CN113474092A - 细胞组织的制备方法、细胞组织制备套件和包含通过该制备方法制备的细胞组织的培养容器 - Google Patents

Abstract

本发明提供细胞组织的制备方法，该制备方法在维持细胞存活率的基础上可制备高密度且保形性高的细胞组织，包括以下工序：第1涂布工序，在涂布对象物上涂布第1涂布液；以及第2涂布工序，在第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布第2涂布液，其中，第2涂布工序包括：边维持第1溶液的涂布液的流动状态，边使第1涂布液与第2涂布液的界面发生凝胶化。

Description

细胞组织的制备方法、细胞组织制备套件和包含通过该制备 方法制备的细胞组织的培养容器

技术领域

本发明涉及制备细胞组织的方法、适合于该方法的细胞组织制备套件、和包含通过该制备方法制备的细胞组织的培养容器。

背景技术

在生物体外构建细胞的三维组织的技术在药物开发研究和再生医学研究中较为重要，特别是要求构建接近于人生物体组织的细胞组织。

在生物体外处理细胞的情况下，通常是使用塑料圆形培养皿(Dish)或玻璃平皿(Schale)等培养容器进行二维的细胞培养。然而，在实际的生物体内细胞进行三维生长而形成组织或器官，所以为了实现接近于生物体内的培养环境，构建三维的细胞组织、并对其细胞组织进行评价实验，这对药物开发研究和再生医学研究的进展较为重要。

将细胞彼此集合、聚集化而得的细胞组织(细胞集合体)例如分别配置在孔板的整列(排列)的多个孔(凹部)中、并对各细胞组织进行评价的测定法(Assay Method，分析法)在细胞功能的评价、或选择作为新型药品有效的化合物的筛选中广泛应用。通过对这样的细胞组织施行测定法，可使用少量的样品在短时间内评价多个项目，在确保快速性、简便性、安全性、重现性和高可靠性方面有利。

作为将细胞在基板上进行精密图案化配置的技术，有利用光刻技术对基板进行加工以控制细胞粘附的方法、和直接打印细胞进行配置和固定化的方法。近年来，随着用于将细胞进行三维(3D)配置和层叠的3D打印机技术的进展，研究了使用3D打印机的细胞集合体的构建，在基于由细胞组织得到的组织模型的药物开发研究和再生医学中的应用正积极展开(参照专利文献1～8)。

近年来，以印刷(涂布)方式描绘、形成RFID标签等微细电路的印刷电子(PrintedElectronics)技术正快速发展。作为形成微细电路的图案或电极图案的方式，有喷墨方式、分液器(Dispenser，滴涂)方式等，这种印刷电子技术不仅应用于电路或电极的形成，还被作为用作细胞组织的制备技术的生物打印(印刷)技术来研究(例如参照专利文献9)。

本申请人拥有作为印刷技术之一的使用涂布针的技术，将涂布针技术应用于生物打印技术，研究开发在生物体外构建细胞的三维组织的技术(参照专利文献10)。作为使用涂布针进行液体材料的微细涂布的方法，例如公开在专利文献11中。这样的涂布单元以修正微细图案的缺陷为目的，可使用宽范围的粘度的涂布液进行微细涂布。在涂布动作时，使1根涂布针从形成于保持涂布液的涂布液容器的底部的贯穿孔突出。涂布针使附着于前端的涂布液与被涂布物接触进行涂布。

涂布方法如下进行：应用上述涂布针使来自iPS的心肌细胞分散在纤维蛋白原溶液中进行涂布，之后浸在凝血酶溶液中，从而通过凝胶化进行组织固定。在该方法中，在将纤维蛋白原用作涂布心肌细胞时的凝胶化剂之际，涂布在第1液中分散有心肌细胞和纤维蛋白原的涂布剂，通过在第2液中添加凝血酶作为凝胶化引发剂以覆盖涂布剂的方式进行涂布。然而，在执行涂布工序前，确认到在第1液内部的心肌细胞和纤维蛋白原溶液中发生不希望的凝胶化的现象。因此，发生了如下的不良情形：在涂布液容器内部凝胶化的心肌细胞块有时会引起堵塞、或已凝胶化的心肌细胞有时会残留在涂布液容器内而无法涂布。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-126459号公报；

专利文献2：日本特开2008-017798号公报；

专利文献3：日本特开2010-022251号公报；

专利文献4：日本特开2015-229148号公报；

专利文献5：日本特开2016-087822号公报；

专利文献6：日本特开2017-163931号公报；

专利文献7：日本特开2017-169560号公报；

专利文献8：日本特开2017-131144号公报；

专利文献9：日本特开2016-526910号公报；

专利文献10：日本专利4802027号公报；

专利文献11：国际公开第2019/088224号小册子。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是为了以下目的而进行的：即在如上所述的生物打印技术中，在执行涂布工序之前的涂布液容器内部不会产生凝胶化、随之发生的堵塞等不良情形的生物打印技术。令人惊奇的是，发现了：如果采用可达到上述目的的生物打印技术，则在维持细胞存活率的基础上，可制备高密度且保形性高的细胞组织。

本发明提供细胞组织的制备方法，其中，在涂布液容器内部不会产生凝胶化、随之发生的堵塞等不良情形，而且，在维持细胞存活率的基础上，可制备高密度且保形性高的细胞组织。

另外，本发明还提供：细胞组织的制备方法，该制备方法在维持细胞存活率的基础上，可制备高密度且保形性高的细胞组织，同时可在一个容器(培养基)内制备多个细胞组织和多种细胞组织；以及包含通过该制备方法制备的细胞组织的培养容器。

用于解决课题的手段

即，本发明提供细胞组织的制备方法，其特征在于，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布第2涂布液。更详细而言，第2涂布工序包括：边维持第1溶液的涂布液的流动状态，边使第1涂布液与第2涂布液的界面发生凝胶化。

发明效果

根据本发明的方法，在涂布针等生物打印技术中的涂布工序中，在执行涂布工序前的涂布液容器内部不会产生凝胶化、随之发生的堵塞等不良情形。

另外，根据本发明，在维持细胞存活率的基础上，可制备高密度且保形性高的细胞组织，可在一个容器(培养基)内制备多个细胞组织和多种细胞组织。因此，取得通过一次的评价实验可对多个样品进行评价的优异效果。

附图说明

[图1]是显示本发明所涉及的实施方式1中使用的微细涂布装置的整体图。

[图2]是显示微细涂布装置中的涂布单元上所安装的涂布针保持部的图。

[图3]是显示设于涂布针保持部的涂布针的前端部分的图。

[图4]是示意性地显示涂布单元中的细胞涂布动作的图。

[图5]是显示在涂布实验1中通过相位差显微镜观察到的液滴点的图像的图。

[图6]是显示在涂布实验2中通过相位差显微镜观察到的液滴点的图像的图。

[图7]是显示涂布实验3中的通过相位差显微镜观察到的液滴点的图像的图。

[图8]是显示涂布实验4中的通过相位差显微镜观察到的液滴点的图像的图。

[图9]是显示涂布实验5的实验结果的图。

[图10]是显示涂布实验6中制造的细胞集合体的图像的图。

[图11]是显示涂布实验7中的活细胞/死细胞(Live/Dead)荧光染色图像的图。

[图12]是显示涂布实验8中制造的心肌组织体的刚刚涂布后的状态的图像的图。

[图13]是显示培养图12所示的心肌组织体6天时的状态的图像的图。

[图14]是显示培养了5天的心肌组织体之一的放大图像的图。

[图15]是显示通过图14所示的培养了5天的心肌组织体的搏动动画的分析而得到的收缩/舒张速度的图。

[图16]是作为本发明所涉及的实施方式2的细胞组织的制备方法，显示具有多个孔的多孔培养容器中的1个孔，是示意性地显示将细胞组织在平底的孔中制备细胞组织的状态的图。

[图17]是示意性地显示在实施方式2的细胞组织的制备方法中在形状不同的孔中制备细胞组织的例子的平面图。

[图18]是用于说明作为本发明所涉及的实施方式3的细胞组织的制备方法的、使用涂布针的涂布方法和涂布后的细胞的沉降沉淀的概略示意图。

[图19]是显示实施方式3中的微细涂布装置的例子的图。

[图20]是显示涂布装置主体的例子的图。

[图21]是显示对96孔板内的40个孔进行涂布的结果的涂布状态的照片。

[图22]是细胞组织的相位差显微镜照片。

[图23]是显示基于细胞组织的HE染色的厚度测定结果的图。

[图24]是通过荧光染色观察细胞组织的相位差显微镜照片。

[图25]是显示在涂布液容器内形成包埋有心肌细胞的凝胶状物质的照片。

[图26]是利用现有方法得到的细胞组织的相位差显微镜照片。

[图27]是示意性地显示本发明所涉及的实施方式4的细胞组织的制备方法中的各工序的图。

[图28]是实施方式4的细胞组织的制备方法中的第1涂布工序、第2涂布工序和培养基形成工序的时间图。

[图29]是显示使心肌细胞和凝血酶分散于第1涂布液的情况下的三维细胞组织的图像的照片。

[图30]是显示所制备的细胞组织的基于荧光染色的厚度测定结果的图像的照片。

[图31]是显示所制备的细胞组织的基于荧光染色的观察结果的图像的照片。

[图32]是显示本发明所涉及的实施方式5的细胞组织的制备方法中使用的微细涂布装置的正面图。

[图33]是示意性地显示使用微细涂布装置在培养容器内制备多个细胞组织的例子的平面图。

[图34]是用于制备图33所示的多个细胞组织的流程图。

[图35]是示意性地显示使用微细涂布装置在培养容器内制备多个细胞组织的变形例的平面图。

[图36]是用于制备图35所示的多个细胞组织的流程图。

具体实施方式

首先，对本发明所涉及的细胞组织的制备方法、和利用培养容器制备的细胞组织的各种方案进行记载，其中该培养容器包含通过该制备方法制备的细胞组织。

需要说明的是，本发明中的细胞组织是指，细胞在基板上集合、聚集、层叠化而进行组织化、发挥功能的状态的细胞集合体。

本发明所涉及的第1方案的细胞组织的制备方法包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布第2涂布液，使第1涂布液与第2涂布液的界面发生凝胶化。

本发明所涉及的第2方案的细胞组织的制备方法，其中，上述第1方案中的上述第2涂布工序可包括：边维持第1溶液的涂布液的流动状态，边使第1涂布液与第2涂布液的界面发生凝胶化。

本发明所涉及的第3方案的细胞组织的制备方法，其中，上述第1或第2方案中的第1涂布液可包含细胞和凝胶化引发剂。

本发明所涉及的第4方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第1～第3方案的任一者中，第2涂布液可包含凝胶化剂。

本发明所涉及的第5方案的细胞组织的制备方法可包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含凝胶化剂的第2涂布液，使在第1涂布液与第2涂布液的界面引发凝胶化反应。

本发明所涉及的第6方案的细胞组织的制备方法可包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含作为凝胶化剂的胶原蛋白、明胶和/或琼脂的第2涂布液，通过加热或冷却使在第1涂布液与第2涂布液的界面引发凝胶化反应。

本发明所涉及的第7方案的细胞组织的制备方法可包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含光交联性明胶水凝胶化剂的第2涂布液，通过光照射使在第1涂布液与第2涂布液的界面引发凝胶化反应。

本发明所涉及的第8方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第1～第7方案的任一者中可包括：将涂布有第1涂布液和第2涂布液的涂布对象物浸在培养基中并培养细胞的工序。

本发明所涉及的第9方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第1～第8方案的任一者中，第1涂布液可包含增稠多糖类。

本发明所涉及的第10方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第1～第9方案的任一者中，第2涂布液可包含增稠多糖类。

本发明所涉及的第11方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第3～第5方案的任一者中，凝胶化引发剂可以是凝血酶。

本发明所涉及的第12方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第4或第5方案的任一者中，凝胶化剂可以是纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶或它们的2种以上的混合物。

本发明所涉及的第13方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第9～第10方案的任一者中，增稠多糖类可以是透明质酸钠、海藻酸钠或它们的混合物。

本发明所涉及的第14方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第3～第13方案的任一者中，细胞可以是心肌细胞。

本发明所涉及的第15方案的细胞组织形成套件至少包括：第1容器，该第1容器包含含有细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及第2容器，该第2容器包含含有凝胶化剂的第2涂布液。

本发明所涉及的第16方案的细胞组织形成套件，其中，在上述第15方案中，第1涂布液可包含增稠多糖类。

本发明所涉及的第17方案的细胞组织形成套件，其中，在上述第15或第16方案中，第2涂布液可包含增稠多糖类。

本发明所涉及的第18方案的细胞组织形成套件，其中，在上述第15～第17方案的任一者中，凝胶化引发剂可以是凝血酶。

本发明所涉及的第19方案的细胞组织形成套件，其中，在上述第15～第18方案的任一者中，凝胶化剂可以是纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶或它们的2种以上的混合物。

本发明所涉及的第20方案的细胞组织形成套件，其中，在上述第16～第19方案的任一者中，增稠多糖类可以是透明质酸钠、海藻酸钠或它们的混合物。

本发明所涉及的第21方案的细胞组织形成套件，其中，在上述第15～第20方案的任一者中，细胞可以是心肌细胞。

本发明所涉及的第22方案的细胞组织是通过上述第1～第14方案的任一者的细胞组织的制备方法制备的细胞组织。

本发明所涉及的第23方案的细胞组织的制备方法为：上述第1涂布工序是采用基于涂布针的接触涂布而进行的第1～第14方案中的任一者。

本发明所涉及的第24方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第1～第14方案、和第23方案的任一者中，

对同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第1涂布工序和上述第2涂布工序的涂布动作，并执行培养基形成工序。

本发明所涉及的第25方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24方案中，对同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第1涂布工序和上述第2涂布工序的涂布动作后，可执行上述培养基形成工序。

