的。培养基通常是一种或多种氨基酸(例如谷氨酰胺或其来源)、一种或多种盐(例如氯化钠或丙酮酸钠)、葡萄糖、和一种或多种维生素(例如维生素A、B、C或D)的水溶液。培养基可进一步包含一种或多种抗生素。抗生素的例子包括青霉素和链霉素。
在一些实施方案中，水性介质包含：(A)浓度为0.5至30.0mg/mL的水凝胶；(b)浓度为60.0至90.0体积％的培养基；(c)浓度为0.1至10.0mmol/L的含有二肽的化合物。水性介质可以选择性地进一步包含(d)浓度为0.001至1.0mg/mL的细胞外膜蛋白。pH7.0的培养基的渗透压通常为200至400mOsm，例如300-350mOsm。
如本文所用，术语“生物细胞”是公知的，并且是指包含封闭在膜内的细胞质(通常包括细胞器，例如细胞核或核糖体)的细胞。用于本发明方法的生物细胞可以是原核细胞或真核细胞。生物细胞通常是真核细胞。生物细胞可以是天然存在的或经过基因(或以其他方式)改造的。通常，生物细胞是源自哺乳动物组织(例如小鼠、大鼠、绵羊或人组织)的哺乳动物细胞。例如，生物细胞可以源自灵长类动物组织，例如人或黑猩猩组织。
在一些实施方案中，一个或多个生物细胞选自两种或多种不同类型的生物细胞。图2显示了含有两种或更多种不同类型的生物细胞的液滴组件的例子。
生物细胞的类型是指取自特定物种的生物细胞的细胞类型。例如，哺乳动物生物细胞类型的典型例子包括人胚肾(HEK)细胞、成骨细胞、软骨细胞和间充质干细胞。
通常，如果存在两种或更多种细胞类型，则一个或多个液滴中的每一个均包含设置在水性介质中的两个或更多个生物细胞，并且所述两个或更多个生物细胞选自两种或更多种不同类型的生物细胞。因此，单个液滴可包含两种或更多种类型的细胞。或者，不同的液滴可以包含不同的细胞类型，让含有不同细胞类型的结构特征结合到液滴组件中。因此，在一些情况下，液滴组件可包括第一多个液滴和第二多个液滴，其中所述第一多个液滴中的每个液滴包括设置在水性介质中的一个或多个第一类型的生物细胞，所述第二多个液滴中的每个液滴包括设置在水性介质中的一个或多个第二类型的生物细胞。
所述一个或多个生物细胞通常是哺乳动物细胞。
通常，以每毫升水性介质中有105至109个细胞的浓度将一个或多个生物细胞设置在水性介质中。例如，设置在水性介质中的生物细胞的浓度可以是每毫升105至108个细胞或每毫升106至109个细胞。优选地，水性介质中生物细胞的浓度大于或等于每毫升107个细胞。图5中显示出了包含不同浓度的生物细胞的液滴网络。
本体疏水介质可以是任何疏水介质。例如，本体疏水介质可包含有机化合物。典型地，本体疏水介质包含碳氢化合物。通常，本体疏水介质包含碳氢化合物和/或硅油。
碳氢化合物是仅包含碳和氢原子的化合物。碳氢化合物的例子包括C4至C20烷烃(例如具有6至18个碳原子的直链烷烃)和C5至C10环烷烃(例如环戊烷或环己烷)。优选地，所述碳氢化合物是C8至C16烷烃，例如辛烷、壬烷、癸烷、十一烷或十二烷。优选地，碳氢化合物是十一烷。
硅油是含有聚合物的油，所述聚合物包含一个或多个硅氧烷基团。例如，硅油典型地是具有有机侧链的聚硅氧烷。例如，硅油可包括聚二甲基硅氧烷、聚乙基甲基硅氧烷或聚二乙基硅氧烷。
本体疏水介质可以例如包含碳氢化合物和硅油的混合物，其中(碳氢化合物)：(硅油)的体积比为50:50至80:20。优选地，该体积比为60:40至70:30。本体疏水介质可以是十一烷和硅油的混合物，其体积比为60:40至70:30。
本体疏水介质通常还包含一种或多种两亲化合物。两亲性化合物是既包含亲水基团也包含亲脂基团(例如疏水基团)的化合物。两亲分子通常能够形成双层和微胶粒。两亲分子是本领域技术人员公知的。
一种或多种两亲化合物可选自脂质。脂质的例子包括甘油三酯、脂肪酸和磷脂。典型地，一种或多种两亲化合物选自磷脂。磷脂是包含被磷酸基团和一个或多个脂肪酸基团取代的甘油分子的化合物。所述一种或多种两亲化合物优选选自磷酸胆碱脂质。
可用于本发明方法的两亲分子的例子包括：二植烷酰磷脂酰胆碱(diphytanoylphosphatidylcholine)、二植烷酰磷脂酰乙醇胺(diphytanoylphosphatidylethanolamine)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸、蛋-PC、氢化蛋PC、氢化大豆PC、1-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，。
本体疏水介质中的一种或多种两亲化合物的总浓度可以为0.01mM至100mM。典型地，该浓度为0.1mM至10mM，例如0.5mM至5.0mM。例如，本体疏水介质可以包含浓度为0.5mM至5.0mM的二植烷酰磷脂酰胆碱或二植烷酰磷脂酰乙醇胺。
产生多个液滴通常包括：(I)多个分配步骤，每个所述分配步骤包括将一定体积的设置有所述一个或多个生物细胞的所述水性介质注入本体疏水介质中。
设置有一个或多个生物细胞的水性介质的体积为0.001至1000nL。例如，水性介质的体积可以为0.1nL至500nL或1.0nL至300nL。通常，所注入的水性介质的体积为50nL至250nL。
产生多个液滴通常包括10个或更多个分配步骤，例如100个或更多个分配步骤。在某些情况下，可能存在大量的分配步骤，例如10,000或更多的分配步骤。
通常，产生多个液滴包括使用用于产生液滴的装置，该装置包括(a)至少一个液滴发生器；(b)能够相对于所述至少一个液滴发生器移动的容器；以及(c)控制单元，该控制单元用于控制从至少一个液滴发生器分配液滴和控制所述容器相对于所述至少一个液滴发生器的移动。液滴发生器的出口的一个例子部分地显示在图1a和图1d中。
所述(或每个)液滴发生器可以例如包括：腔室，该腔室用于容纳其中设置有一个或多个生物细胞的水性介质；出口；和部件，该部件用于通过所述出口排出一定体积的设置有一个或多个生物细胞的水性介质，从而将所述体积分配为液滴。
在WO2014/087175中描述了用于产生适用于本发明方法的液滴的液滴发生器和装置的例子，其全部内容通过引用并入本文。用于通过所述出口排出一定体积的设置有一个或多个生物细胞的水性介质的部件通常是压电换能器。所述可相对于至少一个液滴发生器移动的容器通常包含所述本体疏水介质。
典型地，所述装置包括：至少一个液滴发生器；可相对于所述至少一个液滴发生器移动的容器；以及控制单元，该控制单元用于控制从至少一个液滴发生器分配液滴和控制容器相对于至少一个液滴发生器的移动；其中，所述装置用于产生包含多个液滴的液滴组件，其中每个所述液滴包括(i)液滴介质和(ii)围绕液滴介质的表面的两亲分子外层，其中所述液滴介质为水性介质，且其中至少一个所述液滴与另一个所述液滴接触从而形成作为接触液滴之间的界面的两亲分子层。
所述装置可用于生产所述液滴组件，其中每个所述液滴与另一个所述液滴接触以形成作为接触液滴之间的界面的两亲分子层。控制单元通常用于协调(a)容器相对于所述或每个液滴发生器的移动，和(b)液滴的分配，以产生所述液滴组件。所述控制单元包括计算机或专用电子硬件。所述装置通常还包括用于移动所述容器的微操作器，并且其中所述控制单元用于使用微操作器控制容器的移动。所述装置可以还包括一微操作器，该微操作器用于移动所述或每个液滴发生器，以及，当所述装置包括多于一个的所述液滴发生器时，该微操作器用于协调该多个液滴发生器的相对位移。每个液滴发生器通常包括：用于容纳液滴介质(其是水性介质)的腔室；出口；以及，用于通过所述出口排出一定体积的所述液滴介质从而将所述体积分配为液滴的部件。出口的直径通常小于200μm。在一些情况下，所述或每个液滴发生器用于分配直径等于或小于1mm的液滴，例如直径为10μm至200μm。所述或每个液滴发生器通常用于分配体积为0.001nL至100nL的液滴。控制单元通常用于将液滴分配速度控制为0.01至10s-1。在一些情况下，所述装置可包括多个所述液滴发生器，例如第一液滴发生器包括第一水性介质，并且其中第二液滴发生器包括第二水性介质，其中第一和第二水性介质是不同的(通常因为它们包含不同类型的生物细胞)。
通常，至少一个液滴还包含围绕水性介质表面的两亲分子外层。图1a中显示了包含两亲分子外层的液滴的示意性例子。在图1b中可以看到这种两亲分子外层。通常，至少一个所述液滴还包含围绕所述水性介质表面的两亲分子外层，并与另一个所述液滴接触，所述另一个所述液滴还包含围绕所述水性介质表面的两亲分子外层，其中在第一和第二液滴之间形成作为界面的两亲分子层。
