CN106110401A - 微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法，应用于皮肤再生组织工程。首先，采用静电纺丝技术制备一层纳米纤维膜作为皮肤的表皮层；然后，利用先进的电流体动力喷射打印方法在纳米纤维膜上直写制备三维结构支架作为皮肤的真皮层。纳米纤维膜是一层直径均匀的纳米纤维，纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞的黏附与生长；三维结构支架是通过电流体动力喷射打印技术，由微米纤维组成的三维空间，提供了细胞生长的微环境，有利于细胞的渗透和增殖；纳米纤维膜和三维结构支架均采用可生物降解的高分子材料制成。与传统人工皮肤支架相比，本发明双层皮肤支架是一种微纳米复合型支架，具有良好的可塑性及适宜的力学特性、高度孔隙度的三维立体结构及生物相容性。

Description

微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种模仿细胞外基质的皮肤支架及其制备方法，还涉及一种静电纺丝方法、生物3D打印方法和再生医学工程，特别是涉及一种具有三维立体结构的皮肤支架及其制备方法，应用于组织工程技术领域。

背景技术

目前，大规模烧伤等人类皮肤组织损伤都是通过自体或异体皮肤移植的方法来治疗，这不仅导致治疗材料来源受限，而且还会对患者造成二次伤害。近几年来，随着生物3D打印技术的兴起，利用组织工程技术构建模仿细胞外基质的皮肤支架来治疗皮肤损伤成为了不错的选择。

当前，在人工组织工程皮肤支架领域，用于皮肤支架制备的材料大致分为两类：一类是人工合成生物高分子材料，主要有聚乙交酯、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚碳酸酯类等聚酯类材料；另一类是天然生物衍生材料，如胶原、壳聚糖、透明质酸、羧甲基壳聚糖及丝素蛋白等。大多数皮肤支架都是运用生物材料通过静电纺丝技术或交联来制造。虽然由静电纺丝得到的纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞在支架上的黏附与生长，然而由静电纺丝制备的皮肤支架由于孔径太小，不利于细胞在深度方向上的迁移、增殖；而由交联制备的多孔皮肤支架由于其孔径和孔隙率都不可控，机械强度较差，同样会妨碍细胞生长，这限制了人工皮肤支架在皮肤损伤医学治疗领域中的应用。

近年来，电流体动力喷射打印技术在生物3D打印的领域中迅速发展，它能使用高分子生物材料溶液进行三维生物支架打印，所得到的支架具有孔隙率高、孔径小、可降解、生物相容性好等特点，在组织工程支架中有着广泛的应用。与传统的生物3D打印技术相比，电流体动力喷射打印技术具有更高的分辨率，打印出的支架具有更细的微米纤维和更小的孔径，这有利于细胞在支架上的黏附和生长，但其制备的支架作为细胞的粘附载体还不够理想，其机械强度有待提高。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法，将静电纺丝技术与电流体动力喷射打印技术相结合，制备具有良好的可塑性及适宜的力学特性、高度孔隙度的三维立体结构及生物相容性的微纳米复合型双层皮肤支架，微纳米复合型双层皮肤支架可完全生物降解，适合用于皮肤再生组织工程。

为达到上述发明创造目的，采用下述技术方案：

一种微纳米复合双层皮肤支架，由纳米纤维层和三维结构支架层两部分复合而成，所述纳米纤维膜为静电纺丝方法制备的平整的纳米纤维膜，所述三维结构支架层结合在所述纳米纤维层上，所述三维结构支架层是用电流体动力喷射打印方法直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高，以所述纳米纤维膜作为皮肤细胞的黏附和生长的表皮层支架，并以所述三维结构支架层作为皮肤细胞的渗透和增殖的真皮层支架，形成微纳米复合双层皮肤支架体系，所述纳米纤维层和所述三维结构支架层均采用可生物降解的高分子材料制成。

上述纳米纤维层和上述三维结构支架层分别主要优选采用聚乳酸、聚已内酯和聚左旋乳酸-已内脂中的任意一种可降解高分子材料或任意几种可降解高分子材料制成。

上述纳米纤维层主要优选采用聚左旋乳酸-已内酯制成，上述三维结构支架层主要优选采用聚已内酯制成。

作为本发明上述方案的进一步优选的技术方案，纳米纤维层为直径均匀的静电纺丝组成的纳米纤维膜，厚度为10-30μm；所述三维结构支架层为电流体动力喷射打印的有微米纤维组成具有高孔隙率的三维支架，厚度为370-460μm。

