CN107922921A

CN107922921A - 3d打印组织培养模型的方法

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Publication number: CN107922921A
Application number: CN201680042517.4A
Authority: CN
Inventors: 艾丹·帕特里克·马奥尼; 罗伯特·哈迪诺托·乌塔马; 克里斯托弗·迈克尔·法夫; 拉可玛莉·阿塔帕图; 朱里奥·塞萨尔·卡德拉·里贝罗; 玛利亚·卡瓦拉瑞斯; 约翰·贾斯汀·古丁
Original assignee: English Life Science Co Ltd
Current assignee: English Life Science Co Ltd
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-07-21
Also published as: AU2016297675B2; KR102677014B1; AU2016297675A1; US20180230423A1; JP2018522587A; KR20180032597A; CA2992811A1; WO2017011854A1; EP3325611B1; JP6791960B2; CN107922921B; US10676712B2; EP3325611A4; EP3325611A1

Abstract

3D打印组织培养模型的方法，方法为：(a)将生物墨水液滴打印到基底上；(b)将活化剂液滴打印到生物墨滴上以形成水凝胶滴；(c)以任何顺序重复步骤(a)和(b)以形成适于接受含有细胞的液滴的水凝胶模具；(d)将含有细胞的液滴打印到水凝胶模具；和(e)以任何顺序重复步骤(a)和(b)以形成包含囊封在水凝胶模具中的细胞的3D组织培养模型。

Description

3D打印组织培养模型的方法

相关申请

本申请要求澳大利亚临时专利申请No 2015902917的优先权，于2015年7月22日提交，其全部公开内容通过引用明确地并入本文。

技术领域

该技术涉及形成三维组织培养物的过程，例如3D组织培养模型以及3D组织培养模型的应用。

背景技术

人体和动物体内的大部分细胞组织结构都是三维的。这导致了复杂的细胞间相互作用，而不能在二维细胞培养单层模拟(Pampaloni，Ansari和Stelzer，2013)。然而，二维细胞培养已经成为典型的体外细胞培养的范例。目前已经证明，当在三维环境中培养细胞时，细胞表现更天然，但构建三维细胞培养物的形成是很困难的、昂贵的、且耗力。

细胞球体是三维细胞培养模型的一个例子，也是最早被发现并在基础研究和临床药理学中应用。细胞球体是具有数百微米的典型直径的聚集细胞团。目前有许多技术可用于球体形成，如悬滴法(hanging drop)或旋转搅拌器。通常，培养细胞球体可能需要长达四天的时间，成功率为50％。

许多研究已经报道了使用按需滴落(drop-on-demand)技术的细胞打印。福克纳-琼斯(Faulkner-Jones)等人(2013)打印的细胞悬浮在培养基中，使用按需滴落法，在DMEM中的细胞密度约为1×10⁵个细胞/ml。Ferris等人(2015)报道了利用市场上可买到的喷墨打印头，以2×10⁶细胞/ml的密度在生物墨水(吉兰糖胶)中打印细胞。徐等人(2014)报道了以1×10⁷个细胞/ml的密度在生物墨水中打印细胞。还有报道，细胞打印中使用最广泛的细胞浓度在10⁵和10⁷个细胞/ml之间。尽管许多以前的研究描述了使用按需喷墨技术打印细胞，但是关于通过按需滴墨方法在生物墨水中打印高细胞密度(大于10⁷个细胞/ml)没有报道。

例如，为了形成细胞球体，高密度细胞(5×10⁷-2×10⁸细胞/ml)必须聚集成小球形细胞团。悬滴技术是通过悬浮含有分离细胞的培养基液滴、并使细胞聚集三至七天来实现。由于与高细胞密度相关的高粘度和按需滴落装置中的小特征尺寸，使用按需滴落装置产生细胞球体非常困难。出于这个原因，在之前的尝试中使用球体打印组织结构，细胞球体首先手动形成，装入3D打印机，然后打印形成组织结构。Tan等人(2014)报道了通过挤压法预先形成的细胞球体的3D打印。Tan等人使用加压的巴斯德(Pasteur)移液管系统作为液滴分配喷嘴，但导致了预成型的球状体的连续沉积。Marga等人(2012)也报道了通过挤压法预成形的球体的3D打印。相反地，使用毛细管微量移液管可以将细胞聚集体连续排列在一条线上。同样，米罗诺夫等(2009)也报道了通过挤压法预先形成的细胞球体的3D打印。