液滴组件通常包括以三维结构排列的多个液滴，其中三维结构的每个液滴包括围绕所述水性介质表面的两亲分子外层，并且其中三维结构的每个液滴与至少一个三维结构的其他液滴接触，形成作为接触液滴之间的界面的两亲分子层。
三维结构可包括不同的液滴层，其中每个液滴层包括设置在其中的一种类型的生物细胞，并且各不同层中的生物细胞的类型不同。
在第一和第二液滴之间作为界面形成的两亲分子层通常是在第一和第二液滴之间作为界面形成的两亲分子双层。在一些情况下，围绕一个或多个液滴中的水性介质表面的两亲分子外层可以还包含一个或多个跨膜蛋白。
只有像水和气体(如氧气)这样的小分子才能穿透所述双层，这意味着液滴内容物保持孤立。然而，如果存在蛋白质孔(诸如α溶血素)，则可以穿过所述孔的小分子能够流动穿过这些界面。因此，在包含穿过液滴通路的蛋白质孔的液滴网络中已经看到了紧急快速的通信特性。当网络包含盐浓度不同的区域时，该网络也显示出协调性，因为液滴将通过渗透作用保持渗透平衡，导致局部液滴体积变化，这可能使整个网络的形状变形，即：网络可以折叠成新的形状。
在一些情况下，本体疏水介质还包含跨膜蛋白。
通常，在产生多个液滴的步骤之前，该方法还包括制备设置有一个或多个生物细胞的水性介质的步骤，该制备步骤包括提供水性介质和将多个生物细胞悬浮在水性介质中。
该方法可进一步包括凝胶化步骤，该凝胶化步骤包括使包含水凝胶化合物的水性介质形成凝胶。通常，凝胶化步骤包括将液滴组件冷却至温度小于或等于10.0℃，并使包含水凝胶化合物的水性介质形成凝胶。可以使用替代性的胶凝化方法(例如暴露于UV光)。
该方法可以进一步包括培养多个生物细胞以生产细胞化液滴组件。培养多个细胞通常包括使生物细胞的密度增加。可以在培养之前将液滴组件转移到培养基中。生物细胞的培养可以在图4中看到，其中在图4a-c中，明场共焦显微照片显示所述网络(液滴组件)随着生物细胞增殖而在7天内变暗和变得不透明。
通常，该方法还包括将液滴组件与本体疏水介质隔离。这可以通过从本体疏水介质物理移除液滴组件，或者替代性地，通过移除本体疏水介质(例如通过使其排出)来实现。
本发明还提供一种包括多个液滴的液滴组件，其中每个所述液滴包含：(i)包含水凝胶化合物的水性介质；(ii)设置在水性介质中的一个或多个生物细胞；和(iii)围绕水性介质表面的两亲分子外层，其中液滴组件中的至少一个液滴与液滴组件中的至少一个其他液滴接触，在接触液滴之间形成作为界面的两亲分子层。
本发明的方法的液滴组件的成分和特征可以如上所述。
水凝胶化合物通常是多糖，优选琼脂糖。水性介质通常还包含一种或多种稳定剂。一种或多种稳定剂优选选自含有二肽的化合物，例如用FMOC基团保护的二肽。一种或多种稳定剂最优选为FMOC-异亮氨酸-甘氨酸和/或FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸。例如，水性介质可包含FMOC-异亮氨酸-甘氨酸和FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸。在一些情况下，水性介质可以还包含细胞外膜蛋白，例如胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白。
在一些实施方式中，液滴组件包括第一多个液滴和第二多个液滴，其中每个所述第一多个液滴包含设置在水性介质中的一个或多个第一类型的生物细胞，每个所述第二液滴包含设置在水性介质中的一个或多个第一类型的生物细胞。
在本发明的液滴组件中，多个液滴中的每一个的体积通常为0.001至100nL，或如上所定义。
本发明的液滴组件可以已经凝胶化，使得它是载有细胞的支架。因此，在一些情况下，包含水凝胶化合物的水性介质是凝胶形式。
本发明还提供了一种组合物，该组合物包含本体疏水介质，和设置在本体疏水介质中的、如本文所定义的液滴组件。
本发明还提供了可通过如本文所定义的方法获得的液滴组件。
本发明还提供一种组合物，该组合物包括：(i)水性介质，该水性介质包含：(a)水凝胶化合物；(b)培养基；(c)一种或多种含有二肽的化合物；和(ii)一个或多个设置在水性介质中的生物细胞。组合物中的成分可如本文所定义。
水性介质可进一步包括：(d)细胞外膜蛋白。ECM可以是例如胶原蛋白或I型胶原蛋白。
水性介质优选包含：(A)浓度为0.5至30.0mg/mL的水凝胶；(b)浓度为60.0至90.0体积％的培养基；(c)总浓度为0.1至10.0mmol/L的一种或多种含有二肽的化合物；以及(d)浓度为0.001至1.0mg/mL的细胞外膜蛋白，并且其中设置在水性介质中的一个或多个生物细胞的浓度为每毫升水性介质中有105至107个细胞。所述一种或多种含有二肽的化合物通常是FMOC-异亮氨酸-甘氨酸和/或FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸。
本发明还提供一种或多种含有二肽的化合物用于稳定液滴组件的用途。该一种或多种含有二肽的化合物可以是FMOC-异亮氨酸-甘氨酸和/或FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸。
实施例
概要
通过将载有细胞的生物油墨3D图案化为高细胞密度和高分辨率液滴网络(如图1所示)，该液滴网络随后凝胶化，从而生成载有细胞的液滴组件(支架)。将得到的支架相转移到本体培养基中(如图3a示意性所示)。所涉及的步骤为：(i)创建支架溶液；(ii)将收获的细胞重新悬浮在支架溶液中作为生物油墨；(iii)将生物油墨3D液滴打印到液滴网络中；(iv)细胞-支架的凝胶化和相转移。然后可以在一周或更长时间内培养细胞支架，形成显示生物活性的密集微组织(如图4所示)。
图1a显示了生物打印方法的示意图。液滴分配喷嘴将含有细胞的生物油墨液滴喷射到富含脂质的油中。通过油容器的程序化运动使液滴在空间上定位。各液滴层通过液滴界面双层的形成而粘合在一起。图1b是显示无细胞的打印网络(11×14×7个液滴)内的液滴界面双层(染成黄色)的共焦荧光显微照片。通过将磺酰罗丹明101(～10μM)加入到打印溶液中使双层显现。(比例尺＝100μm)。图1c中显示了直方图，该直方图显示了在油下打印的液滴中的平均HEK-293T细胞密度为生物油墨中细胞密度的函数。细胞密度计算为每个液滴的平均细胞数量(n＝25)除以平均液滴体积。误差棒表示液滴尺寸方差和每液滴细胞方差(Cell per droplet variance)的复合误差。图1d中显示了打印为1nL液滴(d＝130μm)的连续层的细胞网络的明场显微照片，所述液滴从玻璃喷嘴(d＝～150μm)喷射出来。图1e中显示了在油下打印的HEK-293T细胞网络(11×14×2个液滴)的共焦荧光显微照片。分别用钙黄绿素-AM(CAM)和碘化丙啶(PI)进行活/死细胞染色。可见约700个细胞，存活率为85％(通过人工细胞计数确定)(比例尺＝150μm)。图1f中显示了，在以15×106个细胞/mL打印的HEK-293T细胞网络(7×8×4个液滴)上进行的活/死测定的高放大倍率的共焦荧光显微照片，平均占有率为每个液滴38个细胞(比例尺＝75μm)。
下面简要描述这些步骤，并且进一步的细节可以在实验细节部分找到。
支架溶液：
支架溶液由本体细胞培养基中的水凝胶制成，该培养基在需要时具有额外的细胞特定性补充物。使用的水凝胶是超低凝胶化温度的琼脂糖，因为这样构成的生物油墨可以在室温下打印为溶胶(或预凝胶液体)，然后在冰箱内在4℃下凝胶化。使用的补充物是FMOC-二肽(FMOC-IG和FMOC-FF)，其既充当网络稳定剂(即防止凝聚)也增加网络内的液滴-液滴黏附。在图1b中可以看到液滴-液滴黏附。细胞外基质蛋白(ECM)也用于补充生物油墨，这些细胞外基质蛋白(ECM)是I型胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白，因为它们为细胞提供了黏附位点。经验证明这些ECMs促进了支架内的细胞生长。在大多数实验中，使用的ECM补充物是I型胶原蛋白。
将收获的细胞重新悬浮为生物油墨：
