TW201335368A - 作為三維細胞培養基質之中空聚合物微球 - Google Patents
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Abstract
本發明揭露了一種由生物可降解的聚合物製成的中空聚合物微球，該生物可降解的聚合物用以產生三維細胞支架。本發明也有關用於製備包含中空聚合物的工程細胞培養基質的微球的方法。也提供了一種藉由在包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質中篩選抗癌醫療劑的方法。
Description
本發明提供了一種適合用於在中空聚合物微球中生長細胞的工程細胞培養基質，該中空聚合物微球具有能力導致單層形成三維支架。所形成的三維支架可用於篩選。
細胞在培養環境中的增殖以及分化掌握了基礎癌症研究的關鍵，且在藥物發現研究中找到了更多的應用。數個因素促成了活體內，尤其是在疾病狀態中的細胞增殖以及分化，且試管內相同生理狀態的複製以測試可能的療法已是一種挑戰。當重造細胞的天然環境時，培養中細胞的物理方面，例如組成物、結構以及細胞與細胞的交互作用是極度重要的。朝著這個方向，已做出持續的嘗試，以發展出對照傳統二維（2D）培養系統的具有三維（3D）結構的基質，以更佳地模擬在疾病狀態期間在活體內發生的生理改變。
細胞培養技術已漸漸地從迎合學術興趣進展到滿足工業以及商業化需要，尤其是用以提供培養系統以在試管中測試藥物功效以及毒物學。為此，已探索出並使用了各種3D細胞培養技術。傳統中，最有用的技術為懸滴法，其中已在試管中生長出了胚胎、腫瘤以及初代細胞。然而，此技術的一個缺點是不能為了高生產率的需要來生產它們。此外，懸滴系統達成了200μM的最大細胞大小，其可能為研究細胞對測試療法做出反應的機制活性的阻礙。此外，InSphero，一個生物微組織的供應商，已提出了能夠大量生產的三維腫瘤微組織，以在3D疾病模型中測試藥物功效。
美國專利申請案US20080194010提供了由非生物可降解且無細胞毒性的聚合物製成的3D插入物，該3D插入物具有內部以及外部空間來讓活細胞貼附、增殖以及分化。然而，這些插入物需要在正常的培養條件下以組織培養盤或瓶來使用，因此並非不依賴組織培養耗材。相似的情況，US201000330144提供了多孔聚合物的3D管狀支架，其允許操控孔洞的大小、結構以及機械特性。
2D細胞培養系統以單層貼附至微盤表面。為了細胞的任何進一步使用，尤其是高生產量的需要，包含細胞數的胰蛋白酶作用是必需的。US20050054101揭露了一種適合用於生長細胞的微載體，能夠提供將支撐培養中細胞生長的基質。該微載體是一種水凝膠，該水凝膠選自藻酸鹽、明膠、與膠原蛋白或明膠共聚的聚丙烯醯胺、具有修飾電荷的聚丙烯醯胺或與明膠共聚的藻酸鹽。使用光學透明微載體的3D細胞培養系統是特別有利的，因為可直接分配細胞而不需胰蛋白酶作用。
近來，已引入了微流體細胞培養系統，該系統能夠在3D環境中長期地灌注培養細胞。US20090203136揭露了可使用各種標準自動化處理系統來使用的微流體細胞系統。所描述的一種這種系統是整合微流體與不需外部幫浦的標準96孔框架。在該申請案中，也揭露了能夠有較大膠體室的修飾、自動化的溶液交換以及維持長期的空間梯度。
在一個不同的研究中，Whitesides等人已報導注滿了在細胞外基質水凝膠中的細胞懸浮物的堆疊以及卸垛層的紙（Paper-supported 3D cell culture for tissue-based bioassays. PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences), 3, 2009, 106:44, 18457-18462）。該作者已藉由纖維支撐的水凝膠的多層結構的構造物而展示了在3D中控制以及分配培養的細胞，該纖維支撐的水凝膠的多層結構的構造物由注滿了含有活細胞的細胞外基質（ECM）水凝膠的層析紙構成。在此技術中，將水凝膠前驅物作為具有懸浮細胞的流體加至紙支撐物上，該水凝膠前驅物在該處形成凝膠。該研究者指出，其可在3D中控制氧氣以及養分梯度，並分析分子以及基因的反應。
再另一個變化是一種由RealBioR銷售的系統，其在各種微環境中支撐混合的細胞族群。此系統允許控制培養環境，例如藉由分開營養培養基以及代謝氣體的供應而控制整個培養細胞中的養分以及氣體梯度。
US20100048411揭露了一種包含聚合的高內相乳液聚合物的細胞培養支架，該聚合物適用於在常規的組織培養孔或用於分析細胞增殖、分化以及功能的培養瓶中使用。然而，此系統用以作為組織培養盤或培養瓶中細胞培養的附屬物，且不能廢除傳統的培養方法。
QGel™，QGelBio的一種商標產品，設想出一種合成的水凝膠，作為用於3D細胞培養的基質，其具有蛋白酶敏感處以及細胞吸附配位體作為其細胞外基質的成分。
如上所述的所有發展3D細胞培養系統的方法牽涉了使用聚合凝膠、水凝膠、懸浮液、小珠、支架、多孔海綿、懸滴以及諸如此類來生長3D細胞。這些技術大部分是複雜的、牽涉了機器人學，且因此大大地增加了成本因素。在某些情況中，細胞需要使用大量的牛血清來藉由傳統的方法在組織培養瓶或培養盤中生長，增加了用於藥物篩檢的高產量組織培養需求的成本。
下面強調出了普遍的3D細胞培養系統的一些缺點：
大小限制：將使用傳統平面、環境、基質的2D細胞培養以及使用聚合物及/或非聚合物材料的其他形式轉變成3D細胞培養受限於支架形成較小的大小（典型在微米大小）。
細胞株的選擇：所報導的3D細胞培養系統的技術對於特定的細胞株具選擇性，且其難以生長具抗性的細胞株；例如MDAMB231，一種三重陰性乳癌細胞株，如第1圖中所繪示，不會令人滿意地轉變成3D支架，其中示出了在BDMadtrigel™基質中（示於左側）相對於GeltrexT M基質（示於右側）的MDA-MB-231乳癌細胞的生長比較。
時間以及體積：3D細胞培養的其中一個最基本特性是使用最少體積的培養基來產生的這種支架的快速生長。
因此，有需要提升3D支架的表面積或大小，並模擬如同在異種移植模型中基因型或表現型特徵。將生長2D單層系統轉變成3D支架的可轉變性正如同共同培養一樣，將具有極大的重要性，例如，作為藥物發現的研究工具。
在本文中，申請人揭露了一種由生物可降解的聚合物製成的中空微球，該中空微球用以產生3D細胞支架，且因此提供了一種用於3D細胞及/或組織生產以及在試管中以及活體外疾病模型中評估細胞功效的工具。該3D細胞支架是以較低的成本來產生，且具有下述優勢：
避免使用組織培養盤或瓶或容器；
● 避免過量使用牛血清作為細胞培養中的生長促進劑；
● 達成提升的尺寸，例如支架的表面積、大小（毫升）；
● 有效地同時生長混合的細胞族群；
● 儲存具有想要的細胞類型的微球，因此提供暫時停止任何實驗程序的彈性；以及
● 成功復甦含有想要的細胞類型的儲存微球。
細胞培養技術已漸漸地從迎合學術興趣進展到滿足工業以及商業化需要，尤其是用以提供培養系統以在試管中測試藥物功效以及毒物學。為此，已探索出並使用了各種3D細胞培養技術。傳統中，最有用的技術為懸滴法，其中已在試管中生長出了胚胎、腫瘤以及初代細胞。然而，此技術的一個缺點是不能為了高生產率的需要來生產它們。此外，懸滴系統達成了200μM的最大細胞大小，其可能為研究細胞對測試療法做出反應的機制活性的阻礙。此外，InSphero，一個生物微組織的供應商，已提出了能夠大量生產的三維腫瘤微組織，以在3D疾病模型中測試藥物功效。
