IT201800005459A1

IT201800005459A1 - Composizione comprendente un idrogel

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Publication number: IT201800005459A1
Application number: IT102018000005459A
Authority: IT
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2019-11-17
Also published as: WO2019220357A1

Description

Titolo: "COMPOSIZIONE COMPRENDENTE UN IDROGEL"

La presente invenzione si riferisce a una composizione sotto forma di idrogel comprendente cellule tumorali vitali e a un metodo per la sua preparazione.

Il neuroblastoma (NB) è il quarto tumore più comune nei bambini, e il più frequente extracraniale. L'utilizzo di colture monostrato bidimensionali (2D) di linee cellulari cancerose come semplice modelli per studiare in vitro i processi alla base dell’insorgenza e progressione tumorale risalgono agli anni '50. Tuttavia, similmente agli organi sani, i tessuti tumorali sono entità 3D, comprendenti cellule circondate da abbondante matrice extracellulare. Fino ad oggi, è generalmente riconosciuto che le colture di linee cellulari monostrato soffrono di numerose inadeguatezze nella riproduzione di fenomeni d’insorgenza tumorale che avvengono realmente in vivo, limitando quindi la loro capacità di predire il reale comportamento delle cellule cancerogene (LC Kimlin, et al., "In vitro threedimensional (3D) models in cancer research: an update." Molecular carcinogenesis 52.3 (2013): 167-182).

In primo luogo, le attuali colture 2D di cellule tumorali non riescono a mimare la biologia e la progressione della malattia, mentre l’utilizzo di sistemi 3D permette potenzialmente di includere più fattori (chimici, fisici e di conformazione spaziale) in grado di emulare la complessità architetturale della massa tumorale, consentendo una migliore accuratezza del modello e, pertanto, contribuendo a una migliore modellizzazione dei fenomeni di evoluzione della malattia.

Infatti, spesso, medici e ricercatori hanno evidenziato risultati contraddittori tra i test preclinici (in vitro) e i risultati clinici (in vivo) relativamente alla validazione di trattamenti anti-tumorali in termini di efficacia. In particolare, i modelli 2D in genere mostrano una risposta molto più elevata agli agenti terapeutici rispetto alle osservazioni cliniche.

Nel processo di validazione di terapie anti-tumorali, i risultati ottenuti dai test cellulari preclinici vengono poi traslati in modelli animali chiamati “xenotrapianti”, che consistono in innesti in animale di tessuto originario da un'altra specie (e.g. uomo) e che sono, ad oggi, riconosciuti come l'ambiente 3D più vicino al nostro organismo, prima della traduzione clinica. Sfortunatamente, accanto a rilevanti implicazioni etiche, questi xenotrapianti sono generati da topi immuno-compromessi, cioè senza il sistema immunitario, che limitano la possibilità di studiare gli effetti del microambiente umano e il suo sistema immunitario sulla crescita tumorale. Inoltre, numerose altre limitazioni dei modelli murini sono ormai evidenti, per esempio: (i) il tumore del paziente potrebbe non innestarsi nel topo, (ii) gli impianti sottocutanei o ortotropici non riflettono accuratamente il microambiente tumorale, (iii) a seconda del tipo di tumore, le efficienze di attecchimento del tumore in animale variano in modo significativo, non consentendo la creazione di protocolli standard, (iv) la propagazione del tumore nel topo può causare diversi cambiamenti microambientali che potrebbero non riflettere il tumore umano in modo accurato. Quindi, sono in fase di sviluppo diversi modelli 3D, che combinano i vantaggi dei modelli 2D in vitro (controllo spaziale, temporale rispetto alle condizioni biofisiche, relativa facilità di manipolazione e analisi rispetto ai modelli animali) e dei modelli in vivo che presentano un più alto grado di fedeltà.

Tra i primi modelli 3D utilizzati vi sono gli sferoidi tumorali, formati dall'autoaggregazione spontanea di cellule tumorali su una superficie non adesiva. I modelli sferoidali del tumore replicano caratteristiche specifiche dei tumori in vivo, come le condizioni ipossiche centrali, eterogeneità nel fenotipo e espressione genica e metabolismo cellulare alterato. In particolare, gli sferoidi sono aggregati di cellule che consentono di riprodurre le reali interazioni cellulacellula e cellula-matrice extracellulare dei tessuti neoplastici. La tecnica con cui vengono comunemente realizzati si chiama “hanging drop” e consiste nella deposizione di “gocce” (drops) composte da un’alta concentrazione di cellule. Sebbene questo metodo sia semplice ed economico, le dimensioni e l'uniformità delle gocce sono poco controllabili e riproducibili.

