CN111888528A - 一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型及其制备方法，该多细胞共培养模型包括多层定向纳米纤维膜和灌注到所述多层定向纳米纤维膜中成胶的三维多孔结构的GelMA水凝胶。所述多层定向纳米纤维膜可利用静电纺丝技术制备。使用该多细胞共培养模型，在多层定向纳米纤维膜上接种一种细胞，在纤维水凝胶支架的上表面接种第二种细胞，在纤维水凝胶支架的下面接种第三种细胞，实现多种细胞的体外共培养。该多细胞共培养模型不仅可以实现多种细胞的共培养，而且具有很好的力学性能和高的仿生性能，可以给培养的多种细胞提供可以模拟天然组织的细胞外基质的结构和性能。

Description

一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型及其制备方法
技术领域
本发明涉及多细胞共培养模型，尤其是一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型及其制备方法。
背景技术
人体内很多组织及器官都是由多种细胞构成，不同的细胞之间相互通讯，相互影响，促进彼此的增殖及分化等生物学行为，共同维持组织或器官的稳态。因此，在体外构建多细胞共培养模型，不仅可以很好的仿生模拟，而且可以具有更好的功能性。但是，传统的组织工程支架只能实现单一细胞的培养，这对于实现整个组织或器官的体外仿生及模拟是远远不够的。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型及其制备方法，以解决传统方法制备的组织工程支架不能实现多种细胞共培养的问题。
为此，本发明的技术方案为：
一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型，所述多细胞共培养模型包括多层定向纳米纤维膜和灌注到所述多层定向纳米纤维膜中成胶的三维多孔结构的GelMA水凝胶。
进一步地：
所述多层定向纳米纤维膜为单层膜纤维定向排列且相邻的两层膜呈90度正交排列的多层正交定向结构。
优选地，所述多层定向纳米纤维膜为PLGA纳米纤维膜。
所述纳米纤维膜的纤维直径在50-500nm，单层纤维在正负10度内的定向程度在80％以上。
所述多层定向纳米纤维膜的制备材料包括聚乳酸羟基乙酸(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚乙烯醇(PVA)，聚环氧乙烷(PEO)，胶原(collagen)，明胶(gelatin)和丝素蛋白(silk fibroin)中的一种或多种。
一种制备所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型的方法，包括以下步骤：
由静电纺丝技术制备多层定向纳米纤维膜；
配制含有光引发剂的GelMA水溶液，灌注到所述多层定向纳米纤维膜中并成胶，制得所述基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型。
进一步地：
所述静电纺丝技术为熔融静电纺丝技术；或者，所述静电纺丝技术为溶液静电纺丝技术，其中，制备溶液静电纺丝材料，通过溶液静电纺丝技术制备定向纳米纤维膜。
溶液静电纺丝设备运行参数为：溶液的流速为0.1-1.0mL/h，电压为8-16KV，注射器针尖与收集装置之间的距离为50-200mm，收集装置转速为1000-5000r/min。
由静电纺丝技术制备多层定向纳米纤维膜还包括：将所述定向纳米纤维膜两两相差90度放置到模具中，制备所述多层正交定向纤维膜。
所述含有光引发剂的GelMA水溶液的配制步骤包括：取定向的固体GelMA，加入到含有0.05％LAP光引发剂PBS水溶液中，制备5％GelMA水溶液；所述含有光引发剂的GelMA水溶液的成胶步骤包括：将该水溶液灌注到模具中，用3W的405nm的光源照射90s。
一种使用所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型的多细胞共培养方法。
进一步地，通过在多层定向纳米纤维膜上接种一种细胞，在纤维水凝胶支架的上表面接种第二种细胞，在纤维水凝胶支架的下面接种第三种细胞，实现多种细胞的体外共培养。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种多细胞共培养模型，包括多层定向纳米纤维膜和灌注到所述多层定向纳米纤维膜中成胶的三维多孔结构的GelMA水凝胶，构建出基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型。该模型具有很好的力学性能和高的仿生性能，可以通过改变纤维的拓扑结构模拟多种不同天然组织的结构与性能。所述多层定向纳米纤维膜可利用静电纺丝技术制备。
利用本发明的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型，可以通过在多层定向纳米纤维膜上接种一种细胞，在纤维水凝胶支架的上表面接种第二种细胞，在纤维水凝胶支架的下面接种第三种细胞，实现多种细胞的体外共培养。
本发明的多细胞共培养模型至少具有以下优点：
(1)制备简单，但可以实现三种细胞的共培养；
(2)涉及的制备材料生物相容性好；
(3)多层正交定向的纳米纤维膜的仿生性好；
(4)可以实现多种组织或器官的细胞共培养模型的构建。
本发明的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型可用于构建具有上皮层，基质层及内皮层的完整的人工组织角膜植片，为临床组织移植提供可能的材料，在临床组织再生领域具有广阔的应用前景。该多细胞共培养模型不仅可以实现多种细胞的共培养，而且具有很好的力学性能和高的仿生性能，可以给培养的多种细胞提供可以模拟天然组织的细胞外基质的结构和性能。