作为本发明上述方案的进一步优选的技术方案，所述纳米纤维层和所述三维结构支架层组成的复合支架的总厚度为380-450μm。

作为本发明上述方案的进一步优选的技术方案，采用静电纺丝方法制备所述纳米纤维层时，采用的静电纺丝纳米纤维直径为1500-2000nm，采用电流体动力喷射打印方法制备所述三维结构支架层时，采用的电流体动力喷射打印微米纤维直径为220-270μm。

作为本发明上述方案的进一步优选的技术方案，所述三维结构支架层的孔径为98±10μm、孔隙率不低于90.3%。

一种微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，包括如下步骤：

a. 按照一种可降解的高分子材料M1和HFIP溶剂的混合配比为（10-15）g：100ml的比例，将高分子材料M1溶于HFIP溶剂中，在室温下放置在磁力搅拌器上搅拌，直至共聚物完全溶解，形成有机相A；所述高分子材料M1优选采用聚乳酸、聚已内酯和聚左旋乳酸-已内脂中的任意一种可降解高分子材料或任意几种可降解高分子材料；

b. 利用静电纺丝设备，将在所述步骤a中制备的有机相A装入到静电纺丝设备的供料装置的注射器中，在金属收集板上接收一层纳米纤维膜；优选静电纺丝过程参数为：电压范围为8-10kV，注射器的针尖与金属收集板距离为10-18cm，供料速率为1.2-3mL/h，接收时间为3-5min；

c. 按照二氯甲烷与N-二甲基甲酰胺的质量混合配比为1：(0.4~0.6)的比例，将二氯甲烷与N-二甲基甲酰胺混合制备混合溶剂，再按照一种可降解的高分子材料M2和混合溶剂的混合配比为（10-15）g：100ml的比例，将高分子材料M2溶于混合溶剂中制成混合物体系，在室温下，将混合物体系放置在磁力搅拌器上搅拌，直至共聚物完全溶解，形成有机相B；所述高分子材料M2优选采用聚乳酸、聚已内酯和聚左旋乳酸-已内脂中的任意一种可降解高分子材料或任意几种可降解高分子材料；

d. 利用电流体动力喷射打印装置，将在所述步骤b中得到的纳米纤维膜固定在电流体动力喷射打印装置的金属收集板上，将金属收集板放在盛乙醇溶液的容器中，并使乙醇的液面高出金属收集板不大于2mm，再将容器固定在电流体动力喷射打印机的工作平台上，作为接受装置，将在所述步骤c中的有机相B装入到电流体动力喷射打印装置的供料装置的注射器中，利用电流体动力喷射打印方法，在所述步骤b中得到的纳米纤维膜上直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，使所述步骤b中得到的纳米纤维膜与三维结构支架两部分结合在一起，最终形成微纳米复合双层皮肤支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高。优选电流体动力喷射打印过程参数为：电压范围为3-3.20kV，注射器的针尖与金属收集板距离为4-8mm，供料速率1.2-2mL/h，打印头移动速率为8-10mm/s，乙醇高出金属收集板距离0-2mm。本发明所述制备的微纳米复合双层皮肤支架由作为表皮层的纳米纤维膜和作为真皮层的三维结构支架组成。纳米纤维膜由静电纺丝制备，利于细胞的黏附与生长。三维结构支架是在纳米纤维膜上利用电流体动力喷射打印方法打印的三维支架，具有高度孔隙度的三维立体结构和良好的机械性能，利于细胞的迁移增值。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1. 本发明微纳米复合双层皮肤支架均为生物可完全降解材料，具有很好的生物相容性；

2. 与传统的人工静电纺丝皮肤支架相比，本发明复合支架具有更好的机械性能，采用电流体动力喷射打印技术打印的三维结构支架层，具有孔隙率高、孔径更合适等优点，利于细胞在支架中的渗透迁移；

3. 本发明采用纳米纤维膜和微米纤维三维支架的双层结构，更加接近于真实的皮肤组织结构，不同层面接种相应细胞后，通过组织培养可以发育成相应的皮肤组织层，更有利于再生皮肤组织工程的应用；

4. 本发明纳米纤维和微米纤维复合的三维支架不仅为细胞的黏附和铺展提供了合适的表面形态，利于细胞在支架上的黏附与生长，而且提高了整体的微环境，利于细胞渗透到支架内部的迁移和增殖；

