CN110975005A - 抗感染组织工程皮肤支架及其制备方法 - Google Patents

抗感染组织工程皮肤支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗感染组织工程皮肤支架，支架为上下双层结构，层间通过戊二醛交联作用结合在一起，具有良好的机械强度。上层表皮支架聚己内酯‑聚乙二醇‑聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层中纤维内部的纳米银与纤维表面的壳聚糖协同发挥抗菌功效，下层真皮支架丝素/透明质酸纤维中均匀分布有乙酸锌，能够抑制细菌聚集，发挥抗感染功效；下层为纳米纤维束编织支架，纤维束支架的结构、孔径大小及孔隙率可以通过编制自由调节，能够制备得到纤维束有序规则排列、孔径平均值与细胞尺寸接近的支架，使细胞能够进入，并引导组织定向生长。

Description

抗感染组织工程皮肤支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及抗感染组织工程皮肤支架及其制备方法。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官，起着保护人体免受外界物体入侵的作用。皮肤的损伤可导致细菌、病原体的入侵，严重者可导致死亡。因此在过去的三十年中，生物医用材料和组织工程领域大量开展了皮肤支架的研究。人体皮肤为双层结构，由表皮和真皮组成。表皮主要由致密的角化细胞组成，起防护作用；真皮主要由成纤细胞及其分泌的胶原蛋白组成，有较好的弹性和机械强度，在皮肤再生过程中起重要的作用。
双层支架材料应用于皮肤的修复，取得了良好的效果。但目前文献和公开专利中采用的双层支架多为微米多孔结构，且采用单一的方法制备。最新的组织工程支架研究表明，纳米纤维结构的支架能提供更多的细胞吸附位点，促进细胞的生长，因此，纳米纤维的双层支架对于皮肤的修复是一种更好的选择。然而采用静电纺丝制备的纳米纤维支架，纤维排列均为无序，不能发挥对细胞粘附和迁移的导向作用。静电纺丝纤维膜大多存在易收缩变形，纤维稳定性不足的现象，作为皮肤组织工程表皮支架时无法满足结构稳定性的要求；真皮支架结构则存在纳米纤维孔径较小，结构致密，不利于细胞进入支架内部形成三维培养的问题。3D打印制备支架时，虽然孔隙率和孔径大小可以调节，解决了静电纺丝纤维结构致密的问题，但是由于打印材料需要达到一定的硬度才能得到设计的形状和结构，这就造成3D打印支架应用于皮肤组织工程时硬度过大，不易与创面贴合，不利于细胞粘附和迁移。
皮肤及软组织破损极易引发感染，加重创面溃烂，影响组织修复，因此目前常采用在组织工程皮肤支架材料中载入抗菌药物，如庆大霉素、头孢类等抗生素以提高其抗感染能力，但是抗生素用量过大，释放浓度较高，会引起组织损伤。
因此，研发具有抗感染功能、性质稳定、亲水性好、具有导向性、利于细胞粘附生长的组织工程皮肤支架材料意义重大。
发明内容
本发明提供一种不含抗生素、具有双层有序结构的抗感染组织工程皮肤支架材料及其制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种抗感染组织工程皮肤支架，包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层和纳米束编织支架两部分，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层为上层，纳米束编织支架为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层通过动态-液体静电纺丝法制备得到；所述纳米纤维束编织支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织得到，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
一种所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：将聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物溶于有机溶剂中，磁力搅拌至完全溶解后，加入纳米银，超声分散，静置，装入注射器中，高压静电牵引下从针头口高速喷出，制得纳米纤维，在离针尖下方10-15cm处放置一盛水的容器，底部有孔，纳米纤维飘落到水面后，随着涡流从孔中顺水流下，扭转成束形成纳米纱线，转轴接收形成纳米纱，冷冻干燥后，再将纳米纱浸入壳聚糖溶液中自组装，自组装完成后真空干燥即得；
步骤二、聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备：以含有乙酸锌的丝素和透明质酸混合溶液为纺丝液1，聚乳酸溶液为纺丝液2，采用双针头共轭法制备得到聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束；