美國專利申請案US20080194010提供了由非生物可降解且無細胞毒性的聚合物製成的3D插入物，該3D插入物具有內部以及外部空間來讓活細胞貼附、增殖以及分化。然而，這些插入物需要在正常的培養條件下以組織培養盤或瓶來使用，因此並非不依賴組織培養耗材。相似的情況，US201000330144提供了多孔聚合物的3D管狀支架，其允許操控孔洞的大小、結構以及機械特性。
2D細胞培養系統以單層貼附至微盤表面。為了細胞的任何進一步使用，尤其是高生產量的需要，包含細胞數的胰蛋白酶作用是必需的。US20050054101揭露了一種適合用於生長細胞的微載體，能夠提供將支撐培養中細胞生長的基質。該微載體是一種水凝膠，該水凝膠選自藻酸鹽、明膠、與膠原蛋白或明膠共聚的聚丙烯醯胺、具有修飾電荷的聚丙烯醯胺或與明膠共聚的藻酸鹽。使用光學透明微載體的3D細胞培養系統是特別有利的，因為可直接分配細胞而不需胰蛋白酶作用。
近來，已引入了微流體細胞培養系統，該系統能夠在3D環境中長期地灌注培養細胞。US20090203136揭露了可使用各種標準自動化處理系統來使用的微流體細胞系統。所描述的一種這種系統是整合微流體與不需外部幫浦的標準96孔框架。在該申請案中，也揭露了能夠有較大膠體室的修飾、自動化的溶液交換以及維持長期的空間梯度。
在一個不同的研究中，Whitesides等人已報導注滿了在細胞外基質水凝膠中的細胞懸浮物的堆疊以及卸垛層的紙（Paper-supported 3D cell culture for tissue-based bioassays. PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences), 3, 2009, 106:44, 18457-18462）。該作者已藉由纖維支撐的水凝膠的多層結構的構造物而展示了在3D中控制以及分配培養的細胞，該纖維支撐的水凝膠的多層結構的構造物由注滿了含有活細胞的細胞外基質（ECM）水凝膠的層析紙構成。在此技術中，將水凝膠前驅物作為具有懸浮細胞的流體加至紙支撐物上，該水凝膠前驅物在該處形成凝膠。該研究者指出，其可在3D中控制氧氣以及養分梯度，並分析分子以及基因的反應。
再另一個變化是一種由RealBioR銷售的系統，其在各種微環境中支撐混合的細胞族群。此系統允許控制培養環境，例如藉由分開營養培養基以及代謝氣體的供應而控制整個培養細胞中的養分以及氣體梯度。
US20100048411揭露了一種包含聚合的高內相乳液聚合物的細胞培養支架，該聚合物適用於在常規的組織培養孔或用於分析細胞增殖、分化以及功能的培養瓶中使用。然而，此系統用以作為組織培養盤或培養瓶中細胞培養的附屬物，且不能廢除傳統的培養方法。
QGel™，QGelBio的一種商標產品，設想出一種合成的水凝膠，作為用於3D細胞培養的基質，其具有蛋白酶敏感處以及細胞吸附配位體作為其細胞外基質的成分。
如上所述的所有發展3D細胞培養系統的方法牽涉了使用聚合凝膠、水凝膠、懸浮液、小珠、支架、多孔海綿、懸滴以及諸如此類來生長3D細胞。這些技術大部分是複雜的、牽涉了機器人學，且因此大大地增加了成本因素。在某些情況中，細胞需要使用大量的牛血清來藉由傳統的方法在組織培養瓶或培養盤中生長，增加了用於藥物篩檢的高產量組織培養需求的成本。
下面強調出了普遍的3D細胞培養系統的一些缺點：
大小限制：將使用傳統平面、環境、基質的2D細胞培養以及使用聚合物及/或非聚合物材料的其他形式轉變成3D細胞培養受限於支架形成較小的大小（典型在微米大小）。
細胞株的選擇：所報導的3D細胞培養系統的技術對於特定的細胞株具選擇性，且其難以生長具抗性的細胞株；例如MDAMB231，一種三重陰性乳癌細胞株，如第1圖中所繪示，不會令人滿意地轉變成3D支架，其中示出了在BDMadtrigel™基質中（示於左側）相對於GeltrexT M基質（示於右側）的MDA-MB-231乳癌細胞的生長比較。
時間以及體積：3D細胞培養的其中一個最基本特性是使用最少體積的培養基來產生的這種支架的快速生長。
因此，有需要提升3D支架的表面積或大小，並模擬如同在異種移植模型中基因型或表現型特徵。將生長2D單層系統轉變成3D支架的可轉變性正如同共同培養一樣，將具有極大的重要性，例如，作為藥物發現的研究工具。
在本文中，申請人揭露了一種由生物可降解的聚合物製成的中空微球，該中空微球用以產生3D細胞支架，且因此提供了一種用於3D細胞及/或組織生產以及在試管中以及活體外疾病模型中評估細胞功效的工具。該3D細胞支架是以較低的成本來產生，且具有下述優勢：
避免使用組織培養盤或瓶或容器；
● 避免過量使用牛血清作為細胞培養中的生長促進劑；
● 達成提升的尺寸，例如支架的表面積、大小（毫升）；
● 有效地同時生長混合的細胞族群；
● 儲存具有想要的細胞類型的微球，因此提供暫時停止任何實驗程序的彈性；以及
● 成功復甦含有想要的細胞類型的儲存微球。
本申請案提供了一種適合用於在中空聚合物微球中生長細胞的工程細胞培養基質，該中空聚合物微球具有將二維細胞轉變為三維支架的能力。
在一方面中，在中空聚合物微球中生長的細胞選自：上皮細胞、骨髓細胞以及內皮細胞。
在另一方面中，中空聚合物微球包含在不同的兩層中同時生長的多細胞培養。
在本發明的其他方面中，有用於製備包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質的過程。
在本發明的進一步方面中，有藉由在包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質中生長細胞、處理該微球、決定化學藥品、醫療劑、溫度、壓力、pH等的差異對於該微球中的細胞的影響，來用於篩選或測試化學藥品、醫療劑、溫度、壓力、pH等差異的過程。
在進一步方面中，本發明也提供了一種藉由在包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質中生長細胞、以抗癌醫療劑處理該微球、決定該抗癌醫療劑對該微球中細胞生長的影響以及測試該細胞的分化及/或增殖，來篩選抗癌醫療劑的過程。
本發明也提供了一種從三維階段來重新取得二維單層的過程。
此外，在更另一方面中，含有細胞的中空聚合物微球被冷凍於液態氮中，並復甦成二維單層。
在一方面中，在中空聚合物微球中生長的細胞選自：上皮細胞、骨髓細胞以及內皮細胞。
在另一方面中，中空聚合物微球包含在不同的兩層中同時生長的多細胞培養。
在本發明的其他方面中，有用於製備包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質的過程。
在本發明的進一步方面中，有藉由在包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質中生長細胞、處理該微球、決定化學藥品、醫療劑、溫度、壓力、pH等的差異對於該微球中的細胞的影響，來用於篩選或測試化學藥品、醫療劑、溫度、壓力、pH等差異的過程。
在進一步方面中，本發明也提供了一種藉由在包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質中生長細胞、以抗癌醫療劑處理該微球、決定該抗癌醫療劑對該微球中細胞生長的影響以及測試該細胞的分化及/或增殖，來篩選抗癌醫療劑的過程。