In particolare, tali modelli presentano diverse limitazioni. Essi, infatti, sono suscettibili a disgregazione fisica durante la manipolazione e la sperimentazione, e le condizioni microambientali, come per esempio la presenza di matrice extracellulare (ECM), interazioni cellula-matrice, rigidità meccanica, non possono essere controllate. Inoltre, i limiti di trasporto di massa e il rilascio di farmaci anticancro nei tumori in vivo non possono essere replicati con precisione a causa della secrezione non uniforme della matrice extracellulare endogena da parte degli sferoidi.

Pertanto, negli ultimi decenni, sono stati sviluppati nuovi modelli di tumore basati su materiali ingegnerizzati (principalmente idrogel) in cui le cellule tumorali possono essere incapsulate all'interno di matrici (perlopiù polimeriche), che sono geometricamente simili per dimensioni e forma agli sferoidi tumorali.

Questi modelli hanno fornito nuovi metodi per accelerare la ricerca sul cancro, in particolare migliorando la qualità della ricerca oncologica preclinica, necessaria nello sviluppo e il testing di innovative terapie antitumorali.

Nonostante negli ultimi anni sia aumentato l’interesse per questi nuovi modelli 3D basati su idrogel, in letteratura sono presenti pochi lavori relativi allo sviluppo di materiali ingegnerizzati per la modellizzazione del neuroblastoma, seppur sia un tipo di tumore particolarmente aggressivo e il tumore extracranico più comune nei neonati e il quarto nei bambini.

Uno degli aspetti critici nello sviluppo di modelli tumorali è infatti la regolazione delle proprietà biomeccaniche del substrato all’interno del quali crescono le cellule (meccanobiologia). In particolare, le proprietà meccaniche hanno la capacità di modulare la risposta biologica nelle fasi di adesione, migrazione, vitalità nonché in termini di espressione di marker tipici della neoplasia (e.g. recettori di membrana) fondamentali nello sviluppo di nuove terapie immunologiche in quanto bersaglio terapeutico. Una progettazione errata delle proprietà meccaniche (stiffness) del substrato e/o una scelta errata del polimero può infatti condizionare significativamente l’outcome biologico.

Nello specifico, per il neuroblastoma, sono stati sviluppati modelli a base di idrogel di collagene con cellule di neuroblastoma e cellule staminali stromali inglobate al loro interno (P. Yeung, et al. "Microencapsulation of neuroblastoma cells and mesenchymal stromal cells in collagen microspheres: a 3D model for cancer cell niche study." PloS one 10.12 (2015): e0144139); sono stati proposti idrogel a base di collagene e Matrigel™ arricchiti di cellule umane di neuroblastoma della linea SH-SY5Y (GN Li, et al. "Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices." Tissue engineering 13.5 (2007): 1035-1047; A Desai, et al. "Human neuroblastoma (SH-SY5Y) cell culture and differentiation in 3-D collagen hydrogels for cell-based biosensing" Biosensors and Bioelectronics 21.8 (2006): 1483-1492), e scaffold a base di collagene in cui sono state coltivate al loro interno due diverse linee cellulari di neuroblastoma: KellyLuc and KellyCis83Luc (C. Curtin, et al. "A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models." Acta biomaterialia 70 (2018) :84-97).

Tuttavia, questi approcci basati sull’utilizzo di polimeri di origine animale (collagene e gel di matrice extracellulare (ECM) da sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm, es. Matrigel™ avente contenuto di proteine secondo Lowry da 8 a 12 mg/ml, prodotto da Corning Life Science) presentano diversi limiti come la difficile riproducibilità dovuta a variazioni tra i vari lotti e la scarsa possibilità di modellizzazione, rendendo pressoché impossibile la modellizzazione di alcuni aspetti biomeccanici discussi sopra cruciali nell’insorgenza e progressione della neoplasia. Inoltre collagene e gel di matrice extracellulare (ECM) da sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm, di seguito abbreviato anche come "ECM gel", sono usualmente utilizzati in stato liquido e richiedono una manipolazione a basse temperature per evitare la prematura gelificazione, rendendo a volte difficoltosa la loro manipolazione e gestione con cellule vitali e materiale biologico.