从培养瓶中收获通过标准2D培养方法生长的细胞并离心以得到一(细胞)团(pellet)。然后将该细胞团以15×106个细胞/mL的典型细胞密度重新悬浮于支架溶液中。细胞以该高密度重新悬浮，因为发现细胞在打印结构中彼此形成多个接触，并且比其他观察到的较低细胞密度支架更好地增殖。使用的哺乳动物细胞系包括：HEK-293T、HEK-293/YFP、HEK-293/CFP、绵羊间充质干细胞、绵羊成骨细胞、小鼠软骨细胞和小鼠第三神经球。
液滴网络的3D生物打印：
使用3D液滴打印机将生物油墨打印为载有细胞的液滴网络。通过首先将装载有生物油墨的打印喷嘴降低到油包脂溶液浴中，并找到可再现形成液滴的打印参数来进行打印。然后，通过将空间分配的液滴的连续分层(基于上传的“打印图”)，可将这些条件用于3D液滴网络的自动化打印。使用的优化打印油是含有1.2mM DPhPC的十一烷：硅油的65:35V:V(体积比)混合物。这种油的设计允许理想的打印(优化的液滴下沉速度)，且使用DPhPC，是因为它形成稳定的双层。对于生物油墨打印网络，观察到结构几乎从未显示任何液滴-液滴聚结，并且形成了紧密堆积的结构。如图1e和1f显示了这种紧密堆积的液滴网络。
本发明的方法允许两种细胞类型的高分辨率图案化。图2a-d显示了通过本发明的方法制备的打印的载有细胞液滴组件的共焦荧光显微照片。用Deep Red(DR)或Red CMPTX(RC)CellTrackerTM染料染色的HEK-293细胞分别是虚假彩色的(false-coloured)蓝色和黄色。图2a显示了方形网络内的Y形结构(8×9×4个液滴)，平均特征宽度为180μm(比例尺＝200μ)。图2b显示了在限定的z-高度处的横截面，该横截面显示了在打印网络内可见的RC染色的HEK-293单个细胞群，其包含两个不连续的层：下部RC染色的HEK-293细胞，3个液滴厚；上部DR染色的HEK-293细胞，4个液滴厚(比例尺＝250μm)。图2c显示了方形网络(10×12×5个液滴)(比例尺＝250μm)内的HEK-293细胞的十字形图案。图2d显示了图2c中的图案化HEK-293细胞的高放大倍率图像(比例尺＝100μm)。图2e-h显示了包含CellTrackerTM染色的HEK-293细胞的层状网络的侧视3D图像。下部RC染色的HEK-293细胞层，3个液滴厚；上部RC染色的HEK-293细胞层，3或4个液滴厚。图2e和图2f为第0天的图像，其中图2e是在打印后立即获得，图2f是在转移到培养基后立即获得；图2g是在培养第3天的图像；图2h是在培养第5天的图像。(比例尺＝250μm)。
网络凝胶化和凝胶涂覆(相转移准备)：
通过冷却至4℃并持续20-25分钟使打印网络凝胶化。凝胶化载货网络(Gelledcargo-laden networks)显示图案保真度没有损失。然后用少量琼脂糖水凝胶涂覆该结构。首先将打印油换成硅油，然后使琼脂糖的液滴与打印结构结合。换油是为了除去脂质，允许结合而不是形成液滴界面双层。然后使涂覆后的结构凝胶化(4℃，持续20-25分钟)。
细胞化支架的相转移：
然后通过穿过油-培养基界面使凝胶化和涂覆的液滴组件相转移，在这种情况下，油-培养基界面是位于细胞培养基上方的十六烷和矿物油的3：1V：V混合物的两相柱。将细胞化支架微量移液到上部油相中并通过重力穿过界面。相转移后，除去油，将细胞化支架储存在细胞培养箱中培养一周。图3a显示了凝胶化和相转移过程的示意图。
图3b显示了打印为方形网络(7×8×4个液滴)的活/死染色HEK-293T细胞的3D图像，其在油下打印后立即成像。打印液滴的平均密度为29×106个细胞/mL，存活率为96％。(比例尺＝200μm)。图3c显示了活/死染色打印HEK-293T细胞的3D图像，其在凝胶包覆和转移至培养基后成像(比例尺＝200μm)。图3d显示了示出转移至培养基后第0天的五个打印网络的HEK-293T细胞的存活率(包括平均值的标准误差)的图。使用自动对象计数值确定存活率，所使用的该自动对象计数值相对于平均细胞尺寸或者未经修改、或者经过解析，以表示活细胞数和死细胞数。图3e显示第7天的在培养基中的网络上进行的免疫化学的3D图像：细胞核用DAPI染色；活细胞的细胞质用CAM染色；使用有丝分裂标记物磷酸组蛋白-3ICC、PH-3(比例尺＝200μm)。
图4显示了网络内的打印HEK-293T细胞在7天内的发展。图4a-i显示了在7天细胞培养后的个别打印HEK-293T细胞网络的图像。使用含有15×106个细胞/mL和15μg mL-1I型胶原蛋白的生物油墨打印网络。第0天(左栏)、第3天(中间栏)和第7天(右栏)使构造成像。图4a-c是网络的明场共焦显微照片，其中随着细胞增殖，网络在7天内变暗和变得不透明。图4d-f显示了活/死染色细胞网络的3D图像，其表明在整个培养过程中具有高存活率。图4g-i显示了示出打印细胞网络的放大部分的复合明场和荧光显微照片。细胞从个体增殖到密集的细胞簇。图4i，第7天的细胞簇宽度最高达140微米。比例尺是：图4a-f，250μm；图4g-h，100μm；以及图4i，30μm。
图5显示了生物油墨细胞密度对网络细胞密度的影响。图5a-d显示了以不同的生物油墨细胞密度打印HEK-293T细胞网络的复合明场和荧光共焦显微照片：图5a，1×106个细胞/mL；图5b，5×106个细胞/mL；图5c，10×106个细胞/mL；以及图5d，15×106个细胞/mL。这些网络是用含有活/死染料的生物油墨创建的，并且在打印后立即成像，同时仍然在本体油中。图像显示：图5a-c，整个网络，或图5d，分隔在液滴内的细胞。图5e显示了网络a-d的每个液滴的平均细胞数，其根据人工计数计算，此处平均液滴尺寸为：a，直径120μm；b，直径135μm；c，直径130μm；以及d，直径135μm。图5f显示了图5a-d所示的网络的平均液滴细胞密度，其计算为液滴的平均细胞占有率除以平均液滴体积。误差棒表示细胞计数的标准偏差(e)，或者所述计数和液滴体积的复合误差(f)。比例尺是：图5a-c，250μm；以及图5d，75μm。
实验细节：
支架溶液：
这部分介绍用于制造可相转移的支架的支架溶液(也称为生物油墨)。首先解释生物油墨处理和组合物，然后解释如何制作支架补充物。
溶液制备概述
所有支架溶液1-3(SS1-3)(参见表1)以相同的方式制备：即，首先将支架的本体相制备为液体或预凝胶溶液，然后添加支架补充物，最后以所需密度重新悬浮细胞。
为了使细菌感染最小化，采取不同的步骤对支架溶液进行杀菌。然而，每种生物油墨生成均使用无菌技术并且生物油墨加工能够在层流生物安全柜中进行。在使用前，将得到的载有细胞的生物油墨储存在37℃、5％CO2的培养箱[Midi 40，Thermoscientific]中。生物油墨通常在生产的30分钟内打印，但在使用前可储存最多4小时。
基于琼脂糖的溶液(SS1-SS3)
所有基于琼脂糖的支架溶液由具有或不具有支架补充物的超低凝胶点琼脂糖组成。将这些溶液制备成液体并保持在琼脂糖凝胶化温度(即～50℃)之上，直至添加ECM蛋白质或细胞，此时使溶液为37℃。在添加细胞之前，对溶液进行UV照射，在UV LED[Eclipse-M365L2-C5,Nikon]下方以365nm波长各进行15分钟，该UV LED由设为半功率的LED驱动器[LEDD1B，Thorlabs]控制。所有基于琼脂糖的支架溶液在制备当天使用，并不储存以备将来使用。
SS1和SS2：具有FMOC-XX的琼脂糖
将补充FMOC-二肽的琼脂糖溶液制备为13-15mg/mL琼脂糖与10mM FMOC-XX的8：1V：V混合物。初始琼脂糖溶液(SS6)是未稀释的，而稍后稀释的琼脂糖溶液(SS7)还含有10％V/V PBS。在加入细胞之前对支架溶液6进行UV处理，并且在加入PBS之前对支架溶液7进行UV处理。
支架溶液1的最终组成为：在88.9％基础培养基和11.1％超纯水中，11.6-13.3mg/mL琼脂糖和1.1mM FMOC-XX。
支架溶液2的最终组成为：在80％基础培养基、10％超纯水和10％PBS中，10.4-12.0mg/mL琼脂糖和1.0mM FMOC-XX。
SS3：具有FMOC-XX和ECM补充物的琼脂糖
这些生物油墨涉及对支架溶液7补充不同浓度的ECM蛋白(胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白)。制备过程与支架溶液7相同，除了UV杀菌后的具有FMOC-XX溶液的琼脂糖、PBS中的ECM蛋白最初以所需浓度加入，然后仅加入PBS以得到10％V/V PBS部分。将该阶段的支架溶液在2800超声波清洗器[Branson]中进行超声处理(5分钟，40kHz)。以下述浓度范围补充ECM蛋白：胶原蛋白为3.5-300μg/mL；纤连蛋白和层粘连蛋白为0.5-20μg/mL。15μg/mL胶原蛋白的补充物作为微组织生长的标准。