本发明人已经开发了一种制备适合于体外细胞培养测定的3D组织培养模型的方法。

发明内容

第一方面，提供了一种制备3D组织培养模型的方法，所述方法包括：

(a)将生物墨水液滴打印到基底上；

(b)将活化剂液滴打印到生物墨滴上以形成水凝胶滴；

(c)以任何顺序重复步骤(a)和(b)以形成水凝胶模具，水凝胶模具适于接受含有细胞的液滴；

(d)将含有细胞的液滴打印到水凝胶模具；

(e)以任何顺序重复步骤(a)和(b)以形成3D组织培养模型，3D组织培养模型包含囊封在水凝胶模具中的细胞。

在一个实施方案中，步骤(d)包括将含有细胞的细胞墨水液滴打印到水凝胶模具。

在一个实施方案中，步骤(d)包括，在步骤(e)之前，将含有细胞的生物墨水液滴打印至水凝胶模具、并将活化剂液滴打印至含有细胞的生物墨水的液滴上。

第二方面，提供了一种制备3D组织培养模型的方法，所述方法包括：

(a)将生物墨水液滴打印到基底上；

(b)将活化剂液滴打印到生物墨滴上以形成水凝胶滴；

(d)将含细胞的细胞墨水液滴打印到水凝胶模具；

第三方面，提供了一种制备3D组织培养模型的方法，所述方法包括：

(a)将生物墨水液滴打印到基底上；

(b)将活化剂液滴打印到生物墨水液滴上以形成水凝胶滴；

(d)将含有细胞的生物墨水液滴打印到水凝胶模具；

(e)将活化剂液滴打印到含有细胞的生物墨水的液滴上；

(f)以任何顺序重复步骤(a)和(b)以形成3D组织培养模型，3D组织培养模型包含囊封在水凝胶模具中的细胞。

在一个实施方案中，该过程使用能够形成液滴的3D生物打印机来执行。3D生物打印机配置为以保持细胞的完整性、生存力或功能性的方式来打印生物墨水、活化剂、含有细胞的滴剂、含有细胞的细胞墨水滴剂。

应该理解，步骤(a)和(b)可以以任何顺序进行。可以将生物墨水液滴施加到基底上，然后滴加活化剂液滴以形成水凝胶液滴，或者可以将活化剂液滴施加到基底上，然后滴加生物墨水液滴以形成水凝胶液滴。

在一个实施方案中，基底选自用于容纳、保持或生长细胞的任何合适的容器。例如：基底包括不同孔结构的微量滴定板(6，24，48和96孔)，具有不同孔结构(6，24，48和96孔)的盖玻片底部的微量滴定板，各种规格的fluorodish培养皿，不同的腔室载玻片(1，2，4，8和16)，盖玻片或显微镜载玻片。

生物墨水可以选自与细胞相容的任何合适的材料，并且当加入合适的活化剂时可以形成水凝胶。

在一个实施方案中，生物墨水是合成大分子、包含果糖、蔗糖或葡萄糖官能团的聚合物、非离子聚合物、聚电解质或天然大分子。

例如：生物墨水包括：合成大分子，例如多糖；含有果糖、蔗糖或葡萄糖官能团的聚合物；带有胺反应性官能团的聚合物，例如醛，环氧，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯(VDM)；具有巯基反应性官能团的聚合物，例如烯烃，炔烃，叠氮化物，卤素或氰酸酯；非离子聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)，聚ε-己内酯(PCL)，聚乙烯醇(PVA)，聚(NIPAAM)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)和衍生物；聚电解质-携带正电荷或负电荷的聚合物，两性以及两性离子聚合物；多肽是由酰胺键结合在一起的许多氨基酸(最少2个氨基酸)的单一直链。天然大分子包括多糖，例如藻酸盐，壳聚糖，透明质酸，琼脂糖和糖胺聚糖；蛋白质，例如明胶，纤维蛋白，胶原蛋白，肽或其组合；或基底膜提取物。

例如，反应性官能团包括：胺-反应性官能团如醛、环氧、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯(VDM)和巯基反应官能团如烯烃、炔烃、叠氮化物、卤素或氰酸酯。

选择活化剂以将生物墨水形成为水凝胶。

在一个实施方案中，活化剂包含无机盐、光引发剂、聚电解质、多肽、蛋白质和携带胺或硫醇基团的合成或天然大分子。

在一个实施方案中，无机盐是氯化钡、碳酸钙、氯化钙、氯化钠、硫酸镁或氢氧化钠。光引发剂是2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)和Irgacure。

在一个实施方案中，合成或天然大分子可以天然携带或合成修饰为带有胺或硫醇基团。

在一个实施例中，生物墨水可以被化学改性以引入反应性官能团。

在一个实施方案中，生物墨水由藻酸盐溶解在无钙达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中形成，其中可以添加含有分散的神经母细胞瘤(SK-N-BE(2))细胞的胎牛血清(FCS)。在一个实施方案中，生物墨水中添加有约1％，2％，3％，4％，5％，6％，5％，8％，9％或10％的FCS。

在一个实施方案中，活化剂是溶于MilliQ水中的氯化钙。

所述的细胞墨水可以选自与细胞相容的任何合适的材料、并且在打印过程中保持细胞悬浮。

细胞墨水可以是缓冲液、细胞培养基或者是保持细胞的完整性或活性的其他材料。

在一个实施方案中，细胞墨水材料包括结冷胶、Ficoll^TM、葡聚糖、甘油、藻酸盐、甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

在一个实施方案中，细胞墨水是磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的结冷胶。

在一个实施方案中，细胞墨水是PBS中的Ficoll^TM。

在一个实施方案中，细胞选自哺乳动物肝细胞、胃肠细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心脏细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖器细胞、乳腺细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、许旺细胞、脂肪细胞、骨细胞，骨髓细胞、软骨细胞、周细胞、间皮细胞、来自内分泌组织的细胞、基质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞或其组合。

另外的细胞类型可以包括其他哺乳动物细胞(即非人)、细菌、真菌和酵母。

在一个实施方案中，3D组织培养模型进一步包括制剂，例如药剂、治疗剂、抗体、小分子抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、抗原、病原体、血小板、生长因子、细胞因子、氨基酸、营养物质(单糖和多糖)，条件培养基、抗生素、抗病毒剂、纳米颗粒、RNA和相关变体(例如siRNA，miRNA等)。