步骤三、纳米纤维束编织支架的制备：将聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织成孔径适宜的支架，再将支架浸润在聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球溶液中，取出后真空干燥即得；
步骤四、戊二醛交联：在培养皿中加入适量戊二醛水溶液，然后将其放入干净密闭的干燥器底部，再将纳米束编织支架放在铝箔上，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层叠放在纳米束编织支架上方，将叠加后的支架材料置于干燥器孔板中间，盖好盖子并密封后，室温下交联，取出水洗，充分干燥。
进一步地，步骤一聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备中所述有机溶剂为氯仿和二甲基甲酰胺体积比3:1混合。
进一步地，步骤一中所加纳米银的直径为50-100nm。
进一步地，步骤一聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备中，静电纺丝条件速度为1mL/h，电压为15kV。
进一步地，步骤二所述聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备方法，包括以下步骤：(1)丝素膜的制备：桑蚕丝脱胶后溶于80℃的氯化钙、水和乙醇体积比为1:8:2的混合溶液中，搅拌溶解，透析后得纯丝素溶液，流延成膜备用；(2)纺丝液1的制备：将丝素膜与相对分子质量为150万的透明质酸粉末共同加入甲酸溶液中，完全溶解后，再加入乙酸锌溶液，超声20min，得到纺丝液1；(3)纺丝液2的制备：聚乳酸溶于氯仿和丙酮体积比2：1的混合溶剂中，配制成5wt％的聚乳酸溶液，室温搅拌均匀，得到纺丝液2；(4)双针头共轭制备纤维束：将纺丝液1、纺丝液2各自装于两个10mL的注射器内，将四个注射器分别安装到四个SN-50微量注射泵上，再用聚四氟乙烯软管将两个纺丝液2注射泵连于两个纺丝液2串联针管，两个纺丝液1注射泵连于两个纺丝液1串联针管，将串联后的双喷头分别与高压发生器的正负极相连，打开高压发生器后，四喷头与纤维收集装置之间产生“静电感应”现象，这时带有正负电荷的喷头生成的泰勒锥便会产生静电引力的作用下破裂进行集束，纤维收集装置开口表面便形成中空的纤维网，通过绝缘棒将纳米纤维网沿纤维收集装置中心轴线向纤维卷绕装置方向牵伸，并在导纱辊的引导下卷绕到卷绕辊上，集聚成纳米纤维集束。
进一步地，步骤(2)所述乙酸锌溶液浓度为0.1mol/L。
进一步地，步骤四中戊二醛水溶液的浓度为25wt％。
进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法如下：配制生长因子水溶液，将其加入PLGA二氯甲烷溶液中，用超声细胞破碎仪超声分散10s至液体呈乳白色；然后将乳白色溶液到PVA溶液中，继续超声分散2min，至液体呈淡乳白色后，磁力搅拌2-4h，使二氯甲烷挥发完全；待微球成型后，离心、弃上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心、清洗三次，-20℃冷冻，真空干燥后即得聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
进一步地，聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法中离心转速为4000rpm，离心时间5min。
本发明采用的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯与单纯聚己内酯相比降解率高，亲水性好，酸性低，但是由于聚己内酯的疏水性，其通过静电纺丝制备得到的纤维膜仍然具有较强的疏水性，且纤维排列无规则，不具有导向性，在组织工程支架材料中应用有限。本发明在动态-液体静电纺丝技术制备聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯纳米纱时在纺丝液中添加纳米银，然后通过纳米束表面自组装壳聚糖制备得到聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱，纳米银与壳聚糖的抗菌功效相协同，能够快速杀菌，抗感染，由于经过转轴接受，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/壳聚糖纳米纱为有序排列，步骤四戊二醛交联过程中纳米纱之间通过表面修饰的壳聚糖交联结合，形成有序网络结构。
丝素与透明质酸的复合能够良好的模拟细胞外基质的蛋白与多糖结构，对细胞生长起到促进作用，透明质酸还具有一定的抗菌功效，但是二者复合后纤维的稳定性和力学强度较差，本发明通过以含有乙酸锌的丝素和透明质酸混合溶液作为纺丝液1，聚乳酸溶液作为纺丝液2，采用共轭静电纺丝技术将聚乳酸纤维、丝素与透明质酸纤维集束成网，得到纳米纤维束，既能够有效调控纤维束的形态，降低纤维的溶失率，又能增强纳米纤维的稳定性和力学性能，显著提高了支架的弹性模量和压缩应力，同时不会影响纤维的生物相容性，纤维束间的缝隙还有利于聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的结合。