5. 本发明制备工艺简单,设备要求低,制备成本低廉,制备时间短。

附图说明

图1为本发明实施例一制备的微纳米复合双层皮肤支架图。

图2为本发明实施例一～实施例三采用的静电纺丝装置结构示意图。

图3为本发明实施例一～实施例三采用的电流体动力喷射打印装置结构示意图。

图4为本发明实施例一制备的纳米纤维膜层表面的扫描电子显微镜形貌图。

图5为本发明实施例一制备的三维结构支架层表面的扫描电子显微镜形貌图。

图6为本发明实施例一制备的复合支架横截面的扫描电子显微镜形貌图。

具体实施方式

本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，参见图1～6，一种微纳米复合双层皮肤支架，由纳米纤维层和三维结构支架层两部分复合而成，所述纳米纤维膜为静电纺丝方法制备的平整的纳米纤维膜，有利于细胞的黏附和生长，所述三维结构支架层结合在所述纳米纤维层上，提供了细胞生长的微环境，有利于细胞的渗透和增殖，所述三维结构支架层是用电流体动力喷射打印方法直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高，以所述纳米纤维膜作为皮肤细胞的黏附和生长的表皮层支架，并以所述三维结构支架层作为皮肤细胞的渗透和增殖的真皮层支架，形成微纳米复合双层皮肤支架体系，所述纳米纤维层和所述三维结构支架层均采用可生物降解的高分子材料制成。

如图2所示，为本实施例中采用的静电纺丝装置示意图，图中：1一高压电源，2一注射器，3一供料泵，4一金属收集板。

如图3所示，为本实施例中采用的电流体动力喷射打印装置示意图，图中：1一高压电源，2一注射器，3一供料泵，4—金属收集板，5—乙醇容器，6—纳米纤维膜，7—精密三轴运动系统。

在本实施例中，参见图1～6，一种微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，包括如下步骤：

a. 称取1g聚左旋乳酸一已内酯(PLCL)，将其置于10mL的HFIP溶剂中，在室温下放置在磁力搅拌器上搅拌，直至共聚物完全溶解，形成有机相A；

b. 利用静电纺丝设备，参见图2，将在所述步骤a中制备的有机相A装入到静电纺丝设备的供料装置的注射器2中，调整电压为10kV，针尖与金属收集板4距离为15cm，注射速率为2.4mL/h，注射时间为4min。利用静电纺丝技术金属收集板4上接收一层纳米纤维膜；

c. 按照二氯甲烷与N-二甲基甲酰胺的质量混合配比为1：0.5的比例，将二氯甲烷与N-二甲基甲酰胺混合制备混合溶剂，称取1g聚已内酯(PCL)，将其置于9mL的二氯甲烷与N—二甲基甲酰胺混合溶剂中溶剂中，制成混合物体系，在室温下，将混合物体系放置于磁力搅拌器上搅拌直至完全溶解，形成有机相B；

d. 利用电流体动力喷射打印装置，参见图3，将在所述步骤b中得到的纳米纤维膜6固定在电流体动力喷射打印装置的金属收集板4上，将金属收集板4放在盛乙醇溶液的乙醇容器5中，并使乙醇的液面高出金属收集板4为2mm，再将容器固定在电流体动力喷射打印机的工作平台上，作为接受装置，将在所述步骤c中的有机相B装入到电流体动力喷射打印装置的供料装置的注射器2中，调整电压为3.15kV，注射器2的针尖与金属收集板4的距离为4mm，供料速率1.2mL/h，打印头移动速率为8mm/s，利用电流体动力喷射打印方法，在所述步骤b中得到的纳米纤维膜6上直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，使所述步骤b中得到的纳米纤维膜6与三维结构支架两部分结合在一起，最终形成微纳米复合双层皮肤支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高。

参见图4～6，将本实施例所得纳米纤维膜6、三维结构支架和最终的复合支架分别进行拉伸试验,结果表明本实施例复合支架的拉伸强度比纳米纤维膜6或三维结构支架的拉伸强度大,体现出复合支架具有综合的性能优势。通过扫描电子显微镜观察本实施例复合支架,为两层不同的结构,一层为平整的纳米纤维膜,一层为具有三维空间的支架。经游标卡尺测量,本实施例复合支架厚度为400±20μm,扫描电子显微镜结果显示纳米纤维的直径为1500-2000nm，微米纤维的直径为220-250μm，作为真皮层的支架孔径为100±10μm，孔隙率为90.3%。通过NIT/3T3细胞检测本实施例所制备的复合支架具有良好的生物相容性、适合于细胞的黏附、迁移和增殖。