在一个实施方案中，该过程使用能够形成液滴的3D生物打印机来执行。该生物打印机具有用于至少存储生物墨水、活化剂、细胞悬浮液和清洁溶液的流体储存器，三轴运动控制台，按需滴落的液滴分配系统以及用于控制流体储存器中的压力的压力调节器。液滴分配系统和三轴运动控制台可以容纳在诸如层流柜的无菌室内。打印平台可以包括适配器以打印到多种基底上，如微孔板和皮氏培养皿。打印平台可以加热到37℃，以帮助细胞增殖。

3D生物打印机可以由计算机控制，其具有定义打印格式的软件。

在实施方式中，3D组织培养模型可以包含至少约100，1000，5000，10000，50000，100000，150000，200000，250000，300000，350000，400000，450000或500000或更多个细胞。应该认识到，也可以使用其他数量的细胞。

3D组织培养模型中可以使用高达约450×10⁶个细胞/ml的细胞浓度。应该认识到，甚至可以使用更高浓度的细胞。

在一个实施例中，可以在液滴中打印多于一种的细胞类型。例如，两种或更多种细胞类型可以混合、并用于形成3D组织培养模型。

在一个实施例中，方法是在基底上形成多个3D组织培养模型。例如，96孔微量滴定板是一种合适的基底，可以用于多细胞测定。

在一个实施方案中，该方法在基本上无菌的环境中进行。

在一个实施方案中，该方法在约37℃的温度下进行。

可以将培养基添加到3D组织培养模型中以维持细胞活力或者促进细胞生长和细胞分裂。

在一个实施方案中，该方法自动化进行。

在一个实施方案中，所述方法还包括，在允许细胞生长或维持或球体形成的条件下孵育囊封在水凝胶模具中的细胞。

在一种实施方案中，孵育可以在适于细胞生长和维持的任何合适的温度和条件下进行。例如孵育可以在约37℃、约5％CO ₂条件下进行至少24小时。应该指出的是，孵育可以在允许细胞生长或维持或水凝胶模具中的细胞类型的球体形成的任何温度和持续时间下进行。

在一个实施方案中，3D组织培养模型是细胞球体。

在一个实施方案中，水凝胶允许例如使用显微镜目视检查3D组织培养模型中的细胞。

在使用中，3D组织培养模型可以允许营养物质和检测试剂进出水凝胶进行细胞研究。

第四方面，提供了根据第一方面的方法制备的3D组织培养模型。

第五方面，提供了一种3D组织培养模型，其包含封装在由3D生物打印机形成的水凝胶中的细胞液滴。

第六方面，提供了3D组织培养模型在细胞检测中的应用。

在一个实施方案中，细胞检测选自细胞运动性、细胞迁移、细胞侵袭、跨内皮迁移、上皮-间充质转化、间充质-上皮转化、球体形成和生长、细胞分化(更具体的干细胞分化，监测细胞分化标记)、细胞死亡(更特异的细胞凋亡，细胞坏死)、细胞自噬、细胞增殖、细胞代谢、蛋白质转化、蛋白质分布和定位、细胞信号传导和下游事件、药物功效、药物药效学、药物作用机制、药物受体介导的运输、药物内化机制、生物标记物评估、细胞-细胞连接、细胞-细胞信号传导和下游事件、细胞形态学、细胞粘附、基因表达、蛋白质表达、细胞归巢、细胞周期调控和控制、细胞激素释放、胰岛素产生、蛋白质分泌和细胞内运输和转运、受体-配体结合、抗体结合、抗体特异性、蛋白质磷酸化、蛋白酶体功能、酶功能(更具体的酶抑制)、免疫调节克隆形成性、氧化应激、蛋白质折叠、细胞骨架、细胞器形态和功能(更具体地说涉及线粒体，叶绿体，过氧化物酶体，分泌小泡，液泡，核糖体，细胞核，溶酶体，纤毛，内质网，高尔基体)、膜转运、缺氧、血管生成、伤口愈合、神经突(生长或形成)，激酶功能、磷酸酶功能、板状体形成和动力学；焦点接触/粘连形成，动力学和信号传导；细胞传感，机械力传导。

该方法的优点是可以将高浓度的细胞包括在组织培养模型中。

该方法的优点是打印后可以获得高细胞存活率。

该方法的优点是价格并不昂贵，可以重复，可以扩展推广。

定义

整个说明书中，除非上下文清楚地要求，否则词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变化将被理解为意味着包括所陈述的要素、数量或步骤，或多个要素、多个数量或多个步骤，但不排除任何其他要素、数量或步骤，或多个要素、多个数量或多个步骤。

整个说明书中，术语“由组成”意味着仅由组成。

已经包括在本说明书中的对文件、作用、材料、装置、文章等的任何讨论的目的仅仅是为了阐述本发明提供的背景。不能认为是承认任一或者所有这些事实构成了现有技术的一部分，或者不能认为其是本申请每项权利要求要求的优先权日之前存在的、与本发明相关领域的公知常识。

除非上下文另外要求或相反地具体陈述，否则本发明中以单数形式的整数、步骤或要素列举的数量、步骤或要素清楚的包括所述整数、步骤或要素的单数和复数形式。

在本说明书的上下文中，术语“a”和“an”用于指物品的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，对“an element”的意思是一个要素或多个要素。

