CN112980794A - 一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法及其药物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法及其药物筛选方法，为解决NB异质性高、个体化差异大而带来的难治性问题提供了技术支持，为NB的精准化和个性化治疗提供技术解决方案，本发明以明胶衍生物—甲基丙烯酸化明胶（GelMA）作为三维细胞培养的支架，通过固含量的改变调控支架的机械性能，将其作为恶性分化程度较高的神经母细胞瘤细胞SH‑SY5Y的三维培养载体，观察肿瘤细胞在不同于体内的存活、增殖以及肿瘤球状体形成的规律；将形成的三维细胞肿瘤模型进行体外肿瘤化疗药物共培养，观察其对化疗药物的敏感性，为神经母细胞瘤的药物筛选和精准治疗提供一种新的技术平台。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法及其药物筛选方法。
背景技术
神经母细胞瘤（NB）是儿科疾病中一种常见的恶性颅外实体肿瘤，由于其临床表现复杂多样，转移能力强，死亡率高，难以准确诊疗提高治愈率和生存率。目前关于该肿瘤的研究主要是基于二维细胞培养技术和鼠动物模型，两种模型差异较大而降低了研究结果的转化效率。传统的2D细胞培养虽然简单方便，但用于药物筛选的后期淘汰率高；而整体动物模型费用高、效率低。目前，研究者们从基因、蛋白质、信号传导和代谢通路等方面对 NB 的个性化治疗进行了大量的研究和药物开发，然而这些成果目前还未进入临床应用，其主要的原因是基础研究和临床应用之间的巨大差异。NB肿瘤的结构和微环境在体外和体内存在较大的差异，而目前的研究平台无法真实复现。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法及其药物筛选方法。
本发明采用的技术解决方案是：一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 称取甲基丙烯酸化明胶（GelMA）样品，溶解在 PBS 溶液中，配制成水凝胶溶液，配制光引发剂溶液，过滤除菌备用；
（2）根据实验设计需求，配制的浓缩细胞悬液，配制含I2959 的GelMA溶液得到水凝胶前驱体溶液，取水凝胶前驱体溶液，加入浓缩细胞悬液，涡旋均匀，置于96孔板中，于紫外点光源下辐照成胶，得到3D共培养体系，每孔加完全培养基，置于细胞培养箱中培养，每天半量换液；得到体外三维神经母细胞瘤微组织的模型。
所述的步骤（1）中配制的水凝胶溶液中GelMA的含量为5wt-10wt%。
所述的光引发剂为I2959，所述的水凝胶前驱体溶液中光引发剂为I2959含量为0.5wt%。
所述的步骤（2）中加入浓缩细胞悬液浓度为105/孔。
所述的紫外点光源强度为100mW/cm2 ，辐照时间为2-5min。
所述的步骤（2）中加入浓缩细胞悬液为第三代原代细胞。
所述的步骤（2）中每孔加完全培养基的量为100μl。
一种神经母细胞瘤药物的筛选方法，包括以下步骤：采用所述的基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型培养，培养至第7天时，加入系列浓度的神经母细胞瘤药物培养基刺激肿瘤微组织团块，在设定时间点，采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率，从而实现对药物浓度的筛选。
所述的神经母细胞瘤药物的浓度为1-500μg/ml。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法及其药物筛选方法，为解决NB异质性高、个体化差异大而带来的难治性问题提供了技术支持，为NB的精准化和个性化治疗提供技术解决方案，本发明以明胶衍生物—甲基丙烯酸化明胶（GelMA）作为三维细胞培养的支架，通过固含量的改变调控支架的机械性能，将其作为恶性分化程度较高的神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y 的三维培养载体，观察肿瘤细胞在不同于体内的存活、增殖以及肿瘤球状体形成的规律；将形成的三维细胞肿瘤模型进行体外肿瘤化疗药物共培养，观察其对化疗药物的敏感性，为神经母细胞瘤的药物筛选和精准治疗提供一种新的技术平台。
附图说明
图1为蛋白基水凝胶NB体外模型图。
图2为蛋白基水凝胶构建NB模型用于药物筛选。
图3为浓缩细胞种植密度为104/孔，种植7天后的效果图。
图4为浓缩细胞种植密度为105/孔，种植7天后的效果图。
图5为浓缩细胞种植密度为106/孔，种植7天后的效果图。
图6为GelMA浓度为5%，种植7天后的效果图。
图7为GelMA浓度为10%，种植7天后的效果图。
图8为GelMA浓度为15%，种植7天后的效果图。
图9为GelMA浓度为20%，种植7天后的效果图。
具体实施方式
实施例1 神经母细胞瘤的体外三维培养模型的建立
1）称取一定量的 GelMA 样品，溶解在 PBS 溶液中，分别配制成10wt%和5wt%的水凝胶溶液，用75%乙醇溶液配制50mg/ml 的I2959溶液，在超净台中分别用0.22μm的滤膜过滤除菌备用；2) 根据实验设计需求，配制一定浓度的浓缩细胞悬液（第三代原代细胞），配制含0.5wt% I2959 的GelMA溶液，取24μl水凝胶前驱体溶液，加入5μl浓缩细胞悬液，涡旋均匀，置于96孔板中，于100mW/cm2紫外点光源下辐照2min，成胶，得到3D共培养体系，每孔加100μl完全培养基，置于细胞培养箱中培养，每天半量换液；得到三维NB模型。