本发明所涉及的第26方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24方案中，对同一培养容器的各涂布对象位置执行上述第1涂布工序和上述第2涂布工序的涂布动作后，可对该涂布对象位置执行上述培养基形成工序。

本发明所涉及的第27方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24方案中，对同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第1涂布工序的涂布动作后，对该同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第2涂布工序的涂布动作，之后可对该同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述培养基形成工序。

本发明所涉及的第28方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24～第27方案的任一者中，可包含上述培养基形成工序、即使包含上述第1涂布液的上述第2涂布液浸渍的方式涂布第3涂布液。

本发明所涉及的第29方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24～第28方案的任一者中，可对同一培养容器的多个涂布对象位置制备包含相同种类的细胞的细胞组织。

本发明所涉及的第30方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24～第28方案的任一者中，可对同一培养容器的多个涂布对象位置制备包含不同种类的细胞的细胞组织。

本发明所涉及的第31方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24～第30方案的任一者中，在上述第1涂布液上重叠涂布上述第2涂布液的上述第2涂布工序可采用喷墨方式、或分液器方式。

本发明所涉及的第32方案的细胞组织的制备方法，其中，在上述第24～第31方案的任一者中，在形成细胞组织时可使用双液式的凝胶化溶液作为涂布液。

本发明所涉及的第33方案的培养容器是在同一容器内包含多个细胞组织的容器。

本发明所涉及的第34方案的培养容器，其中，在上述第33方案中，可在同一容器内包含相同种类的多个细胞组织。

本发明所涉及的第35方案的培养容器，其中，在上述第33方案中，可在同一容器内包含种类不同的多个细胞组织。

本发明所涉及的第36方案的培养容器，其中，在上述第33～第35方案的任一者中，在同一容器内包含多个细胞组织，且具有多个该容器。

另外，作为本发明所涉及的一个方案的细胞组织制备方法，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布第1涂布液；

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的上述第1涂布液上重叠涂布第2涂布液；以及

培养基形成工序，使包含上述第1涂布液的上述第2涂布液浸渍的方式涂布第3涂布液，

可对同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第1涂布工序和上述第2涂布工序的涂布动作，并执行上述培养基形成工序。

在以下说明的细胞组织的制备方法中，如在后述的实施方式中利用具体示例进行说明的那样，使用微细涂布装置，安全性和重现性高，可实现自动化，在短时间内制备大量的可靠性高的细胞组织(细胞集合体)，所述的微细涂布装置每次用极短时间、例如0.1秒可在对象物的规定位置高精度地涂布附着于涂布针前端的数pL(皮升)的微少液滴。

在本发明中，通过使用高速的微细涂布装置，即使是现有的打印机无法应对的具有高粘性的材料、例如包含细胞和凝胶化剂的高粘度溶液，也可在短时间内可靠地涂布在规定位置，高精度地制造多个细胞组织(细胞集合体)。其结果，根据本发明，可二维和三维地任意配置控制所期望的细胞，可自动化且在无菌状态下大量地制造各种细胞组织。因此，本发明所涉及的细胞组织的制备方法，安全性和重现性高，可通过自动化大量地制造具有可靠性的细胞组织。

接下来，参照附图，利用实施方式对细胞组织的制备方法、和通过该制备方法制备的细胞组织进行说明。需要说明的是，本发明所涉及的细胞组织的制备方法并不限于以下说明的实施方式的使用微细涂布装置的构成，通过基于与在微细涂布装置中执行的细胞涂布动作(细胞涂布方法)同等的技术思想的细胞涂布动作(细胞涂布方法)实现。

(实施方式1)

以下，参照附图，对本发明所涉及的细胞组织的制备方法、和通过该制备方法制备的细胞组织所相关的具体实施方式1进行说明。图1是显示实施方式1中使用的微细涂布装置1的整体图。如图1所示，微细涂布装置1具备：涂布装置主体2；以及对该涂布装置主体2进行设定、控制和显示的显示/控制部3。作为实施方式1中的微细涂布装置1的显示/控制部3，由所谓个人计算机(PC)构成。

微细涂布装置1的涂布装置主体2具备：在主体底座12上可沿水平方向移动的XY工作台4、相对于XY工作台4可沿上下方向(垂直方向)移动的Z工作台5、与Z工作台5同样可沿上下方向移动的固定于驱动机构的涂布单元6、以及用于观察XY工作台4上的涂布对象物的光学检测部(例如CCD相机) 7。在XY工作台4上涂布作为含细胞溶液的涂布液10，载置并固定形成有多个细胞组织的基板等。

以上述方式构成的微细涂布装置1中的涂布单元6以进行细胞涂布动作、即在XY工作台4上的基板等上整列并形成多个细胞组织的方式构成。以下，对涂布单元6的构成和基于涂布单元6的细胞涂布动作进行说明。

[涂布单元的构成]

图2是显示安装于涂布单元6上的涂布针保持部13的图。在涂布针保持部13突出设有涂布针9。图3是显示涂布针9的前端部分的图。在本实施方式的涂布针9中，形成圆锥状的前端部分的前端9a以与XY工作台4的水平面相对的方式形成为平面(平坦) (参照图3的(a))。即，前端9a的平面是与垂直方向垂直的平面。如后所述，前端9a的直径d非常有助于所制备的细胞组织的形状。在实施方式1中，作为涂布针9的前端9a的直径d，采用50～330μm。在实施方式1中，如图3的(a)所示，涂布针9的前端部分形成为圆锥状，前端9a为水平面，所以通过将前端9a研磨成水平面，可容易地使前端9a的直径d形成为例如50～330μm范围的所期望的值。

需要说明的是，在实施方式1中，通过由水平的平面构成涂布针9的前端9a的例子进行说明(参照图3(a))，但也可形成如下的构成：将该前端9a的面形状形成为具有规定直径、例如30μm以下的直径的凹面(半球面)，使细胞可保持在该凹面中的方式进行细胞涂布动作(参照图3(b))。通过如此地使涂布针9的前端9a形成为凹面，通过基于涂布针9的细胞涂布动作，形成可制备具有所期望的细胞密度或细胞排列的细胞组织的构成。另外，如图3的(c)所示，可形成在涂布针9的前端9a设有带台阶的突起9b的构成。通过形成这样的具有突起9b的构成，例如，通过在基板上连续地涂布多次、且在每1次的细胞涂布动作中使针尖仅上升规定距离，例如通过使其上升0.5μm，可在基板上制备向上方延伸的细胞组织。

图4是示意性地显示涂布单元6中的细胞涂布动作的图。如图4所示，涂布单元6具有：涂布液容器8，其形成有贮存规定量的作为含细胞溶液的涂布液10的涂布液积存处8a；以及涂布针保持部13，其具备贯穿涂布液积存处8a的涂布针9。涂布针保持部13具备滑动机构部16，该滑动机构部16保持涂布针9使其可沿上下方向(垂直方向)滑动。涂布针保持部13可拆装地设在驱动机构部17的规定位置，例如可形成利用磁铁的磁力相对于驱动机构部17可拆装的构成。

涂布针保持部13以上述方式固定于涂布装置主体2中的驱动机构部17，以沿上下方向(垂直方向)以高速往返移动规定间隔的方式构成。这样的驱动机构部17的驱动控制、或YX工作台4和Z工作台5的驱动控制的设定等在显示/控制部3中进行。设于涂布针保持部13的滑动机构部16保持涂布针9使其可上下往返。滑动机构部16以进行往返动作、即在涂布针9的前端9a所保持的涂布液10与涂布对象物接触后上升的方式构成。需要说明的是，滑动机构部16具有如下的构成：当涂布针9的前端9a下降、例如与基板11抵接时，涂布针9使滑动机构部16沿垂直方向滑动，以使其从该抵接位置上升。

如上所述，实施方式1的涂布单元6中的滑动机构部16的构成为：涂布针9的前端9a所保持的涂布液10对涂布对象物进行接触涂布。涂布针9的前端9a进行往返动作、即在与涂布对象物接触的位置折返上升。需要说明的是，此时的涂布针9在上下方向的往返动作为高速，例如1个往返优选设定为0.5秒以下、进一步优选设定为0.1秒以下。

如上所述，涂布单元6中的涂布针保持部13具备保持涂布针9使其可上下滑动的滑动机构部16，可拆装地固定于沿上下方向移动的驱动机构部17。另外，涂布针保持部13以涂布针9可沿上下方向(垂直方向)移动以贯穿涂布液积存处8a的方式构成，该涂布液积存处8a贮存作为含细胞溶液的涂布液10。在涂布液容器8的上部和下部形成有涂布针9所贯穿的孔(上部孔14a、下部孔14b)。

[细胞涂布动作]

接下来，对图4中示意性地显示的、涂布单元6中的细胞涂布动作进行说明。在图4所示的细胞涂布动作中，涂布针9穿过涂布液容器8的涂布液积存处8a，与作为涂布对象物的基板11接触，在基板11上涂布含有细胞的涂布液10，形成液滴点。该细胞涂布动作重复规定的次数，通过多次涂布涂布液10，在基板11上制备所期望的细胞组织。

图4中的(a)显示细胞涂布动作中的待机状态。在该待机状态下，涂布针9从上部孔14a插入，涂布针9的前端9a浸在涂布液积存处8a的涂布液10中。这样，在待机状态(待机工序)下为如下的构成：涂布针9的前端9a浸在涂布液10中，附着于前端9a的涂布液10不会干燥。此时，由于涂布液容器8的下部孔14b的直径微细(例如1mm以下)，所以涂布液10不会从涂布液积存处8a泄漏。

图4中的(b)显示涂布针9的前端9a从涂布液容器8的下部孔14b突出、而前端9a从涂布液积存处8a朝着基板11下降的状态(下降工序)。即，图4的(b)显示涂布针9的前端9a贯穿涂布液容器8的涂布液积存处8a而突出的下降状态。在该下降状态下，涂布针9上附着有涂布液10，由于所附着的涂布液10的表面张力，在涂布针9的前端9a保持有一定量的涂布液10。

图4中的(c)显示涂布针9的前端9a所保持的涂布液10与基板11的表面接触，涂布液10被涂布到基板11的表面上的状态(涂布工序)。此时所涂布的涂布液10的液滴点对应于涂布针9的前端9a所保持的一定量的涂布液10。在实施方式1中，虽然是涂布针9的前端9a所保持的涂布液10与涂布对象物接触进行涂布(接触涂布)的构成，但即使在涂布针9的前端9a与基板11的表面接触(抵接)的情况下，也以其接触瞬间的冲击载荷为约0.06N以下的方式构成。在实施方式1中，如上所述，由于涂布针9通过滑动机构部16可滑动地保持以吸收垂直方向的冲击，因此抵接时的冲击载荷达到极小的值。

图4中的(d)显示涂布针9在基板11的表面上刚刚涂布涂布液10后的状态，显示涂布针9正上升的状态。在该上升状态后转变为待机状态、即涂布针9的前端9a浸在涂布液积存处8a的涂布液10中(收纳工序)。

如上所述，图4所示的(a)→(b)→(c)→(d)→(a)的动作是1个循环的细胞涂布动作。在实施方式1中，用0.1秒进行1个循环的细胞涂布动作，在短时间内执行细胞涂布动作。需要说明的是，在实施方式1中，通过重复规定次数(例如10个循环)的细胞涂布动作，制备所期望的细胞组织。

在本发明所涉及的实施方式1中的微细涂布装置1的细胞涂布动作中，通过使附着于涂布针9前端的极微量的涂布液10与涂布对象物接触，能够以高配置精度、例如±15μm以下、优选±3μm以下的配置精度涂布并形成数pL(皮升)的涂布量的液滴点。另外，作为涂布液10的粘度，可涂布1×10⁵mPa·s以下的材料，可涂布高粘度的细胞分散液。在实施方式1中的微细涂布装置1的细胞涂布动作中，可使用粘度为10mPa·s以上且1×10⁵mPa·s以下的材料作为涂布材料，而这种材料在喷墨打印机等使用喷嘴的打印机中因存在堵塞等问题而无法使用。另外，由于是使附着于涂布针9前端的极微量的涂布液10与涂布对象物接触而进行涂布，所以不受涂布针9的垂直方向位置的偏差影响，能够以所期望的涂布量稳定地重复涂布涂布液10。这样，在实施方式1中，由于可在基板11等的表面的规定位置精密涂布高粘度的细胞分散液，因此可制备将具有任意图案化的细胞进行立体造形而得的细胞组织。因此，本发明所涉及的细胞组织的制备方法所制备的细胞组织被用于药剂的药效、安全性的评价的筛选等药物开发研究和再生医学领域，对各领域中的进展发挥效果。

(实验例1)

使用在上述的实施方式1中说明的微细涂布装置1，利用浓度和粘性不同的涂布液10进行涂布实验1。在该涂布实验1中，使用5%、10%和20%的明胶PBS (磷酸缓冲液)溶液的3种涂布液10进行液滴点的形状的确认。

准备3个涂布单元6中的涂布液容器8，准备在磷酸缓冲液(PBS)中以5、10、20重量体积百分比(%w/v)溶解有明胶的3种明胶PBS溶液作为涂布液10。需要说明的是，该涂布实验1中使用的涂布液10不含细胞。

在涂布实验1中，在各涂布液容器8中填充20μL 5%、10%、20%的明胶PBS溶液。作为涂布单元6中的涂布针9，前端9a (平面形状)的直径d采用100μm。在该涂布实验1中，在固定于XY工作台4的载玻片上，以150μm的间隔点接触涂布液10，涂布5×5个点(spot)。使用相位差显微镜观察在载玻片上涂布而形成的液滴点。