附图说明
图1为实施例中采用的静电纺丝技术的结构示意图；
图2为实施例中基于纤维水凝胶的多细胞培养模型制备过程的示意图；
图3为制备的多层正交定向纤维膜扫描电镜(SEM)图。
图中标记说明如下：1-注射器；2-带电射流；3-定向纳米纤维；4-纤维收集装置；5-角膜基质细胞；6-多层正交定向纳米纤维膜；7-GelMA水溶液；8-纤维水凝胶；9-角膜上皮细胞；10-角膜内皮细胞；11-含三种细胞的多细胞培养模型。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。这些更详细的描述旨在帮助理解本发明，而不应被用于限制本发明。根据本发明公开的内容，本领域技术人员明白，可以不需要一些或者所有这些特定细节即可实施本发明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
本发明的实施例提供一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型，该模型包括多层定向纳米纤维膜和GelMA水凝胶。
在优选的实施例中，所述多层定向纳米纤维膜为单层膜纤维定向排列且相邻的两层膜呈90度正交排列的多层正交定向结构。应理解，本发明相邻两层膜的纤维定向也不限于90度正交定向。
在优选的实施例中，所述多层定向纳米纤维膜为PLGA纳米纤维膜。
在优选的实施例中，所述纳米纤维膜的纤维直径在50-500nm，单层纤维在正负10度内的定向程度在80％以上。
在不同的实施例中，所述多层定向纳米纤维膜的制备材料可以包括(但不限于)聚乳酸羟基乙酸(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚乙烯醇(PVA)，聚环氧乙烷(PEO)，胶原(collagen)，明胶(gelatin)和丝素蛋白(silk fibroin)中的一种或多种。
本发明的实施例还提供一种制备所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型的方法，包括以下步骤：
由静电纺丝技术制备多层定向纳米纤维膜；
配制含有光引发剂的GelMA水溶液，灌注到所述多层定向纳米纤维膜中并成胶，制得所述基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型。
由静电纺丝技术制备的多层定向纳米纤维膜具有很高的比表面积和孔隙率，不仅可以很好的模拟天然组织的细胞外基质的结构，而且具有可控的理化特性。
配制含有光引发剂的GelMA水溶液，灌注到所述多层定向纳米纤维膜中制成的纤维水凝胶具有很好的生物相容性，其三维多孔的特性有利于组织工程支架的制备。
在优选的实施例中，所述静电纺丝技术为熔融静电纺丝技术；或者，所述静电纺丝技术为溶液静电纺丝技术，其中，制备溶液静电纺丝材料，通过溶液静电纺丝技术制备定向纳米纤维膜。
在优选的实施例中，溶液静电纺丝设备运行参数为：溶液的流速为0.1-1.0mL/h，电压为8-16KV，注射器针尖与收集装置之间的距离为50-200mm，收集装置转速为1000-5000r/min。
在优选的实施例中，将所述定向纳米纤维膜两两相差90度放置到模具中，制备所述多层正交定向纤维膜。
在优选的实施例中，所述含有光引发剂的GelMA水溶液的配制步骤包括：取定向的固体GelMA，加入到含有0.05％LAP光引发剂PBS水溶液中，制备5％GelMA水溶液。
在优选的实施例中，所述含有光引发剂的GelMA水溶液的成胶步骤包括：将该水溶液灌注到模具中，用3W的405nm的光源照射90s。
本发明的实施例还提供一种使用所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型的多细胞共培养方法。
在优选的实施例中，通过在多层定向纳米纤维膜上接种一种细胞，在纤维水凝胶支架的上表面接种第二种细胞，在纤维水凝胶支架的下面接种第三种细胞，实现多种细胞的体外共培养。
根据本发明的具体实施例，结合静电纺丝技术和GelMA水凝胶，以PLGA为主要材料，构建多层正交定向纤维水凝胶复合支架，用于制备组织工程支架，实现多种细胞的共培养。PLGA材料具有很好的生物相容性和降解性，并且通过静电纺丝技术制备的PLGA纳米纤维膜具有很好的力学性能，同时，通过正交堆叠多层纳米纤维膜，得到多层正交定向的纳米纤维结构。因此将静电纺丝技术和水凝胶结合起来，以GelMA和PLGA为主要材料，构建的正交定向的多层纳米纤维水凝胶不仅可以实现多种细胞的共培养，而且具有很好的力学性能和高的仿生性能，可以模拟天然组织的结构与性能。
在一个具体实施例中，通过接种角膜上皮细胞，角膜基质细胞及角膜内皮细胞实现基于纤维水凝胶的角膜多细胞共培养模型的构建。
图1为实施例中采用的静电纺丝技术的结构示意图。图2为实施例中基于纤维水凝胶的多细胞培养模型制备过程的示意图。参见图1和图2，一个具体实施例的多细胞培养模型制备方法包括以下步骤：
(1)利用如图1所示的静电纺丝技术制备多层正交定向的纳米纤维膜。具体如下：
称取1g PLGA固体颗粒，加入到5mL的氯仿溶液中，磁力搅拌机搅拌直至PLGA完全溶解，制备20％PLGA溶液，并加入到10mL的注射器1中；利用静电纺丝技术由溶液供给系统的注射器1发出带电射流2，以在纤维收集装置4上形成定向纳米纤维3；
设置静电纺丝的参数为：溶液的流速为0.3mL/h，电压为12KV，注射器1针尖与纤维收集装置4之间的距离为150mm，纤维收集装置4转速为5000r/min，电纺时间为1h；