Vi è quindi la necessità di sviluppare un nuovo modello 3D di tumore, e in particolare di neuroblastoma, biologicamente accurato per poter studiare gli eventi microambientali, che attualmente compromettono la prognosi dei pazienti oncologici, e per sviluppare nuovi sistemi di screening dei farmaci per trattamenti antitumorali più efficaci. In particolare, l’accuratezza e affidabilità del modello di neuroblastoma si sostanzia nella espressione di marker tipici della neoplasia e nella proliferazione cellulare. Le cellule di neuroblastoma devono infatti esprimere PVR, un ligando DNAM-1 cruciale per il riconoscimento da parte di cellule del sistema immunitario (R. Castriconi, et al., "Natural killer cell-mediated killing of freshly isolated neuroblastoma cells: critical role of DNAX accessory molecule-1–poliovirus receptor interaction." Cancer research 64.24 (2004): 9180-9184).

Forma oggetto della presente invenzione una composizione comprendente o consistente di:

i. cellule vitali primarie, di linea o derivanti da paziente di neuroblastoma; e

ii. un idrogel comprendente alginato in una soluzione acquosa o una miscela polimerica comprendente alginato e almeno un polimero idrofilo (PI) diverso da alginato, in cui l'alginato e il polimero (PI) sono presente all’interno dell’idrogel in rapporti volumetrici da 99,9/0,1 a 1/99, dove l’idrogel ii. è reticolato mediante reticolazione ionica a base di ioni calcio o cross-link fisico controllato, tale da permettere una elasticità finale dell’idrogel, misurabile con tecnica AFM, compresa tra 2 e 4000KPa.

Le cellule di neuroblastoma sono inglobate all’interno dell’idrogel con una densità che può variare, preferibilmente, ma senza limitazione, da 2 milioni a 6 milioni di cellule per ml.

La soluzione acquosa comprendente alginato nell'idrogel ii. può consistere di acqua e alginato o comprendere anche altri componenti, ad esempio, senza limitazioni, può essere una soluzione salina, una soluzione fisiologica, può comprendere un tampone, ad esempio fosfato, o altro.

Il modulo elastico degli idrogel può essere opportunamente regolato variando la concentrazione del polimero e del reticolante e raggiungendo valori compresi tra E= 2 kPa e E= 4000 kPa, ad esempio da 20 a 2000 kPa. Questa modularità delle caratteristiche di elasticità permette di studiare gli effetti che le proprietà meccaniche degli idrogel hanno sulla migrazione delle cellule tumorali e sulla crescita e progressione tumorale.

Forma inoltre oggetto della presente invenzione un metodo per realizzare una composizione come sopra definita, in cui il metodo comprende i seguenti passaggi:

(a) la formazione di una composizione comprendente acqua e almeno un polimero idrofilo in grado di formare un idrogel come sopra definito;

(b) la sospensione di cellule vitali di tumore e in particolare di neuroblastoma di un primo tipo nella soluzione polimerica precursore dell’idrogel ottenuta nel passaggio (a);

(c) la reticolazione del polimero nella sospensione ottenuta nel passaggio (b) a ottenere l'idrogel con cellule di tumore e in particolare di neuroblastoma incorporate al suo interno.

Forma, inoltre, oggetto della presente invenzione l'uso della composizione come sopra definita comprendente un idrogel e cellule di neuroblastoma come modello in vitro tridimensionale di neuroblastoma e, preferibilmente, come piattaforma di testing di molecole.

Se non diversamente indicato, nell’ambito della presente invenzione le percentuali e le quantità di un componente in una miscela sono da riferirsi al peso di tale componente rispetto al peso totale della miscela.

Se non diversamente specificato, nell'ambito della presente invenzione l’indicazione che una composizione “comprende” uno o più componenti o sostanze significa che altri componenti o sostanze possono essere presenti oltre a quello, o quelli, specificamente indicati.

Se non diversamente specificato, nell'ambito della presente invenzione un intervallo di valori indicato per una grandezza, per esempio il contenuto in peso di un componente, include il limite inferiore e quello superiore dell'intervallo. Ad esempio, se il contenuto in peso o in volume di un componente A è indicato come "da X a Y", dove X e Y sono valori numerici, A può essere X o Y o uno qualsiasi dei valori intermedi.

Gli inventori hanno sorprendentemente trovato che è possibile realizzare un modello in vitro tridimensionale di neuroblastoma umano, realizzando un idrogel a base di almeno un polimero idrofilo e comprendente cellule umane vitali di neuroblastoma incapsulate al suo interno.