因此，标准支架溶液3的最终组成为：在80％基础培养基、10％超纯水和10％PBS中，10.4-12.0mg/mL琼脂糖，1.0mM FMOC-XX和15μg/mL胶原蛋白。
支架补充物制备
10mM FMOC-IG和10mM FMOC FF溶液
由在-20℃下保存的粉末等分试样制备10mM的FMOC-异亮氨酸-甘氨酸(FMOC-IG)和FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸(FMOC-FF)溶液，并使其升温至室温。将FMOC-IG(16mg)和FMOC-FF(12mg)分别与1M NaOH(10-20μL)溶解于超纯水(1.5mL)中，并搅拌过夜。在Branson 2800超声波清洁器中对部分溶解的FMOC溶液进行超声处理(20分钟，37℃，40kHz)，用0.1mMNaOH校正pH至8.50(FMOC-IG)或10.50(FMOC-FF)，然后用超纯水稀释至3mL总体积。FMOC-IG和FMOC-FF在一周内使用，如果需要，在使用前进行pH校正。
10mM FMOC-XX溶液
FMOC-XX溶液是FMOC-IG和FMOC-FF的等摩尔比溶液。对于10mM FMOC-XX溶液，将10mM FMOC-FF和10mM FMOC-IG混合为1：1V：V溶液，然后进行超声处理(40kHz)。FMOC-XX在使用当天才制备。
琼脂糖溶液
使用超低凝胶点琼脂糖[A5030]制备13-15mg/mL琼脂糖溶液。通常将琼脂糖粉末和基础培养基在水浴(65℃)中加热。将加热后的琼脂糖粉末(通常～12mg)溶解在加热后的基础培养基中(通常～0.8mL)。为了有助于溶解，将溶液涡旋混合，并且任选地，通过微管吸吮或超声处理(40kHz)机械扰动。琼脂糖溶液一制备好就置于水浴(65℃)中。HEK-293衍生细胞系的基础培养基是oMSC、成骨细胞和软骨细胞的基础培养基是DMEM-ITS，或神经球的基础培养基是NB-A+。
ECM蛋白补充物
通过从储备液浓度稀释成活性凝胶形式(即，工作溶液)来制备ECM蛋白。ECM蛋白的储备溶液是5.0mg/mL I型牛胶原蛋白、1.0mg/mL天然小鼠层粘连蛋白和1.0mg/mL人纤连蛋白，并在4℃(胶原蛋白)或-20℃(层粘连蛋白和纤连蛋白)下以等分试样储存。通过按以下顺序混合冰冷试剂制备I型胶原蛋白凝胶工作溶液(3.0mg/mL)：I型胶原蛋白储备液(50μL)、10倍浓缩PBS(8.3μL)、1N NaOH(1.3μL)和超纯水(23.8μL)。通过在PBS中稀释各自的储备溶液(通常是10μL蛋白质储备液与90μL PBS)制备层粘连蛋白和纤连蛋白工作溶液(0.1mg/mL)。所有ECM蛋白-工作溶液在加入到生物油墨之前才在层流生物安全柜中制备。
表1：基于琼脂糖的生物油墨组成
将收获的细胞重新悬浮为生物油墨：
收获细胞并按如下方式混合到支架溶液中。对于HEK-293T(即非贴壁细胞)，将融合的T25瓶培养物重新悬浮于(5mL)中，将其等分试样(通常1-2mL)在5702离心机[Eppendorf]中离心(3-5分钟，300-500×G)，并将所得的(细胞)团以所需的细胞密度重新悬浮于支架溶液中。对于典型的重新悬浮，将100-200μL支架溶液与细胞混合，以得到15×106个细胞/mL溶液。然而，对于贴壁细胞系(如HEK-293/YFP)，在获得细胞溶液的等分试样之前，首先将培养物胰蛋白酶化，然后在离心后重新悬浮于(31985-062)中。当制备MSC、成骨细胞或软骨细胞生物油墨时，将细胞重新悬浮于DMEM-ITS培养基中而不是中。神经球收获遵循与其传代相同的协议，除了在NB-A+洗涤后不再重新接种，而将细胞离心并重新悬浮于细胞支架溶液中。
为了由细胞悬浮液等分试样以所需的密度使细胞重新悬浮，首先测定等分试样的细胞密度，并使用等式3计算重新悬浮体积。该等式来源于溶液的总细胞数(n细胞)等于细胞密度(ρ细胞，以个细胞/mL计)乘以体积(V细胞，以mL计)的等式1。对于重新悬浮，细胞总数不变，因此，细胞数公式可用于使初始体积溶液等于最终体积溶液作为等式2，该等式2可以重新排列为等式3。
等式1 n细胞＝ρ细胞×V细胞
等式2 ρ初始×V初始＝ρ最终×V最终
等式3
确定细胞等分试样的密度的标准方法是：将细胞试样与台盼蓝溶液(仅染色死细胞，将其染成深蓝色)按100μL:100μL混合以制备计数溶液。将该溶液(2×10μL)加入到一次性血球计芯片中，该芯片由芯片两侧的自动细胞计数器[II FL，Countess]进行读数，得到两组数值。自动细胞计数器提供活细胞密度、死细胞密度和总细胞密度。将两个活细胞密度计数的平均值用作为初始细胞密度的值，并随后用于使用等式3计算重新悬浮/最终体积。
液滴网络的3D生物打印：
液滴打印机概述
在文献[Villar et al,Science 340,48–52(2013)]中可以找到用于产生液滴的装置(例如，液滴网络的3D打印机)的例子的描述。简而言之，液滴发生器(可以称为“压电器(piezo)”)包括压电盘，所述压电盘利用突出的锥形毛细管喷嘴密封水性腔室的背面。当尖端浸没在本体疏水介质，例如油包脂溶液中时，压电器可以在施加方波电压脉冲时从喷嘴喷射液滴(例如，如图1a或1d所示)。使用电子微操作器在三维空间中移动打印台，例如油容器。这与实验室设计的、解释“打印图”并自动进行液滴喷射的打印软件相结合，以允许通过将空间上分配的液滴连续分层来构建3D液滴网络。图2e-h中显示了由该方法生成的层状3D结构。
打印机制备
在打印之前，用超纯水和乙醇彻底清洗压电器的水性腔室、打印油容器和其他打印物品，然后在N2(g)下干燥。在使用当天，用超纯水、乙醇和异丙醇冲洗毛细管，然后在N2(g)下干燥。随后将清洗后的毛细管真空密封在等离子体清洁器[Femto版本A，DienerElectronic]中并用氧等离子体处理(8分钟，5-10SCCM)。清洗仪器后，使压电器充满超纯水并插入毛细管。
在每次重新加载生物油墨之间，通过先浸泡在Virkon中然后浸泡在8M NaOH中来清洗毛细管，并重新补充水性腔室所失去的水。对于基于琼脂糖的生物油墨，还通过在65℃下浸泡于纯水中来清洗毛细管。
打印的载有细胞的液滴网络
将载有细胞的支架与含有细胞的基于琼脂糖的支架溶液(即，生物油墨)打印到含有1.2mM DPhPC的(十一烷)：(硅油)的65：35V:V混合物中。以下为标准打印流程。
将生物油墨涡旋混合并将等分试样(10μL)与十六烷(8μL)一起置于打印机装载孔阵列中。首先将十六烷(～1μL)吸入打印机喷嘴，然后吸入生物油墨(1-6μL)(图1d)。对于基于琼脂糖的生物油墨，装载后，用浸泡在纯水中的拭镜纸擦拭玻璃毛细管尖端的外侧。
一旦将毛细管浸没在打印油中(通常为200μL)，就用不同的电压脉冲连续激发压电器，直到发现可重复喷射单线态液滴的条件，理想情况下液滴具有均匀的尺寸。典型的调谐脉冲参数为50-350μs脉冲宽度，电压为40-63V。
调谐脉冲可用于自动打印载有细胞的液滴网络。通常，在多个网络的打印会话期间，该打印脉冲的电压逐渐增加，以保持一致的液滴生产。通常，在同一打印腔室内连续打印多个网络，最后一个网络在移动之前保持5分钟。对于不同网络类型，生物油墨打印顺序和打印参数的信息，请参见下文。
单个细胞类型的支架
单细胞类型的细胞支架主要打印为2-4层液滴片，其水平地图尺寸(x×y像素)为7×9或7×8。对于待相转移的支架(即，液滴组件)，通常的厚度是4层。
结点支架(Junction Scaffold)(两种细胞类型)
对于所有结点支架，使用单个液滴发生器打印具有或不具有胶原蛋白的载有细胞的生物油墨，首先打印细胞类型1，然后在清洗喷嘴和装载生物油墨后打印细胞类型2。每个结点由较宽的基底液滴片(细胞类型1)组成，在其上方是中心对齐的较窄的液滴片(细胞类型2)。
在所有情况下，按如下打印结点网络：将下部液滴薄片打印为3-4层的完整地图(即，在每个像素下喷射液滴的地图)，然后有时通过在顶部打印另外两层的空心地图(即，仅在地图边缘喷射液滴的地图)来使结构边缘平坦化。类似地打印上层：打印3-4层的完整地图，然后有时打印两层的空心地图。表2总结了每个连接点的特定地图尺寸和打印层数。