在本说明书的上下文中，术语“约”意味着对数字或数值不能看作为绝对数字或数值，而是包括符合本领域技术人员能够理解的高于或低于该范围边界的数字或数值，包括典型的误差范围或仪器限制范围内。换句话说，术语“约”的使用被理解为指本领域技术人员在实现相同功能或结果的情况下认为与文中所列出的值相等同的范围或近似值。

本领域的技术人员将认识到，除了本申请中具体描述的那些以外，本文所述的发明易于进行变化和修改。应该理解，本发明包括所有这些变化和修改。为了避免疑义，本发明还包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征和化合物，单独地或共同地，以及任何两个或更多个所述步骤、特征和化合物的任何和所有组合。

为了更清楚地理解本发明，将参考以下附图和实施例来描述优选实施方式。

附图说明

图1显示了3D生物打印机的示意图。

图2显示了内部印有细胞克隆的打印水凝胶模具的例子。

A：在中心带有杯子的打印的水凝胶模具；B：打印在水凝胶模具中心的杯子中的细胞；C：孵育48小时后形成的细胞球体；D：培养72小时后形成的细胞球体。

图3显示了3D组织培养模型测定的示意图(尺寸以mm为单位)。

具体实施方式

材料和方法

生物墨水

在本说明书中，生物墨水被定义为其中可以悬浮或容纳细胞的一种或多种类型的大分子的水溶液。在活化或交联后，生物墨水产生具有由其化学和物理组成限定的物理和化学性质的水凝胶结构。大分子被限定为合成和天然聚合物，蛋白质和肽的阵列。大分子可以处于其天然状态或者用胺或硫醇反应官能团化学修饰。

合成大分子可以包括：

多糖，例如含有果糖、蔗糖或葡萄糖官能团的聚合物。

非离子聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)，聚ε-己内酯(PCL)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(NIPAAM)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)及衍生物。

聚电解质-携带正电荷或负电荷的聚合物，两性以及两性离子聚合物。

多肽——多个氨基酸(最少2个氨基酸)通过酰胺键结合在一起组成的单一直链。

含合成聚合物的核碱基——具有核碱基的聚合物(腺嘌呤、胸腺嘧啶，鸟嘌呤或胞嘧啶)重复单元。

天然大分子可以包括：

多糖，例如藻酸盐、壳聚糖、结冷胶、透明质酸、琼脂糖和糖胺聚糖；

蛋白质，例如明胶、纤维蛋白和胶原蛋白；

DNA和寡核苷酸，例如单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)DNA核酶和核酸适配体

基底膜提取物

胺反应性官能团可以包括：醛、环氧、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯(VDM)；

巯基反应性官能团可以包括：烯烃、炔烃、叠氮化物、卤素和氰酸酯。

使用和发现的合适的生物墨水为：海藻酸盐以2w/v％的浓度溶解在无钙的DMEM培养基中，还添加有10v/v％FCS、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠。

具有分散的SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞的生物墨水被称为含有细胞的生物墨水。

活化剂

活化剂是一种包含小分子或大分子的水溶液，活化剂与生物墨水相互作用形成水凝胶结构。可以改变活化剂的组成以控制所得水凝胶的物理性质。所使用的活化剂的类型很大程度上依赖于所使用的大分子以及预期的交联过程。

活化剂可以选自：

无机盐，例如碳酸钙、氯化钙、氯化钠、硫酸镁、氢氧化钠和氯化钡。

光引发剂，例如2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)和Irgacure。

聚合电解质-聚合物，与生物墨水中的大分子带相反电荷。它可以是阳离子、阴离子、两性氧化物和两性离子。

多肽-由多个氨基酸(最少2个氨基酸)通过酰胺键连接在一起组成的单一直链。

DNA接头-携带核苷酸或DNA序列的大分子，与生物墨水的大分子上存在的核苷酸或DNA序列互补；

带有胺基或巯基的天然或合成大分子，可以是天然的或通过化学修饰。

用于藻酸盐生物墨水的活化剂是：溶解在MilliQ水中的4w/v％的氯化钙。

交联或胶凝

这是单个大分子链通过活化剂连接在一起形成水凝胶的过程。交联过程可分为化学交联或物理交联。物理交联或非共价交联可以包括：

离子交联——通过存在于大分子和活化剂中的相反电荷的相互作用进行交联。活化剂可以包括带电荷的低聚物、离子盐和离子分子。

氢键——通过极性分子的静电吸引力交联。在这种情况下，大分子和活化剂携带极性官能团。

温度交联——通过大分子链的重排交联，该重排是大分子链对温度变化(加热或冷却)的反应。

疏水相互作用或范德华力。

化学或共价交联涉及大分子和活化剂之间的化学反应。反应的类型可以包括：

通过紫外线或光照射促进交联反应的光交联；

在水介质中，硫醇和携带乙烯基的大分子之间的Michael型加成反应；

氨基和醛基之间的席夫碱反应；

狄尔斯-阿尔德反应；

点击化学；

氨基分解反应为活性酯基；

酶交联。

其他生物墨水和活化剂组合的例子列于下表：

细胞墨水

细胞墨水是一种或多种类型的分子或大分子的水溶液，在整个三维生物打印过程中细胞将被保持均匀悬浮。细胞墨水的浓度被优化以防止细胞沉降但仍保持高细胞活率。

细胞墨水可以从以下选项中选择：

小分子如甘油。

大分子如Ficoll^TM、葡聚糖、藻酸盐、结冷胶、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

Ficoll^TM是一种中性、高度支化、高质量的亲水性多糖，易溶于水溶液中。Ficoll^TM的半径范围为2-7nm，并且通过多糖与环氧氯丙烷的反应来制备。Ficoll^TM是GE Healthcare公司拥有的注册商标。