本發明也提供了一種從三維階段來重新取得二維單層的過程。
此外，在更另一方面中，含有細胞的中空聚合物微球被冷凍於液態氮中，並復甦成二維單層。
第1圖：示出了在BDMadtrigel™基質中（示於左側的圖）對照在Geltrex™基質中（示於右側的圖）的MDA-MB-231乳癌細胞的比較性生長。
第2圖：描繪了含有玻璃毛細管以及中空聚合物基質的聚合物基質，該玻璃毛細管以及中空聚合物基質都含有細胞。
第3A圖：示出了中空聚合物微球中的細胞生長。
第3B圖：示出了微球中培養在第3、5以及7天時細胞數的逐步增加。
第4圖：示出了生長於基質中範圍在2-3 mm的細胞大小。
第5圖：示出了在相同的環境中，生長於玻璃毛細管中對照微球中細胞的同時比較。
第6圖：示出了微球中兩種細胞族群的同時生長。看到A549細胞為外層，且MCG7-GFP細胞為內層。
第7圖：示出了MCF7-GFP以及A549細胞同時生長的情況的重新取得順序。
第8A圖：示出了從微球以2D再生細胞的開始。
第8B圖：示出了為單層的2D細胞的逐步生長。
第9圖：示出了於微球中生長的A549細胞的試管中細胞毒性評估。P276-00是研究中所使用的抗癌分子。
第10圖：示出了以3 μM阿黴素處理的3D微球系統的Z堆疊影像。
第11圖：示出了阿黴素處理(1-3 μM)對於HL460衍生的3D微球系統的時間動力學以及細胞毒性效果。
第12圖：示出了抗癌化合物對於HL460衍生的3D微球系統的細胞毒性以及細胞生長抑制的效果。
第13圖：示出了在2D單層中的HL460細胞中對照在HL460衍生的3D微球系統中觀察到的阿黴素（0.03 - 3 μM）的細胞毒性效果。
第 14 圖：示出了HL460衍生的3D微球系統中抗癌劑的細胞毒性效果的比較。
第 15 圖：示出了在使用MCF7（乳癌）細胞株的2D單層以及3D微球系統中抗癌化合物的細胞毒性效果的比較。
為了下述詳細描述的目的，要了解的是，除了明確地做出相反的具體說明，本發明可假設各種替代的變化以及步驟順序。此外，除了在任何操作範例中，或另外指出，，所有的數字表示，例如在應用中所使用的成分的數量，將被了解為在所有例子中藉由用語「大約」所修飾。因此，除非相反地指出，在下述說明書以及所附的申請專利範圍中提及的數字參數為近似值，其可取決於本發明要獲得的想要特性而不同。至少，且不企圖將均等物的教導的應用限制至申請專利範圍的範圍，每個數字參數應至少按照所報導的有意義位數的數字，並藉由應用通常的四捨五入技術來理解。
儘管提及本發明廣範圍的數字範圍以及參數是近似值，在特定範例中提及的數值被盡可能精確地報導。然而，任何數值，本質上含有必定由它們各自測試測量中所發現的標準差而造成的某些誤差。
同樣地，應了解的是，本文中所列舉的任何數字範圍意欲包括其中所包含的所有子範圍。例如，「1至10」的範圍意欲包含在所列舉的最小值1以及所列舉的最大值10之間（且包括1以及10）的所有子範圍，也就是，具有等於或大於1的最小值以及等於或小於10的最大值。
在此申請案中，除非另外具體地聲明，單數的使用包括了複數，且複數包括單數。此外，在此申請案中，除非另外具體地聲明，「或」的使用意指「及/或」，即便可能在某些例子中明確地使用「及/或」。
哺乳動物來源的初代細胞被使用於毒物學研究或藥物篩選分析法，且這些包括纖維母細胞、內皮細胞、上皮細胞以及肝細胞。在藥物篩選中常規地使用哺乳動物細胞培養以鑑別領先的療法，並用於在從事動物（活體內）毒物學以及功效研究之前經由一系列的試管中測試來評估該療法。因此，為了在藥物篩選期間測試細胞增殖以及分化，模擬細胞生理以功能性方面的改進的細胞培養系統是具高度價值的。為了此原因，以多層來存在並展現三維結構的細胞是這種類型的研究的較佳系統。
本發明有關一種包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質以及產生三維細胞支架的方法，該三維細胞支架具有在下述中作為藥物發現工具的效用：
（a）產生三維細胞培養及/或組織生產；及/或
（b）評估試管中以及活體外模型中潛在療法的功效。
在一方面中，本發明是一種用於在中空聚合物微球中生長細胞以形成三維（3D）支架的工程細胞培養基質。
在本發明的一方面中，有一種製備包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質的方法，該方法包含下述步驟：
（a）藉由將生物可降解的聚合物加至水中來製備凝膠；
（b）將該凝膠加熱至85°C-90°C，以確保完全的水合作用，以獲得黏的聚合物凝膠；以及
（c）藉由將該黏的聚合物凝膠直接滴入2-5％的氯化鈣溶液中來形成中空微球。
在本發明的具體實施例中，使用了3％的氯化鈣溶液。作為替代方案，可使用鎂、銅以及其他無機離子。
在本發明的另一方面中，提供了一種用於製備包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質的方法，該方法包含下述步驟：
（a）藉由將生物可降解的聚合物加至水中來製備凝膠；
（b）將該凝膠加熱至85°C-90°C，以確保完全的水合作用，以獲得聚合物水凝膠；以及
（c）藉由將空氣困在聚合物水凝膠中，或藉由將空氣注射至所預先形成的聚合物球體內來形成中空微球。
在特定的具體實施例中，生物可降解的聚合物是樹膠（gellan）聚合物。GELRITE™,CPKelco,U.S.Inc.,Atlanta,Georgia,USA是一種樹膠聚合物。一般而言，所使用的樹膠聚合物的量是2-3w/v％。
從樹膠聚合物形成的凝膠在水中是流體狀態。當滴到氯化鈣離子的溶液中時，該凝膠形成固態球狀微球。之後，使用針筒而藉由注入空氣來在此固態樹膠球體中誘導出真空。該過程描述了從樹膠聚合物製備軟/彈性球體的方法。藉由注射空氣來創造出該固態聚合物球體內中空的空間。一旦注入空氣之後，該空間即產生，其中注入了在培養基中的細胞。利用在均衡狀態中具有細胞以及培養基遍及各處的此空間，將2D細胞轉變成模擬癌細胞活體外支架的3-D支架。在藥物發現設定中，這種系統的大量生產將至少是半自動化的。
因此形成的本發明的中空聚合物微球的直徑接近5mm至25mm。
在微球的製備之後，將在胎牛血清（FCS）培養基或其他培養基中的細胞注入至該微球的中空中。可將這些微球轉置入具有過量FCS培養基或其他培養基的96孔盤中。在幾分鐘之後達到了溶劑平衡，且持續地以FCS及/或其他養分滋養細胞。每24小時替換新鮮的培養基/或將微球轉置入具有新鮮培養基的新的孔中。可將具有培養細胞的微球維持在培養箱中。之後，可將完全生長的細胞支架儲存在液態氮中至少4星期，並簡單地藉由將具有3D支架的微球插入新鮮的FCS或其他適合的培養基中來重新取得。
在本發明的一方面中，支架支持了同步或同時生長的多於一種細胞類型的生長。同時生長在微球中的兩個不同層的細胞選自：上皮-上皮細胞、上皮-內皮細胞、上皮-骨髓細胞、內皮-骨髓細胞、內皮-內皮細胞以及骨髓-骨髓細胞。在進一步的方面中，本發明展現了在3D多球體細胞培養中生長源自上皮細胞、骨髓細胞或內皮細胞的癌細胞。
想像到的是，取決於同時生長的細胞類型組合，特定的細胞類型將佔據細胞的內層以及細胞的第二外層。