表2：细胞结点生成的打印细节。每个结点打印都列有生物油墨细胞密度，以及上层和下层的地图尺寸(水平像素x×y乘垂直像素z)。用红色CMPTX(RC)或深红色(DR)cellTracker染料对非荧光细胞染色。
通路支架(两种细胞类型)
对于所有通路支架，通过使用单个液滴发生器创建具有或不具有胶原蛋白的载有细胞的生物油墨，首先打印细胞类型1，然后清洗喷嘴和装载生物油墨后打印细胞类型2。每个通路网络由被结构液滴(细胞类型2)在同一平面和上方包围的窄通路结构(细胞类型1)组成。
在所有情况下，按如下方式打印通路网络：首先打印3-7层通路液滴，然后，打印2-6层通路平面、结构液滴，最后通常用2层封顶结构液滴完成网络。这三个地图中每一个的地图尺寸在整个网络打印过程中保持不变，但是通路网络之间的设计不同(见表3)。
表3：细胞通路结构的生成的打印细节。每个路径打印都列出了生物油墨细胞密度、地图尺寸(水平像素x×y)和打印层数(垂直像素z)以及通路的宽度(地图中的像素宽度)。每个结构使用的细胞是：在三叉通路[1]中的HEK-293/YFP(路径)和HEK-293/CFP(结构)；在三叉通路[2]中的HEK-293/CFP(路径)和HEK-293/YFP(结构)；和在三叉通路[1]中的HEK-293T(RC)(路径)和HEK-293T(DR)(结构)。用红色CMPTX(RC)或深红色(DR)cellTracker染料对非荧光细胞染色。
混合细胞打印网络
包含混合细胞的支架用生物油墨打印，生物油墨包含：生物油墨加胶原蛋白中的10×106HEK-293T(红色CMPTX染色)/mL与生物油墨加胶原蛋白中的13×106HEK-293T(深红色染色)/mL的1：1V：V混合物。这些被打印为4层的水平7×8(x×y)地图。
网络凝胶化和凝胶涂覆(相转移准备)：
支架凝胶化
打印后，将结合在标准生物油墨打印油中的SS7或SS8组成的打印支架在静置(5分钟)。然后将支架在冰箱中凝胶化(4℃，20-25分钟)。凝胶网络可以直接使用或储存在水化腔室中。凝胶化后，将网络(即液滴组件)转移到水相(如培养基)中。
细胞支架维护
使用显微镜室载玻片[154534K，Lab-Tek TM]容器，将相转移后的支架在培养基(每孔～600μL)中培养最长达14天。在更换培养基和实验之间，将支架储存在设定为37℃并具有5％CO2(g)的Midi 40细胞培养箱[Thermo Scientific]中。每2-3天更换支架培养基，对于单个孔，按如下方式进行：在空气-培养基界面附近小心地移除～200-300μL容器培养基，然后在孔的角落处缓慢加入300μL新鲜培养基，将培养基的移除和更换再重复1-2次。在层流生物安全柜中进行培养基更换。
大多数HEK-293T和荧光HEK-293支架在完全补充的标准细胞支架培养基中培养。
将oMSC支架在MSC培养基中培养，用于标准存活率评估，并且对于分化实验，使用MSC分化培养基或MSC对照培养基。
神经球支架在标准细胞支架培养基或神经球培养基中培养。
另外的细胞培养基：
细胞培养基混合物
各细胞类型都有其特定的细胞培养基组成。所有培养基均由具有或不具有以下补充物的必需培养基组成：10％V/V FBS、2mM GlutaMAXTM(其是谷氨酰胺来源)、0.1mM MEM非必需氨基酸、10-25mM HEPES(缓冲剂)、100U/mL青霉素(一种抗生素)和100μg/mL链霉素(一种抗生素)。这些组分的比例见表4。
不同细胞系的基础培养基不同，该基础培养基是DMEM,MEM或具体地，在大多数细胞系的整个培养过程中使用了三种不同的DMEM培养基，现在将描述这些培养基与其Sigma-Aldrich产品代码：DMEM D6546是高葡萄糖培养基，用于所有HEK-293细胞系衍生物；DMEM D5564是低葡萄糖培养基，用于MSC的培养；而DMEM D5671是不含丙酮酸钠的高葡萄糖培养基，用于制备用MSC进行的分化实验的DMEM-ITS基础培养基。每个DMEM均含有高(4500mg/L)或低(1000mg/mL)葡萄糖和碳酸氢钠、盐酸吡哆醇和10mg/L丙酮酸钠(除非另有说明)。对于MSC的成骨分化和成骨细胞的培养，使用MEM M4526，并且与标准MEM相比，含有碳酸氢钠且增加了氨基酸浓度。在 (10888-022)(无血清神经元培养基)中培养神经元细胞。表4中也描述了每种细胞系培养基的基础培养基。
除了HEK-293T，其他营养素或特殊抗生素也用于所有细胞系。以下针对每种细胞类型描述这些内容。
表4：用于生长各种细胞系的标准培养基的组成。100倍浓缩储备液是200mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAXTM)、10mM MEM-NEAA、和10,000U/mL青霉素以及10,000μg/mL链霉素(PenStrep)。
荧光HEK-293培养基
对于表达HEK-293细胞的荧光蛋白的培养，还添加10μg/mL杀稻瘟菌素。通过将杀稻瘟菌素粉末(50mg)溶解在过滤-杀菌后的超纯水(5mL)中来制备杀稻瘟菌素储备溶液(10mg/mL)，并在-20℃下储存为10μL等分试样。以1μL/mL向每个培养瓶加入储备溶液。
绵羊MSC分化培养基
对于MSCs分化实验，细胞在MSC分化培养基或MSC对照培养基中培养，其基础培养基是由以下组成的ITS-DMEM：未补充FBS但含有ITS(10.0mg/mL牛胰岛素，5.5mg/mL人转铁蛋白和6.7μg/mL亚硒酸钠)、1mM丙酮酸钠、2mM GlutaMAXTM，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM D5671。0-7天的MSC分化培养基还含有100nM地塞米松、80μM抗坏血酸-2-磷酸和10ng/mL TGF-β3，所有这些都是新鲜补充的。7天后，MSC分化培养基另外包括10ng/mL胰岛素，这也是新鲜加入的。MSC对照培养基与0-7天的MSC分化培养基相同，但没有TGF-β3。MSC培养的另外的营养补充物的概况见表5。
另外的营养素、地塞米松、抗坏血酸、TGFβ3和胰岛素均由粉末试剂制备成储备溶液，将储备溶液涡旋混合，然后过滤-杀菌，并在-20℃下储存为等分试样。通过将地塞米松(3.925mg)溶解在乙醇(1mL)中来制备100μM地塞米松储备液，然后在ITS-DMEM(1mL)中进一步稀释至0.01％(V/V)溶液。对于抗坏血酸盐，通过将L-抗坏血酸2-磷酸倍半水镁盐水合物(L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate)溶解在超纯水(3mL)中来制备80mM储备液。通过将TGF-β3溶解在含有1mg/mL BSA的过滤杀菌后的4mM盐酸中来创建10μg/mL TGF-β3储备液。最后，通过将胰岛素(20mg)溶解在超纯水稀释的乙酸(2mL，pH2.0)中来制备10mg/mL胰岛素储备液。
表5：添加到MSC培养基中的另外的营养补充物的比例。添加的营养素来自如下储备溶液：100倍浓缩的ITS(1.00g/mL牛胰岛素、0.55g/mL人转铁蛋白和0.67mg/mL亚硒酸钠)、100倍浓缩的丙酮酸钠(100mM)、10μg/mL FGF、100μM地塞米松、80mM抗坏血酸-2-磷酸、10μg/mL TGF-β3和10mg/mL胰岛素。
其他可能的培养基包括以下培养基。
成骨细胞培养基
对于MSC骨生成，成骨细胞培养基还含有50μL/mL StemXVivoTM成骨补充物，其在使用当天加入。在-20℃下将成骨补充物储存为等分试样。
神经球培养基
神经球在称为NB-A+的神经球培养基中培养，该培养基包括补充有4％V/V B-27补充物、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养基。对于神经元干细胞扩增，NB-A+另外补充有20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性FGF。
绵羊MSC和软骨细胞培养基