本发明在聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/壳聚糖纳米纱层的制备过程中，使用传统平板接收器时，得到的纤维膜中纳米纤维呈无序排列，而使用动态-液体接收时，收集到的纳米纱呈规则有序排列。在后续实验中纳米纱层与纳米纤维膜相比，表现出良好的细胞粘附和增殖能力，细胞形态以及三维定向生长倾向。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本发明提供的抗感染组织工程皮肤支架上层表皮支架聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层中纤维内部的纳米银与纤维表面的壳聚糖协同发挥抗菌功效，能够快速杀菌，长效抑菌，具有极强的抗感染能力，下层真皮支架丝素/透明质酸纤维中均匀分布有乙酸锌，能够抑制细菌聚集，发挥抗感染功效；
(2)本发明提供的抗感染组织工程皮肤支架在所用原料均无毒无害，具有良好的生物相容性，不同于现有双层皮肤支架上层采用静电纺丝纳米纤维膜，纳米纱具有很高的稳定性，上下层通过戊二醛交联作用结合在一起，结合牢固，下层为纳米纤维束编织支架，纤维束支架的结构、孔径大小及孔隙率可以通过编制自由调节，能够制备得到纤维束有序规则排列、孔径平均值与细胞尺寸接近的支架，使细胞能够进入，并引导细胞均匀沉积，组织定向生长；
(3)本发明提供的抗感染组织工程皮肤支架，所用纤维采用纳米纱和纳米束的形式，排列有序、机械强度高，下层支架材料表面固定有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球，能够稳定释放生长因子，而微球的多孔结构还可以保护生长因子免受外界环境的影响，保持性能稳定，将负载生长因子的多孔PLGA微球修饰在支架材料上，能够避免单纯的微球在组织中容易发生团聚或迁移的现象，得到的支架材料不仅具有传导性和诱导性，便于细胞粘附、增殖和分化，而且能为皮肤组织再生提供必要的力学支持、充足的血供及养分。
附图说明
图1为各时间点细胞粘附和增殖测试结果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合具体实施例进行详细描述。
实施例1
聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：将聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物(购自上海甄准生物科技有限公司，货号：ZZR-T-C-2k1k2k)溶于氯仿和二甲基甲酰胺体积比3:1混合的有机溶剂中，磁力搅拌至完全溶解后，加入直径为50-100nm的纳米银，超声分散30min，静置一段时间，装入10mL注射器中，15kV高压静电牵引下从针头口高速喷出，速度为1mL/h，制得纳米纤维，在离针尖下方10cm处放置一盛水的容器，底部有孔，纳米纤维飘落到水面后，随着涡流从孔中顺水流下，扭转成束形成纳米纱线，转轴接收形成纳米纱，冷冻干燥后，再将纳米纱浸入5wt％的壳聚糖溶液中自组装3h，真空干燥即得。
实施例2
聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：将聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物(购自上海甄准生物科技有限公司，货号：ZZR-T-C-2k1k2k)溶于氯仿和二甲基甲酰胺体积比3:1混合的有机溶剂中，磁力搅拌至完全溶解后，加入直径为50-100nm的纳米银，超声分散30min，静置一段时间，装入10mL注射器中，15kV高压静电牵引下从针头口高速喷出，速度为1mL/h，制得纳米纤维，在离针尖下方12cm处放置一盛水的容器，底部有孔，纳米纤维飘落到水面后，随着涡流从孔中顺水流下，扭转成束形成纳米纱线，转轴接收形成纳米纱，冷冻干燥后，再将纳米纱浸入5wt％的壳聚糖溶液中自组装4h，真空干燥即得。
实施例3
聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：将聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物(购自上海甄准生物科技有限公司，货号：ZZR-T-C-2k1k2k)溶于氯仿和二甲基甲酰胺体积比3:1混合的有机溶剂中，磁力搅拌至完全溶解后，加入直径为50-100nm的纳米银，超声分散30min，静置一段时间，装入10mL注射器中，15kV高压静电牵引下从针头口高速喷出，速度为1mL/h，制得纳米纤维，在离针尖下方12cm处放置一盛水的容器，底部有孔，纳米纤维飘落到水面后，随着涡流从孔中顺水流下，扭转成束形成纳米纱线，转轴接收形成纳米纱，冷冻干燥后，再将纳米纱浸入5wt％的壳聚糖溶液中自组装6h，真空干燥即得。
实施例4