In particolare, è opportuno scegliere e modulare le caratteristiche dell’idrogel anche considerando la tipologia di tessuto tumorale da modellizzare. Le cellule incapsulate secondo l'invenzione sono in grado di proliferare e di aggregarsi all’interno dell’idrogel e hanno la capacità di esprimere proteine di superficie tipiche delle cellule di neuroblastoma ed essenziali nella progressione tumorale. Tramite la composizione dell'invenzione, quindi, si è ottenuto in vitro un sistema 3D complesso contenente un idrogel polimerico in cui le cellule sono in grado di esprimere almeno una proteina tipica del tumore e necessaria per lo sviluppo di terapie immunologiche (dal momento che le cellule del sistema immunitario riconoscono proprio proteine di questo tipo).

In questo modo, è stato ottenuto un biomateriale utilizzabile come attendibile modello in vitro per il neuroblastoma, per lo screening nelle fasi pre-cliniche di farmaci e terapie anti-tumorali, che permette di ridurre il numero di fallimenti che avvengono nelle primissime fasi di test clinici.

Descrizione delle Figure

Tale descrizione verrà esposta qui di seguito con riferimento agli uniti disegni, forniti a solo scopo indicativo e, pertanto, non limitativo.

FIG. 1 Rappresentazione del procedimento di preparazione dell’idrogel di alginato di forma sferica con incapsulate cellule umane di neuroblastoma della linea HTLA-230 e immagini rappresentanti le cellule marcate in fluorescenza che mostrano il loro avvenuto incapsulamento all’interno degli idrogel.

FIG. 2 Immagini in fluorescenza rappresentanti l’espressione o meno di proteine di superficie dopo 7 giorni di coltura. Per ogni proteina analizzata vengono mostrate immagini dell’idrogel in luca trasmessa, fluorescenza e la combinazione delle due.

FIG. 3 Immagini in fluorescenza rappresentanti l’espressione o meno di proteine di superficie dopo 7 giorni di coltura con e senza un fattore solubile (Interferone gamma (IFNg)) nel mezzo di coltura. Per ogni proteina analizzata vengono mostrate immagini dell’idrogel in fluorescenza.

Nel contesto della presente invenzione, per cellula vitale si intende una cellula in grado di riprodursi e di dare progenie e/o di espletare almeno una funzione metabolica come, per esempio non limitativo, la produzione di almeno una proteina.

In una forma di realizzazione preferita, nella composizione secondo la presente invenzione, l'idrogel tridimensionale comprende o consiste di alginato con incorporate cellule di neuroblastoma.

In una forma di realizzazione, l’idrogel è composto da alginato e uno o più altri polimeri idrofili, per esempio alginato e ECM gel, presenti all’interno dell’idrogel in rapporti volumetrici (alginato/ECM gel) da 99,9/0,1 a 1/99, preferibilmente da 99/1 a 20/80, da 90/10 a 25/75, da 80/20 a 40/60 o da75/25 a 50/50. Gli inventori hanno trovato che è possibile bilanciare opportunamente le caratteristiche finali dell’idrogel, in particolar modo la bioattività conferita dal substrato proteico (ECM gel) con la sua consistenza meccanica, conferita, tra l'altro, dall’alginato, che ne permette la coltura in vitro per periodi di tempo prolungati.

Nella composizione secondo la presente invenzione, le cellule di neuroblastoma sono inglobate all’interno dell’idrogel con una densità che può variare da 2 milioni a 6 milioni di cellule per ml (volume totale di idrogel).

Il modulo elastico degli idrogel può variare da E= 20 kPa a E= 4000 kPa, modulando la densità del polimero e la concentrazione di ioni calcio con cui si reticola la soluzione polimerica. Questo permette di studiare gli effetti che le proprietà meccaniche degli idrogel hanno sulla crescita e progressione tumorale. Il modulo elastico è stato misurato impiegando la tecnica della microscopia a forza atomica (AFM) e analizzando le curve di forza-spostamento ottenute per effetto del cantilevel sulla superficie del gel (A. M. Kloxin, et al., "Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination." Advanced materials (2010) 22.31: 3484-3494).

In una forma di realizzazione preferita, detto idrogel comprende alginato reticolato con ioni calcio.

In una forma di realizzazione preferita, l'idrogel comprende almeno due polimeri idrofili, in cui almeno uno di detti due polimeri idrofili è alginato.

In una forma di realizzazione preferita, l’idrogel comprende alginato e un altro polimero naturale, tra collagene, gel di matrice extracellulare (ECM) da sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm, gelatina, PEG, o altri polimeri di origine naturale o sintetica.