所有oMSC培养基都含有额外的补充物；对于MSC培养，培养基还含有5ng/mL FGF，其在使用时间之前才从10μg/mL FGF储备液添加。软骨细胞培养基与MSC培养基完全相同。通过将FGF(50μg)溶解在过滤杀菌后的5mM Tris·HCl溶液(5mL，pH 7.6)中来制备10μg/mLFGF储备溶液，在-20℃下储存等分试样。
本发明方法优于其他打印技术的优点
与已知的打印技术相比，上述实施例中描述的本发明的方法具有几个优点。
与基于阀门(valve-based)的液滴生物打印相比，液滴分辨率更高
基于阀门的生物打印机可根据需要制造液体水凝胶液滴并将其堆叠以形成3D支架。然而，通常，它们的液滴分辨率(打印机体素分辨率)要低得多，即比我们的技术低一个数量级。Li et al.,Angew.Chemie Int.Ed.54,1–6a(2015)制备了直径为500μm且体积为65nL的液滴。Gurkan et al.,Mol.Pharm.11,2151–9(2014)制备了直径为300μm且体积为14nL的液滴。最小的用微量移液的液滴通常具有200nL的体积和～0.7mm的直径。本发明的方法使得可以制备直径为50μm且体积为65pL的基于盐的溶液的液滴和直径为～130μm且体积为～1.2nL的生物油墨的液滴。
打印水凝胶支架的高细胞密度
大多数已知的生物打印技术以106个细胞/mL规模的细胞密度进行。本发明的方法允许以高一个数量级的密度(例如15×106个细胞/mL)进行打印。
支架中的高存活率
如图3c所示，打印后的细胞存活率在80-95％之间。
整个结构中均匀的细胞分布
如图1e所示，利用本发明的方法，细胞均匀分布。
无需支撑支架
一些生物打印方法使用次级支撑支架来为其载有细胞的结构提供刚性或在其载有细胞的结构内确保多孔性(Derby,Science 338,921–6,2012)。对于组织生长来说，这种支撑支架可能必须降解，这是一种困难的材料设计限制。而且，如果植入这样的支架，则必须与宿主生物相容并避免免疫系统的排斥。所述基于水凝胶的载有细胞的支架不需要这种支撑支架。
高图案分辨率
通过本发明的方法已经以高特征分辨率(～250μm，即2个液滴宽度)打印了多种细胞类型的复杂架构，例如交叉通路、树枝状通路(脉管系统或神经组织那样的结构)和网络结点。图案分辨率比已知方法(例如Kolesky et al.,Adv.Mater.26,3124–30,2014)更大。图2显示了这种高的图案分辨率。
可重复制造毫米级微组织
没有文献公开过可重复制备具有由本发明方法证明的尺寸的小的微组织(通常为1×1×0.4mm3)。大多数已知技术示出了厘米级的支架。
支架制造不受ECM补充的影响
使用本发明的方法，可以用一定比例的细胞外基质蛋白(如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)补充生物油墨，而不影响打印过程。经验证明，低比例的ECM足以帮助初始细胞增殖。因此，使用替代性的基于ECM的补充物补充生物油墨应该是可行的。

Claims (46)

1.一种用于制造液滴组件的方法，所述液滴组件包括多个液滴，其中每个所述液滴包括：
水性介质，其包含水凝胶化合物；和
一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中，
所述方法包括：
在本体疏水介质中产生多个液滴，其中每个所述液滴包括：
水性介质，其包含水凝胶化合物；和
一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水凝胶化合物是多糖，优选地，其中所述水凝胶化合物是琼脂糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述水性介质还包含一种或多种稳定剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述一种或多种稳定剂选自含有二肽的化合物，优选地，其中所述一种或多种稳定剂选自用FMOC基团保护的二肽，更优选地，其中所述一种或多种稳定剂是FMOC-异亮氨酸-甘氨酸和/或FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述水性介质还包含细胞外膜蛋白，优选地，其中所述细胞外膜蛋白包括胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述水性介质还包含培养基，优选地，其中所述培养基是一种或多种氨基酸、一种或多种盐、葡萄糖和一种或多种维生素的水溶液。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述水性介质包含：
(a)浓度为0.5至30.0mg/mL的水凝胶；
(b)浓度为60.0至90.0体积％的培养基；和
(c)浓度为0.1至10.0mmol/L的含有二肽的化合物；并且非必要地，
(d)浓度为0.001至1.0mg/mL的细胞外膜蛋白。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述一个或多个生物细胞选自两种或更多种不同类型的生物细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
(a)一个或多个所述液滴中的每一个均包含设置在所述水性介质中的两个或更多个生物细胞，并且其中所述两个或更多个生物细胞选自两种或更多种不同类型的生物细胞，或者
(b)所述液滴组件包括
第一多个液滴，每个所述第一多个液滴包含一个或多个设置在所述水性介质中的第一类型的生物细胞，和
第二多个液滴，每个所述第二多个液滴包含一个或多个设置在所述水性介质中的第二类型的生物细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述一个或多个生物细胞是哺乳动物细胞。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述一个或多个生物细胞以每毫升水性介质中105至109个细胞的浓度设置在所述水性介质中。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述本体疏水介质包含碳氢化合物和/或硅油，优选地，其中所述碳氢化合物是C8至C16烷烃，更优选地，其中碳氢化合物是十一烷。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述本体疏水介质包含碳氢化合物和硅油的混合物，所述碳氢化合物和硅油的比例(碳氢化合物)：(硅油)按体积计为50：50至80：20，优选地，比例按体积计为60：40到70：30。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述本体疏水介质还包含一种或多种两亲化合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述一种或多种两亲化合物选自脂质，优选地，其中所述一种或多种两亲化合物选自磷脂，更优选地，其中所述一种或多种两亲化合物选自磷酸胆碱脂质。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，产生所述多个液滴包括：
(I)多个分配步骤，每个所述分配步骤包括将一定体积的设置有所述一个或多个生物细胞的所述水性介质注入所述本体疏水介质中。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，设置有所述一个或多个生物细胞的所述水性介质的体积为0.001至100nL。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，产生所述多个液滴包括100个或更多个所述分配步骤。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，产生所述多个液滴包括使用用于产生液滴的装置，
所述装置包括
(a)至少一个液滴发生器；
(b)容器，其能够相对于所述至少一个液滴发生器移动；和
(c)控制单元，其用于控制从所述至少一个液滴发生器分配液滴和控制所述容器相对于所述至少一个液滴发生器的移动。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述或每个液滴发生器包括：