图5是显示在涂布实验1中使用相位差显微镜观察到的液滴点的图像的图。图5中的(a)是显示使用前端9a的直径d (前端直径)为100μm的涂布针9在载玻片上涂布作为涂布液10的5%的明胶PBS溶液(粘度为3mPa·s)而形成的液滴点的图像。图5中的(b)是显示使用涂布针9 (前端直径为100μm)在载玻片上涂布作为涂布液10的10%的明胶PBS溶液(粘度为30mPa·s)而形成的液滴点的图像。另外，图5中的(c)是显示使用涂布针9 (前端直径为100μm)在载玻片上涂布作为涂布液10的20%的明胶PBS溶液(粘度为220mPa·s)而形成的液滴点的图像。

如由图5中的(a)、(b)和(c)所判明，通过使用微细涂布装置1的涂布单元6，即使是浓度和粘性不同的涂布液10，所形成的液滴点也具有同样的形状(5%明胶液滴点的直径为136±3μm、10%明胶液滴点的直径为147±1μm、20%明胶液滴点的直径为151±1μm)。即，在涂布实验1中，不会很大程度地依赖于明胶浓度和粘性，并且始终可确认到稳定的液滴点。根据发明人的实验，液滴点的直径相对于涂布针9的前端直径为1.3～1.6倍的范围内，没有形成至少2倍以上的大液滴。在另一实验例中，作为进行涂布试验的涂布液，使用进一步高粘度化的涂布液，相对于涂布针9的前端9a的直径在1.0～1.2倍左右的范围内进行涂布。另外，在又一实验例中，在孔中在细胞组织不重复的范围内，使用相对于涂布针9的前端9a的直径形成2倍以上的大液滴这样的低粘度的涂布液进行涂布试验。

(实验例2)

使用在上述的实施方式中说明的微细涂布装置1，利用前端9a的直径(前端直径)不同的涂布针9进行涂布实验2。在该涂布实验2中，使用5%的明胶PBS溶液作为涂布液10，确认所形成的液滴点的形状。在该涂布实验2中使用的涂布液10中不含细胞。

在涂布实验2中，使用前端直径为50μm、100μm、150μm的3种涂布针9。在涂布实验2中，在固定于XY工作台4的载玻片上，以150μm间隔点接触涂布液10，涂布5×5个点。利用相位差显微镜观察在载玻片上涂布而形成的液滴点。

图6是显示在涂布实验2中通过相位差显微镜观察到的液滴点的图像的图。图6中的(a)是显示使用前端直径为50μm的涂布针9在载玻片上涂布5%的明胶PBS溶液的涂布液10而形成的液滴点的图像。图6中的(b)是显示使用前端直径为100μm的涂布针9在载玻片上涂布5%的明胶PBS溶液的涂布液10而形成的液滴点的图像。图6中的(c)是显示使用前端直径为150μm的涂布针9在载玻片上涂布5%的明胶PBS溶液的涂布液10而形成的液滴点的图像。

如图6中的(a)、(b)和(c)所示，可确认所形成的液滴点具有与涂布针10的直径(50μm、100μm、150μm)大致成比例的液滴点直径(50μm涂布针：液滴点直径为75±2μm、100μm涂布针：液滴点直径为137±3μm、150μm涂布针：液滴点直径为219±5μm)。

(实验例3)

在涂布实验3中，使用将正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)以2×10⁷个细胞/mL的浓度分散于10%明胶PBS溶液而得的涂布液10。在涂布实验3中，使用微细涂布装置1，使前端直径(前端直径)为100μm、150μm、200μm的3种涂布针9在载玻片上点接触来涂布涂布液10。利用相位差显微镜观察在载玻片上涂布而形成的液滴点的形状。

图7是显示涂布实验3中的通过相位差显微镜观察到的液滴点的图像的图。图7中的(a)是显示使用前端直径为100μm的涂布针9在载玻片上涂布分散有NHDF的10%明胶PBS溶液而形成的液滴点的图像。图7中的(b)是显示使用前端直径为150μm的涂布针9在载玻片上涂布分散有NHDF的10%明胶PBS溶液而形成的液滴点的图像。图7中的(c)是显示使用前端直径为200μm的涂布针9在载玻片上涂布分散有NHDF的10%明胶PBS溶液而形成的液滴点的图像。

根据涂布实验3，在使用前端直径为100μm的涂布针9的情况下，在1个液滴点中确认到0～3个涂布细胞。在使用前端直径为150μm的涂布针9的情况下，在1个液滴点中确认到2～6个涂布细胞。另外，在使用前端直径为200μm的涂布针9形成的1个液滴点中确认到个数可达约10个的涂布细胞。因此，确认到：通过确定涂布针9的前端直径，可在1～10个左右的范围控制液滴点中的涂布细胞的个数。

(实验例4)

在涂布实验4中，更换上述的涂布实验3中的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)，使用肝癌细胞株(HepG2)进行同样的实验。在涂布实验4中，使用将HepG2以5×10⁷个细胞/mL的浓度分散于10%明胶PBS溶液而得的涂布液10。

图8是显示使用前端直径为100μm的涂布针9在载玻片上涂布分散有HepG2的10%明胶PBS溶液而形成的液滴点的图像。在涂布实验4中也确认到：在液滴点中存在规定量的细胞，不依赖于细胞的种类，可进行稳定的涂布。在以下说明的涂布实验5中，对涂布针9的前端直径与所形成的液滴点中所含的涂布细胞数的关联性进行验证。

(实验例5)

在涂布实验5中，使用将来自iPS细胞的心肌细胞(iPS-CM)以4×10⁷个细胞/mL的浓度分散于PBS溶液而得的涂布液10，使用前端直径分别为50μm、100μm、150μm、200μm、330μm的各涂布针9形成液滴点。在涂布实验5中，对涂布针9的前端直径与所形成的液滴点中所含的涂布细胞数的关联性进行验证。

在涂布实验5中，在载玻片上涂布1次上述的涂布液10，通过荧光显微镜(细胞使用在涂布前用荧光色素的DAPI进行了核染色的细胞)和相位差显微镜观察算出涂布后的细胞数。在该涂布实验5中，关于使用前端直径为50μm、100μm、150μm、200μm、330μm的各涂布针9形成的液滴点，对20点以上进行测量，求出其平均值。

图9是显示涂布实验5的实验结果的图。在图9中，纵轴表示涂布细胞数[细胞/spot]，横轴表示涂布针9的前端直径[μm]。如图9所示，在将iPS-CM以4×10⁷个细胞/mL的浓度分散于PBS溶液的情况下，使用前端直径为50μm的涂布针9进行涂布时，液滴点中平均存在1.1个涂布细胞。在使用前端直径为100μm的涂布针9得到的液滴点中平均存在4.0个涂布细胞，在使用前端直径为150μm的涂布针9得到的液滴点中平均存在4.5个涂布细胞，在使用前端直径为200μm的涂布针9得到的液滴点中平均存在19.1个涂布细胞，而且，在使用前端直径为330μm的涂布针9得到的液滴点中平均存在85.3个涂布细胞。需要说明的是，在图9中以误差棒表示各涂布针9的涂布细胞数的标准偏差(正方向)。

如上所述，确认到：使用的涂布针9的前端直径与所形成的液滴点中存在的涂布细胞的个数具有关联性，随着涂布针9的前端直径的变大，液滴点中存在的涂布细胞的个数增加。因此，可验证：通过确定涂布针9的前端直径，可将液滴点中的涂布细胞的个数控制在某种程度的范围内。

(实验例6)

在涂布实验6中，使用微细涂布装置1制造细胞集合体20。在涂布实验6中，使用将正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)以2×10⁷个细胞/mL的浓度分散于2.5%海藻酸钠PBS溶液而得的涂布液10。将该涂布液10填充至涂布单元6的涂布液容器8，利用微细涂布装置1进行细胞涂布动作。

在涂布实验6中，使用前端直径为100μm、且前端9a具有带台阶的突起9b的涂布针9(参照图3的(c))，在载玻片上连续地1600次涂布含有海藻酸钠的细胞分散液。此时，在每一次细胞涂布动作中使针尖上升0.5μm，从而制造了细胞集合体20。其结果，制造了直径为50μm、高度为500μm的细胞集合体20。图10是显示涂布实验6中制造的细胞集合体20的图像。

如上所述，可确认到：对于基板11中的要进行涂布的一定位置(一定点)，在每1个循环中使细胞涂布动作中的涂布工序时的涂布针9的前端9a的停止位置(折返位置)上升(例如0.5μm)，重复进行多个循环的细胞涂布动作，从而可制备所期望形状的细胞集合体20。

(实验例7)

在涂布实验7中，确认了使用微细涂布装置1进行涂布而形成的液滴点中的涂布细胞的存活率。在涂布实验7中，使用将正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)以8×10⁷个细胞/mL的浓度分散于PBS溶液而得的涂布液10。另外，在涂布实验7中，使用前端直径为330μm的涂布针9在载玻片上连续地40次涂布涂布液10，通过活细胞/死细胞(Live/Dead)荧光染色法(死细胞为红色染色)评价涂布后的细胞15的存活率。图11是显示涂布实验7中的活细胞/死细胞(Live/Dead)荧光染色图像的图。

在图11中，(a)显示涂布前的涂布液10中的细胞15的活细胞/死细胞(Live/Dead)荧光染色图像，(b)显示涂布后的液滴点中的细胞15的活细胞/死细胞(Live/Dead)荧光染色图像。需要说明的是，在涂布实验7中的活细胞/死细胞(Live/Dead)荧光染色图像中，该图像是活细胞为绿色、死细胞被染色成红色，在图11的显示活细胞/死细胞(Live/Dead)荧光染色图像的图中，活细胞用○表示，死细胞用●表示。

在涂布实验7中确认了细胞15的存活率，其结果是：涂布前的细胞存活率为96%，相对于此，在涂布后也显示高达91%的细胞存活率。根据该确认结果可明确：在使用了微细涂布装置1的细胞涂布动作中，几乎没有直接地对细胞15造成损伤。需要说明的是，虽然从涂布前的96%的细胞存活率轻微下降至涂布后的91%的细胞存活率，但该下降是随着时间推移而发生的通常的下降，属于其他要素。

(实验例8)

在涂布实验8中，使用微细涂布装置1在细胞盘上构建来自iPS细胞的心肌细胞(iPS-CM)的细胞组织，评价其细胞组织中的心肌组织体的搏动行为。

在涂布实验8中，使用将iPS-CM以4×10⁷个细胞/mL的浓度分散于20mg/mL的纤维蛋白原溶液而得的涂布液10 (第1涂布液)。在涂布实验8中，使用前端直径为330μm的涂布针9在单元盘上连续地涂布10次，之后浸在800单位/mL (8.3mg/mL)的凝血酶溶液(第2涂布液)中，从而通过凝胶化进行组织固定。纤维蛋白原通过凝血酶的作用而形成纤维蛋白(与血液凝固有关的蛋白)，通过利用其凝胶化反应将组织固定于基板。

之后，浸在培养基中培养6天，利用相位差显微镜观察经时性的搏动行为。其结果，刚刚涂布后形成直径为约300μm的心肌组织，即使在培养6天后也可确认到等间隔的心肌组织的结构。

图12是显示涂布实验8中制造的心肌组织的刚刚涂布后(培养0天)的状态的图像。图13是显示将图12所示的心肌组织培养了6天时的状态的图像。图14是显示培养了5天的心肌组织之1的放大图像。如图13和图14所示，确认到了心肌组织的结构，可确认可靠地构建了细胞组织。

在所制造的心肌组织中，心肌细胞从培养2天后开始搏动，培养6天后在6个样品数中每分钟观察到平均82次搏动，6个样品数中的标准偏差为15。

另外，通过分析用高速相机拍摄的搏动动画，得到了一定周期的收缩/舒张速度。图15是显示通过分析图14所示的培养了5天的心肌组织(细胞组织)中的搏动动画而得的收缩/舒张速度的图。在图15中，纵轴为心肌组织的收缩/舒张的移动速度[μm/秒]，横轴为时间[秒]。

如图15所示，在心肌组织(细胞组织)中显示一定的搏动，确认到一定周期的收缩/舒张速度。此时的搏动数为78次/分钟，平均收缩速度为8.7μm/s，平均舒张速度为4.6μm/s。

通过在96孔板等的各孔中制造上述涂布实验8中得到的心肌组织，可制造可使用机器人在无菌状态下进行自动评价的高流通量化的心毒性评价试剂盒。

对本发明中可使用的细胞没有特别限定，例如可使用成纤维细胞、血管内皮细胞、表皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、消化道细胞、神经细胞、肝细胞、肾细胞、胰细胞等各种初代细胞；ES细胞和iPS细胞等来自干细胞的分化细胞；以及各种癌细胞等。作为细胞，可使用未修饰的细胞；或者用蛋白、糖链、核酸等修饰的细胞，例如用纤连蛋白、明胶、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等已知的包被剂、包被方法包被的细胞。

需要说明的是，在含有细胞的溶液中，为了提供内包的细胞可稳定地粘附/生长的环境，可含有纤连蛋白、明胶、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、Matrigel等细胞外基质成分，成纤维细胞生长因子或来自血小板的生长因子等细胞生长因子，以及血管内皮细胞或淋巴管内皮细胞、各种干细胞等添加剂。另外，可包含纤维蛋白原或海藻酸、热响应性高分子等作为凝胶化剂。

如利用上述的实施方式1和各实验例进行说明的那样，本发明提供：制备细胞组织的新的制备方法。与使用现有的使用喷嘴的打印机进行制备的情况相比，其是使用涂布针涂布附着于其前端表面的溶液的构成，所以溶液的堵塞得到抑制，细胞组织的分辨率和形成速度提高，可用更少的样品量(试样)可靠地制备可靠性高的细胞组织。另外，与使用现有的打印机的情况相比，其是在对象物上涂布高粘度的细胞分散液以制备细胞组织，因此可抑制涂布后的细胞分散液中的蒸发，可维持高的细胞存活率。