生長在本發明微球中上皮來源的細胞包括但不限於MCF-7（乳癌細胞）、MDAMB231（三重陰性乳癌細胞）、PC3（前列腺癌細胞）、HL460（肺癌細胞）、Colo205（大腸癌細胞）、HCT116（大腸癌細胞）、Ovcar（卵巢癌細胞）、Pane1（胰臟癌細胞）以及A549（肺癌細胞）。骨髓細胞，例如K562（人類bcr-abl白血病細胞）、Ba/F3（小鼠單核細胞骨髓細胞）、HL60（人類前髓細胞性白血病細胞）、THP1（人類急性單核細胞白血病細胞）、Jurkat（人類T細胞似淋巴母細胞）、U937（人類組織細胞性淋巴瘤細胞）、SUP-B15（急性淋巴母細胞白血病細胞）以及諸如此類；以及內皮細胞，包括HUVEC（人類臍帶靜脈內皮細胞）為可在此三維細胞培養系統中生長的其他細胞的範例。
可將生長在中空聚合物微球中的三維細胞曝露至化學物品、醫療劑、溫度、壓力、pH等的差異，以測試，例如，分化以及增殖。在非限制性的方面，骨髓細胞的三維細胞基質以抗癌醫療劑處理，並測試其分化以及增殖。
在另一方面，本發明提供了一種用於從生長為中空聚合物微球中的三維支架的細胞重新取得為二維單層的細胞的方法；其中所述方法包含下述步驟：
1. 將該細胞生長在二維單層中作為第一步驟；
2. 將該二維細胞注入該中空聚合物微球中作為第二步驟；
3. 將該二維細胞轉變為該微球中的三維支架，並生長至少7-10天作為第三步驟；
4. 藉由將它們從該微球釋放至盤或瓶中的組織培養基中，來從該三維支架重新取得二維細胞單層作為第四步驟。一旦達成生長（2天至18天），可將微球切開以分離所形成的多層支架/組織。
因此，微球中細胞的生長不改變細胞生長回二維系統中的能力。組織培養環境可為本技術領域常規使用的環境。
在一個具體實施例中，本發明提供了一種儲存以及復甦生長在中空聚合物微球中的三維細胞的方法，其中所述方法包含下述步驟：
1.在液態氮中冷凍含有細胞的微球；
2.隨後藉由解凍來復甦該細胞；以及
3.在較晚的時間點，使用組織培養方法來將該解凍的細胞生長為二維單層。
復甦時間點可為冷凍細胞之後的任何時間，例如，10、15、20或30天或甚至更高達冷凍中空微球之後60天。將冷凍的微球復甦成完全正常的二維單層細胞，並因此作為有效的工具，以按比例增加細胞用於高產量的用途。此外，儲存該三維微球以及當需要時復甦它們的能力提供了研究者當處理初代細胞培養時非常需要的彈性。
本發明的中空微球系統用以從各種癌細胞株來產生三維微球。使用完全生長的三維癌細胞球體，這些微球被進一步使用以研究各種化療劑的效果。該化療劑為抗癌劑，其包括但不限於P276-00、阿黴素、順鉑、太平洋紫杉醇、喜樹鹼、奧拉帕尼、拉帕替尼及/或任何其他已知的抗癌劑或研究抗癌劑，例如BEZ235（2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-側氧基-8-(3-喹啉基)-2,3-二氫-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈）。該抗癌劑，即阿黴素、順鉑、太平洋紫杉醇、拉帕替尼以及喜樹鹼為商業可得的。奧拉帕尼可藉由Drugs of Future 2009, 34(2): 101中所揭露的方法來製備。研究藥物，BEZ235，可藉由美國專利編號7667039中所描述的方法來製備。抗癌劑，P276-00（(+)-反-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥基-甲基-1-甲基-吡咯啶-基)-色烯-4-酮鹽酸鹽），一種CDK抑制劑，可藉由US7271193中所描述的方法來製造，其併入於本文中以作為參考。此外，化合物P276-00可如本文中所描述來製備。
在另一方面中，本發明提供了一種篩選抗癌醫療劑的方法，包含：
（a）在中空聚合物微球中生長細胞；
（b）以該抗癌醫療劑處理該微球；
以及
（c）測試該細胞的分化及/或增殖。
在本文中，也很重要的是去注意到，經由本發明注重於在抗癌醫療劑的篩選中使用了中空聚合物微球，本領域的技術人員將領略到，所述微球是用以模擬任何活體內生理狀態的有用工具，且因此有用於篩選任何醫療劑。
在一個具體實施例中，申請人已使用本發明的中空微球而建立了P276-00的抗癌功效，因此建立了3D癌細胞球體在分析抗癌醫療劑中作為有效活體外模型的有效用途。
此外，聚合物微球自己本身對於細胞不給予任何的表現型以及基因型特徵。
定義
藉由二維（2D）細胞培養，其意指將細胞在傳統的組織培養容器或任何平面中，在瓶子、盤子或插入物中生長成單層。
藉由三維（3D）細胞培養系統、支架或基質，其意指將細胞生長在具有三維結構的中空聚合物基質中，如同可能的情況，模擬真的組織對藥物或毒物的反應。
進行培養單層或用於生長培養單層的組織培養瓶、盤、插入物或任何的容器在此揭露內容中可替代地使用。
與形狀有關的聚合物基質的尺寸可被替代或改變，因此形狀對於本發明的微球而言並無限制。例如，微球的形狀可為卵形、方形或圓形。
藉由多個中空微球，其在本文中意指在培養情況中的中空微球總是以多個且非單一地存在。
如本文中所使用的，用語「接近」意指中空聚合物微球的平均直徑的特定值的± l mm- 4 mm的值範圍。例如，「接近25mm」將暗示「24mm至26mm」或「21mm至29mm」。
如同本揭露內容中所使用的組織培養方法，意指按照已知用於所生長的特定細胞的標準方法來將細胞生長於具有補給品的適當組織培養基中。
雖然已在揭露內容以及下述用於示例目的的範例中詳細地描述了本發明，要了解的是，這種細節僅為了示例的目的，且本領域的技術人員可於其中做出變化，而不悖離本發明的精神以及範圍。下述範例意欲於示例，而非用以限制本發明。
範例
參考範例： P276-00 （ ( +)- 反 -2- ( 2- 氯 - 苯基 ) -5,7- 二羥基 -8- ( 2- 羥基甲基 -1- 甲基 - 吡咯啶 -3- 基 ) - 色烯 -4- 酮鹽酸鹽 ）的製備
將熔化的吡啶鹽酸鹽（4.1g,35.6mmol）加至(+)-反-2-(2-氯-苯基)-8-(2-羥基甲基-1-甲基-吡咯啶-3-基)-5,7-二甲氧基-色烯-4-酮（0.4g,0.9mmol）中，並於180°C加熱1.5小時。將反應混合物冷卻至25°C，以甲醇（10mL）稀釋，並使用碳酸鈉鹼化至pH10。過濾該混合物，並濃縮有機層。將殘餘物懸浮於水（5mL）中，攪拌30分鐘，將其過濾並乾燥，以獲得化合物，(+)-反-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥基甲基-1-甲基-吡咯啶-3-基)-色烯-4-酮。
產量：0.25g（70％）；IR（KBr）：3422、3135、1664、1623、1559cm-1；
1HNMR(CDC13,300MHz):δ7.56(d,1H),7.36(m,3H),6.36(s,1H),6.20(s,1H),4.02(m,1H),3.70(m,2H),3.15(m,2H),2.88(m,lH),2.58(s,3H),2.35 (m,lH),1.88(m,1H);MS(ES+):m/z402(M+1);
分析：C21H20ClN05C,62.24(62.71);H,5.07(4.97);N,3.60(3.48); Cl,9.01(8.83)。
將上述獲得的化合物（0.2g,0.48mmol）懸浮於異丙酮（5mL）中，並加入3.5％HCl（25mL）。將該懸浮液加熱，以得到澄清的溶液。將該溶液冷卻，並過濾固體，以獲得化合物，(+)-反-2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥基甲基-1-甲基-吡咯啶-3-基)-色烯-4-酮鹽酸鹽（P276）。