Il modello può essere eterotipico o omotipico, cioè può essere relativo a un solo tipo di cellule o a più di uno, e le cellule in coltura possono includere, ma non sono limitate a, cellule tumorali e/o cellule sane. Il sistema di coltura cellulare 3D può, cioè, comprendere una pluralità di cellule dello stesso tipo o di diversi tipi di cellule.

Quando nel modello si coltivano due o più tipi cellulari, questo può essere utilizzato, per esempio, per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule o per lo screening di farmaci ad alto rendimento in un ambiente di cellule eterotipico. In una forma di realizzazione della presente invenzione, possono essere applicate strategie d’ingegneria tissutale per ricreare le tipiche interazioni cellula-microambiente (ad es. interazioni 3-D cellula-cellula e cellulaextracellulare, rigidità meccanica, presenza del fattore solubile).

Questi sistemi di coltura 3D possono essere utilizzati per studiare il "cross-talk" fisico-chimico tra cellule tumorali (es. cellule di neuroblastoma) e cellule sane (ad es. cellule staminali) e valutare l'importanza di questo meccanismo sulla progressione del tumore e, viceversa, sulla reattività alla terapia anti-cancro.

La composizione secondo la presente invenzione fornisce un microambiente tumorale patologicamente rilevante. Il microambiente tumorale patologicamente rilevante può essere utilizzato per scopi di ricerca di base o per screening di terapie (screening farmacologico). In una forma di realizzazione preferita, il microambiente tumorale patologicamente rilevante secondo la presente invenzione può essere utilizzato per lo screening farmacologico, anche, senza limitazione, ad alto rendimento (high throughput).

In una forma di realizzazione, l'idrogel è approssimativamente di forma sferica, geometricamente simile per dimensione e forma agli sferoidi tumorali.

Detta sfera può incorporare una o più tipi di cellule.

Gli alginati sono polimeri polisaccaridi versatili che possono essere manipolati per applicazioni specifiche controllando il peso molecolare, il tasso di degradazione e il metodo di formazione del gel. Gli idrogel di alginato possono assumere una varietà di forme.

In una forma di realizzazione, gli idrogel sono di forma sferica e sono ottenuti mediante l’estrusione di soluzione polimerica combinata con cellule di neuroblastoma in un bagno arricchito di agenti reticolanti (ioni calcio).

In una forma di realizzazione gli idrogel sono di forma cilindrica (di qualsiasi dimensione) ottenuti mediante l’utilizzo di stampi di agarosio contenenti ioni calcio.

In una forma di realizzazione, la presente invenzione è diretta all'uso della composizione come sopra definita come un modello in vitro tridimensionale di neuroblastoma.

In una forma di realizzazione, la presente invenzione fornisce un metodo per lo screening di farmaci antitumorali e/o di qualsiasi altro farmaco, molecola, principio attivo, estratto naturale, pianta o suoi derivati, in cui detto screening comprende mettere a contatto della composizione comprendente o consistente di cellule vitali di un neuroblastoma e un idrogel comprendente acqua e almeno un polimero idrofilo, come sopra definita, almeno un farmaco antitumorale oggetto dello screening.

Per "mettere a contatto" si intende, in ogni modo noto al tecnico del ramo, fare in modo che detto farmaco o altra sostanza/composizione da testare possa avere un'interazione farmacologica con le cellule tumorali comprese in detta composizione per esempio, senza limitazione, infondere detto farmaco in detta composizione o porre la composizione come sopra definita in una soluzione comprendente detto farmaco antitumorale o altra sostanza/composizione da testare.

Modelli di tumori umani ingegnerizzati (o "tumori biomimetici") possono essere scalati e convalidati, utilizzando metodi standard, per lo screening, anche, ma non solo, ad alto rendimento (high throughput) di farmaci anti-cancro. Imitando le tipiche condizioni microambientali dei tumori umani, il metodo fornito dalla presente invenzione supera le note limitazioni associate agli approcci di coltura cellulare convenzionale e ai modelli animali non umani.

I sistemi di coltura cellulare tridimensionale forniti dall'invenzione possono essere utilizzati per ridurre drasticamente i costi di sviluppo del farmaco per l'industria farmaceutica (attualmente stimato intorno a $ 1.4 miliardi per ogni nuovo farmaco).