使用的细胞墨水是溶于PBS中的Ficoll^TM 400，其浓度为10w/v％。

具有分散的SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞的细胞墨水被称为含有细胞的细胞墨水。

结冷胶是由鞘氨醇单胞菌Sphingomonas elodea(原名称Pseudomonas elodea)产生的水溶性阴离子多糖。

细胞培养方法

细胞培养液是与培养细胞接触的液体，适用于各种细胞相关的研究。制备过程包括盐的精准分析和pH平衡，仅加入生物相容性分子，并进行灭菌。

一些细胞培养方法包括：

细胞培养基，例如DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)，最低必需培养基(Minimum Essential Media，MEM)，IMDM培养基(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium)，199培养基(Media 199)，Ham's F10，Ham's F12，McCoy's 5A培养基和RPMI培养基(Roswell Park Memorial Institute)。

生长补充剂，例如胎牛血清(FCS)，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFBF)，成纤维细胞生长因子(FBF)，内皮细胞生长因子(ECGF)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)和血小板源生长因子(PDGF)。

生物缓冲液，例如PBS缓冲液、HEPES缓冲液和CHES缓冲液。

螯合和稳定方法；

灭菌的MilliQ水。

细胞培养条件

细胞和3D组织培养模型的孵育、培养和保持，可以采用标准细胞培养技术进行。3D组织培养模型包括囊封在水凝胶模具中的细胞，该3D组织培养模型可以在允许或保持细胞生长或球体形成的条件下孵育。对于大多数动物和人类细胞系来说，培养通常在约37℃，5％的CO ₂的条件下进行至少24小时。应该理解的是，孵育可以在允许水凝胶模具中的细胞或细胞的类型的生长、维持或球体形成的任何合适的条件、温度和持续时间下进行。

效用解决方案

效用解决方案被定义为不与细胞接触但用于清洁和消毒所有暴露于细胞的打印机表面的解决方案。这些解决方案可能包括：

正确浓度的乙醇；

无菌MilliQ水；

细胞培养基；

清洁剂；

过氧化氢溶液(最大浓度2w/v％)。

打印基底

打印基底是用于封装和培养打印的细胞结构的具有生物相容性的耗材。这些基底可以包括：

不同孔结构的微量滴定板(6，24，48和96孔)；

盖玻片底部具有不同孔结构的微量滴定板(6，24，48和96孔)；

盖玻片和显微镜载玻片；

各种规格的fluorodish培养皿；

不同腔室结构的腔室培养玻片(Chamber slides)(1，2，4，8和16)。

3D生物打印平台

由Inventia生命科学开发和组装的3D生物打印机的原理图如图1所示。三维生物打印机的组件包括三轴运动控制台，按需滴落的液滴分配系统和控制液体储存器中压力的压力调节器。液滴分配系统和三轴运动控制台可以容纳在诸如层流柜的无菌室内。打印平台包括适配器，可以在多种基底上打印，如微孔板和培养皿。打印平台可以加热到37℃，以促进细胞增殖。

三轴运动控制台能够在三个(X，Y和Z)维度上、以10μm的分辨率精确地定位液滴分配系统。四个液滴分配系统由具有宝石孔口(a jewelled orifice)分配喷嘴组的电磁阀组成，其由微控制器控制。宝石孔口喷嘴的内径可以在127和254μm之间，这取决于流体粘度和需要的液滴体积。每个液滴分配系统都连接到一个静压储存器，以便通过柔性管分配生物墨水和活化剂溶液。也可以利用流体储存器中的背压和电磁阀打开时间来调节所需的液滴体积。常用地，背压被设定为1至60psi之间的压力，电磁阀打开时间为0.3ms或更长，并且液滴体积在1至500nl之间。连接生物墨水和活化剂储存器的柔性管道要尽可能短，以便将启动系统和在打印程序结束时清除系统所需的时间最小化。

控制软件

3D生物打印机通过为打印生物分析开发的定制软件进行控制。该软件包括图形用户界面(GUI)。通过GUI，终端用户可以选择不同的测定打印程序，并更改测定参数，如液滴间距和液滴体积。用户还可以手动控制液滴分配系统的空间位置，并创建液滴的自定义图案。该软件的其他功能包括启动和清洗液滴分配系统的例程。

生物墨水的制备

首先，通过在合适的细胞培养溶液中混合适当类型和量的大分子来制备生物墨水。达到均质性后，通过UV照射和过滤(022μm过滤器)将空白生物墨水灭菌。然后将生物墨水保持在4℃备用。

细胞的制备

收获的细胞用PBS缓冲液洗涤，然后吸出PBS。加入胰蛋白酶并在37℃下孵育以从培养瓶表面分离细胞。加入组织培养基，将分离的细胞收集到管中。离心细胞，吸取上清液，并用新鲜的培养基重新悬浮细胞。通过混合等体积的细胞悬液和台盼蓝染色来进行细胞计数。进行计算以确定细胞浓度。然后可以将所需数量的细胞添加到生物墨水、细胞墨水，或添加到细胞培养溶液中。