实施例2药物筛选应用
1）称取一定量的 GelMA 样品，溶解在 PBS 溶液中，分别配制成10wt%和5wt%的水凝胶溶液，用75%乙醇溶液配制50mg/ml 的I2959溶液，在超净台中分别用0.22μm的滤膜过滤除菌备用；2) 根据实验设计需求，配制一定浓度的浓缩细胞悬液（第三代原代细胞），配制含0.5wt% I2959 的GelMA溶液，取24μl水凝胶前驱体溶液，加入5μl浓缩细胞悬液，涡旋均匀，置于96孔板中，于100mW/cm2紫外点光源下辐照2min，成胶，得到3D共培养体系，每孔加100μl完全培养基，置于细胞培养箱中培养，每天半量换液；得到三维NB模型；3）培养至第7天时，加入系列浓度的长春新碱药物培养基（1μg/ml,3μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,30μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,300μg/ml 及 500μg/ml）刺激肿瘤微组织团块，在设定时间点，采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率，从而实现对药物浓度的筛选。
试验检测
GelMA与SY5Y 细胞3D共培养，技术参数调控结果对比
GelMA成胶参数：固含量5wt-20wt%，UV时间2-5min，引发剂添加量（0.5wt%）等参数；SY5Y细胞悬液浓度：104/孔、105/孔、106/孔。
具体佐证如下（以GelMA浓度为10%为例）：
细胞种植密度为104/孔，种植7天后的效果如图3所示：不能成团；
细胞种植密度为105/孔，种植7天后的效果如图4所示：能成团块，并且分布均匀；
细胞种植密度为106/孔，种植7天后的效果如图5所示：分步不均匀。
结论：细胞悬液浓度对体外三维NB微肿瘤构建的影响：细胞悬液浓度105/孔效果最好，104/孔则细胞成不了团，106/孔则细胞过多分步不均匀。
2）GelMA固含量对体外三维NB微肿瘤构建的影响：
具体佐证如下（以细胞种植密度为105/孔为例）：
GelMA浓度为5%，种植7天后的效果如图6所示：能成团块，并且分布均匀；
GelMA浓度为10%，种植7天后的效果如图7所示：能成团块，并且分布均匀；
GelMA浓度为15%，种植7天后的效果如图8所示：不能成团块；
GelMA浓度为20%，种植7天后的效果如图9所示：不能成团块。
GelMA固含量高于15%，则不能构建三维NB微肿瘤模型。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 称取甲基丙烯酸化明胶（GelMA）样品，溶解在 PBS 溶液中，配制成水凝胶溶液，配制光引发剂溶液，过滤除菌备用；
（2）根据实验设计需求，配制浓缩细胞悬液：配制含I2959 的GelMA溶液得到水凝胶前驱体溶液，取水凝胶前驱体溶液，加入浓缩细胞悬液，涡旋均匀，置于96孔板中，于紫外点光源下辐照成胶，得到3D共培养体系，每孔加完全培养基，置于细胞培养箱中培养，每天半量换液；得到体外三维神经母细胞瘤微组织的模型。
2.根据权利要求1所述的一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（1）中配制的水凝胶溶液中GelMA的含量为5wt-10wt%。
3.根据权利要求1所述的一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，所述的光引发剂为I2959，所述的水凝胶前驱体溶液中光引发剂为I2959含量为0.5wt%。
4.根据权利要求1所述的一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）中加入浓缩细胞悬液浓度为105/孔。
5. 根据权利要求1所述的一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，所述的紫外点光源强度为100mW/cm2 ，辐照时间为2-5min。
6.根据权利要求1所述的一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）中加入浓缩细胞悬液为第三代原代细胞。
7.根据权利要求1所述的一种基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）中每孔加完全培养基的量为100μl。
8.一种神经母细胞瘤药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1-7任意一项所述的基于蛋白基水凝胶体外构建神经母细胞瘤微组织的模型培养，培养至第7天时，加入系列浓度的神经母细胞瘤药物培养基刺激肿瘤微组织团块，在设定时间点，采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率，从而实现对药物浓度的筛选。
9.根据权利要求1所述的神经母细胞瘤药物的筛选方法，其特征在于，所述的神经母细胞瘤药物的浓度为1-500μg/ml。
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