一种抗感染组织工程皮肤支架，包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层和纳米束编织支架两部分，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层为上层，纳米束编织支架为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层通过动态-液体静电纺丝法制备得到；所述纳米纤维束编织支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织得到，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
一种所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：同实施例2；
步骤二、聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备：以含有乙酸锌的丝素和透明质酸混合溶液为纺丝液1，聚乳酸溶液为纺丝液2，采用双针头共轭法制备得到聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束；
步骤三、纳米纤维束编织支架的制备：聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织成孔径适宜的支架，再将支架浸润在聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球溶液中，取出后真空干燥即得；
步骤四、戊二醛交联：在培养皿中加入适量25wt％的戊二醛水溶液，然后将其放入干净密闭的干燥器底部，再将纳米束编织支架放在铝箔上，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层叠放在纳米束编织支架上方，将叠加后的支架材料置于干燥器孔板中间，盖好盖子并密封后，室温下交联8h，取出水洗，充分干燥。
进一步地，步骤二所述聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备方法，包括以下步骤：(1)丝素膜的制备：桑蚕丝脱胶后溶于80℃的氯化钙、水和乙醇体积比为1:8:2的混合溶液中，搅拌溶解，透析后得纯丝素溶液，流延成膜备用；(2)纺丝液1的制备：将丝素膜与相对分子质量为150万的透明质酸粉末共同加入甲酸溶液中，完全溶解后，再加入乙酸锌溶液，超声20min，得到纺丝液1；(3)纺丝液2的制备：聚乳酸溶于氯仿和丙酮体积比2：1的混合溶剂中，配制成5wt％的聚乳酸溶液，室温搅拌均匀，得到纺丝液2；(4)双针头共轭制备纤维束：将纺丝液1、纺丝液2各自装于两个10mL的注射器内，将四个注射器分别安装到四个SN-50微量注射泵上，再用聚四氟乙烯软管将两个纺丝液2注射泵连于两个纺丝液2串联针管，两个纺丝液1注射泵连于两个纺丝液1串联针管，将串联后的双喷头分别与高压发生器的正负极相连，打开高压发生器后，四喷头与纤维收集装置之间产生“静电感应”现象，这时带有正负电荷的喷头生成的泰勒锥便会产生静电引力的作用下破裂进行集束，纤维收集装置开口表面便形成中空的纤维网，通过绝缘棒将纳米纤维网沿纤维收集装置中心轴线向纤维卷绕装置方向牵伸，并在导纱辊的引导下卷绕到卷绕辊上，集聚成纳米纤维集束。
进一步地，步骤(2)所述乙酸锌溶液浓度为0.1mol/L。
进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法如下：配制生长因子水溶液，将其加入PLGA二氯甲烷溶液中，用超声细胞破碎仪超声分散10s至液体呈乳白色；然后将乳白色溶液到PVA溶液中，继续超声分散2min，至液体呈淡乳白色后，磁力搅拌2-4h，使二氯甲烷挥发完全；待微球成型后，离心、弃上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心、清洗三次，-20℃冷冻，真空干燥后即得聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
进一步地，聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法中离心转速为4000rpm，离心时间5min。
实施例5
一种抗感染组织工程皮肤支架，包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层和纳米束编织支架两部分，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层为上层，纳米束编织支架为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层通过动态-液体静电纺丝法制备得到；所述纳米纤维束编织支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织得到，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