活化剂的制备

将适当类型和数量的分子溶解在合适的细胞培养液中。所得溶液在使用前经UV照射和过滤灭菌。

细胞墨水的制备

将适当类型和数量的分子溶解在合适的细胞培养液中。溶解均匀后，使用前将所得溶液通过UV照射和过滤灭菌。然后将细胞墨水放置在室温下备用。

准备3D生物打印机

含有工作流体的打印墨盒通过连接件装载到3D生物打印机中。在开始打印程序之前，液滴分配系统和连接的流体通道用乙醇，水，介质和空气消毒。灭菌后，液滴分配系统启动，将气泡从流体系统中清除。

细胞收获

采用下述已有的操作规程收获某些聚集处的所需要的培养细胞。为了制备含有细胞的生物墨水或细胞墨水，将收获的细胞以合适的细胞浓度再悬浮，以在200μl生物墨水或细胞墨水中达到25×10⁸个细胞/ml的浓度。然后将得到的细胞团粒再分散在合适体积的生物墨水或细胞墨水中。含有细胞的生物墨水或细胞墨水随后准备用于3D生物打印机。

打印墨盒的准备

在无菌环境中，使用微量移液管将激活剂，生物墨水和含有细胞的生物墨水或细胞墨水缓慢加入到适当的墨盒小瓶中以避免产生小气泡。然后将墨盒关闭以保持其无菌性并将其装入打印机用于打印过程。

打印水凝胶模具

采用滴落式工艺打印水凝胶模具，在此过程中，将生物墨水夜滴和活化剂液滴沉积在彼此的顶部以产生水凝胶。这个过程可以重复使用，并通过建立水凝胶层来形成3D水凝胶结构。在图2中显示了具有打印在中央的细胞的打印的水凝胶模具的实例。

细胞类型

3D组织培养模型例如球状体可以由任何合适的细胞类型制备，所述细胞类型包括贴壁细胞，例如哺乳动物肝细胞、胃肠细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心脏细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖器细胞、乳腺细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、许旺氏细胞、脂肪细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、周皮细胞、间皮细胞、来自内分泌组织的细胞、基质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞或其组合。

另外的细胞类型可以包括其他真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢)、细菌(例如幽门螺杆菌)、真菌(例如，产黄青霉(Penicilliumchrysogenum))和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。

细胞系SK-N-BE(2)(成神经细胞瘤细胞)已被成功用于在一定条件下制备3D组织培养模型的过程。应该理解的是，其他的细胞系也可以根据需要按照所开发的工艺制备3D组织模型。其他使用的细胞系包括DAOY(人成神经管细胞瘤癌细胞)、H460(人的非小肺癌细胞)和p53^R127H(人胰腺癌细胞)。其他可能适合的细胞系列于088和089。

3D生物打印技术被开发用于通过按需滴落技术生产包封在水凝胶模具中的高密度3D组织培养模型。具体而言，使用3D打印技术来打印生物相容性水凝胶模具，其使用以逐层构建生物墨水和活化剂的方式来制造各种3D结构。在制造水凝胶模具的过程中，可以将高细胞密度的液滴包含在水凝胶模具中。

实施例

实施例1

材料和方法

藻酸盐(高含量>55％的古洛糖醛酸含量，50,000-80000g/mol，FMC生物聚合物)，氯化钙(BioReagent，Sigma Aldrich)，不含氯化钙的磷酸盐缓冲溶液(PBS，Gibco)，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco)，无钙DMEM(Gibco)，丙酮酸钠(Gibco)，L-谷氨酰胺(Gibco)，结冷胶(Sigma Aldrich)，胰蛋白酶(Sigma Aldrich)，0.22μm针式过滤器(聚醚砜膜，Merck Millipore)，T150烧瓶(Corning)，15ml离心管(Corning)，乙醇(SigmaAldrich)。通过将DMEM与FCS(10v/v％)以混合来制备组织培养基。

细胞类型

使用SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞。

细胞培养

采用3ml PBS洗涤T150烧瓶中聚集了80％的神经母细胞瘤细胞。吸出过量的PBS后，加入3ml胰蛋白酶，将烧瓶在37℃温育以使细胞从烧瓶表面解离5分钟。随后，加入7ml组织培养基，并将解离的细胞转移到15mL管中。将细胞分散液以400×g的速度离心3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀(pellet)重新悬浮于5ml培养基中。然后通过混合等体积的细胞悬液和台盼蓝染色来确定细胞浓度进行细胞计数。

基底

使用由康宁公司提供的6孔微量滴定板。无菌包装在无菌环境中打开以保持内容物的无菌性。

生物墨水

将丙酮酸钠(5.5ml，100mM)、FCS(55ml)和L-谷氨酰胺(5.5ml，200mM)加入到无钙的DMEM(500ml)中以形成生物墨水分散剂。在剧烈搅拌下，将藻酸盐(0.2g)缓慢加入到分散剂(10ml)中，得到2w/v％的生物墨水。然后将得到的均匀溶液通过0.22μm针式过滤器在无菌环境下过滤。

活化剂

将氯化钙(0.4g)溶于10ml MilliQ水中，质量浓度为4w/v％。然后将溶液紫外灭菌10分钟，并在无菌环境中通过0.22μm过滤器过滤。

细胞墨水

将结冷胶(0.05g)溶于10ml温热的PBS中，质量浓度为0.5w/v％。当溶液冷却至室温时，将溶液涡旋。然后将溶液紫外灭菌10分钟，并在无菌环境中通过0.22μm过滤器过滤。