在本发明中的微细涂布装置中，通过使附着于针(涂布针)的前端的极微量的涂布液与涂布对象物接触，能够以高的配置精度、例如±15μm以下、优选±3μm以下的配置精度涂布达数pL(皮升)的涂布量的液滴。另外，作为涂布液的粘度，可涂布达1×10⁵mPa·s的材料，可涂布高粘度的细胞分散液。这样，根据本发明，对于对象物(基板等)可在规定的位置精密涂布高粘度的细胞分散液，可制备具有任意的图案、且将细胞进行立体造形而得的细胞组织。其结果，所制备的细胞组织可用于药剂的药效、安全性的评价的筛选等药物开发研究和再生医学领域。

(实施方式2)

以下，对本发明所涉及的细胞组织的制备方法、和与通过该制备方法制备的细胞组织有关的实施方式2进行说明。需要说明的是，在实施方式2的说明中，对具有与上述实施方式1同样的作用、构成和功能的要素附上相同的参照符号，为了避免重复记载，有时省略说明。

如实施方式1中所说明的那样，作为涂布针9的前端9a的直径d，可采用50～330μm，如实验例2中所说明的那样，所形成的液滴点具有与涂布针10的直径大致成比例的液滴点直径。这样，通过采用实施方式1的细胞组织的制备方法，可形成极小的液滴点。为了对细胞组织有效地进行培养，通常使用具有多个孔(有底孔)的培养容器。在使用这样的培养容器的现有的细胞组织的制备方法中，在1个孔(有底孔)内制备1个细胞组织，进行评价。然而，通过使用实施方式1中的微细涂布装置1，可形成微细的液滴点，因此可在1个孔(有底孔)中制备多个细胞组织。

图16显示具有多个孔(例如96孔板)的培养容器中的1个孔w，是示意性地显示在直径为6.5mm的平底的孔w中制备细胞组织c的状态的图。图16的(a)显示在1个孔w的整体中制备细胞组织c的状态，是通过现有的细胞组织的制备方法制备的状态。图16的(b)显示采用实施方式1的细胞组织的制备方法在1个孔w中制备1个细胞组织c的状态。图16的(c)显示采用实施方式1的细胞组织的制备方法在1个孔w中制备多个(6个)细胞组织c的状态。如图16所示制备的各细胞组织c浸在培养基中进行培养。

如图16的(c)所示，通过采用实施方式1的细胞组织的制备方法，例如可在直径为6.5mm的平底的孔w中制备6个细胞组织c。在1个孔w中可制备的细胞组织的数目根据孔w的大小、细胞组织的大小而不同。

图17是示意性地显示在形状不同的孔w中制备细胞组织c的例子的平面图。在图17中，(a)显示在96孔板中、在直径为6.45mm的1个孔w中在圆周上可制备8个细胞组织c、在其中央可制备1个细胞组织c。图17的(a)所示的细胞组织c的直径为约1.0mm。图17的(b)是在384孔板中、在3.24mm×3.24mm的正方形的平底的孔w中制备4个直径为约1.0mm的细胞组织c的情况下的配置例。图17的(c)是在384孔板中、在3.24mm×3.24mm的正方形的平底的孔w中制备81 (9×9)个直径为约0.1mm的细胞组织c的情况下的配置例。在图17所示的各细胞组织c的配置例中，从孔w的内壁面到细胞组织c的距离为250μm。

如上所述，通过采用实施方式1的细胞组织的制备方法，可在小的孔w的内部制备多个细胞组织c。根据实施方式1的细胞组织的制备方法，能够以771.4个/cm²的配置密度制备细胞组织c。

如上所述，通过在1个小的孔w中制备多个细胞组织c，可利用1个孔w对多个样品数进行评价。另外，在图像和动画的分析中，通过一次摄影可拍摄多个样品，因此摄影时间缩短，进而分析时间也缩短。例如，在使用96孔w作为培养容器的情况下，在现有的细胞组织的制备方法中，在1个孔w内只能制备1个样品，但在实施方式1的细胞组织的制备方法中，例如在1个孔w内可制备9个直径为约1.0mm的细胞组织c的样品。因此，根据实施方式1的细胞组织的制备方法，可使用96孔w的培养容器制备864个 (96×9)细胞组织c的样品。另外，例如若针对1个孔w的动画分析需要20秒的摄影，则在现有的细胞组织的制备方法中，由于1个孔w中有1个样品，所以9个样品的动画摄影需要180秒。另一方面，在实施方式1的细胞组织的制备方法中，由于在1个孔w的内部制备了9个样品，所以动画摄影大幅缩短至20秒。

(实施方式3)

以下，参照附图对本发明所涉及的实施方式3的细胞组织的制备方法、和通过该制备方法制备的细胞组织进行说明。需要说明的是，在实施方式3的说明中，对具有与上述的实施方式1、2同样的作用、构成和功能的要素附上相同的参照符号，为了避免重复记载，有时省略说明。

在本发明所涉及的实施方式3的细胞组织的制备方法中，是也可使用在上述的实施方式1中详细说明的微细涂布装置1来涂布附着于涂布针9的前端9a的含有细胞的涂布液(第1涂布液)的构成。在上述的实施方式1中的实验例8中，使用微细涂布装置1涂布将来自iPS细胞的心肌细胞(iPS-CM)分散于纤维蛋白原溶液而得的涂布液10 (第1涂布液)，之后浸在凝血酶溶液(第2涂布液)中，从而通过凝胶化进行组织固定。

如上所述，通过使用涂布针9进行的接触涂布，使来自iPS细胞的心肌细胞分散于纤维蛋白原溶液进行涂布，之后浸在凝血酶溶液中，从而通过凝胶化进行组织固定。在该制备方法中，当使用纤维蛋白原作为涂布心肌细胞时的凝胶化剂时，使心肌细胞和纤维蛋白原分散于作为第1液的第1涂布液进行涂布，在作为第2液的第2涂布液中以包覆第1涂布液的方式添加凝血酶作为凝胶化引发剂，从而进行涂布动作。

即，上述方法包括以下的工序并实施细胞组织的制备方法：第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞(例如心肌细胞)和凝胶化剂(例如纤维蛋白原)的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含凝胶化引发剂(例如凝血酶)的第2涂布液，引发凝胶化反应。凝胶化在第1涂布液与第2涂布液的界面引发。需要说明的是，将该制备方法称为“实施方式1中的双液式的细胞组织制备方法”，将下述的实施方式3中的双液式的细胞组织制备方法称为“实施方式3中的双液式的细胞组织制备方法”。

在实施方式1中的双液式的细胞组织制备方法中，在执行涂布工序前，确认到在第1涂布液的内部的细胞(心肌细胞)和凝胶化剂(纤维蛋白原)的溶液中发生不希望的凝胶化的现象。因此，在涂布液容器内部凝胶化的心肌细胞残留在涂布液容器内部，有时会产生无法涂布涂布液容器内部的所有涂布液的情况。

实施方式3中的细胞组织的制备方法会防止在执行涂布工序前的涂布液容器内部发生凝胶化。在实施方式3的细胞组织的制备方法中，在形成细胞组织时也使用双液式的凝胶化溶液作为涂布液(以下，称为“实施方式3中的双液式的细胞组织制备方法”)。

在实施方式1中的双液式的细胞组织制备方法中，在包含细胞的第1溶液中包含凝胶化剂、在第2涂布溶液中包含凝胶化引发剂，相对于此，在实施方式3中的双液式的细胞组织的制备方法中，在含有细胞的第1溶液中包含凝胶化引发剂、在第2涂布溶液中包含凝胶化剂，这一点大为不同。除了这点以外，两者由共同的概念、要素构成。

在实施方式3中，涉及细胞组织的制备方法，该制备方法包括：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含凝胶化剂的第2涂布液，引发凝胶化反应。

另外，在实施方式3中，涉及细胞组织制备套件，该套件包括：第1容器，其包含含有细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及第2容器，其包含含有凝胶化剂的第2涂布液。

首先，对本发明所涉及的实施方式3的细胞组织的制备方法中的工序进行说明：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含凝胶化剂的第2涂布液，引发凝胶化反应。

第1涂布工序

对可适用本发明的方法的细胞没有特别限定，有来自iPS细胞的心肌细胞、正常人心脏成纤维细胞、正常人成纤维细胞、人血管内皮细胞、HePG2细胞等细胞。可混合2种以上进行使用。这些之中，本发明优选适用于来自iPS细胞的心肌细胞、正常人成纤维细胞、HepG2细胞、特别是来自iPS细胞的心肌细胞。在使用来自iPS细胞的心肌细胞的情况下，出于更接近于生物体的心脏的形态、通过由正常人心脏成纤维细胞产生的因子使来自iPS细胞的心肌细胞成熟化的理由，通常与正常人心脏成纤维细胞混合进行使用。作为细胞，可使用未修饰的细胞；或者用蛋白、糖链、核酸等修饰的细胞，例如通过纤连蛋白、明胶、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、Matrigel等已知的包被剂、包被方法包被的细胞。

作为第1涂布液中所含的凝胶化引发剂，可使用凝血酶、氯化钙、醇类(例如乙二醇、甘油等)。这些凝胶化引发剂通常根据第2涂布液中所含的凝胶化剂的种类分开使用。它们的分开使用为本领域技术人员所已知，只要以这样的已知的组合进行使用即可。例如，作为凝胶化引发剂与凝胶化剂的使用的组合(凝胶化引发剂：凝胶化剂)，可列举：凝血酶：纤维蛋白原(凝胶化引发剂：凝胶化剂)、氯化钙：海藻酸钠(凝胶化引发剂：凝胶化剂)、氯化钙：角叉菜胶(凝胶化引发剂：凝胶化剂)、醇类：罗望子胶(凝胶化引发剂：凝胶化剂)等的组合使用。

在使用来自iPS细胞的心肌细胞作为细胞的情况下，优选使用凝血酶：纤维蛋白原(凝胶化引发剂：凝胶化剂)的组合。

第1涂布液是上述细胞和凝胶化引发剂包含在水性溶液中而得的涂布液。

作为水性溶液，可使用水、各种生理盐水、例如磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水等。此外，还可使用用作细胞培养液的培养基、例如Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)等。这些水溶液通常根据细胞的种类分开使用。它们的分开使用为本领域技术人员所已知，可使用这样的已知的组合。例如，如果是来自iPS细胞的心肌细胞，则优选使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Dulbecco改良Eagle培养基、各公司专用培养基、特别是磷酸缓冲生理盐水。

对上述水性容器中所含的细胞的量没有特别限定，能够以1×10⁵个/mL～1×10⁹个/mL、优选1×10⁶个/mL～1×10⁸个/mL、更优选1×10⁷个/mL～1×10⁸个/mL左右的浓度含有。若过多，则难以调整溶液，若过少，则根据涂布量而不含细胞。

对凝胶化引发剂的含量没有特别限定，通常可考虑凝胶化的速度而适当设定其含量。若其量过少，则凝胶化的速度变慢，作为第1液的第1涂布液的保形性下降。例如，在使用凝血酶的情况下，其浓度可设为以1单位/mL～1000单位/mL、优选10单位/mL～1000单位/mL、更优选100单位/mL～800单位/mL左右的浓度含有。

在第1涂布液中，为了提供细胞可稳定地粘附/生长的环境，可包含纤连蛋白、明胶、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、Matrigel等细胞外基质成分，成纤维细胞生长因子或来自血小板的生长因子等细胞生长因子，以及血管内皮细胞或淋巴管内皮细胞、各种干细胞等添加剂。

在第1涂布液中，可进一步添加增稠剂作为添加剂。作为增稠剂，可使用增稠多糖类、例如透明质酸钠、海藻酸钠。

增稠剂是为了对第1涂布液赋予保形性而含有的，特别是增稠多糖类对制备保形性高的三维细胞组织有效。

在包含增稠剂的情况下，其量可考虑第1涂布液的保形性、使用的涂布装置的可能的粘度范围、成本、操作性等适当设定。例如，在使用实施方式1的微细涂布装置1的涂布方法中，可包含增稠剂使达到1mPa·s～1×10⁵mPa·s、优选3×10³mPa·s～1×10⁵mPa·s、更优选1×10⁴mPa·s～5×10⁴mPa·s的粘度。若其粘度过低，则第1涂布液的保形性下降。需要说明的是，第1涂布液的粘度采用通过旋转粘度法在25℃下测得的值。

细胞外基质是为了促进细胞的生长、促进细胞与细胞、或者细胞与基质的粘附而含有的。在包含细胞外基质的情况下，对其量没有特别限定。可根据想要制备的组织指定其种类、浓度。

在实施方式3中的细胞组织的制备方法的第1涂布工序中，在涂布对象物上涂布第1涂布液。对使用的涂布对象物没有特别限定，使用通常用于细胞生长的培养容器。作为本发明中使用的“同一培养容器”，有具有6～384个孔的孔板、圆形培养皿(Dish)、平皿(Schale)、微孔板(Microwell Plate) (注册商标、Thermo Fisher Scientific Inc.)等。这里使用的“培养容器”是底面由平面或曲面形成、且具有侧面的凹状容器。另外，作为“培养容器”，也可以是底面和侧面由连续的曲面形成的半球面。需要说明的是，“多孔培养容器”是具有多个凹状的容器(凹部：培养容器)的一体化的培养容器。

作为实施方式3中的细胞组织的制备方法中的涂布方法，并不特别限于微细涂布装置1，例如还可采用公知的生物打印技术、例如喷墨方式、分液器方式、激光辅助方式等。

在溶液的粘度高的情况下，可适合使用利用实施方式1中说明的微细涂布装置1进行的涂布针法。关于采用涂布针法进行溶液、液体的涂布的方法，除了使用实施方式1中说明的微细涂布装置1以外，例如还可使用专利文献10 (日本专利第4802027号公报说明书)和专利文献11 (国际公开第2019/088224号小册子)中所公开、记载的涂布装置。这些说明书、附图中所公开、记载的全部内容作为本申请说明书的记载内容的一部分而引用于此。