產量：0.21 g（97 ％）； mp：188 - 192oC ； [α]D25 = +21.3o（c = 0.2，甲醇）；
lH NMR(CD30D,300MHz):δ7.80(d,lH), 7.60(m,3H),6.53(s,lH), 6.37(s,lH), 4.23(m,lH), 3.89(m,2H),3.63(m,lH), 3.59(dd,lH),3.38(m,lH),2.90 (s,3H),2.45(m,lH), 2.35(m,lH);MS(ES+):rnlz402(M+1)（游離鹼）
範例 1 ：中空聚合物微球的製備
使用樹膠聚合物（GELRITE™, CP Kelco,U.SsInc.,Atlanta, Georgia, USA）製備黏的凝膠。將GELRITE加入水中，並持續攪拌，並將該分散物加熱至85-90°C，以確保完全的水合作用。一般而言，所使用樹膠聚合物的量是2-3w/v％。由於藉由使用氯化鈣溶液而形成的二價錯合物，凝膠轉變成較軟的聚合物基質。
藉由將該黏的聚合物凝膠直接滴入氯化鈣溶液（3％w/v）中來製造聚合物球體。藉由以二價Ca2+離子取代聚合物中的鈉基團，聚合物立即形成了強力的錯合物。此外，藉由將空氣困在聚合物水凝膠中或藉由使用，例如針筒，而將空氣注射於預先形成的樹膠球體內，來形成中空微球。
範例 2 ：生長於微球基質中的細胞的物理特徵
細胞數
第3A圖描繪了微球中健康細胞的生長。細胞數在培養的第3、5以及7天逐步地增加。細胞數在培養的第3天從接近3x103個細胞增加至第7天的大約5x105個細胞（第3B圖）。
大小
雖然在二維培養系統中細胞的大小是大約100-200 μM，如第4圖所示，本發明微球內所生長的細胞達到最大2-3mm的大小。
環境誘導的細胞生長
進行了在玻璃毛細管以及中空聚合物基質之間對於生長細胞的比較。如第2圖中所示，將玻璃毛細管放置在聚合物基質內作為2D細胞生長成3D支架的同時比較。第2圖描繪了含有玻璃毛細管以及中空聚合物基質的聚合物基質，該玻璃毛細管以及中空聚合物基質都含有細胞。
藉由注入空氣（在玻璃毛細管平行側）而在聚合物微球內形成中空基質。在該玻璃毛細管內以及中空微球中注入相同的細胞株。
第5圖示出了在相同環境中在玻璃毛細管中對照在微球中生長的細胞的比較。
範例 3 ：在微球基質中生長混合的細胞族群
將MCF7GFP細胞先播種於聚合物微球內，並允許其生長2-3天。一旦發展出具有MCF7-GFP細胞的3D支架，將A549細胞種入相同的中空微球中。監控生長進度以及模式，並照下影像用於分析。
第6圖描繪了微球中混合的細胞族群的同時生長。在第6圖中，看到（上皮來源的）A549細胞為外層，且所生長的（上皮來源的）MCF7-GFP細胞為內層。兩個細胞層似乎完全正常且健康，因此重申了可在微球中常規地生長混合的細胞族群，因此提供了用於同時生長不同細胞類型的三維細胞培養系統。
範例4：從3D系統重新取得細胞成2D系統
先將初代細胞在適當的組織培養條件中生長成二維單層。例如，將A549（肺癌）單層生長於組織培養基（具有FCS（胎牛血清）的RPMI）中。一旦健康之後，將它們注入中空微球中，並發現它們轉變成三維支架。在7-10天之後，儲存具有該細胞的微球並復甦（如範例5中所示），或藉由將它們從該微球中釋放至適當的組織培養基中來重新取得成二維狀態。
第7圖示出了同時生長MCF7-GFP以及A549細胞的情況中的重新取得順序。第一，使用MCF7-GFP細胞發展出3D支架。之後，將A549細胞注射/種入具有發展的MCF-GFP支架的相同中空微球中。A549細胞開始在較早的支架（即，MCF-GFP）上生長。
範例5：生長在中空微球中的細胞的儲存以及復甦
將含有細胞（獨立生長的MCF7以及A549細胞）的微球冷凍或儲存在液態氮中。在儲存的5、10、15、20或30天後將細胞復甦，並使用組織培養復甦以及生長技術來生長成單層。
第8A以及8B圖分別示出了單層的MCF7以及A549細胞的復甦開始以及逐步生長。
相較於在2D單層系統中生長的細胞，在從3D支架復甦/重新取得成2D的細胞中沒有觀察到顯著的表現型改變。
範例6：在微球中生長的細胞對於化療劑P276-00的反應
允許含有細胞的微球生長成3D培養。3天之後，以不同的濃度（3μM以及10μM）將化療劑P276-00加至培養基，並分析其對3D培養生長的影響。以P276-00處理48小時之後，在顯微鏡下觀察微球，以研究該培養的生長模式。擷取控制組對照處理過的微球的影像。
觀察到的是，如同所展現的，經由在微球內對3D培養的形成與生長的破壞，以P276-00處理以劑量依賴的方式誘導出了細胞毒性。
第9圖提供了P276-00對抗微球中所生長的A549細胞的醫療潛力。
範例7：評估阿黴素在3D微球系統中的穿透性
評估了藥物，例如阿黴素，在3D微球系統中的穿透性。以3 μM 阿黴素處理3D HL460衍生的微球系統的Z堆疊達18小時。
第10圖提供了以3 μM阿黴素處理的3D微球系統的Z堆疊影像。
範例8：阿黴素對HL460衍生的3D微球系統的細胞毒性效果
以阿黴素（1 -3 μM）處理HL460衍生的3D微球系統達48小時。觀察到的是，1 μM阿黴素抑制細胞生長，並在48小時內顯示出較大的細胞毒性，而3μM阿黴素在24小時內展現了細胞毒性的效果。
第11圖示出了阿黴素處理（1-3μM）對於HL460衍生的3D MCS的時間動力學以及細胞毒性效果。
範例9：BEZ235、拉帕替尼以及太平洋紫杉醇對於HL460衍生的3D微球系統的影響的評估。
以BEZ235（1 μM）、拉帕替尼（1 μM）以及太平洋紫杉醇（1 μM）處理HL460衍生的3D微球系統。觀察到的是，BEZ235（1 μM）以及拉帕替尼（1 μM）顯示了細胞生長抑制的效果，而太平洋紫杉醇（1 μM）在接種的48小時內對於HL460衍生的3D微球展現了細胞毒性效果。
第12圖示出了抗癌化合物對於HL460衍生的3D微球系統的細胞毒性以及細胞生長抑制的效果。
範例10：阿黴素在2D單層培養中對照在3D微球系統中的劑量依賴效果
使用H460細胞，將48小時之後在2D單層中阿黴素（0.03 - 3 μM）的細胞毒性效果百分比與以阿黴素（0.03至3 μM）處理曝露96小時的HL460衍生的3D微球系統比較。
第13圖描繪了48小時的阿黴素（0.03 - 3 μM）在2D單層中的HL460細胞中的細胞毒性效果，對照在曝露96小時的HL460衍生的3D微球系統中觀察到的細胞毒性效果。
範例11：在HL460衍生的3D微球系統中抗癌劑的細胞毒性效果的比較
以抗癌劑，例如阿黴素、順鉑、BEZ235、奧拉帕尼、太平洋紫杉醇、拉帕替尼以及P276處理HL460衍生的3D微球系統。在1 -10 μM的濃度範圍中評估該抗癌劑。此研究的結果呈現於下表中。
第14圖描繪了HL460衍生的3D微球系統中抗癌劑的細胞毒性效果的比較。
範例12：在使用MCF7（乳癌）細胞株的2D單層以及3D微球系統中，抗癌劑的比較性細胞毒性百分比特徵。
比較在2D單層中使用MCF7（乳癌）細胞株在48小時後以及MCF7（乳癌）細胞衍生的3D微球系統96小時的不同濃度的某些抗癌劑細胞毒性效果百分比。