一种所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：同实施例2；
步骤二、聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备：以含有乙酸锌的丝素和透明质酸混合溶液为纺丝液1，聚乳酸溶液为纺丝液2，采用双针头共轭法制备得到聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束；
步骤三、纳米纤维束编织支架的制备：聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织成孔径适宜的支架，再将支架浸润在聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球溶液中，取出后真空干燥即得；
步骤四、戊二醛交联：在培养皿中加入适量25wt％的戊二醛水溶液，然后将其放入干净密闭的干燥器底部，再将纳米束编织支架放在铝箔上，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层叠放在纳米束编织支架上方，将叠加后的支架材料置于干燥器孔板中间，盖好盖子并密封后，室温下交联10h，取出水洗，充分干燥。
进一步地，步骤二所述聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备方法，包括以下步骤：(1)丝素膜的制备：桑蚕丝脱胶后溶于80℃的氯化钙、水和乙醇体积比为1:8:2的混合溶液中，搅拌溶解，透析后得纯丝素溶液，流延成膜备用；(2)纺丝液1的制备：将丝素膜与相对分子质量为150万的透明质酸粉末共同加入甲酸溶液中，完全溶解后，再加入乙酸锌溶液，超声20min，得到纺丝液1；(3)纺丝液2的制备：聚乳酸溶于氯仿和丙酮体积比2：1的混合溶剂中，配制成5wt％的聚乳酸溶液，室温搅拌均匀，得到纺丝液2；(4)双针头共轭制备纤维束：将纺丝液1、纺丝液2各自装于两个10mL的注射器内，将四个注射器分别安装到四个SN-50微量注射泵上，再用聚四氟乙烯软管将两个纺丝液2注射泵连于两个纺丝液2串联针管，两个纺丝液1注射泵连于两个纺丝液1串联针管，将串联后的双喷头分别与高压发生器的正负极相连，打开高压发生器后，四喷头与纤维收集装置之间产生“静电感应”现象，这时带有正负电荷的喷头生成的泰勒锥便会产生静电引力的作用下破裂进行集束，纤维收集装置开口表面便形成中空的纤维网，通过绝缘棒将纳米纤维网沿纤维收集装置中心轴线向纤维卷绕装置方向牵伸，并在导纱辊的引导下卷绕到卷绕辊上，集聚成纳米纤维集束。
进一步地，步骤(2)所述乙酸锌溶液浓度为0.1mol/L。
进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法如下：配制生长因子水溶液，将其加入PLGA二氯甲烷溶液中，用超声细胞破碎仪超声分散10s至液体呈乳白色；然后将乳白色溶液到PVA溶液中，继续超声分散2min，至液体呈淡乳白色后，磁力搅拌2-4h，使二氯甲烷挥发完全；待微球成型后，离心、弃上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心、清洗三次，-20℃冷冻，真空干燥后即得聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
进一步地，聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法中离心转速为4000rpm，离心时间5min。
实施例6
一种抗感染组织工程皮肤支架，包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层和纳米束编织支架两部分，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层为上层，纳米束编织支架为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层通过动态-液体静电纺丝法制备得到；所述纳米纤维束编织支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织得到，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
一种所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：同实施例2；
步骤二、聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备：以含有乙酸锌的丝素和透明质酸混合溶液为纺丝液1，聚乳酸溶液为纺丝液2，采用双针头共轭法制备得到聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束；
步骤三、纳米纤维束编织支架的制备：聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织成孔径适宜的支架，再将支架浸润在聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球溶液中，取出后真空干燥即得；