例如，使用实施方式1中说明的微细涂布装置1进行的涂布针法可使用宽范围的粘度的涂布液进行微细的涂布。在涂布动作时，使1根涂布针从形成于保持涂布液的涂布液容器的底部的贯穿孔突出。涂布针法是使附着于前端的涂布液与被涂布物接触来进行涂布。

第1涂布液的涂布方法使用实施方式1中说明的微细涂布装置1。如上所述，使用了微细涂布装置1的涂布方法通过使附着有极微量的涂布液的涂布针9的前端9a与对象物(基板等)接触，能够以高配置精度、例如±15μm以下、优选±3μm以下的配置精度涂布数pL (皮升)～数100μL (微升)的涂布量的液滴。另外，作为第1涂布液的粘度，可涂布达1×10⁵mPa·s的材料，可涂布高粘度的细胞分散液。这样，根据使用了微细涂布装置1的涂布方法，对于涂布对象物(基板等)可在规定的位置精密涂布高粘度的细胞分散液。特别是通过使用粘度为3×10³mPa·s左右以上的涂布液，可将涂布液立体地进行涂布、详细而言涂布成立体的圆顶状，在直到接下来的第2涂布工序期间可保持其立体形状。在本发明中，将该特性称为“保形性”。

第1涂布液的涂布量可根据所期望的量适当设定涂布方法的条件。在使用了微细涂布装置1的涂布方法中，可根据涂布针9的前端9a的直径、涂布次数等进行调整。

更具体而言，使用涂布针进行的涂布方法如下：

使用具备涂布单元的微细涂布装置，该涂布单元包含：涂布液容器，其具有贮存规定量的第1涂布液的涂布液积存处；以及

涂布针，其可贯穿贮存有上述第1涂布液的上述涂布液积存处，

包括以下工序来执行：

待机工序，将上述涂布针的前端浸在填充至上述涂布液积存处的上述第1涂布液中，

下降工序，上述涂布针的前端贯穿上述涂布液积存处，使附着有上述第1涂布液的上述涂布针的前端下降；

涂布工序，使附着有上述第1涂布液的上述涂布针的前端与涂布对象物接触，在上述涂布对象物上涂布上述第1涂布液，形成液滴点；以及

收纳工序，使上述涂布针的前端上升，将上述涂布针的前端收纳于上述涂布液积存处。

即使在采用涂布针法以外的生物打印技术的情况下，也可适当调整涂布条件进行涂布，使通过适当设定涂布条件得到与涂布针法同样的涂布物。

第2涂布工序

第2涂布工序中使用的第2涂布液是在水性溶液中包含有凝胶化剂的涂布液。

作为第2涂布液中所含的凝胶化剂，可使用纤维蛋白原、海藻酸钠等。这些凝胶化剂通常根据第1涂布液中所含的凝胶化引发剂的种类分开使用。它们的分开使用、组合已在上述的第1涂布液中进行了说明。

作为第2涂布液中所含的凝胶化剂，可使用无凝胶化引发剂而发生固化的凝胶化剂。在使用这样的凝胶化剂的情况下，第1涂布液中无需包含凝胶化引发剂。作为这样的凝胶化剂，可列举：胶原蛋白、明胶、琼脂(琼脂糖)等、以及明胶-甲基丙烯酰胺、明胶-丙烯酰胺等光交联性明胶水凝胶化剂等。例如，胶原蛋白通过加热进行凝胶化，明胶通过冷却进行凝胶化。在使用含有这样的凝胶化剂的第2涂布液的情况下，在涂布第2涂布液后，在包含胶原蛋白的情况下需要进行加热操作、在包含明胶的情况下需要进行冷却操作，使发生凝胶化反应。明胶-甲基丙烯酰胺通过照射紫外光(波长365μm)进行凝胶化。明胶-丙烯酰胺通过照射紫外光(波长365μm)进行凝胶化。在使用含有这样的光交联性明胶水凝胶化剂的第2涂布液的情况下，在涂布第2涂布液后，需要进行光(紫外线、可见光等)照射操作使发生凝胶化反应。

第2涂布液中所含的水性溶液可使用上述的第1涂布液中使用的同样的水性溶液，可以是第1涂布液中使用的相同的水性溶液，也可以是不同种类的水性溶液。

对上述的水性溶液中所含的凝胶化剂的量没有特别限定，可考虑凝胶化的速度、凝胶化剂的浓度、凝胶的硬度等适当设定其含量。若过少，则凝胶化的速度变慢。例如，在使用纤维蛋白原的情况下，其浓度可达到0.1mg/mL～100mg/mL、优选1mg/mL～80mg/mL、更优选1mg/mL～30mg/mL的浓度。

第2涂布液中可包含增稠剂等成分(以及添加剂)。增稠剂是从涂布完的第1涂布液的保形的观点考虑而包含的，可使用透明质酸钠、海藻酸钠等。在包含增稠剂的情况下，其量可考虑涂布完的第1涂布液的保形性、使用的微细涂布装置1的可能的粘度范围、成本、操作性等适当设定。作为第2涂布液，例如在使用涂布针9的涂布方法中，可包含增稠剂使达到5×10²mPa·s～1×10⁵mPa·s、优选5×10²mPa·s～1×10⁴mPa·s、更优选5×10²mPa·s～5×10⁴mPa·s的粘度。若其量少、粘度过低，则涂布完的第1涂布液的保形性无法保持。需要说明的是，第2涂布液的粘度采用通过旋转粘度法在25℃下测得的值。

第2涂布液是在第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布第2涂布液。“重叠”是指以覆盖第1涂布工序中涂布的第1溶液的涂布对象物(基板等)的方式进行涂布，包含以下意义：也覆盖第1溶液的与涂布对象物接触的面以外的面。

如上所述，通过在第1涂布液上重叠涂布第2涂布液，所涂布的第1溶液与第2溶液的界面发生凝胶化。此时，存在于该凝胶化的界面下的第1涂布液的内部并未凝胶化，保持第1溶液的溶液状态(粘度)。因此，第1涂布液的内部的细胞因重力而沉降沉淀，在第1涂布液的下部聚集、堆积、层叠。

从第1涂布工序结束到第2涂布工序开始的时间间隔希望尽可能短。若其时间间隔过长，则第1涂布液会发生干燥，而产生所含的细胞死亡的问题。

关于第2涂布液的涂布量，考虑第1涂布液的涂布量、凝胶化的速度等适当设定，以使第2涂布液被重叠涂布于第1涂布液。

作为第2涂布液的涂布方法，可以是使用了实施方式1的微细涂布装置1的涂布方法，没有特别限定，例如可采用：通过手工操作进行的涂布、例如使用注射器、滴管等进行的液滴涂布、生物打印技术、例如喷墨法、分液器法等。

在涂布第2涂布液后，仅第1涂布液与第2涂布液的接触面(界面)发生凝胶化，在存在于已凝胶化的界面下的第1涂布液的内部，固化引发剂以液体形式存在，保持第1涂布液的溶液状态(粘度)，随着时间的推移，细胞沉降沉淀，在第1涂布液的下部聚集、堆积、层叠，从而无需经过复杂的制备工序，即可制备呈高密度、且保形性高的三维细胞组织。

刚刚涂布后的细胞组织的外周部即第1涂布液与第2涂布液的接触面发生凝胶化，由于第1涂布液的内部以液体状态保持，所以还可抑制细胞组织的干燥。

细胞的培养是将第1涂布工序和第2涂布工序中涂布的涂布液浸在培养基中来进行。此时，可与涂布对象物(基板)一起浸在培养基中。作为培养基，可根据其与细胞的关系使用通常使用的培养基，例如，在细胞中包含来自iPS细胞的心肌细胞的情况下，使用Dulbecco改良Eagle培养基、各公司市售专用培养基。

图18是示意性地显示实施方式3中实施的细胞组织的制备方法的概略的图，用示意图表示涂布工序后的细胞组织的三维集聚的形态。

准备悬浮含有细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液，将该第1涂布液填充至涂布液容器。使用涂布针9在涂布对象上涂布第1涂布液(第1液)。在涂布该第1涂布液的第1涂布工序中，执行所期望的次数的涂布动作。接下来，涂布包含凝胶化剂的第2涂布液(第2液)使覆盖第1涂布工序中涂布的第1涂布液(第1液)。第1涂布液与第2涂布液的接触面及其外周区域发生凝胶化后添加培养基。由于在第1液的第1涂布液的内部，保持流动性的液体状态得到保持而形成圆顶结构，所以随着时间的推移，细胞沉降沉淀，在第1涂布液的下部聚集、堆积、层叠。其结果，可制备高密度的三维细胞组织。

本发明中，“高密度”是指在细胞间不存在纤维蛋白凝胶等、且细胞集聚的状态，作为细胞密度若用数值表示，则是指具有1×10⁸个/mL～1×10⁹个/mL左右的密度的情况。

作为本发明所涉及的实施方式3中的第2方面，涉及细胞组织制备套件，该套件至少包含：第1容器，其包含含有细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及第2容器，其包含含有凝胶化剂的第2涂布液。

该细胞组织制备套件适合用于实施方式3中的细胞组织的制备方法。细胞组织制备套件中规定的第1涂布液和第2涂布液与实施方式3的细胞组织的制备方法中说明的第1涂布液和第2涂布液为相同含义。

根据实施方式3中的细胞组织的制备方法，在使用了微细涂布装置1的涂布工序中，在执行涂布工序前的涂布液容器的内部不会发生凝胶化等。另外，根据实施方式3中的细胞组织的制备方法，在维持细胞存活率的基础上，可制备高密度且保形性高的细胞组织。

以下，利用具体的实施例，对实施方式3中的细胞组织的制备方法进行说明，但本发明不应被解释为限定于这些实施例，接触到本发明的概念的本领域技术人员想到并认为可实施的所有技术思想、其具体方案都应理解为包含在本发明中。

实施例

实施例1

(1) 涂布方法

(1-1) 第1涂布液(第1液)的涂布动作

实施例1中使用的第1涂布液的微细涂布装置100见图19。图19是显示微细涂布装置100的斜视图。实施例1中使用的微细涂布装置100的构成为：与实施方式1中说明的微细涂布装置1执行实质上相同的涂布方法，在涂布对象物上接触涂布附着于涂布针9的前端9a的第1涂布液。图20是显示实施例1中使用的微细涂布装置100中的涂布装置主体101的斜视图。

在由XYZ载台105支撑的涂布装置主体101中，通过凸轮104的动作，可动部105沿Z方向进行往返动作，可贯穿涂布液容器8地被支撑的涂布针9沿同样的Z方向进行往返动作。通过该往返动作，附着于涂布针9的前端9a的第1涂布液被接触涂布于涂布对象物。

显示/控制部103由监视器、控制用计算机、操作面板构成。由操作面板输入涂布速度指令值，保存在控制用计算机的存储装置中。在涂布动作时，由存储装置读取涂布速度指令值，发送给涂布装置主体101的控制程序。控制程序根据涂布速度指令值确定涂布装置主体101中的作为驱动机构的发动机的旋转速度，使涂布针9以规定的速度往返动作，而执行涂布动作。在控制用计算机与上位的控制系统(没有图示)通信的情况下，可由上位的控制系统接收涂布速度指令值。另外，可将与第1涂布液的种类对应的参数保存在存储部，根据所指定的第1涂布液的种类和涂布量或涂布尺寸算出涂布速度指令值。

如实施方式1的微细涂布装置1中所说明的那样，涂布针9的前端9a从设在涂布液容器8的底面的下部孔14b突出，进行涂布动作(参照图4)。当涂布针9的前端9a从涂布液容器8的下部孔14b突出时，第1涂布液附着于涂布针9的前端9a，从涂布液容器8突出。此时，由于表面张力将第1涂布液向上方提升，在涂布针9的前端9a残留大致一定量的第1涂布液。通过将残留于涂布针9的前端9a的第1涂布液转印到涂布对象上，可实现具重现性的涂布动作。

(1-2) 第2溶液的涂布动作

第2溶液的涂布动作是使用微量移液管通过手动滴加来进行。

(2) 涂布条件细胞(cells)

・涂布针直径：

1000μm；

・涂布针形状： 笔直；

・涂布次数： 10次；

・第1涂布液的涂布量： 数100nL/10次；

・第2涂布液的涂布量： 15μL/1次；

・涂布液容器内的待机时间： 1020ms；

・涂布针降下后的待机时间： 0ms；

・上升时间： 5μm/1次；

・直至添加第2涂布液的所需时间： 5s以内；

・直至添加培养基的所需时间： 制备4个后汇总，使用微量移液管进行手动添加。

(3) 涂布液

(3-1) 第1涂布液(第1液)

・来自iPS细胞的心肌细胞： 人心脏成纤维细胞=3：1；

・细胞数： 8×10⁷个细胞/mL；

・透明质酸钠： 13mg/mL；

・凝血酶： 800单位/mL；

・PBS

・粘度： 1.5×10⁴mPa·s。

(3-2) 第2涂布液(第2液)

・添加量： 15μL；

・透明质酸钠： 0.5 mg/mL；

・纤维蛋白原： 10 mg/mL；

・PBS

・粘度： 1×10³mPa·s。

(4) 结果考察

(4-1) 制备方法

在上述涂布条件下重复多次进行第1涂布液的涂布动作，确认了可无残留地涂布作为第1液的第1涂布液的涂布液容器内的心肌细胞和凝胶化引发剂的凝血酶。涂布结束后，当肉眼观察涂布液容器的内部时，没有确认到第1涂布液的凝胶的发生。添加作为第2液的包含凝胶化剂即纤维蛋白原的第2涂布液以覆盖第1液的第1涂布液。