第15圖描繪了使用MCF7（乳癌）細胞株的2D單層以及3D微球系統中抗癌化合物的細胞毒性效果的比較。
本發明有關一種包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質以及產生三維細胞支架的方法，該三維細胞支架具有在下述中作為藥物發現工具的效用：
（a）產生三維細胞培養及/或組織生產；及/或
（b）評估試管中以及活體外模型中潛在療法的功效。
在一方面中，本發明是一種用於在中空聚合物微球中生長細胞以形成三維（3D）支架的工程細胞培養基質。
在本發明的一方面中，有一種製備包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質的方法，該方法包含下述步驟：
（a）藉由將生物可降解的聚合物加至水中來製備凝膠；
（b）將該凝膠加熱至85°C-90°C，以確保完全的水合作用，以獲得黏的聚合物凝膠；以及
（c）藉由將該黏的聚合物凝膠直接滴入2-5％的氯化鈣溶液中來形成中空微球。
在本發明的具體實施例中，使用了3％的氯化鈣溶液。作為替代方案，可使用鎂、銅以及其他無機離子。
在本發明的另一方面中，提供了一種用於製備包含中空聚合物微球的工程細胞培養基質的方法，該方法包含下述步驟：
（a）藉由將生物可降解的聚合物加至水中來製備凝膠；
（b）將該凝膠加熱至85°C-90°C，以確保完全的水合作用，以獲得聚合物水凝膠；以及
（c）藉由將空氣困在聚合物水凝膠中，或藉由將空氣注射至所預先形成的聚合物球體內來形成中空微球。
在特定的具體實施例中，生物可降解的聚合物是樹膠（gellan）聚合物。GELRITE™,CPKelco,U.S.Inc.,Atlanta,Georgia,USA是一種樹膠聚合物。一般而言，所使用的樹膠聚合物的量是2-3w/v％。
從樹膠聚合物形成的凝膠在水中是流體狀態。當滴到氯化鈣離子的溶液中時，該凝膠形成固態球狀微球。之後，使用針筒而藉由注入空氣來在此固態樹膠球體中誘導出真空。該過程描述了從樹膠聚合物製備軟/彈性球體的方法。藉由注射空氣來創造出該固態聚合物球體內中空的空間。一旦注入空氣之後，該空間即產生，其中注入了在培養基中的細胞。利用在均衡狀態中具有細胞以及培養基遍及各處的此空間，將2D細胞轉變成模擬癌細胞活體外支架的3-D支架。在藥物發現設定中，這種系統的大量生產將至少是半自動化的。
因此形成的本發明的中空聚合物微球的直徑接近5mm至25mm。
在微球的製備之後，將在胎牛血清（FCS）培養基或其他培養基中的細胞注入至該微球的中空中。可將這些微球轉置入具有過量FCS培養基或其他培養基的96孔盤中。在幾分鐘之後達到了溶劑平衡，且持續地以FCS及/或其他養分滋養細胞。每24小時替換新鮮的培養基/或將微球轉置入具有新鮮培養基的新的孔中。可將具有培養細胞的微球維持在培養箱中。之後，可將完全生長的細胞支架儲存在液態氮中至少4星期，並簡單地藉由將具有3D支架的微球插入新鮮的FCS或其他適合的培養基中來重新取得。
在本發明的一方面中，支架支持了同步或同時生長的多於一種細胞類型的生長。同時生長在微球中的兩個不同層的細胞選自：上皮-上皮細胞、上皮-內皮細胞、上皮-骨髓細胞、內皮-骨髓細胞、內皮-內皮細胞以及骨髓-骨髓細胞。在進一步的方面中，本發明展現了在3D多球體細胞培養中生長源自上皮細胞、骨髓細胞或內皮細胞的癌細胞。
想像到的是，取決於同時生長的細胞類型組合，特定的細胞類型將佔據細胞的內層以及細胞的第二外層。
生長在本發明微球中上皮來源的細胞包括但不限於MCF-7（乳癌細胞）、MDAMB231（三重陰性乳癌細胞）、PC3（前列腺癌細胞）、HL460（肺癌細胞）、Colo205（大腸癌細胞）、HCT116（大腸癌細胞）、Ovcar（卵巢癌細胞）、Pane1（胰臟癌細胞）以及A549（肺癌細胞）。骨髓細胞，例如K562（人類bcr-abl白血病細胞）、Ba/F3（小鼠單核細胞骨髓細胞）、HL60（人類前髓細胞性白血病細胞）、THP1（人類急性單核細胞白血病細胞）、Jurkat（人類T細胞似淋巴母細胞）、U937（人類組織細胞性淋巴瘤細胞）、SUP-B15（急性淋巴母細胞白血病細胞）以及諸如此類；以及內皮細胞，包括HUVEC（人類臍帶靜脈內皮細胞）為可在此三維細胞培養系統中生長的其他細胞的範例。
可將生長在中空聚合物微球中的三維細胞曝露至化學物品、醫療劑、溫度、壓力、pH等的差異，以測試，例如，分化以及增殖。在非限制性的方面，骨髓細胞的三維細胞基質以抗癌醫療劑處理，並測試其分化以及增殖。
在另一方面，本發明提供了一種用於從生長為中空聚合物微球中的三維支架的細胞重新取得為二維單層的細胞的方法；其中所述方法包含下述步驟：
1. 將該細胞生長在二維單層中作為第一步驟；
2. 將該二維細胞注入該中空聚合物微球中作為第二步驟；
3. 將該二維細胞轉變為該微球中的三維支架，並生長至少7-10天作為第三步驟；
4. 藉由將它們從該微球釋放至盤或瓶中的組織培養基中，來從該三維支架重新取得二維細胞單層作為第四步驟。一旦達成生長（2天至18天），可將微球切開以分離所形成的多層支架/組織。
因此，微球中細胞的生長不改變細胞生長回二維系統中的能力。組織培養環境可為本技術領域常規使用的環境。
在一個具體實施例中，本發明提供了一種儲存以及復甦生長在中空聚合物微球中的三維細胞的方法，其中所述方法包含下述步驟：
1.在液態氮中冷凍含有細胞的微球；
2.隨後藉由解凍來復甦該細胞；以及
3.在較晚的時間點，使用組織培養方法來將該解凍的細胞生長為二維單層。
復甦時間點可為冷凍細胞之後的任何時間，例如，10、15、20或30天或甚至更高達冷凍中空微球之後60天。將冷凍的微球復甦成完全正常的二維單層細胞，並因此作為有效的工具，以按比例增加細胞用於高產量的用途。此外，儲存該三維微球以及當需要時復甦它們的能力提供了研究者當處理初代細胞培養時非常需要的彈性。
本發明的中空微球系統用以從各種癌細胞株來產生三維微球。使用完全生長的三維癌細胞球體，這些微球被進一步使用以研究各種化療劑的效果。該化療劑為抗癌劑，其包括但不限於P276-00、阿黴素、順鉑、太平洋紫杉醇、喜樹鹼、奧拉帕尼、拉帕替尼及/或任何其他已知的抗癌劑或研究抗癌劑，例如BEZ235（2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-側氧基-8-(3-喹啉基)-2,3-二氫-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈）。該抗癌劑，即阿黴素、順鉑、太平洋紫杉醇、拉帕替尼以及喜樹鹼為商業可得的。奧拉帕尼可藉由Drugs of Future 2009, 34(2): 101中所揭露的方法來製備。研究藥物，BEZ235，可藉由美國專利編號7667039中所描述的方法來製備。抗癌劑，P276-00（(+)-反-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥基-甲基-1-甲基-吡咯啶-基)-色烯-4-酮鹽酸鹽），一種CDK抑制劑，可藉由US7271193中所描述的方法來製造，其併入於本文中以作為參考。此外，化合物P276-00可如本文中所描述來製備。
在另一方面中，本發明提供了一種篩選抗癌醫療劑的方法，包含：
（a）在中空聚合物微球中生長細胞；
（b）以該抗癌醫療劑處理該微球；
以及
（c）測試該細胞的分化及/或增殖。