腔室，其用于容纳设置有所述一个或多个生物细胞的所述水性介质；
出口；和
部件，其用于通过所述出口排出一定体积的设置有所述一个或多个生物细胞的所述水性介质，从而将所述体积分配为液滴。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，用于通过所述出口排出一定体积的设置有所述一个或多个生物细胞的所述水性介质的所述部件是压电换能器。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其特征在于，能够相对于所述至少一个液滴发生器移动的所述容器包含所述本体疏水介质。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个所述液滴还包含围绕所述水性介质的表面的两亲分子外层。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个所述液滴还包含围绕所述水性介质的表面的两亲分子外层，并与另一个所述液滴接触，该另一个所述液滴还包含围绕所述水性介质的表面的两亲分子外层，并且其中在第一和第二液滴之间形成两亲分子层作为界面。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述液滴组件包括以三维结构排列的多个液滴，其中三维结构的每个液滴包括围绕所述水性介质的表面的两亲分子外层，并且其中三维结构的每个液滴与至少一个三维结构的其他液滴接触，在接触液滴之间形成作为界面的两亲分子层。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，在第一和第二液滴之间作为界面形成的所述两亲分子层是在第一和第二液滴之间作为界面形成的两亲分子双层。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其特征在于，一个或多个液滴中围绕所述水性介质的表面的所述两亲分子外层还包含一个或多个跨膜蛋白。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在产生多个液滴的步骤之前，所述方法还包括制备设置有一个或多个生物细胞的水性介质的步骤，该制备步骤包括提供水性介质和将多个生物细胞悬浮在所述水性介质中。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括凝胶化步骤，该凝胶化步骤包括让含有所述水凝胶化合物的所述水性介质形成凝胶，优选地，其中所述凝胶化步骤包括将所述液滴组件冷却至温度小于或等于10.0℃，让含有所述水凝胶化合物的所述水性介质形成凝胶。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括培养多个细胞以产生细胞化的液滴组件。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述液滴组件与所述本体疏水介质隔离。
32.一种液滴组件，包括多个液滴，其中每个所述液滴包括：
(i)水性介质，其包含水凝胶化合物；
(ii)一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中；和
(iii)两亲分子外层，其围绕所述水性介质的表面，
其中所述液滴组件中的至少一个液滴与所述液滴组件中的至少一个其他液滴接触，在接触液滴之间形成作为界面的两亲分子层。
33.根据权利要求32所述的液滴组件，其特征在于，所述水凝胶化合物是多糖，优选地，其中所述水凝胶化合物是琼脂糖。
34.根据权利要求32或33所述的液滴组件，其特征在于，所述水性介质还包含一种或多种稳定剂，优选地，其中所述一种或多种稳定剂选自含有二肽的化合物，更优选地，其中所述一种或多种稳定剂选自用FMOC基团保护的二肽，最优选地，其中所述一种或多种稳定剂是FMOC-异亮氨酸-甘氨酸和/或FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的液滴组件，其特征在于，所述水性介质包含细胞外膜蛋白，优选地，其中所述细胞外膜蛋白包括胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的液滴组件，其特征在于，所述液滴组件包括：
第一多个液滴，每个所述第一多个液滴包含一个或多个设置在所述水性介质中的第一类型的生物细胞，和
第二多个液滴，每个所述第二多个液滴包含一个或多个设置在所述水性介质中的第二类型的生物细胞。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的液滴组件，其特征在于，每个所述多个液滴的体积为0.001至100nL。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的液滴组件，其特征在于，所述液滴组件如权利要求5至8中任一项所进一步限定。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的液滴组件，其特征在于，包含水凝胶化合物的所述水性介质为凝胶形式。
40.一种组合物，其包含本体疏水介质和设置在所述本体疏水介质中的、如权利要求32至39中任一项所限定的液滴组件。
41.一种液滴组件，其能够通过权利要求1至31中任一项所限定的方法获得。
42.一种组合物，包含：
(i)水性介质，该水性介质包含：
(a)水凝胶化合物；
(b)培养基；
(c)一种或多种包含二肽的化合物，
和
(ii)一个或多个生物细胞，其设置在所述水性介质中。
43.根据权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述水性介质还包含：
(d)细胞外膜蛋白。
44.根据权利要求42或43所述的组合物，其特征在，所述水性介质包含：
(a)浓度为0.5至30.0mg/mL的水凝胶；
(b)浓度为60.0至90.0体积％的培养基；
(c)总浓度为0.1至10.0mmol/L的一种或多种含有二肽的化合物；和
(d)浓度为0.001至1.0mg/mL的细胞外膜蛋白，
并且，其中设置在所述水性介质中的所述一个或多个生物细胞的浓度为每毫升水性介质中有105至107个细胞。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的组合物，其特征在于，所述一种或多种含有二肽的化合物是FMOC-异亮氨酸-甘氨酸和/或FMOC-苯丙氨酸-苯丙氨酸。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的组合物，其特征在于，所述水性介质如权利要求1至31中任一项所进一步限定。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017225355A1 (en) 2016-03-01 2018-09-13 Oxford University Innovation Limited Phase transfer of a cargo laden scaffold
KR102160588B1 (ko) 2019-12-24 2020-09-28 주식회사 팡세 균일한 크기의 스페로이드의 제작 방법
KR102160587B1 (ko) 2019-12-24 2020-09-28 주식회사 팡세 하이드로겔 액적 디핑용 액체 배스 조성물
CN116322718A (zh) * 2020-10-07 2023-06-23 富士胶片株式会社 关节治疗用细胞制剂的制造方法、关节治疗用细胞制剂及间充质干细胞的培养方法
WO2022084513A1 (en) * 2020-10-23 2022-04-28 The Chancellor, Masters And Scholars Of The University Of Oxford Cellularized structures comprising extracellular matrix protein

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6114153A (en) * 1999-07-26 2000-09-05 Shukla; Ashok K. Hydrophobic particle-coated aqueous droplet reaction chamber