Costituisce una forma di realizzazione della presente invenzione un metodo per realizzare la composizione come sopra definita, per esempio per produrre un modello 3D in vitro di neuroblastoma, in cui detto metodo comprende almeno i seguenti passaggi:

(a) la formazione di una composizione comprendente acqua e almeno un polimero idrofilo come sopra definita in grado di formare un idrogel;

(b) sospensione di cellule vitali di neuroblastoma di un primo tipo nella soluzione polimerica precursore dell’idrogel ottenuta nel passaggio (a);

(c) reticolazione del polimero nella sospensione ottenuta nel passaggio (b) ad ottenere l'idrogel con cellule di neuroblastoma incorporate al suo interno.

In una forma di realizzazione preferita, il metodo secondo la presente invenzione prevede inoltre l’utilizzo di cellule di un secondo tipo, differente da quello delle cellule di neuroblastoma del primo tipo, e in cui le cellule del secondo tipo vengono sospese all’interno della stessa composizione comprendente acqua e l'almeno un polimero idrofilo nel passaggio (b) insieme alle cellule di neuroblastoma di un primo tipo prima della reticolazione (c) del polimero ad ottenere un idrogel comprendente cellule di neuroblastoma del primo tipo e cellule del secondo tipo.

In una forma di realizzazione preferita, la soluzione di idrogel comprende solamente alginato come polimero idrofilo.

In una forma di realizzazione, la soluzione di idrogel comprende alginato e un altro polimero naturale, tra collagene, gel di matrice extracellulare (ECM) da sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm, gelatina, PEG, o altri polimeri.

In una forma di realizzazione, l'incorporazione delle cellule nell'idrogel viene realizzata mettendo a contatto la composizione del passaggio (b), comprendente le cellule sospese nella soluzione di idrogel, in una soluzione di reticolazione comprendente di ioni calcio.

In un'altra forma di realizzazione preferita, l'idrogel ottenuto nel passaggio (c) è uno sferoide con un diametro che varia da 2 millimetri a 5 millimetri in base all’estrusore utilizzato. In particolare, la soluzione polimerica di partenza può avere una concentrazione di 1% in peso di polimero rispetto al volume totale della soluzione (w/v).

Nel passaggio (b), è preparata una miscela di una prima sospensione contenente le cellule di neuroblastoma e di una soluzione comprendente un polimero idrofilo del passaggio (a), ad esempio con un rapporto volumetrico di 1/1 tra la prima sospensione e la soluzione polimerica, pertanto la concentrazione finale dell’idrogel è 0.5% in peso rispetto al volume totale della composizione ottenuta nel passaggio (b).

In una forma di realizzazione, la miscela contenente cellule di neuroblastoma e la soluzione polimerica viene estrusa con un ago in una soluzione contente ioni calcio alla concentrazione di 0,5 M, formando sfere di dimensioni di 2 mm di diametro.

In una forma di realizzazione gli idrogel sono cilindri (di qualsiasi dimensione) ottenuti mediante l’utilizzo di stampi di agarosio arricchiti di ioni calcio, in particolare la sospensione di cellule di neuroblastoma inglobate nella soluzione polimerica viene versata all’interno di stampi realizzati all’interno di gel di agarosio. Il calcio presente nei gel di agarosio reticola la soluzione polimerica formando idrogel cilindrici di dimensione variabile, a seconda dello stampo utilizzato. Questa tecnica permette di realizzare idrogel di dimensione e forma predefinita, in base alla geometria dello stampo utilizzato.

In un'altra forma di realizzazione, la soluzione polimerica di partenza ha una concentrazione di 1% in peso di polimero rispetto al volume totale della soluzione (w/v).

In un'altra forma di realizzazione, la densità cellulare è 5 × 10<6 >cellule / ml nella soluzione di idrogel.

In una forma di realizzazione, uno o più tipi di cellule (staminali mesenchimali, linfociti natural killer (NK)) possono essere disperse o incorporate all'interno dell'idrogel.

I vantaggi della presente invenzione sono molteplici. In particolare, l’utilizzo dell’alginato come polimero bulk conferisce riproducibilità e stabilità chimicofisica e strutturale al modello, caratteristiche difficilmente ottenibili mediante l’uso di polimeri naturali di origine animale, come collagene e ECM gel. Inoltre, l’alginato permette di modellizzare diversi aspetti degli idrogel (proprietà biomeccaniche, capacità di assorbimento di fluidi (swelling), bioattività variando la sua densità e la concentrazione di ioni calcio, mediante i quali avviene la reticolazione del polimero.