在本文中，也很重要的是去注意到，經由本發明注重於在抗癌醫療劑的篩選中使用了中空聚合物微球，本領域的技術人員將領略到，所述微球是用以模擬任何活體內生理狀態的有用工具，且因此有用於篩選任何醫療劑。
在一個具體實施例中，申請人已使用本發明的中空微球而建立了P276-00的抗癌功效，因此建立了3D癌細胞球體在分析抗癌醫療劑中作為有效活體外模型的有效用途。
此外，聚合物微球自己本身對於細胞不給予任何的表現型以及基因型特徵。
定義
藉由二維（2D）細胞培養，其意指將細胞在傳統的組織培養容器或任何平面中，在瓶子、盤子或插入物中生長成單層。
藉由三維（3D）細胞培養系統、支架或基質，其意指將細胞生長在具有三維結構的中空聚合物基質中，如同可能的情況，模擬真的組織對藥物或毒物的反應。
進行培養單層或用於生長培養單層的組織培養瓶、盤、插入物或任何的容器在此揭露內容中可替代地使用。
與形狀有關的聚合物基質的尺寸可被替代或改變，因此形狀對於本發明的微球而言並無限制。例如，微球的形狀可為卵形、方形或圓形。
藉由多個中空微球，其在本文中意指在培養情況中的中空微球總是以多個且非單一地存在。
如本文中所使用的，用語「接近」意指中空聚合物微球的平均直徑的特定值的± l mm- 4 mm的值範圍。例如，「接近25mm」將暗示「24mm至26mm」或「21mm至29mm」。
如同本揭露內容中所使用的組織培養方法，意指按照已知用於所生長的特定細胞的標準方法來將細胞生長於具有補給品的適當組織培養基中。
雖然已在揭露內容以及下述用於示例目的的範例中詳細地描述了本發明，要了解的是，這種細節僅為了示例的目的，且本領域的技術人員可於其中做出變化，而不悖離本發明的精神以及範圍。下述範例意欲於示例，而非用以限制本發明。
範例
參考範例： P276-00 （ ( +)- 反 -2- ( 2- 氯 - 苯基 ) -5,7- 二羥基 -8- ( 2- 羥基甲基 -1- 甲基 - 吡咯啶 -3- 基 ) - 色烯 -4- 酮鹽酸鹽 ）的製備
將熔化的吡啶鹽酸鹽（4.1g,35.6mmol）加至(+)-反-2-(2-氯-苯基)-8-(2-羥基甲基-1-甲基-吡咯啶-3-基)-5,7-二甲氧基-色烯-4-酮（0.4g,0.9mmol）中，並於180°C加熱1.5小時。將反應混合物冷卻至25°C，以甲醇（10mL）稀釋，並使用碳酸鈉鹼化至pH10。過濾該混合物，並濃縮有機層。將殘餘物懸浮於水（5mL）中，攪拌30分鐘，將其過濾並乾燥，以獲得化合物，(+)-反-2-(2-氯-苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥基甲基-1-甲基-吡咯啶-3-基)-色烯-4-酮。
產量：0.25g（70％）；IR（KBr）：3422、3135、1664、1623、1559cm-1；
1HNMR(CDC13,300MHz):δ7.56(d,1H),7.36(m,3H),6.36(s,1H),6.20(s,1H),4.02(m,1H),3.70(m,2H),3.15(m,2H),2.88(m,lH),2.58(s,3H),2.35 (m,lH),1.88(m,1H);MS(ES+):m/z402(M+1);
分析：C21H20ClN05C,62.24(62.71);H,5.07(4.97);N,3.60(3.48); Cl,9.01(8.83)。
將上述獲得的化合物（0.2g,0.48mmol）懸浮於異丙酮（5mL）中，並加入3.5％HCl（25mL）。將該懸浮液加熱，以得到澄清的溶液。將該溶液冷卻，並過濾固體，以獲得化合物，(+)-反-2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-(2-羥基甲基-1-甲基-吡咯啶-3-基)-色烯-4-酮鹽酸鹽（P276）。
產量：0.21 g（97 ％）； mp：188 - 192oC ； [α]D25 = +21.3o（c = 0.2，甲醇）；
lH NMR(CD30D,300MHz):δ7.80(d,lH), 7.60(m,3H),6.53(s,lH), 6.37(s,lH), 4.23(m,lH), 3.89(m,2H),3.63(m,lH), 3.59(dd,lH),3.38(m,lH),2.90 (s,3H),2.45(m,lH), 2.35(m,lH);MS(ES+):rnlz402(M+1)（游離鹼）
範例 1 ：中空聚合物微球的製備
使用樹膠聚合物（GELRITE™, CP Kelco,U.SsInc.,Atlanta, Georgia, USA）製備黏的凝膠。將GELRITE加入水中，並持續攪拌，並將該分散物加熱至85-90°C，以確保完全的水合作用。一般而言，所使用樹膠聚合物的量是2-3w/v％。由於藉由使用氯化鈣溶液而形成的二價錯合物，凝膠轉變成較軟的聚合物基質。
藉由將該黏的聚合物凝膠直接滴入氯化鈣溶液（3％w/v）中來製造聚合物球體。藉由以二價Ca2+離子取代聚合物中的鈉基團，聚合物立即形成了強力的錯合物。此外，藉由將空氣困在聚合物水凝膠中或藉由使用，例如針筒，而將空氣注射於預先形成的樹膠球體內，來形成中空微球。
範例 2 ：生長於微球基質中的細胞的物理特徵
細胞數
第3A圖描繪了微球中健康細胞的生長。細胞數在培養的第3、5以及7天逐步地增加。細胞數在培養的第3天從接近3x103個細胞增加至第7天的大約5x105個細胞（第3B圖）。
大小
雖然在二維培養系統中細胞的大小是大約100-200 μM，如第4圖所示，本發明微球內所生長的細胞達到最大2-3mm的大小。
環境誘導的細胞生長
進行了在玻璃毛細管以及中空聚合物基質之間對於生長細胞的比較。如第2圖中所示，將玻璃毛細管放置在聚合物基質內作為2D細胞生長成3D支架的同時比較。第2圖描繪了含有玻璃毛細管以及中空聚合物基質的聚合物基質，該玻璃毛細管以及中空聚合物基質都含有細胞。
藉由注入空氣（在玻璃毛細管平行側）而在聚合物微球內形成中空基質。在該玻璃毛細管內以及中空微球中注入相同的細胞株。
第5圖示出了在相同環境中在玻璃毛細管中對照在微球中生長的細胞的比較。
範例 3 ：在微球基質中生長混合的細胞族群
將MCF7GFP細胞先播種於聚合物微球內，並允許其生長2-3天。一旦發展出具有MCF7-GFP細胞的3D支架，將A549細胞種入相同的中空微球中。監控生長進度以及模式，並照下影像用於分析。
第6圖描繪了微球中混合的細胞族群的同時生長。在第6圖中，看到（上皮來源的）A549細胞為外層，且所生長的（上皮來源的）MCF7-GFP細胞為內層。兩個細胞層似乎完全正常且健康，因此重申了可在微球中常規地生長混合的細胞族群，因此提供了用於同時生長不同細胞類型的三維細胞培養系統。
範例4：從3D系統重新取得細胞成2D系統
先將初代細胞在適當的組織培養條件中生長成二維單層。例如，將A549（肺癌）單層生長於組織培養基（具有FCS（胎牛血清）的RPMI）中。一旦健康之後，將它們注入中空微球中，並發現它們轉變成三維支架。在7-10天之後，儲存具有該細胞的微球並復甦（如範例5中所示），或藉由將它們從該微球中釋放至適當的組織培養基中來重新取得成二維狀態。
第7圖示出了同時生長MCF7-GFP以及A549細胞的情況中的重新取得順序。第一，使用MCF7-GFP細胞發展出3D支架。之後，將A549細胞注射/種入具有發展的MCF-GFP支架的相同中空微球中。A549細胞開始在較早的支架（即，MCF-GFP）上生長。