CN1520306A (zh) * 2001-02-05 2004-08-11 �����ѧ�͹�ҵ�о���֯ 用于组织修复的方法和器件
CN1994478A (zh) * 2006-12-21 2007-07-11 大连理工大学 一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050032118A1 (en) 1996-06-18 2005-02-10 Self Colin H. Nitrophenyl derivatives that can be activated by light
US6017758A (en) 1997-02-20 2000-01-25 Vanderbilt University DMNPE caged nucleic acid and vector
JP2002315576A (ja) 2001-04-23 2002-10-29 Inst Of Physical & Chemical Res 遺伝子発現調節方法
US20070224273A1 (en) 2004-09-28 2007-09-27 Bing Xu Multifunctional Supramolecular Hydrogels as Biomaterials
US8420605B2 (en) 2005-09-07 2013-04-16 The University Of Strathclyde Hydrogel compositions
SG131015A1 (en) 2005-09-15 2007-04-26 Millipore Corp Method and apparatus for making porous agarose beads
US10004828B2 (en) 2005-10-11 2018-06-26 Romat at Tel-Aviv University Ltd. Self-assembled Fmoc-ff hydrogels
AU2006304110B2 (en) 2005-10-12 2012-02-02 The Scripps Research Institute Selective posttranslational modification of phage-displayed polypeptides
JP5177774B2 (ja) 2008-12-12 2013-04-10 国立大学法人 東京大学 細胞の３次元階層的共培養法
WO2011151832A1 (en) * 2010-06-03 2011-12-08 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Malleable hydrogel hybrids made of self-assembled peptides and biocompatible polymers and uses thereof
GB201119032D0 (en) 2011-11-03 2011-12-14 Isis Innovation Multisomes: encapsulated droplet networks
US9090866B2 (en) * 2012-01-31 2015-07-28 The Rogosin Institute Method for manufacture of macrobeads
DE102012100859B4 (de) * 2012-02-02 2015-12-17 Rwth Aachen Verfahren zum Herstellen dreidimensionaler Strukturen und solche Strukturen
CN104582747B (zh) * 2012-08-08 2016-12-21 南洋理工大学 用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物
GB201219201D0 (en) * 2012-10-25 2012-12-12 Isis Innovation Hydrogel network
GB201219196D0 (en) 2012-10-25 2012-12-12 Isis Innovation Droplet assembly method
AU2013336430B2 (en) * 2012-10-26 2018-02-15 Oxford Nanopore Technologies Limited Droplet interfaces
KR102449271B1 (ko) * 2012-12-07 2022-09-29 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드 3d 프린팅에 의한 비말 어셈블리
US11285115B2 (en) 2013-02-28 2022-03-29 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Peptide-based hydrogel particles and uses thereof
US9555007B2 (en) * 2013-03-14 2017-01-31 Massachusetts Institute Of Technology Multi-layer hydrogel capsules for encapsulation of cells and cell aggregates
WO2014200997A2 (en) 2013-06-10 2014-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method for preparing three-dimensional, organotypic cell cultures and uses thereof
CN104353123A (zh) * 2014-11-11 2015-02-18 四川大学 一种非匀质水凝胶及其制备方法和应用
GB201504222D0 (en) 2015-03-12 2015-04-29 Dovetailed Ltd Droplet assemblies and methods for producing droplet assemblies
AU2017225355A1 (en) 2016-03-01 2018-09-13 Oxford University Innovation Limited Phase transfer of a cargo laden scaffold
GB201603591D0 (en) 2016-03-01 2016-04-13 Isis Innovation Improved promotors and compositions

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6114153A (en) * 1999-07-26 2000-09-05 Shukla; Ashok K. Hydrophobic particle-coated aqueous droplet reaction chamber
CN1520306A (zh) * 2001-02-05 2004-08-11 �����ѧ�͹�ҵ�о���֯ 用于组织修复的方法和器件
CN1994478A (zh) * 2006-12-21 2007-07-11 大连理工大学 一种三维动态条件下扩增骨髓间充质干细胞的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D F DUARTE CAMPOS等: "Three-dimensional printing of stem cell-laden hydrogels submerged in a hydrophobic high-density fluid", 《IOP PUBLISHING》 *

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