将分散在DMEM中的收获的神经母细胞瘤细胞以10×10⁶细胞/ml(5ml)离心，得到50×10⁶个细胞的细胞沉淀(pellet)。然后将得到的细胞团再分散在细胞墨水(0.2ml)中，得到具有250×10⁶个细胞/ml分散的SK-N-BE(2)细胞的生物墨水溶液。

细胞打印条件

首先用乙醇(70v/v％水溶液)擦拭打印机杀菌，干燥空气并置于生物安全柜内。液体管线和液滴分配系统也使用乙醇、水、无菌Milli-Q水和组织培养基按顺序进行杀菌。然后将含有细胞的细胞墨水，生物墨水和活化剂装入它们各自的小瓶中。然后，在开始打印程序之前，通过从流体供应管线排出空气来启动液滴分配系统。

每种流体的液滴分配系统在储存器中使用不同的喷嘴直径和供应压力。生物墨水，活化剂和含有细胞的细胞墨水的喷嘴的直径分别为0007”，0003”和0007”。生物墨水、活化剂和含有细胞的细胞墨水的供应压力分别为40,5和12psi。

如图2所示，水凝胶模具包括呈圆柱形式样的多层生物墨水和活化剂液滴。水凝胶模具中的每一层通过沉积一滴生物墨水，然后将一滴激活剂直接放在顶部或反之亦然，并重复该过程以形成圆柱形结构来打印。在生物墨水或活化剂的前两层没有沉积在圆柱形结构的中心处后，在结构的中心处形成凹陷或杯子。对于多个后续层重复该过程。将一至五滴含有细胞的细胞墨水液滴沉积到水凝胶模具的中心或杯子中。最后，以相同的方式打印其他的水凝胶层以将细胞包封在水凝胶模具内。

打印完成后，将微量滴定板置于培养箱(37℃和5％CO ₂)中72小时。

细胞浓度

在实验中使用含有250×10⁶个细胞/ml的SK-N-BE(2)的细胞墨水。

细胞存活率

获得大于或等于95％的细胞存活率。

实施例2

如实施例1中所述，使用生物墨水、细胞墨水和活化剂，分别在40psi，12psi和5psi的供应压力下打印水凝胶模具或杯子。将细胞墨水中的SK-N-BE(2)细胞以1亿个细胞/ml的浓度打印在水凝胶杯的中心。打印的3D细胞培养模型的显微镜图像显示孵育24小时，48小时和120小时后细胞球体形成。

实施例3

如实施例1所述，使用生物墨水和活化剂在40psi和5psi的供应压力下分别打印水凝胶模具或杯子。细胞墨水是溶于PBS(10ml)中的Ficoll^TM(Sigma Aldrich，1.65g)，使其质量浓度为16.5w/v％。将细胞墨水中的SK-N-BE(2)细胞在20psi的供应压力下以25亿个细胞/ml的浓度打印到水凝胶杯的中心。打印的3D细胞培养模型的显微镜图像显示，孵育24，48和72小时后细胞球体形成。

实施例4

如实施例3中所述，使用生物墨水、细胞墨水和活化剂，分别在40psi，20psi和5psi的供应压力下打印水凝胶模具或杯子。将细胞墨水中的p53^R127H细胞以25亿个细胞/ml的浓度打印到水凝胶杯的中心。打印模型的显微镜图像显示，在孵育24小时，48小时和72小时后细胞球体形成。

实施例5

如实施例3中所述，使用生物墨水、细胞墨水和活化剂，分别在40psi和5psi的供应压力下打印水凝胶模或杯。细胞墨水是溶于PBS(10ml)中的Ficoll^TM(Sigma Aldrich，1g)，使其质量浓度为10w/v％。在20psi的供应压力下，以25亿细胞/ml的浓度将细胞墨水中的p53^R127H细胞打印到水凝胶杯的中心。封装细胞滴的模具在37℃孵育24小时至48小时后允许细胞生长和球体形成。

实施例6

如实施例5所述，使用生物墨水、细胞墨水和活化剂，分别在40psi，20psi和5psi的供应压力下打印水凝胶模具或杯子。将细胞墨水中的DAOY细胞以25亿个细胞/ml的浓度打印到水凝胶杯的中心。封装细胞滴的模具在37℃孵育24小时至48小时后细胞生长和球体形成。

实施例7

如实施例5所述，使用生物墨水、细胞墨水和活化剂，分别在40psi，20psi和5psi的供应压力下打印水凝胶模具或杯子。将细胞墨水中的H460细胞以25亿个细胞/ml的浓度打印在水凝胶杯的中心。封装细胞滴的模具在37℃孵育24小时至48小时后细胞生长和球体形成。

实施例8

如实施例5所述，使用生物墨水，细胞墨水和活化剂，分别在40psi，20psi和5psi的供应压力下打印水凝胶模具或杯子。将细胞墨水中的SKOV-3细胞以25亿个细胞/ml的浓度打印在水凝胶杯的中央。封装细胞滴的模具在37℃孵育24小时至48小时后细胞生长和球体形成。