Inoltre, all’interno degli idrogel realizzati secondo la presente invenzione, le cellule di neuroblastoma (NB) esprimono specifiche proteine di superficie relative alla crescita tumorale. In particolare, è stata osservata mediante immunocolorazioni una proteina chiamata PVR (polivirus receptor) espressa dalla maggior parte dei tumori di NB, che consente il riconoscimento del tumore dalle cellule del sistema immunitario Natural Killer (NK). PVR è pertanto un target promettente per le terapie antitumorali, dal momento che è sovra-espresso nel neuroblastoma e attiva l’attività citolitica delle NK contro il NB.

Inoltre, gli idrogel contenenti alginato secondo la presente invenzione hanno dimostrato essere dei validi modelli anche in termini di diffusione di citochine, molecole proteiche prodotte dalle cellule del sistema immunitario, secrete nel mezzo circostante e in grado di rilasciare segnali biochimici.

In particolare, gli idrogel sono stati coltivati in presenza della citochina Interferone Gamma (IFN-γ), un fattore solubile che viene rilasciato dalle NK, al fine di riprodurre i segnali biochimici che vengono rilasciati dal sistema immunitario in presenza della neoplasia; l’applicazione di IFN- γ ha causato nei modelli di NB a base di alginato una chiara induzione dell’espressione di marker tipici di superficie (PD-L1, PD-L2 e HLA-1) sulla linea cellulare di NB HTLA-230, associata alla down-regolazione del PVR mostrando l’accuratezza e l’affidabilità biologica del modello. Questo risultato biologico, per la prima volta osservato in un modello 3D, è perfettamente allineato con i risultati ottenuti sui pazienti di NB; inoltre, le modifiche di espressione di PD-L2 e PVR non vengono rilevate in 2D, evidenziando i limiti dei modelli tradizionali.

Pertanto, gli idrogel realizzati secondo la presente invenzione rappresentano dei modelli in cui le cellule esprimono marker tipici della neoplasia e adatti, quindi, a testare in vitro terapie immunologiche basate sul potenziamento delle cellule del sistema immunitario Natural Killer.

I seguenti esempi sono forniti per illustrare alcune forme di realizzazione dell'invenzione, senza limitarne lo scopo.

Questo esempio mostra lo sviluppo di un modello 3D di neuroblastoma in vitro. Questo modello biomimetico può essere utilizzato per testare farmaci o nuove terapie anti-tumorali in condizioni di coltura più realistiche.

Nello specifico, è stato sviluppato e caratterizzato un modello 3D di neuroblastoma basato su sfere di alginato e cellule umane di neuroblastoma (HTLA-230).

Le cellule di neuroblastoma sono state incorporate in idrogel di alginato (1% w/v) con un rapporto volumetrico tra soluzione polimerica di partenza e sospensione cellulare 1:1 v/v. La densità cellulare all’interno dell’idrogel è di 4 milioni/ml. Usando una specifica colorazione in fluorescenza “Dead/Alive kit” a base di calceina e ioduro di propidio, le cellule sono state osservate attraverso microscopia a fluorescenza per valutare la vitalità cellulare durante la procedura di incapsulamento e formazione dell’idrogel (figura 1).

La proliferazione cellulare è stata monitorata attraverso un kit metabolico fino a 1 settimana di coltura (Presto Blue assay).

Le cellule HTLA-230 hanno mantenuto un buon livello di vitalità durante il processo di incapsulamento, e la curva di proliferazione è crescente mostrando che le cellule sono capaci di duplicarsi e proliferare all’interno dell’idrogel di alginato.

Per esaminare la neoplasia tumorale e l’espressione di proteine di superficie tipiche delle forme più aggressive di neuroblastoma, gli idrogel sono stati analizzati mediante immuno-colorazioni, incubando gli idrogel con un anticorpo primario e successivamente con un anticorpo secondario in fluorescenza. Le immagini in fluorescenza sono mostrate in scala di grigi, pertanto lo sfondo nero rappresenta l’assenza di segnale, mentre il segnale luminoso nei toni di grigio rappresenta l’espressione della proteina.

I risultati mostrano che le cellule coltivate negli idrogel di alginato dopo 1 settimana esprimono selettivamente una proteina chiamata PVR (polivirus receptor) espressa dalla maggior parte dei tumori di neuroblastoma ad alto rischio ed essenziali per la sopravvivenza/invasività del tumore (figura 2). Le cellule cancerose dotate di PVR vengono riconosciute e uccise dalle cellule del sistema immunitario Natural Killer (NK) grazie a specifici recettori (veri e propri sensori biologici) in grado di riconoscere la proteina.