步骤四、戊二醛交联：在培养皿中加入适量25wt％的戊二醛水溶液，然后将其放入干净密闭的干燥器底部，再将纳米束编织支架放在铝箔上，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层叠放在纳米束编织支架上方，将叠加后的支架材料置于干燥器孔板中间，盖好盖子并密封后，室温下交联12h，取出水洗，充分干燥。
进一步地，步骤二所述聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备方法，包括以下步骤：(1)丝素膜的制备：桑蚕丝脱胶后溶于80℃的氯化钙、水和乙醇体积比为1:8:2的混合溶液中，搅拌溶解，透析后得纯丝素溶液，流延成膜备用；(2)纺丝液1的制备：将丝素膜与相对分子质量为150万的透明质酸粉末共同加入甲酸溶液中，完全溶解后，再加入乙酸锌溶液，超声20min，得到纺丝液1；(3)纺丝液2的制备：聚乳酸溶于氯仿和丙酮体积比2：1的混合溶剂中，配制成5wt％的聚乳酸溶液，室温搅拌均匀，得到纺丝液2；(4)双针头共轭制备纤维束：将纺丝液1、纺丝液2各自装于两个10mL的注射器内，将四个注射器分别安装到四个SN-50微量注射泵上，再用聚四氟乙烯软管将两个纺丝液2注射泵连于两个纺丝液2串联针管，两个纺丝液1注射泵连于两个纺丝液1串联针管，将串联后的双喷头分别与高压发生器的正负极相连，打开高压发生器后，四喷头与纤维收集装置之间产生“静电感应”现象，这时带有正负电荷的喷头生成的泰勒锥便会产生静电引力的作用下破裂进行集束，纤维收集装置开口表面便形成中空的纤维网，通过绝缘棒将纳米纤维网沿纤维收集装置中心轴线向纤维卷绕装置方向牵伸，并在导纱辊的引导下卷绕到卷绕辊上，集聚成纳米纤维集束。
进一步地，步骤(2)所述乙酸锌溶液浓度为0.1mol/L。
进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法如下：配制生长因子水溶液，将其加入PLGA二氯甲烷溶液中，用超声细胞破碎仪超声分散10s至液体呈乳白色；然后将乳白色溶液到PVA溶液中，继续超声分散2min，至液体呈淡乳白色后，磁力搅拌2-4h，使二氯甲烷挥发完全；待微球成型后，离心、弃上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心、清洗三次，-20℃冷冻，真空干燥后即得聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
进一步地，聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法中离心转速为4000rpm，离心时间5min。
对比例1
除直接采用平板接收器接收得到静电纺丝纳米纤维膜外，其余同实施例2。
对比例2
除未浸入壳聚糖溶液中自组装外，其余同实施例2。
对比例3
除不加纳米银外，其余同实施例2。
对比例4
除不加乙酸锌溶液外，其余同实施例5。
对比例5
除步骤四中戊二醛交联时间为6h外，其余同实施例5。
对比例6
除步骤四中戊二醛交联时间为14h外，其余同实施例5。
形态表征
纳米纱层、纳米纤维束、组织工程支架样本表面喷金镀膜后，在扫描电子显微镜加速电压为25kV时，拍摄得到放大5000倍的SEM照片，观察纤维形态、直径、孔隙率，纳米纤维、纳米纱和纳米纤维束的平均直径均通过NanoMeasurer 1.2测量软件测量不同样品20次后统计得到。
吸水性测试
将样本裁剪成相同尺寸大小，充分干燥，用电子天平分别称取各样品的起始重量记为m0，然后分别将各样本放入培养皿中，向培养皿中加入重蒸水，在不同的时间用镊子夹出样品，用吸水纸擦去表面水分，电子天平称重，记录为mt。利用如下公式计算吸水率，吸水率
Figure BDA0002311230920000101
抗菌性测试
将样本裁剪成相同尺寸大小，用接种环从固体培养基上取一定量的新鲜大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，加入液体培养基，稀释成相同浓度，即1.5×106cfu/ml；分别取1ml的上述菌液滴加在样品上，用灭菌覆盖膜覆盖在样品上，在37℃，湿度大于90％的条件下培养24h；用洗脱液24ml反复清洗覆盖膜和样品，然后取0.2ml洗脱液滴入固体琼脂培养基上，在37℃条件下培养1～48h，然后进行活菌计数，测定活菌数目，计算杀菌率。
机械性能测试
取纳米纱层、纳米纤维束、组织工程支架样本(长×宽：1cm×5cm)，用螺旋测微器测量样品的厚度，将样品两端1cm处固定于材料测试机的夹具上，在室温20℃、相对湿度60％环境下，采用H5K-S型万能材料实验机施50N的力，10mm/min的速度进行拉伸测试。通过应力-应变曲线计算样本的断裂强度、断裂伸长及拉伸模量(每组测量5个标本)。
对实施例1～3及对比例1～3制备得到的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/纳米银/壳聚糖纳米纱层进行形态表征、吸水性测试、抗菌性及机械性能测试，结果如表1所示：