应用

3D组织培养模型试验

3D组织培养模型试验在多孔板(例如96孔板)的孔内构建进行。第一步是打印支持3D组织培养模型的圆柱形水凝胶结构或模具的下半部分。这是通过使用生物墨水和活化剂的滴落过程来实现的。然后将含有高密度细胞的细胞墨水液滴打印到圆柱形水凝胶结构的中心，如图3所示。随后将3D组织培养模型通过使用生物墨水和活化剂的滴落(drop-on-drop)工艺进一步打印而包封在水凝胶中。最后，通过有或没有药物或其他测试剂(50,100,150或200μl)的生长培养基沉积来完成孔上的打印过程。

体外应用

生物表型的检测，包括但不限于细胞运动性，细胞迁移，细胞侵袭，跨内皮迁移，上皮-间充质转变，间充质-上皮转变，球体形成和生长，细胞分化(更具体的干细胞分化，监测细胞分化标志物)，细胞死亡(更特异的细胞凋亡，细胞坏死)，细胞自噬，细胞增殖，细胞代谢，蛋白质转化，蛋白质分布和定位，细胞信号传导和下游事件，药物功效，药物药效学，药物受体介导的运输，药物内化机制，生物标志物评估，细胞-细胞连接，细胞-细胞信号传导和下游事件，细胞形态，细胞粘附，基因表达，蛋白质表达，细胞归巢，细胞周期调控和控制，细胞因子释放，胰岛素产生，蛋白质分泌和细胞内运输和转运，受体蛋白质磷酸化，蛋白酶体功能，酶功能(更具体的酶抑制)，免疫调节，克隆形成性，氧化应激，蛋白质折叠，细胞骨架，细胞器形态和功能(更具体地说涉及线粒体，叶绿体，过氧化物酶体，分泌小泡，液泡，核糖体，细胞核，溶酶体，纤毛，内质网，高尔基体)，膜转运，缺氧，血管生成，伤口愈合，神经突(生长或形成)，激酶功能，磷酸酶功能，板状体形成和动力学；焦点接触/粘连形成，动力学和信号传导；细胞传感，机械力传导。

可递送或给予细胞的物质列表包括但不限于药剂，治疗剂，抗体，小分子抑制剂，激酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，抗原，病原体，血小板，生长因子，细胞因子，氨基酸，营养素(单糖和多糖)，条件培养基，抗生素，抗病毒剂，纳米颗粒，RNA和相关变体(例如siRNA，miRNA等)。

打印结构类型

打印的一种结构是局部由没有细胞的区域构成，至少一个区域含有至少一个球形体。

打印的一种结构至少包含两个球形体，其中不同的球体可以由相同或不同的细胞类型组成。

打印的一种结构包含相邻毗连球体的结构，其中毗连的球体可以由相同或不同的细胞类型组成。

打印的一种结构至少含有一种上述所列的物质。

本领域技术人员将会理解，可以对具体实施方式中所示的本发明进行多种变化和/或修改，而不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围。因此，本实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。

参考文献

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Claims

1.一种制备3D组织培养模型的方法，该方法包括：

(a)将生物墨水液滴打印到基底上；

(b)将活化剂液滴打印到生物墨水液滴上以形成水凝胶滴；

(d)将含有细胞的液滴打印到水凝胶模具；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括将含有细胞的细胞墨水液滴打印到所述水凝胶模具。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括在步骤(e)之前，打印含有细胞的生物墨水液滴，并将活化剂液滴打印到含有细胞的生物墨水的液滴上。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述基底适于包含，保存或生长细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基底选自不同孔构型的微量滴定板(6，24，48和96孔)，具有不同孔构型(6，24，48和96孔)的盖玻片底部的微量滴定板，fluorodish培养皿，不同的腔室载玻片(1，2，4，8和16)，盖玻片或显微镜载玻片。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物墨水加入合适的活化剂时形成水凝胶，并与细胞相容。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生物墨水包括合成大分子，携带胺反应性官能团的聚合物，具有硫醇反应性官能团的聚合物，含有果糖，蔗糖或葡萄糖官能团的聚合物，非离子聚合物，聚电解质或天然大分子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，合成大分子为多糖，带有胺反应性官能团的聚合物为醛，环氧，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯(VDM)，具有巯基反应性官能团的聚合物是烯烃，炔烃，叠氮化物，卤素或氰酸酯；非离子聚合物是聚乙二醇(PEG)，聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)，聚ε-己内酯(PCL)，聚乙烯醇(PVA)，聚(NIPAAM)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)和衍生物；天然大分子为藻酸盐，壳聚糖，透明质酸，琼脂糖，糖胺聚糖或甲基纤维素，蛋白质，明胶，纤维蛋白，胶原蛋白或基底膜提取物。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化剂用于将所述生物墨水形成为水凝胶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，活化剂包括无机盐和光引发剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，无机盐为氯化钡，碳酸钙，氯化钙，氯化钠，硫酸镁或氢氧化钠，光引发剂为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)和Irgacure。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述生物墨水是藻酸盐并且所述活化剂是氯化钙。

13.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞墨水选自结冷胶，Ficoll ^TM，葡聚糖，甘油，藻酸盐，甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，细胞墨水为结冷胶。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，细胞墨水为Ficoll^TM。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，还包括在一定温度和条件下孵育封装在所述水凝胶模具中的所述细胞，以允许或维持细胞生长或球体形成。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述3D组织培养模型是细胞球体。

18.一种根据权利要求1-17任一项所述的方法制备的3D组织培养模型。

19.3D组织培养模型包括封装在由3D生物打印机形成的水凝胶中的细胞液滴。

20.一种如权利要求18或19所述的3D组织培养模型在细胞测定中的应用。