Pertanto, le cellule di neuroblastoma che esprimono PVR possono essere potenzialmente trattate mediante terapia immunologica basata sul potenziamento delle cellule del sistema immunitario Natural Killer.

Gli idrogel di alginato con cellule di neuroblastoma sono stati coltivati per una settimana in presenza di un fattore solubile (Interferone Gamma), prodotto dalle cellule del sistema immunitario Natural Killer, per regolare la neoplasia e la reattività all’eventuale terapia immunologica anti-tumorale. L’espressione delle proteine di superfice relative alla crescita tumorale in presenza di interferone gamma sono state analizzate attraverso immuno-colorazioni (figura 3). Il fattore solubile è stato in grado di perfondere gli idrogel e ha mostrato un ruolo chiave nell’induzione/soppressione dell’espressione di marker tipici di superficie sulla linea cellulare di neuroblastoma HTLA-230 (figura 3), dimostrando che gli idrogel a base di alginato possono potenzialmente rappresentare dei validi modelli dove testare immunoterapie basate sull’utilizzo di cellule Natural Killer.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Una composizione comprendente o consistente di: i. cellule vitali primarie, o di linea, o di paziente di neuroblastoma; e ii. un idrogel comprendente alginato in soluzione acquosa o una miscela polimerica comprendente alginato e almeno un polimero idrofilo (PI) diverso da alginato, in cui l'alginato e il polimero (PI) sono presenti all’interno dell’idrogel in rapporti volumetrici da 99,9/0,1 a 1/99, dove l’idrogel ii. è reticolato mediante reticolazione ionica a base di ioni calcio o cross-link fisico controllato, tale da permettere una elasticità finale dell’idrogel, misurabile con tecnica AFM, compresa tra 2 e 4000 KPa.
2. La composizione secondo la rivendicazione 1, in cui detta miscela polimerica comprende almeno un polimero idrofilo (PI) tra collagene, gel di matrice extracellulare (ECM) da sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarme e PEG.
3. La composizione secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui ii. è un idrogel comprendente acqua e una miscela comprendente alginato e un polimero idrofilo (PI) diverso da alginato in rapporti volumetrici da 75/25 a 50/50.
4. La composizione secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, che comprende inoltre cellule vitali di almeno un secondo tipo, che è differente da quello delle cellule di neuroblastoma.
5. La composizione secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui l'idrogel è di forma sferica per mimare la struttura biologica tridimensionale del tumore.
6. Un metodo per preparare una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il metodo comprende i seguenti passaggi: (a) la formazione di una composizione comprendente acqua e alginato, opzionalmente in miscela con almeno un polimero idrofilo in grado di formare un idrogel; (b) la sospensione di cellule vitali di neuroblastoma di un primo tipo nella soluzione polimerica precursore dell’idrogel ottenuta nel passaggio (a); (c) la reticolazione del polimero nella sospensione ottenuta nel passaggio (b) a ottenere l'idrogel con cellule di neuroblastoma incorporate al suo interno.
7. Il metodo secondo la rivendicazione 6, comprendente inoltre l’utilizzo di cellule di un tipo differente dal tipo delle cellule di neuroblastoma del primo tipo e in cui la cellule del secondo tipo vengono sospese all’interno della stessa composizione comprendente acqua e alginato, opzionalmente in miscela con l'almeno un polimero idrofilo nel passaggio (b) insieme alle cellule di neuroblastoma di un primo tipo prima della reticolazione (c) del polimero ad ottenere un idrogel comprendente cellule di neuroblastoma del primo tipo e cellule del secondo tipo.
8. Uso della composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 come un modello in vitro tridimensionale di neuroblastoma.
9. L'uso della composizione secondo la rivendicazione 8, come un modello in vitro tridimensionale di neuroblastoma per lo screening di farmaci antitumorali e/o di qualsiasi altro farmaco, molecola, principio attivo, estratto naturale, pianta o suoi derivati.
10. Un metodo per lo screening di farmaci antitumorali e/o di qualsiasi altro farmaco, molecola, principio attivo, estratto naturale, pianta o suoi derivati, in cui detto screening comprende mettere almeno un farmaco antitumorale e/o di qualsiasi altro farmaco, molecola, principio attivo, estratto naturale, pianta o suoi derivati oggetto dello screening a contatto della composizione comprendente o consistente di cellule vitali di un neuroblastoma e un idrogel comprendente acqua e alginato, opzionalmente in composizione almeno un polimero idrofilo, secondo almeno una delle rivendicazioni 1-5.