在上述条件下对96孔板内的40个孔进行涂布，从孔板上方拍摄涂布的结果的涂布状态，所得照片见图21 (2倍的倍率)。如图21所示，即使多次涂布，细胞数也大致没有偏差。

(4-2) 组织观察

(4-2-1) 密度

在涂布1小时后，使用相位差显微镜对所得的细胞组织进行显微镜观察。该显微镜观察是从上方观察涂布液(在图18的右下描绘的记作凝胶圆顶的状态)。其照片见图22。

如由图22所判明：在细胞与细胞之间几乎不存在细胞间基质，可制备高密度的三维细胞组织。密度为3.5×10⁸个/mL。

需要说明的是，培养是在温度37℃、5% CO₂的环境下进行7天。

(4-2-2) 厚度

在培养后，通过对细胞核和细胞质进行苏木精-伊红(HE)染色，测定所得的细胞组织的厚度。苏木精-伊红(HE)染色测定结果见图23。通过图23确认：该组织的厚度为50μm左右。

(4-2-3) 细胞组织

进行细胞核、肌动蛋白、肌钙蛋白染色。

其荧光染色的结果见图24。

该照片原本是彩色照片，细胞核用蓝色投影，肌动蛋白用红色投影，心肌肌钙蛋白T用绿色投影。由图24确认了：心肌细胞特征性的心肌肌钙蛋白T的横纹结构的表达。另外，搏动数为与成人的心脏接近的50～60搏动/分钟。

(4-3) 考察

通过如下的涂布方法、即多次涂布作为第1液的分散有心肌细胞和凝胶化引发剂的凝血酶的第1涂布液、并添加作为第2液的包含作为凝胶化剂的纤维蛋白原的第2涂布液以覆盖第1液的第1涂布液，无需经过复杂的制备工序，即可维持细胞存活率、并简易地制备高密度且保形性高的三维细胞组织。

比较例1

(1) 使用实施例1中使用的相同的微细涂布装置100，在下述涂布条件下来涂布涂布液。

在比较例中，第1溶液中加入有凝胶化剂(纤维蛋白原)、第2溶液中加入有凝胶化引发剂(凝血酶)，这一点与实施例1大不相同。

(2) 涂布条件

・涂布针直径：

1000μm；

・涂布针形状： 笔直；

・涂布次数： 10次；

・第1涂布液的涂布量： 数nL/10次；

・第2涂布液的涂布量： 15μL/1次；

・涂布液容器内的待机时间： 1020ms；

・涂布针降下后的待机时间： 0ms；

・上升时间： 5μm/1次；

・直至添加第2涂布液的所需时间： 5s以内；

・直至添加培养基的所需时间： 制备4个后汇总，使用微量移液管进行手动添加。

(3) 涂布液

(3-1) 第1涂布液(第1液)

・来自iPS细胞的心肌细胞： 人心脏成纤维细胞=3：1；

・细胞数： 8×10⁷个细胞/mL；

・透明质酸钠： 13mg/mL；

・纤维蛋白原： 10mg/mL；

・PBS

・粘度： 1.5×10⁴mPa·s。

(3-2) 第2涂布液(第2液)

・添加量 15μL；

・透明质酸钠 0.5mg/mL；

・凝血酶： 800单位/mL；

・PBS

・粘度： 1×10³mPa·s。

(4) 结果考察

(4-1) 组织观察

(4-1-1) 密度

使用相位差显微镜对刚刚涂布后得到的细胞组织进行显微镜观察。其照片见图26。

在图26中，可知在近似球形的细胞与细胞之间存在细胞间基质。在刚刚涂布后的细胞沉淀前的状态下，与图22相比，可知在图26中细胞密度低。认为其原因在于：通过在第1液中混合凝胶化剂，细胞在稀疏的状态下被固定化，不会发生沉淀。

(4-2) 制备方法

在使心肌细胞和纤维蛋白原分散于作为第1液的第1涂布液的情况下，经过15分钟后，在涂布液容器内确认到包埋有心肌细胞的凝胶状物质(图25)。

图25的(a)显示可贯穿地被支撑的具体的涂布针9和涂布液容器8，图25的(b)显示形成于涂布液容器8的下部孔14b的周围的包埋有细胞的原纤维凝胶。图25的(c)显示从涂布液容器8中取出的包埋有细胞的原纤维凝胶。图25的(d)是图25的(c)的放大图。

在本比较例的制备方法中，细胞残留在涂布液容器内，在第1涂布液内产生了细胞数的偏差。

(4-3) 考察

在涂布作为第1液的分散有心肌细胞和纤维蛋白原的第1涂布液、并涂布作为第2液的以覆盖第1液的涂布液的方式包含作为凝胶化引发剂的凝血酶的第2涂布液的本比较例中，在包埋心肌细胞的状态下纤维蛋白原发生凝胶化，因此心肌细胞在凝胶内稀疏地分散，产生了维持细胞存活率并简易地制备高密度且保形性高的三维心肌细胞组织变得困难的不良情形。

另外，若重复涂布在第1液中分散有心肌细胞和纤维蛋白原的第1涂布液、或者在涂布液容器内长时间保持第1涂布液，则在涂布液容器内产生第1涂布液的凝胶化，因此产生了如下的不良情形：在涂布液容器内部凝胶化的心肌细胞块有时会残留在涂布液容器内而无法涂布。

由以上公开事项，作为本发明所涉及的实施方式3中的第1方面的更具体的方案，例如提供下述方案。

(1) 细胞组织的制备方法，其特征在于，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布第2涂布液。

(2) 上述(1)所述的细胞组织的制备方法，其中，第2涂布工序包括：边维持第1溶液的涂布液的流动状态，边使第1涂布液与第2涂布液的界面发生凝胶化。

(3) 上述(1)或上述(2)所述的细胞组织的制备方法，其中，第1涂布液含有细胞和凝胶化引发剂。

(4) 上述(1)～上述(3)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，第2涂布液包含凝胶化剂。

(5) 细胞组织的制备方法，其特征在于，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含凝胶化剂的第2涂布液，在第1涂布液与第2涂布液的界面引发凝胶化反应。

(6) 上述(1)～上述(5)中任一项所述的细胞组织的制备方法，该制备方法包括以下工序：将涂布有第1涂布液和第2涂布液的涂布对象物浸在培养基中，并培养细胞。

(7) 上述(1)～上述(6)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，第1涂布液包含增稠多糖类。

(8) 上述(1)～上述(7)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，第2涂布液包含增稠多糖类。

(9) 上述(3)～上述(8)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，凝胶化引发剂为凝血酶。

(10) 上述(4)～上述(9)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，凝胶化剂为纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶或它们的2种以上的混合物。

(11) 上述(7)～上述(10)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，增稠多糖类为透明质酸钠、海藻酸钠或它们的混合物。

(12) 上述(3)～上述(11)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，细胞为心肌细胞。

另外，作为本发明所涉及的实施方式3中的第2方面的更具体的方案，例如提供下述方案。

(13) 细胞组织形成套件，该套件至少包括：第1容器，其含有包含细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及第2容器，其含有包含凝胶化剂的第2涂布液。

(14) 上述(13)所述的细胞组织形成套件，其中，第1涂布液包含增稠多糖类。

(15) 上述(13)或上述(14)所述的细胞组织形成套件，其中，第2涂布液包含增稠多糖类。

(16) 上述(13)～上述(15)中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，凝胶化引发剂为凝血酶。

(17) 上述(13)～上述(16)中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，凝胶化剂为纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶或它们的2种以上的混合物。

(18) 上述(14)～上述(17)中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，增稠多糖类为透明质酸钠、海藻酸钠或它们的混合物。

(19) 上述(13)～上述(18)中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，细胞为心肌细胞。

(20) 细胞组织，该细胞组织是通过上述(1)～上述(12)中任一项所述的细胞组织的制备方法制备的。

(21) 上述(1)～上述(12)中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，利用基于涂布针的接触涂布进行第1涂布工序。

(实施方式4)

以下，对本发明所涉及的实施方式4的细胞组织的制备方法、和通过该制备方法制备的细胞组织进行说明。需要说明的是，在实施方式4的说明中，对具有与上述的实施方式1、2、3同样的作用、构成和功能的要素附上相同的参照符号，为了避免重复记载，有时省略说明。

在本发明所涉及的实施方式4的细胞组织的制备方法中，利用在上述的实施方式1和3中详细说明的涂布方法，在涂布对象物上涂布附着于涂布针9的前端9a的包含细胞的涂布液(第1涂布液)。其构成为：涂布第1涂布液后，在第1涂布液上以重叠的方式涂布第2涂布液。对第2涂布液的涂布方法没有特别限定，例如可采用：通过手工操作进行的涂布、例如使用注射器、滴管等进行的液滴涂布、生物打印技术、例如喷墨法、分液器法等。

在实施方式4的细胞组织的制备方法中，通过采用上述的实施方式3中说明的涂布方法，可形成微细的液滴点，因此在作为小的培养容器的1个孔(有底孔)中制备多个细胞组织(参照图16的(c))。

实施方式4的细胞组织的制备方法与上述的实施方式3的细胞组织的制备方法中的工序相同。即，如图18的示意图所示，实施方式4的细胞组织的制备方法是利用涂布针9在涂布对象上涂布第1涂布液(第1液)。在涂布该第1涂布液的第1涂布工序中，执行所期望的次数的涂布动作。接下来，包含凝胶化剂的第2涂布液(第2液)以覆盖第1涂布工序中涂布的第1涂布液(第1液)的方式进行涂布。在第1涂布液与第2涂布液的接触面及其外周区域发生凝胶化后，添加作为第3涂布液(第3液)的培养基。在第1液的第1涂布液的内部，保持流动性的液体状态得到保持而形成圆顶结构，因此随着时间的推移细胞沉降沉淀，在第1涂布液的下部聚集、堆积、层叠。其结果，可制备高密度的三维细胞组织。在图18中的右下所示的图中，示意性地显示在凝胶圆顶中细胞沉淀的状态。

图27是示意性地显示实施方式4的细胞组织的制备方法中的各工序的图。图27的(a)是涂布针9被浸在涂布液容器8中所填充的第1涂布液(第1液)30的内部的状态(涂布针浸渍工序)。图27的(b)显示利用涂布针9涂布第1涂布液30的第1涂布工序A。在第1涂布工序A中，对涂布对象仅涂布所期望的次数的第1涂布液30。图27的(c)显示在第1涂布工序A中涂布的第1涂布液30上以重叠覆盖的方式涂布第2涂布液40的第2涂布工序B。在实施方式4中，第2涂布工序B是通过使用微量移液管110进行的涂布动作来执行。接下来，以第2涂布液40的整体浸渍的方式涂布(添加)第3涂布液50，形成培养基(培养基形成工序C)。图27的(d)显示通过培养基形成工序C使以覆盖基板上的第1涂布液30的方式重叠的第2涂布液40浸在培养基(50)中的状态。

如上所述，在实施方式4的细胞组织的制备方法中，与上述的实施方式3的细胞组织的制备方法同样地具有以下工序：第1涂布工序A，在涂布对象物上涂布包含细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液30；以及第2涂布工序B，对于第1涂布工序A中涂布的第1涂布液30以覆盖的方式重叠涂布包含凝胶化剂的第2涂布液40，引发凝胶化反应。之后，以重叠成覆盖第1涂布液30的第2涂布液40被浸渍的方式形成培养基(培养基形成工序C)。

实施方式4的细胞组织的制备方法例如是在基板上的多个涂布对象位置的各个位置有效地制备细胞组织。作为多个涂布对象位置，可以是培养容器的多个孔的各个位置，或者可以在1个孔中具有多个涂布对象位置以在1个孔中制备多个细胞组织(参照图16的(c))。

在实施方式4的细胞组织的制备方法中，对多个涂布对象位置中的第1涂布对象位置执行图27的(b)所示的第1涂布工序A，接下来，执行图27的(c)所示的第2涂布工序B。接下来，移动位置，对第2涂布对象位置执行第1涂布工序A，接下来执行第2涂布工序B。这样，对于多个涂布对象位置分别依次执行第1涂布工序A和第2涂布工序B。对所有的涂布对象位置执行第1涂布工序A和第2涂布工序B后，对各涂布对象位置执行培养基形成工序C。在该培养基形成工序C中，在各孔(培养容器)中形成培养基。

实施方式4的细胞组织的制备方法中的第1涂布工序A和第2涂布工序B采用上述的实施例1中说明的涂布方法。第1涂布工序A中的第1涂布液30的涂布动作使用微细涂布装置100。第2涂布工序B中的第2涂布液40的涂布动作是通过使用微量移液管进行手动滴加来进行。

(1) 第1涂布液(第1液) 30如下。

・来自iPS细胞的心肌细胞：人心脏成纤维细胞=3：1；

・细胞数： 8×10⁷个细胞/mL；

・透明质酸钠： 13mg/mL；

・凝血酶： 800单位/mL；

・PBS

・粘度： 1.5×10⁴mPa·s；

・涂布直径： 约1.0mm (利用涂布针进行的接触涂布)。

(2) 第2涂布液(第2液) 40

・添加量： 15μL；

・透明质酸钠： 0.5mg/mL；

・纤维蛋白原： 10mg/mL；

・PBS

・粘度： 1×10³mPa·s；

・使用微量移液管进行手动涂布(添加)；

・涂布第1涂布液30之后，在5秒(sec)以内添加。

(3) 培养基(第3液) 50

・在针对多个涂布对象位置的第1涂布工序A和第2涂布工序B的涂布结束后，使用微量移液管对培养容器的整体进行手动添加。

图28是显示实施方式4的细胞组织的制备方法中的第1涂布工序A、第2涂布工序B、和培养基形成工序C的具体的涂布时间、和工序间的间隔时间的一个例子的时间图。如图28所示，对1个涂布对象位置执行第1涂布工序A 4秒(sec)、执行第2涂布工序B 0.5秒(sec)。在第1涂布工序A中执行10次涂布动作。在第2涂布工序B中，使用微量移液管手动添加第2涂布液40。