表1
样品 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3
纤维状态 有序 有序 有序 无序 有序 有序
平均直径(nm) 356 342 368 49 327 350
吸水率(％) 242.03 246.41 243.52 113.64 96.48 239.64
杀菌率(％) 98.4 98.7 98.6 96.2 80.5 69.7
断裂伸长率(％) 25.63 27.34 28.15 13.20 22.35 23.56
断裂强度(MPa) 196.35 213.57 212.08 51.24 150.84 192.49
拉伸模量(GPa) 1.44 1.38 1.52 0.36 0.88 1.42
从表1可以看出，实施例1～3制得的纳米纱纤维排列有序，平均直径较大，吸水性好，抗菌性大于98％，而且具有良好的机械强度。对比例1为平板接收，所得纳米纤维无序，直径较小，吸水率仅为纳米纱的一半，机械强度较差；对比例2未用壳聚糖改性，抗菌性明显下降，吸水性较差；对比例3未添加纳米银，抗菌性大幅下降；这也说明纳米银与壳聚糖之间在抗菌性方面具有协同增效的作用。
对实施例4～6及对比例4～6制备得到的抗感染组织工程皮肤支架进行厚度、形态观察、吸水率、抗菌性及拉伸强度测试，结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002311230920000111
从表2可知，实施例4～6所得抗感染组织工程皮肤支架厚度范围为442-466μm，扫描电子显微镜结果显示纳米纱的平均直径范围为298-312nm，纳米纤维束的平均直径范围为8.6-9.3μm，且统计所得作为真皮层的纳米纤维束支架孔隙直径范围在50-200μm，孔隙率大于90％，吸水率大于480％，整体杀菌率大于99.5％，拉伸强度大于10KN·m-1，伸长率大于8％。对比例4不含乙酸锌，制得的组织工程皮肤支架整体杀菌率仅为94.7％，低于单独聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的灭菌率，这可能是由于银离子溶出的灭菌范围有限，无法完全覆盖真皮支架层，表明乙酸锌在表皮支架层抗菌功效方面发挥重要作用。对比例5、实施例4～6、对比例6步骤四中戊二醛交联时间依次增加，抗感染组织工程皮肤支架的抗拉强度和伸长率呈先增大后减小的趋势，这可能是由于交联时间逐渐延长使得交联强度逐渐增强，但是交联程度过大，戊二醛与壳聚糖大分子链的交联程度过大使得上下层之间出现应力集中，降低了拉伸强度和伸长率。
细胞粘附和增殖测试
通过CCK-8法检测小鼠成纤维细胞(NIH3T3)在支架上的黏附及增殖情况。分别于4h、1d、3d、7d取实施例6制得的支架为A组、对比例1制得的材料为B组及24孔板作为对照组C组。每孔中加入400μL新鲜培养液和40μL CCK-8溶液，在孵箱中继续培养4h，每孔取100μL加入96孔板中，然后使用酶标仪测定450nm波长段的光密度值。每组支架材料3个复孔，并重复实验3次。
测试结果如图1所示。从图1可以看出，NIH3T3细胞在三组中培养4h后，各组的光密度值相当，表明NIH3T3细胞在三组材料上黏附的细胞数量没有明显差异。NIH3T3细胞在三组中培养1、3d和7d后，三组的光密度值都随着共培养时间的增加而增大，在各个检测时间点，A组光密度值均大于B组、C组，B组光密度值均大于C组，表明实施例6制得的支架相对于对比例1制得的纳米纤维膜支架和孔板更有利于细胞粘附和增殖。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种抗感染组织工程皮肤支架，其特征在于，包括聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层和纳米束编织支架两部分，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层为上层，纳米束编织支架为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层通过动态-液体静电纺丝法制备得到；所述纳米纤维束编织支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织得到，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
2.根据权利要求1所述抗感染组织工程皮肤支架，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法如下：配制生长因子水溶液，将其加入PLGA二氯甲烷溶液中，用超声细胞破碎仪超声分散10 s至液体呈乳白色；然后将乳白色溶液到PVA溶液中，继续超声分散2 min，至液体呈淡乳白色后，磁力搅拌2-4 h，使二氯甲烷挥发完全；待微球成型后，离心、弃上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心、清洗三次，-20℃冷冻，真空干燥后即得聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。