本实施例微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法，可应用于皮肤再生组织工程。首先，采用静电纺丝技术制备一层纳米纤维膜6作为皮肤的表皮层；然后，利用先进的电流体动力喷射打印方法在纳米纤维膜6上直写制备三维结构支架作为皮肤的真皮层。纳米纤维膜6是一层直径均匀的纳米纤维，纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞的黏附与生长；所述的三维结构支架是通过电流体动力喷射打印技术，由微米纤维组成的三维空间，提供了细胞生长的微环境，有利于细胞的渗透和增殖；纳米纤维膜6和三维结构支架均采用可生物降解的高分子材料制成。与传统人工皮肤支架相比，本实施例制备的双层皮肤支架是一种微纳米复合型支架，具有良好的可塑性及适宜的力学特性、高度孔隙度的三维立体结构及生物相容性。

实施例二：

本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，参见图2和图3，一种微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，包括如下步骤：

a. 本步骤与实施例一相同；

b. 本步骤与实施例一相同；

c. 本步骤与实施例一相同；

d. 利用电流体动力喷射打印装置，参见图3，将在所述步骤b中得到的纳米纤维膜6固定在电流体动力喷射打印装置的金属收集板4上，将金属收集板4放在盛乙醇溶液的乙醇容器5中，并使乙醇的液面高出金属收集板4为2mm，再将容器固定在电流体动力喷射打印机的工作平台上，作为接受装置，将在所述步骤c中的有机相B装入到电流体动力喷射打印装置的供料装置的注射器2中，调整电压为3.15kV，注射器2的针尖与金属收集板4的距离为6mm，供料速率1.8mL/h，打印头移动速率为9mm/s，利用电流体动力喷射打印方法，在所述步骤b中得到的纳米纤维膜6上直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，使所述步骤b中得到的纳米纤维膜6与三维结构支架两部分结合在一起，最终形成微纳米复合双层皮肤支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高。

参见图4～6，将本实施例所得纳米纤维膜6、三维结构支架和最终的复合支架分别进行拉伸试验,结果表明本实施例复合支架的拉伸强度比纳米纤维膜6或三维结构支架的拉伸强度大,体现出复合支架具有综合的性能优势。通过扫描电子显微镜观察本实施例复合支架,为两层不同的结构,一层为平整的纳米纤维膜,一层为具有三维空间的支架。经游标卡尺测量,本实施例复合支架厚度为425±20μm,扫描电子显微镜结果显示纳米纤维的直径为1500-2000nm，微米纤维的直径为225-260μm，作为真皮层的支架孔径为108±10μm，孔隙率为91.2%。通过NIT/3T3细胞检测本实施例所制备的复合支架具有良好的生物相容性、适合于细胞的黏附、迁移和增殖。

实施例三：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，参见图2和图3，一种微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，包括如下步骤：

a. 本步骤与实施例一相同；

b. 本步骤与实施例一相同；

c. 本步骤与实施例一相同；

d. 利用电流体动力喷射打印装置，参见图3，将在所述步骤b中得到的纳米纤维膜6固定在电流体动力喷射打印装置的金属收集板4上，将金属收集板4放在盛乙醇溶液的乙醇容器5中，并使乙醇的液面高出金属收集板4为2mm，再将容器固定在电流体动力喷射打印机的工作平台上，作为接受装置，将在所述步骤c中的有机相B装入到电流体动力喷射打印装置的供料装置的注射器2中，调整电压为3.15kV，注射器2的针尖与金属收集板4的距离为8mm，供料速率2mL/h，打印头移动速率为10mm/s，利用电流体动力喷射打印方法，在所述步骤b中得到的纳米纤维膜6上直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，使所述步骤b中得到的纳米纤维膜6与三维结构支架两部分结合在一起，最终形成微纳米复合双层皮肤支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高。

参见图4～6，将本实施例所得纳米纤维膜6、三维结构支架和最终的复合支架分别进行拉伸试验,结果表明本实施例复合支架的拉伸强度比纳米纤维膜6或三维结构支架的拉伸强度大,体现出复合支架具有综合的性能优势。通过扫描电子显微镜观察本实施例复合支架,为两层不同的结构,一层为平整的纳米纤维膜,一层为具有三维空间的支架。经游标卡尺测量,本实施例复合支架厚度为440±10μm,扫描电子显微镜结果显示纳米纤维的直径为1500-2000nm，微米纤维的直径为230-270μm，作为真皮层的支架孔径为98±10μm，孔隙率为90.6%。通过NIT/3T3细胞检测本实施例所制备的复合支架具有良好的生物相容性、适合于细胞的黏附、迁移和增殖。