如图28的时间图所示，最初对各涂布对象位置执行第1涂布工序A和第2涂布工序B，之后对各涂布对象位置执行培养基形成工序C (1秒(sec))。需要说明的是，执行第1涂布工序A、第2涂布工序B和培养基形成工序C的各工序间的间隔时间均为1秒(sec)。这些工序的涂布时间和间隔时间根据第1涂布液30和第2涂布液的组成内容、涂布量、和制备的细胞组织的数量等涂布条件而适当变更。

在实施方式4的细胞组织的制备方法中，在上述的实施方式3中，如图18的示意图所示，将细胞悬浮在第1涂布液30中，将其第1涂布液30填充至涂布液容器8。将第1涂布液30填充至涂布液容器8后，利用涂布针9在涂布对象上涂布包含细胞的第1涂布液30。接下来，添加第2涂布液40以覆盖第1涂布液30。其结果，从第1涂布液30与第2涂布液40的接触面到外周发生凝胶化。在如此地凝胶化后添加培养基。

如图18的右下所示，在培养基中的涂布液内部形成第1涂布液30仍保持为液体的圆顶结构。因此，在第1涂布液30的内部，随着时间的推移细胞沉淀。其结果，可制备高密度的三维细胞组织。

另外，刚刚涂布后的细胞组织的外周部即纤维蛋白原与凝血酶的接触面发生凝胶化，其内部保持液体状态，因此成为还可抑制细胞组织的干燥的构成。

图29是显示将心肌细胞和凝血酶分散于第1涂布液30的情况下的三维细胞组织的图像的照片。图29所示的状态是细胞还未沉淀的状态，由图29所示的状态可知：在细胞与细胞之间存在间隙。测定图29所示的细胞组织的厚度，结果确认到：具有50μm左右的厚度，并且层叠至高密度。图30是显示所制备的细胞组织的基于荧光色的厚度测定结果的图像的照片。而且，细胞核、肌动蛋白、肌钙蛋白染色的结果，确认到细胞存活，确认到心肌细胞特征性的肌动蛋白和肌钙蛋白的表达。图31是显示所制备的细胞组织的基于荧光染色的观察结果的图像的照片。在图31中，近似圆形为细胞核60，黑色线性蛋白为肌动蛋白70，白色线性蛋白为肌钙蛋白80。

需要说明的是，可采用细胞层叠法或细胞集聚法：即通过在悬浮于第1涂布液30的细胞的膜表面包被作为细胞粘附因子的蛋白，促进细胞彼此的粘附，构建具有高的细胞密度的三维结构。

[针对多孔培养容器的涂布动作]

如上所述，通过对具有多个孔的多孔培养容器的各孔进行第1涂布工序A、第2涂布工序B和培养基形成工序C，可抑制因干燥引起的细胞死亡，以高速、高精度且高的形状稳定性制备多个细胞组织。即，可减少对于第1涂布工序A的初期阶段涂布的第1涂布液30的等待时间以抑制细胞死亡，同时更换用于各涂布液的涂布动作的涂布机构、或降低载置有培养容器的载台的移动频率，可抑制工序整体的所需时间变长，这样，通过进行实施方式4的细胞组织的制备方法，可在多孔培养容器中制备多个三维细胞组织。

需要说明的是，将混合有凝胶化引发剂和细胞的第1涂布液30与作为凝胶化剂的第2涂布液40进行混合来制备包埋于凝胶的细胞组织时，需要约10秒～几分钟左右的凝胶化时间。通过将该凝胶化时间和直至涂布(添加)用于形成培养基的第3涂布液的等待时间整合到相同的工序中，不仅可抑制细胞死亡和所需时间，还可在规定的涂布位置制备形状稳定的包埋于凝胶的细胞组织。

在96孔板等多孔培养容器内制备细胞组织的情况下，按照图28所示的时间图进行涂布动作。在该涂布动作中，涂布第2涂布液40之后，在涂布第3涂布液(培养基) 50之前发生等待时间。然而，由于覆盖纤维蛋白原与凝血酶的接触面附近的外周的纤维蛋白原发生凝胶化，在第1涂布液30的内部凝血酶以液体形式存在，在该等待时间期间细胞沉淀，从而细胞层叠，可制备高密度的三维细胞组织。而且，通过涂布作为第3涂布液的培养基，可长期培养三维细胞组织，而不会发生细胞死亡。

关于第1涂布液30的涂布动作(第1涂布工序A)和第2涂布液40的涂布动作(第2涂布工序B)的重复次数、即涂布第3涂布液50 (培养基形成工序C)之前的第1涂布工序A和第2涂布工序B的重复次数，可设定4次、6次、8次、12次、24次、36次、48次、96次、384次等次数。该重复次数可根据第1涂布液30和第2涂布液40的涂布量、纤维蛋白原和凝血酶等凝胶化剂的凝胶化时间等各种条件来设定。

需要说明的是，在图28所示的时间图中，以在第1涂布工序A中进行多次的第1涂布液30的涂布动作、在第2涂布工序B中进行1次的第2涂布液40的涂布动作的构成进行说明，但本发明并不限于这样的构成，各涂布工序中的涂布动作的次数可适当设定。例如，在第1涂布工序A和第2涂布工序B中每1次交替进行涂布动作，可在多个涂布对象位置连续地进行涂布。另外，在各涂布工序中，可分别多次进行第1涂布液30或第2涂布液40的涂布动作。这样，在进行多次的涂布动作的情况下，涂布对象位置的涂布液的涂布量增加。特别是，关于悬浮有细胞的第1涂布液30，通过多次进行涂布动作，所涂布的第1涂布液30的内部的细胞数增加，细胞的层叠厚度增加。

需要说明的是，在实施方式4的细胞组织的制备方法中，虽然在第1涂布液30和第2涂布液40中混合有作为增稠剂的透明质酸钠，但也可使用海藻酸钠等其他的增稠多糖类。增稠剂对提高涂布液涂布后的保形性有效。即，增稠剂具有抑制涂布液在涂布后流出而形状崩塌的效果。特别是，透明质酸钠的粘附性高、与培养容器或细胞良好地粘附，最适合提高涂布液的保形性。而且，透明质酸钠来自生物体，还具有细胞生长的适合性高的优点。

在实施方式4的细胞组织的制备方法中，作为第1涂布液(包含凝胶化引发剂) 30和第2涂布液(包含凝胶化剂) 40，除了凝血酶与纤维蛋白原的组合以外，还可使用氯化钙与海藻酸钠、氯化钙与角叉菜胶、醇类与罗望子胶等。

另外，在实施方式4的细胞组织的制备方法中，对来自iPS细胞的心肌细胞和人心脏成纤维细胞进行了显示，但对于正常人成纤维细胞、人血管内皮细胞、HePG2细胞等细胞、或者它们的2种以上混合的细胞，也能以高速、高精度且高形状稳定性制备抑制了因干燥引起的细胞死亡的细胞组织。

需要说明的是，在实施方式4的细胞组织的制备方法中，由于第1涂布液30的涂布动作是使用涂布针9通过接触涂布来执行，所以不必担心在使用喷墨装置或分液器装置制备细胞组织时有可能产生的喷嘴堵塞，而且可与宽范围的液体对应，并且可进行微细涂布。另外，关于第2涂布液40和第3涂布液(培养基) 50的涂布，使用喷墨装置或分液器装置来执行。喷墨装置可进行微细涂布，高速性优异。分液器装置与喷墨相比，可与更宽范围的液体对应，适合于量较多的涂布。

另外，在实施方式4的细胞组织的制备方法中，虽然显示了在第1涂布液30中包含细胞和凝胶化引发剂、在第2涂布液40中包含凝胶化剂的例子，但除心肌细胞以外，也可以是在第1涂布液30中包含细胞和凝胶化剂、在第2涂布液40中包含凝胶化引发剂的组合。这种情况下，在短时间内形成包埋有细胞的凝胶，因此可制备形状稳定性高、更符合目标形状、特别是目标平面形状的细胞组织。

[对于1个孔(培养容器)的多个细胞组织的制备]

还可对1个孔(培养容器)执行实施方式4的细胞组织的制备方法中的第1涂布液30的涂布动作(第1涂布工序A)、第2涂布液40的涂布动作(第2涂布工序B)、和第3涂布液50的涂布动作(培养基形成工序C)来制备多个细胞组织。通过对各孔(培养容器)内的多个位置进行实施方式4的细胞组织的制备方法中的各工序，可在1个孔(培养容器)内制备独立的多个细胞组织。

例如，在96孔板内制备细胞组织的情况下，在使用现有的微量移液管的细胞接种方法中，细胞在96孔板的各孔(培养容器)的整个培养面铺展，其直径达到6.5mm (孔的直径) (参照图16的(a))。然而，通过采用实施方式4的细胞组织的制备方法，可涂布第1涂布液30和第2涂布液40使直径为1.0mm以内，可在1个孔的内部制备微细的细胞组织(参照图16的(b))。

而且，在96孔板的各孔(培养容器)的培养面上，通过对多个位置分别进行第1涂布液30的第1涂布工序A、和第2涂布液40的第2涂布工序B，可在同一孔(培养容器)内的多个位置制备独立存在的细胞组织(参照图16的(c))。

需要说明的是，为了在同一孔(培养容器)内的多个位置制备独立的细胞组织，通过将涂布针9的前端直径9a设为1.0mm，可制备直径为约1.0mm的细胞组织。另外，通过变更涂布针9的前端直径9a，可制备不同直径的细胞组织。例如，在使用前端直径9a为330μm的涂布针9制备细胞组织的情况下，可在同一培养容器内的6个位置独立地制备直径为约330μm的细胞组织(参照图12)。

如上所述，通过在1个孔(培养容器)内的多个位置独立地制备细胞组织，可有效地进行药物开发工艺中的药效药理评价或安全性评价中的药剂评价。在现有的细胞组织的制备方法中，在1个孔(培养容器)内只能制备1个细胞组织，因此由1个孔(培养容器)只能得到1个分析结果。然而，根据本发明所涉及的实施方式4的细胞组织的制备方法，可在1个孔(培养容器)内制备多个细胞组织，因此可由1个孔(培养容器)得到多个分析结果，以高流通量得到评价效率高的细胞组织。

如上所述，根据实施方式4的细胞组织的制备方法，对多孔培养容器的多个孔(有底孔：培养容器)分别连续涂布混合有凝胶化引发剂和细胞的第1涂布液30、和作为凝胶化剂的第2涂布液40后，最后对各孔涂布作为培养基的第3涂布液50，从而可抑制因干燥引起的细胞死亡，可在多孔培养容器内以高速、高精度、且高形状稳定性制备三维的细胞组织。

另外，通过使用微细涂布装置在个别的孔(培养容器)的平坦的培养面的多个位置涂布混合有凝胶化剂和细胞的第1涂布液30，可在减少整体的细胞数的同时，通过简易的工序制备独立存在、且大小的偏差少的多个细胞组织。

(实施方式5)

以下，参照附图，对本发明所涉及的实施方式5的细胞组织的制备方法、和通过该制备方法制备的细胞组织进行说明。需要说明的是，在实施方式5的说明中，对具有与上述的实施方式1、2、3、4同样的作用、构成和功能的要素附上相同的参照符号，为了避免重复记载，有时省略说明。

在本发明所涉及的实施方式5的细胞组织的制备方法中，采用在上述的实施方式1中详细说明的涂布方法，在涂布对象物上涂布附着于涂布针9的前端9a的包含细胞的第1涂布液30。其构成为：涂布第1涂布液30后，在第1涂布液30上以重叠覆盖的方式涂布第2涂布液40。对第2涂布液40的涂布方法没有特别限定，例如可采用：通过手工操作进行涂布、例如使用注射器、滴管等进行的液滴涂布、生物打印技术、例如喷墨法、分液器法等。

在实施方式5的细胞组织的制备方法中，与上述的实施方式1、2、3、4的不同之处在于：利用一系列的涂布工序在1个培养容器内制备包含不同种类的细胞的各细胞组织。

图32是显示实施方式5的细胞组织的制备方法中使用的微细涂布装置200的正面图。在微细涂布装置200中设有3个涂布单元201、202、203，分别设有涂布液容器，该涂布液容器中填充有包含种类不同的细胞的溶液(第1涂布液30X、30Y、30Z)。作为这些涂布单元201、202、203的构成，具有与实施方式1中说明的微细涂布装置1中的涂布单元6同样的构成，是同样地使用涂布针9对涂布对象进行接触涂布的构成。

另外，在微细涂布装置200中设有2个分液器204、205。2个分液器204、205与3个涂布单元201、202、203并列设置。第1分液器204以如下方式构成：在涂布完的第1涂布液30(30X、30Y、30Z)上以重叠覆盖的方式涂布第2涂布液40。第2分液器205的构成为：以在涂布完的第1涂布液30 (30X、30Y、30Z)上重叠覆盖的第2涂布液40成为浸渍状态的方式进行涂布，并且以形成培养基的方式进行涂布。

实施方式5中的微细涂布装置200的构成为：细胞(X细胞、Y细胞、Z细胞)不同的3种第1涂布液30 (30X、30Y、30Z)分别通过3个涂布单元201、202、203进行涂布。即，在微细涂布装置200中，第1涂布单元201使用混合有凝胶化引发剂和细胞X的第1涂布液30X执行第1涂布工序，第2涂布单元202使用混合有凝胶化引发剂和细胞Y的第1涂布液30Y执行第1涂布工序，然后，第3涂布单元203使用混合有凝胶化引发剂和细胞Z的第1涂布液30Z执行第1涂布工序。

图33是示意性地显示使用微细涂布装置200在1个孔(培养容器)内的3个位置制备独立的细胞组织的例子的平面图。图34是用于制备图33所示的3种细胞组织的流程图。在微细涂布装置200中于规定的位置固定多孔培养容器后，开始实施方式5中的细胞组织制备动作。