範例5：生長在中空微球中的細胞的儲存以及復甦
將含有細胞（獨立生長的MCF7以及A549細胞）的微球冷凍或儲存在液態氮中。在儲存的5、10、15、20或30天後將細胞復甦，並使用組織培養復甦以及生長技術來生長成單層。
第8A以及8B圖分別示出了單層的MCF7以及A549細胞的復甦開始以及逐步生長。
相較於在2D單層系統中生長的細胞，在從3D支架復甦/重新取得成2D的細胞中沒有觀察到顯著的表現型改變。
範例6：在微球中生長的細胞對於化療劑P276-00的反應
允許含有細胞的微球生長成3D培養。3天之後，以不同的濃度（3μM以及10μM）將化療劑P276-00加至培養基，並分析其對3D培養生長的影響。以P276-00處理48小時之後，在顯微鏡下觀察微球，以研究該培養的生長模式。擷取控制組對照處理過的微球的影像。
觀察到的是，如同所展現的，經由在微球內對3D培養的形成與生長的破壞，以P276-00處理以劑量依賴的方式誘導出了細胞毒性。
第9圖提供了P276-00對抗微球中所生長的A549細胞的醫療潛力。
範例7：評估阿黴素在3D微球系統中的穿透性
評估了藥物，例如阿黴素，在3D微球系統中的穿透性。以3 μM 阿黴素處理3D HL460衍生的微球系統的Z堆疊達18小時。
第10圖提供了以3 μM阿黴素處理的3D微球系統的Z堆疊影像。
範例8：阿黴素對HL460衍生的3D微球系統的細胞毒性效果
以阿黴素（1 -3 μM）處理HL460衍生的3D微球系統達48小時。觀察到的是，1 μM阿黴素抑制細胞生長，並在48小時內顯示出較大的細胞毒性，而3μM阿黴素在24小時內展現了細胞毒性的效果。
第11圖示出了阿黴素處理（1-3μM）對於HL460衍生的3D MCS的時間動力學以及細胞毒性效果。
範例9：BEZ235、拉帕替尼以及太平洋紫杉醇對於HL460衍生的3D微球系統的影響的評估。
以BEZ235（1 μM）、拉帕替尼（1 μM）以及太平洋紫杉醇（1 μM）處理HL460衍生的3D微球系統。觀察到的是，BEZ235（1 μM）以及拉帕替尼（1 μM）顯示了細胞生長抑制的效果，而太平洋紫杉醇（1 μM）在接種的48小時內對於HL460衍生的3D微球展現了細胞毒性效果。
第12圖示出了抗癌化合物對於HL460衍生的3D微球系統的細胞毒性以及細胞生長抑制的效果。
範例10：阿黴素在2D單層培養中對照在3D微球系統中的劑量依賴效果
使用H460細胞，將48小時之後在2D單層中阿黴素（0.03 - 3 μM）的細胞毒性效果百分比與以阿黴素（0.03至3 μM）處理曝露96小時的HL460衍生的3D微球系統比較。
第13圖描繪了48小時的阿黴素（0.03 - 3 μM）在2D單層中的HL460細胞中的細胞毒性效果，對照在曝露96小時的HL460衍生的3D微球系統中觀察到的細胞毒性效果。
範例11：在HL460衍生的3D微球系統中抗癌劑的細胞毒性效果的比較
以抗癌劑，例如阿黴素、順鉑、BEZ235、奧拉帕尼、太平洋紫杉醇、拉帕替尼以及P276處理HL460衍生的3D微球系統。在1 -10 μM的濃度範圍中評估該抗癌劑。此研究的結果呈現於下表中。
第14圖描繪了HL460衍生的3D微球系統中抗癌劑的細胞毒性效果的比較。
範例12：在使用MCF7（乳癌）細胞株的2D單層以及3D微球系統中，抗癌劑的比較性細胞毒性百分比特徵。
比較在2D單層中使用MCF7（乳癌）細胞株在48小時後以及MCF7（乳癌）細胞衍生的3D微球系統96小時的不同濃度的某些抗癌劑細胞毒性效果百分比。
第15圖描繪了使用MCF7（乳癌）細胞株的2D單層以及3D微球系統中抗癌化合物的細胞毒性效果的比較。
2D．．．二維
3D．．．三維
A549．．．肺癌細胞
BEZ235．．．抗癌劑
hr．．．小時
MCF7．．．乳癌
Claims (15)
- 一種適合用於生長細胞的工程細胞培養基質，其包含多個中空聚合物微球，該多個中空聚合物微球具有將二維細胞轉變或轉換為三維支架的能力。
- 如申請專利範圍第1項所述的工程細胞培養基質，其中該中空聚合物微球具有接近5mm至25mm的一平均直徑。
- 如申請專利範圍第1項所述的工程細胞培養基質，其中所生長的細胞選自上皮細胞、骨髓細胞以及內皮細胞。
- 如申請專利範圍第3項所述的工程細胞培養基質，其中該上皮細胞選自：MCF-7、MDAMB231、PC3、MCF-7、MDAMB231、PC3、HL460、Colo205、HCT116、Ovcar、Pane1以及A549。
- 如申請專利範圍第3項所述的工程細胞培養基質，其中該骨髓細胞選自：K562、Ba/F3、HL60、THPl、Jurkat、U937以及SupB15。
- 如申請專利範圍第3項所述的工程細胞培養基質，其中該內皮細胞為HUVEC。
- 如申請專利範圍第1項所述的工程細胞培養基質，其中該微球包含在兩個不同層中同時生長的多細胞培養。
- 如申請專利範圍第7項所述的工程細胞培養基質，其中該兩個不同層選自：上皮-上皮細胞、上皮-內皮細胞、上皮-骨髓細胞、內皮-骨髓細胞、內皮-內皮細胞以及骨髓-骨髓細胞。
- 如申請專利範圍第7項所述的工程細胞培養基質，其中該微球包含MCF-7細胞的一內層以及A549肺癌細胞的一外層。
- 一種製備中空聚合物微球的方法，包含下述步驟：
（a）藉由將一生物可降解的聚合物加至水中來製備一凝膠；
（b）將該凝膠加熱至85°C-90°C，以確保完全的水合作用，以獲得黏的聚合物水凝膠；以及
（c）藉由將該黏的聚合物凝膠直接滴入3％氯化鈣溶液中來形成中空微球。 - 一種用於製備中空聚合物微球的方法，包含下述步驟：
（a）藉由將一生物可降解的聚合物加至水中來製備一凝膠；
（b）將該凝膠加熱至85°C-90°C，以確保完全的水合作用，以獲得聚合物水凝膠；以及
藉由將空氣困在該聚合物水凝膠中，或藉由將空氣注射於預先形成的聚合物球體中來形成中空微球。 - 一種篩選抗癌劑的方法，包含：
（a）在中空聚合物微球中生長細胞；
（b）以該抗癌劑處理該微球；以及
（c） 測試該細胞的分化及/或增殖。 - 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中該抗癌劑選自：P276-00、阿黴素（doxorubicin）、順氯氨鉑（cisplatin）、太平洋紫杉醇（paclitaxel）、喜樹鹼（camptothecin）、奧拉帕尼（olaparib）、拉帕替尼（lapatinib）或BEZ235。
- 一種用於從在中空聚合物微球中生長成三維支架的細胞重新取得成二維單層細胞的方法；其中所述方法包含下述步驟：
a） 在二維單層中生長該細胞作為第一步驟；
b） 將該二維細胞注射入該中空聚合物微球中作為第二步驟；
c） 在該微球中將該二維細胞轉變為三維支架，並生長至少7-10天作為第三步驟；以及
d） 藉由將該三維支架從該微球釋放至一盤子或燒瓶中的一組織培養基中，而從該三維支架重新取得二維細胞單層作為第四步驟。 - 一種儲存以及復甦在一中空聚合物微球中生長的三維細胞的方法，包含下述步驟：
a） 在液態氮中冷凍含有細胞的該微球；
b） 隨後藉由解凍來復甦該細胞；以及
c） 在一較晚的時間點使用一組織培養方法來將該解凍的細胞生長成二維單層。
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