上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种微纳米复合双层皮肤支架，其特征在于：由纳米纤维层和三维结构支架层两部分复合而成，所述纳米纤维膜为静电纺丝方法制备的平整的纳米纤维膜，所述三维结构支架层结合在所述纳米纤维层上，所述三维结构支架层是用电流体动力喷射打印方法直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高，以所述纳米纤维膜作为皮肤细胞的黏附和生长的表皮层支架，并以所述三维结构支架层作为皮肤细胞的渗透和增殖的真皮层支架，形成微纳米复合双层皮肤支架体系，所述纳米纤维层和所述三维结构支架层均采用可生物降解的高分子材料制成。

2.根据权利要求1所述微纳米复合双层皮肤支架，其特征在于：所述纳米纤维层和所述三维结构支架层分别主要采用聚乳酸、聚已内酯和聚左旋乳酸-已内脂中的任意一种可降解高分子材料或任意几种可降解高分子材料制成。

3.根据权利要求2所述微纳米复合双层皮肤支架，其特征在于：所述纳米纤维层主要采用聚左旋乳酸-已内酯制成，所述三维结构支架层主要采用聚已内酯制成。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述微纳米复合双层皮肤支架，其特征在于：所述纳米纤维层为直径均匀的静电纺丝组成的纳米纤维膜，厚度为10-30μm；所述三维结构支架层为电流体动力喷射打印的有微米纤维组成具有高孔隙率的三维支架，厚度为370-460μm。

5.根据权利要求2所述微纳米复合双层皮肤支架，其特征在于：所述纳米纤维层和所述三维结构支架层组成的复合支架的总厚度为380-450μm。

6.根据权利要求1～3中任意一项所述微纳米复合双层皮肤支架，其特征在于：采用静电纺丝方法制备所述纳米纤维层时，采用的静电纺丝纳米纤维直径为1500-2000nm，采用电流体动力喷射打印方法制备所述三维结构支架层时，采用的电流体动力喷射打印微米纤维直径为220-270μm。

7.根据权利要求1～3中任意一项所述微纳米复合双层皮肤支架，其特征在于：所述三维结构支架层的孔径为98±10μm、孔隙率不低于90.3%。

8.一种微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a. 按照一种可降解的高分子材料M1和HFIP溶剂的混合配比为（10-15）g：100ml的比例，将高分子材料M1溶于HFIP溶剂中，在室温下放置在磁力搅拌器上搅拌，直至共聚物完全溶解，形成有机相A；

b. 利用静电纺丝设备，将在所述步骤a中制备的有机相A装入到静电纺丝设备的供料装置的注射器中，在金属收集板上接收一层纳米纤维膜；

c. 按照二氯甲烷与N-二甲基甲酰胺的质量混合配比为1：(0.4~0.6)的比例，将二氯甲烷与N-二甲基甲酰胺混合制备混合溶剂，再按照一种可降解的高分子材料M2和混合溶剂的混合配比为（10-15）g：100ml的比例，将高分子材料M2溶于混合溶剂中制成混合物体系，在室温下，将混合物体系放置在磁力搅拌器上搅拌，直至共聚物完全溶解，形成有机相B；

d. 利用电流体动力喷射打印装置，将在所述步骤b中得到的纳米纤维膜固定在电流体动力喷射打印装置的金属收集板上，将金属收集板放在盛乙醇溶液的容器中，并使乙醇的液面高出金属收集板不大于2mm，再将容器固定在电流体动力喷射打印机的工作平台上，作为接受装置，将在所述步骤c中的有机相B装入到电流体动力喷射打印装置的供料装置的注射器中，利用电流体动力喷射打印方法，在所述步骤b中得到的纳米纤维膜上直写而成的由微米纤维组成的三维结构支架，使所述步骤b中得到的纳米纤维膜与三维结构支架两部分结合在一起，最终形成微纳米复合双层皮肤支架，所述三维结构支架层比所述纳米纤维层孔隙率更高。

9.根据权利要求8所述微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，其特征在于：在所述步骤a或c中，所述高分子材料M1或所述高分子材料M2分别采用聚乳酸、聚已内酯和聚左旋乳酸-已内脂中的任意一种可降解高分子材料或任意几种可降解高分子材料。

10.根据权利要求8或9所述微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，其特征在于，在所述步骤b中，静电纺丝过程参数为：电压范围为8-10kV，注射器的针尖与金属收集板距离为10-18cm，供料速率为1.2-3mL/h，接收时间为3-5min。

11.根据权利要求8或9所述微纳米复合双层皮肤支架的制备方法，其特征在于，在所述步骤d中，电流体动力喷射打印过程参数为：电压范围为3-3.20kV，注射器的针尖与金属收集板距离为4-8mm，供料速率1.2-2mL/h，打印头移动速率为8-10mm/s，乙醇高出金属收集板距离0-2mm。