3.根据权利要求2所述抗感染组织工程皮肤支架，其特征在于，其特征在于，聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法中离心转速为4000 rpm，离心时间5 min。
4.一种根据权利要求1所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备：将聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物溶于有机溶剂中，磁力搅拌至完全溶解后，加入纳米银，超声分散，静置，装入注射器中，高压静电牵引下从针头口高速喷出，制得纳米纤维，在离针尖下方10-15 cm处放置一盛水的容器，底部有孔，纳米纤维飘落到水面后，随着涡流从孔中顺水流下，扭转成束形成纳米纱线，转轴接收形成纳米纱，冷冻干燥后，再将纳米纱浸入壳聚糖溶液中自组装，自组装完成后真空干燥即得；
步骤二、聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备：以含有乙酸锌的丝素和透明质酸混合溶液为纺丝液1，聚乳酸溶液为纺丝液2，采用双针头共轭法制备得到聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束；
步骤三、纳米纤维束编织支架的制备：将聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束编织成孔径适宜的支架，再将支架浸润在聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球溶液中，取出后真空干燥即得；
步骤四、戊二醛交联：在培养皿中加入适量戊二醛水溶液，然后将其放入干净密闭的干燥器底部，再将纳米束编织支架放在铝箔上，聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/壳聚糖纳米纱层叠放在纳米束编织支架上方，将叠加后的支架材料置于干燥器孔板中间，盖好盖子并密封后，室温下交联，取出水洗，充分干燥。
5.根据权利要求4所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，步骤一聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备中所述有机溶剂为氯仿和二甲基甲酰胺体积比3:1混合。
6.根据权利要求4所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，步骤一中所加纳米银的直径为50-100 nm。
7.根据权利要求4所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，步骤一聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯接枝共聚物/纳米银/壳聚糖纳米纱层的制备中，静电纺丝条件速度为以1 mL/h，电压为15 kV。
8.根据权利要求4所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，步骤二所述聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备方法，包括以下步骤：（1）丝素膜的制备：桑蚕丝脱胶后溶于80 ℃的氯化钙、水和乙醇体积比为1:8:2的混合溶液中，搅拌溶解，透析后得纯丝素溶液，流延成膜备用；（2）纺丝液1的制备：将丝素膜与相对分子质量为150万的透明质酸粉末共同加入甲酸溶液中，完全溶解后，再加入乙酸锌溶液，超声20 min，得到纺丝液1；（3）纺丝液2的制备：聚乳酸溶于氯仿和丙酮体积比2：1的混合溶剂中，配制成5wt%的聚乳酸溶液，室温搅拌均匀，得到纺丝液2；（4）双针头共轭制备纤维束：将纺丝液1、纺丝液2各自装于两个10 mL的注射器内，将四个注射器分别安装到四个SN-50微量注射泵上，再用聚四氟乙烯软管将两个纺丝液2注射泵连于两个纺丝液2串联针管，两个纺丝液1注射泵连于两个纺丝液1串联针管，将串联后的双喷头分别与高压发生器的正负极相连，打开高压发生器后，喷头生成的泰勒锥破裂，并进行集束，纤维收集装置开口表面形成中空的纤维网，通过绝缘棒将纤维网沿着纤维收集装置中心轴线向纤维卷绕装置方向牵伸，并在导纱辊的引导下卷绕到卷绕辊上，集聚成纳米纤维集束。
9.根据权利要求8所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维束的制备方法中步骤（2）所述乙酸锌溶液浓度为0.1 mol/L。
10.根据权利要求4所述抗感染组织工程皮肤支架的制备方法，其特征在于，步骤四中戊二醛水溶液的浓度为25wt%。
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