若开始实施方式5中的细胞组织制备动作，则多孔培养容器中的特定的孔中的指定的第1位置被设置成利用第1涂布单元201涂布细胞X的对象位置。利用所设置的第1涂布单元201执行第1涂布工序，作为第1液的混合有凝胶化引发剂和细胞X的第1涂布液30X被涂布在第1位置(步骤1)。在步骤2中执行如下的第2涂布工序：利用第1分液器204在第1涂布液30X上以重叠的方式涂布作为第2液且为凝胶化剂的第2涂布液40。涂布第2涂布液40之后，以特定的孔内的第2位置作为细胞Y的涂布对象位置，移动载台(步骤3)。

以第2位置作为涂布对象位置，利用第2涂布单元202执行第1涂布工序，在第2位置涂布作为第1液的混合有凝胶化引发剂和细胞Y的第1涂布液30Y (步骤4)。在步骤5中，使用第1分液器204在第1涂布液30Y上以重叠的方式涂布作为第2液且为凝胶化剂的第2涂布液40 (第2涂布工序)。在涂布第2涂布液40之后，以特定的孔内的第3位置作为细胞Z的涂布对象位置，移动载台(步骤6)。

以第3位置作为涂布对象位置，利用第3涂布单元203执行第1涂布工序，在第3位置涂布作为第1液的混合有凝胶化引发剂和细胞Z的第1涂布液30Z (步骤7)。在步骤8中，使用第1分液器204执行第2涂布工序，使作为第2液且为凝胶化剂的第2涂布液40在第1涂布液30Z上重叠。涂布第2涂布液40后，移动载台使特定的孔内成为涂布对象(步骤9)，利用第2分液器205执行在孔内涂布(添加)成为培养基的第3涂布液50的培养基形成工序。

如上所述，若在多孔培养容器中对特定的孔执行第1涂布工序、第2涂布工序和培养基形成工序，则对其余的孔执行第1涂布工序、第2涂布工序和培养基形成工序。这样，对多孔培养容器中的各孔依次执行第1涂布工序、第2涂布工序和培养基形成工序，在各孔中制备种类不同的细胞组织。

需要说明的是，在实施方式5中，对在1个孔(同一培养容器)内制备多个3种细胞组织的情况进行了说明，但本发明并不限于这种制备方法，例如还包括：在同一培养容器内制备相同种类的多个细胞组织和不同种类的细胞组织的情况、或即使是不同种类也制备2种以上的细胞组织的情况等的各种组合。

另外，作为在1个孔内涂布不同种类的多个细胞的情况的组合的具体例子，例如有：

(1) X细胞为来自iPS细胞的心肌细胞、Y细胞为来自iPS细胞的神经细胞、Z细胞为初代肝细胞的组合；

(2) X细胞为来自iPS细胞的心肌细胞、Y细胞为来自iPS细胞的神经细胞、Z细胞为HepG2的组合；

(3) X细胞为来自iPS细胞的心肌细胞、Y细胞为来自iPS细胞的神经细胞、Z细胞为HeLa细胞的组合；

(4) X细胞为来自iPS细胞的心肌细胞、Y细胞为人心脏成纤维细胞、Z细胞为人心脏血管内皮细胞的组合等。

图35是示意性地显示在1个孔(培养容器)内的3个位置制备独立的细胞组织的例子的平面图，是上述的图33所示的细胞组织的制备例的变形例。图36是用于制备图35所示的3种细胞组织的流程图。

在图35和图36所示的细胞组织的制备方法中，在规定的位置固定多孔培养容器后，开始细胞组织制备动作。若开始细胞组织制备动作，则多孔培养容器中的特定的孔中的指定的第1位置被设置成利用第1涂布单元201涂布细胞X的对象位置。利用所设置的第1涂布单元201执行第1涂布工序，作为第1液的混合有凝胶化引发剂和细胞X的第1涂布液30X被涂布在第1位置(步骤1)。

在涂布第1涂布液30X后，以特定的孔内的第2位置作为细胞Y的涂布对象位置，移动载台(步骤2)。以第2位置作为涂布对象位置，利用第2涂布单元202执行第1涂布工序，作为第1液的混合有凝胶化引发剂和细胞Y的第1涂布液30Y被涂布在第2位置(步骤3)。

在涂布第1涂布液30Y后，以特定的孔内的第3位置作为细胞Z的涂布对象位置，移动载台(步骤4)。以第3位置作为涂布对象位置，利用第3涂布单元203执行第1涂布工序，作为第1液的混合有凝胶化引发剂和细胞Z的第1涂布液30Z被涂布在第3位置(步骤5)。

在步骤6中，利用第1分液器204执行第2涂布工序，使作为第2液且为凝胶化剂的第2涂布液40在第1涂布液30X、30Y、30Z上重叠。涂布第2涂布液40后，移动载台使特定的孔内成为涂布对象(步骤7)，利用第2分液器205执行在孔内涂布(添加)成为培养基的第3涂布液50的培养基形成工序。

如上所述，图36所示的细胞组织的制备方法的构成为：对多孔培养容器中的孔依次执行第1涂布工序，之后执行第2涂布工序和培养基形成工序。这样，对多孔培养容器执行细胞组织的制备方法，在各孔中制备种类不同的细胞组织。

需要说明的是，在实施方式5中，微细涂布装置200具有制备3种细胞组织的构成，但本发明并不限于这样的构成，通过根据要制备的细胞的种类设置涂布单元，可制备多个种类的细胞组织。

如上所述，根据本发明所涉及的实施方式5的微细涂布装置200的构成，可在1个孔(培养容器)内制备多个种类的细胞组织。作为像这样在1个孔(培养容器)内制备多个种类的细胞组织的优点，列举以下的事项。

(1) 例如，在对细胞X和细胞Y赋予不同的作用的药剂存在的情况下，若在1个孔内制备分别包含细胞X和细胞Y的各细胞组织，则通过在该孔内添加药剂，可在该孔内同时确认对各细胞(X、Y)的作用。例如，蒽环类抗癌药是经常产生心毒性的药剂。通过使癌细胞与来自iPS细胞的心肌细胞共存于1个孔，通过向其中添加抗癌药，可在癌细胞中观测到抗癌药原本的效果，同时在来自iPS细胞的心肌细胞中观测到心毒性的效果。

(2) 通过使不同种类的细胞组织共享培养基，可共享由细胞生成的细胞因子或所添加的药剂的代谢物。例如，可观测到通过细胞X代谢的药剂与细胞Y作用。

在实施方式5的微细涂布装置200中，说明了对于多孔培养容器中的各孔制备多个种类的细胞组织的方法，但微细涂布装置200也可对多孔培养容器的各孔制备包含相同种类的细胞的多个细胞组织。这样，通过在1个孔中制备多个细胞组织，可通过1个孔对多个样品数进行评价。另外，在图像和动画的分析中，可通过一次摄影拍摄多个样品，因此摄影时间缩短，进而使分析时间缩短。例如，在使用96孔作为培养容器的情况下，在现有的细胞组织的制备方法中，在1个孔内只能制备1个样品，但在实施方式5的细胞组织的制备方法中，例如在1个孔内可制备4个直径为约1.0mm的细胞组织c的样品。因此，根据实施方式5的细胞组织的制备方法，可使用96孔w的培养容器制备384个(96×4)细胞组织的样品。另外，例如针对1个孔的动画分析需要20秒的摄影，则在现有的细胞组织的制备方法中由于1个孔为1个样品，所以4个样品的动画摄影需要80秒。另一方面，在实施方式5的细胞组织的制备方法中，由于在1个孔的内部制备4个样品，所以动画摄影大幅缩短至20秒。

如上所述，根据实施方式5的细胞组织的制备方法，对多孔培养容器的多个孔(有底孔：培养容器)分别连续涂布混合有凝胶化引发剂和细胞的第1涂布液30、和作为凝胶化剂的第2涂布液40后，最后对各孔涂布作为培养基的第3涂布液50，从而可抑制因干燥引起的细胞死亡，可在多孔培养容器中以高速、高精度、且高形状稳定性制备三维的细胞组织。

另外，通过使用微细涂布装置在个别的孔(培养容器)的平坦的培养面的多个位置涂布混合有凝胶化剂和细胞的第1涂布液30，可减少整体的细胞数，同时可通过简易的工序制备独立存在、且大小的偏差少的多个细胞组织。

虽然在实施方式中以一定程度的细节对本发明进行了说明，但该构成仅为示例，该实施方式的公开内容应该在构成的细节中有所变化。在本发明中，实施方式中的要素与其他要素的置换、组合和顺序的变更可在不脱离所要求的本发明的范围和思想的情况下实现。

产业实用性

本发明所涉及的细胞组织的制备方法可大量制造可靠性高的各种细胞组织，因此在药物开发研究和再生医学研究上也是重要的技术，是产业实用性高的发明。

Claims (36)

1. 细胞组织的制备方法，其特征在于，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布第2涂布液，使第1涂布液与第2涂布液的界面发生凝胶化。

2.权利要求1所述的细胞组织的制备方法，其中，上述第2涂布工序包括：边维持第1溶液的涂布液的流动状态，边使第1涂布液与第2涂布液的界面发生凝胶化。

3.权利要求1或2所述的细胞组织的制备方法，其中，第1涂布液包含细胞和凝胶化引发剂。

4.权利要求1～3中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，第2涂布液包含凝胶化剂。

5. 细胞组织的制备方法，其特征在于，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含凝胶化剂的第2涂布液，使在第1涂布液与第2涂布液的界面引发凝胶化反应。

6. 细胞组织的制备方法，其特征在于，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含作为凝胶化剂的胶原蛋白、明胶和/或琼脂的第2涂布液，通过加热或冷却使在第1涂布液与第2涂布液的界面引发凝胶化反应。

7. 细胞组织的制备方法，其特征在于，包括以下工序：

第1涂布工序，在涂布对象物上涂布包含细胞的第1涂布液；以及

第2涂布工序，在上述第1涂布工序中涂布的第1涂布液上重叠涂布包含光交联性明胶水凝胶化剂的第2涂布液，通过光照射使在第1涂布液与第2涂布液的界面引发凝胶化反应。

8.权利要求1～7中任一项所述的细胞组织的制备方法，该制备方法包括以下工序：将涂布有第1涂布液和第2涂布液的涂布对象物浸在培养基中并培养细胞。

9.权利要求1～8中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，第1涂布液包含增稠多糖类。

10.权利要求1～9中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，第2涂布液包含增稠多糖类。

11.权利要求3或5所述的细胞组织的制备方法，其中，凝胶化引发剂为凝血酶。

12.权利要求4或5所述的细胞组织的制备方法，其中，凝胶化剂为纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶或它们的2种以上的混合物。

13.权利要求9～10中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，增稠多糖类为透明质酸钠、海藻酸钠或它们的混合物。

14.权利要求3～13中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，细胞为心肌细胞。

15.细胞组织形成套件，该套件至少包括：第1容器，其包含含有细胞和凝胶化引发剂的第1涂布液；以及第2容器，其包含含有凝胶化剂的第2涂布液。

16.权利要求15所述的细胞组织形成套件，其中，第1涂布液包含增稠多糖类。

17.权利要求15或16所述的细胞组织形成套件，其中，第2涂布液包含增稠多糖类。

18.权利要求15～17中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，凝胶化引发剂为凝血酶。

19.权利要求15～18中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，凝胶化剂为纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶或它们的2种以上的混合物。

20.权利要求16～19中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，增稠多糖类为透明质酸钠、海藻酸钠或它们的混合物。

21.权利要求15～20中任一项所述的细胞组织形成套件，其中，细胞为心肌细胞。

22.细胞组织，该细胞组织是通过权利要求1～14中任一项所述的细胞组织的制备方法制备的。

23.权利要求1～14中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，上述第1涂布工序是采用基于涂布针的接触涂布进行的。

24.权利要求1～14和23中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，对同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第1涂布工序和上述第2涂布工序的涂布动作，并执行培养基形成工序。

25.权利要求24所述的细胞组织的制备方法，其中，对同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第1涂布工序和上述第2涂布工序的涂布动作后，执行上述培养基形成工序。

26.权利要求24所述的细胞组织的制备方法，其中，对同一培养容器的各涂布对象位置执行上述第1涂布工序和上述第2涂布工序的涂布动作后，对该涂布对象位置执行上述培养基形成工序。

27.权利要求24所述的细胞组织的制备方法，其中，对同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第1涂布工序的涂布动作后，对该同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述第2涂布工序的涂布动作，之后对该同一培养容器的多个涂布对象位置执行上述培养基形成工序。

28.权利要求24～27中任一项所述的细胞组织的制备方法，该制备方法包括：上述培养基形成工序，使包含上述第1涂布液的上述第2涂布液浸渍的方式涂布第3涂布液。

29.权利要求24～28中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，对同一培养容器的多个涂布对象位置制备包含相同种类的细胞的细胞组织。

30.权利要求24～28中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，对同一培养容器的多个涂布对象位置制备包含不同种类的细胞的细胞组织。

31.权利要求24～30中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，在上述第1涂布液上重叠涂布上述第2涂布液的上述第2涂布工序采用喷墨方式、或分液器方式。

32.权利要求24～31中任一项所述的细胞组织的制备方法，其中，在形成细胞组织时使用双液式的凝胶化溶液作为涂布液。

33.培养容器，该培养容器在同一容器内包含多个细胞组织。

34.权利要求33所述的培养容器，其中，在同一容器内包含相同种类的多个细胞组织。

35.权利要求33所述的培养容器，其中，在同一容器内包含种类不同的多个细胞组织。

36.权利要求33～35中任一项所述的培养容器，其中，在同一容器内包含多个细胞组织，且具有多个该容器。

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