上述参数下得到的PLGA纤维支架的纤维平均直径200nm，单层纤维在正负10度内的定向程度为96％，厚度约为20μm。
(2)在PLGA纤维支架纤维膜上接种角膜基质细胞5，细胞接种浓度为5X104个/cm2，在基质细胞培养基下培养1天后进行步骤(3)。
(3)取5块上述含有角膜基质细胞的定向纳米纤维膜，两两相差90度放置到模具中，制备含有角膜基质细胞的多层正交定向纤维膜6。图3为制备的多层正交定向纤维膜扫描电镜(SEM)图。
(4)配制含有0.05％LAP光引发剂的GelMA水溶液7，将其灌注到步骤(3)中的模具中，405nm光源光照90s后成胶，制备含有角膜基质细胞的纤维水凝胶8。
(5)在上述含有角膜基质细胞的纤维水凝胶上表面接种角膜上皮细胞9，在共培养的培养基下培养1天后进行步骤(6)。
(6)将上述纤维水凝胶上下翻转，并在另一面上接种角膜内皮细胞10，形成含三种细胞的多细胞培养模型11，在共培养的培养基条件下培养，实现角膜三种主要细胞的体外共培养模型的构建。
本发明制备的多细胞共培养模型至少具有以下优点：
(1)制备简单，但可以实现三种细胞的共培养；
(2)涉及的制备材料生物相容性好；
(3)多层正交定向的纳米纤维膜的仿生性好；
(4)可以实现多种组织或器官的细胞共培养模型的构建。
本发明的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型可用于构建具有上皮层，基质层及内皮层的完整的人工组织角膜植片，为临床组织移植提供可能的材料，在临床组织再生领域具有广阔的应用前景。该多细胞共培养模型不仅可以实现多种细胞的共培养，而且具有很好的力学性能和高的仿生性能，可以给培养的多种细胞提供可以模拟天然组织的细胞外基质的结构和性能。
本发明的背景部分可以包含关于本发明的问题或环境的背景信息，而不一定是描述现有技术。因此，在背景技术部分中包含的内容并不是申请人对现有技术的承认。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离专利申请的保护范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。

Claims (10)

1.一种基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型，其特征在于：所述多细胞共培养模型包括多层定向纳米纤维膜和灌注到所述多层定向纳米纤维膜中成胶的三维多孔结构的GelMA水凝胶。
2.根据权利要求1所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型，其特征在于：所述多层定向纳米纤维膜为单层膜纤维定向排列且相邻的两层膜呈90度正交排列的多层正交定向结构；优选地，所述多层定向纳米纤维膜为PLGA纳米纤维膜。
3.根据权利要求1所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型，其特征在于：所述纳米纤维膜的纤维直径在50-500nm，单层纤维在正负10度内的定向程度在80％以上。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型，其特征在于：所述多层定向纳米纤维膜的制备材料包括聚乳酸羟基乙酸(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚乙烯醇(PVA)，聚环氧乙烷(PEO)，胶原(collagen)，明胶(gelatin)和丝素蛋白(silk fibroin)中的一种或多种。
5.一种制备根据权利要求1至4任一项所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
由静电纺丝技术制备多层定向纳米纤维膜；
配制含有光引发剂的GelMA水溶液，灌注到所述多层定向纳米纤维膜中并成胶，制得所述基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述静电纺丝技术为熔融静电纺丝技术；或者，所述静电纺丝技术为溶液静电纺丝技术，其中，制备溶液静电纺丝材料，通过溶液静电纺丝技术制备定向纳米纤维膜。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：溶液静电纺丝设备运行参数为：溶液的流速为0.1-1.0mL/h，电压为8-16KV，注射器针尖与收集装置之间的距离为50-200mm，收集装置转速为1000-5000r/min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：由静电纺丝技术制备多层定向纳米纤维膜还包括：将所述定向纳米纤维膜两两相差90度放置到模具中，制备所述多层正交定向纤维膜。
9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其特征在于：所述含有光引发剂的GelMA水溶液的配制步骤包括：取定向的固体GelMA水凝胶，加入到含有0.05％LAP光引发剂PBS水溶液中，制备5％GelMA水溶液；所述含有光引发剂的GelMA水溶液的成胶步骤包括：将该水溶液灌注到模具中，用3W的405nm的光源照射90s。
10.一种多细胞共培养方法，其特征在于：使用根据权利要求1至4任一项所述的基于纤维水凝胶的多细胞共培养模型进行多细胞共培养，优选地，通过在多层定向纳米纤维膜上接种一种细胞，在纤维水凝胶支架的上表面接种第二种细胞，在纤维水凝胶支架的下面接种第三种细胞，实现多种细胞的体外共培养。
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