KR101142103B1 - 실크 피브로인 분말을 이용하여 제조된 바이오복합재료 및 이를 이용한 인공도관 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체재료로서 합성 폴리머의 단점을 극복하기 위하여 합성 폴리머와 실크 피브로인 분말을 이용하여 전기방사 방법으로 제조한 바이오복합재료에 관한 것이다. 본 발명의 바이오복합재료에서 합성 폴리머는 기질 재료로 이용되었고, 실크 피브로인 분말은 기계적 특성, 세포 부착 및 번식을 강화하는 분산 재료로서 이용되었다. 본 발명의 바이오복합재료는 전기방사를 거쳐 얻어지는데, 기계적으로 똑바로 뻗는 특성(mechanically orthotropic behavior)을 가진 복합재료 거미줄(composite webs)이 얻어진다.

Description

실크 피브로인 분말을 이용하여 제조된 바이오복합재료 및 이를 이용한 인공도관{Biocomposite produced from silk fibroin powder and artificial conduit made of the same}

본 발명은 생체재료로서 합성 폴리머의 단점을 극복하기 위하여 합성 폴리머와 실크 피브로인 분말을 이용하여 전기 방사 방법으로 제조한 바이오복합재료에 관한 것이다.

나노미터 크기의 섬유는 전도성 고분자 바이오센서(conductive polymeric biosensors), 필터 멤브레인, 생물의학적 구조체(biomedical scaffolds), 상처치료물질(wound dressing materials), 인공장기(artificial organs), 나노전자(nanoelectronics), 나노조성물(nanocomposites) 및 화학물질로부터 보호하는 의류(chemical protective clothing)와 같이 매우 유용하게 이용할 수 있다[Teo W. E, Ramakrishna S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology 2006;17:89-106]. 이들 중 생물의학 구조체(biomedical scaffold)는 전기방사 마이크로/나노섬유의 유망한 적용분야이다[Agarwal S, Wendorff J. H, Greiner A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer 2008;49:5603-5621]. 다양한 천연 및 합성 폴리머들이 생물의학 분야의 응용을 위해 마이크로/나노섬유를 제조하는데 이용되어 왔다. 예컨대, 알지네이트(alginate), 아가로즈(agarose), 히알루론산(hyaluronic acid), 피브린 글루(fibrin glue), 실크 피브로인(silk fibroin; SF), 및 콜라겐/젤라틴(collagen/gelatin)과 같은 천연 폴리머들뿐만 아니라, 폴리(글리콜산){poly(glycolic acid); PGA}, 폴리(락트산){poly(lactic acid); PLA}, 폴리(락틱-코-글리콜산){poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA} 및 폴리(ε-카프로락톤{poly(ε-caprolactone); PCL}과 같은 생분해성 합성 폴리머가 생체재료로 이용되어 왔다. 비록 전기방사 나노섬유가 생물의학적 응용 분야에서 장점이 있긴 하지만, 기계적인 면에서 단점이 있었다. 조직 재생에 있어서, 새로운 조직이 형성되는 동안 기계적인 지지는 세포로 하여금 새로운 세포외 기질의 구조적이고 기계적인 기능을 최적화하도록 신호를 제공해 준다. 또한, 이방성 기계적 특성(anisotropic mechanical properties)은 근골격 체계의 디자인에서 필요하다 [Li W, Mauck R, Cooper J, Yuan X, Tuan R. Engineering controllable anisotropy in electrospun biodegradable nanofibrous scaffolds for musculoskeletal tissue engineering. J. Biomech Eng 2006;401:686-93]. 예를 들어, 힘줄과 인대는 수직 방향에 비해서 수평 방향으로 200~500배 높은 인장 특성을 나타낸다[Lynch H. A, Johannessen W, Wu J. P, Jawa A, Elliott D. M. Effect of fiber orientation and strain rate on the nonlinear uniaxial tensile material properties of tendon. J. Biomech Eng 2003;125:726-731]. 더욱이, 관절연골 및 반월상 연골(menisci)은 그 구조적 기능과 관련하여 이방성 기계적 특성을 나타낸다[Mow V. C, Guo X. E. Mechano-electrochemcial properties of articular cartilage: their inhomogeneities and anisotropies. Annu Rev Biomed Eng 2002;4:175-209]. 몇몇 연구자들은 전기방사된 나노섬유의 기계적 이방성을 강화하기 위하여 다른 수집 시스템 디자인[Park S. A, Park K. E, Yoon H, Son J. G, Min T. J, Kim G. H. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polym Int 2007;56:1361-1366, Kim G. H. Electrospun PCL nanofibers with anisotropic mechanical properties as a biomedical scaffold. Biomed Mater 2008;3:025010] 및 제조후 처리(post-processing treatments)[Agarwal S, Wendorff J. H, Greiner A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer 2008;49:5603-5621]에 관하여 연구한 바 있다.

실크는 중심부에 피브로인이라 불리는 섬유상 단백질과 피브로인 섬유를 감싸는 세리신이라고 불리는 점성 단백질로 구성된다[Asakura T, Kaplan D. L, Arntzen C. J, Ritter E. M. Silk Production and Processing. Encylopedia Agricultural Science Eds. Academic Press New York 1994;4:1-11]. 실크 피브로인은 특이한 기계적 특성, 생체적합성 및 낮은 속도의 생분해성으로 인하여 다양한 생물의학 분야에 적용되어 왔다[Sofia S, McCarthy M. B, Gronowicz G, Kaplan D. L. J. Functionalized silk-based biomaterials for bone formation. J. Biomed Mater Res 2001;54:139-148, Perez-Rigueiro J, Viney C, Llorca J, Elices M. J. Silkworm silk as an engineering material. J. Appl Polym. Sci 1998;70:2439-2447]. 실크 피브로인의 우수한 기계적 특성은 분자구조 및 결정성(crystallinity)에 기인한다. 실크 피브로인 내의 결정성 물질은 섬유 축과 평행한 엄청난 길이의 리본 형상 필라멘트 형태 내에 존재한다[Dobb M. G, Fraser R. D. B, Macrae T. P. The fine structure of silk fibroin. The J. Cell Biology 1967; 32: 289-294]. 연구자들은 메탄올과 같은 유기용매로 화학처리하여 그 기계적 특성을 개선함으로써 실크 피브로인의 결정성을 향상시키는 것을 연구해 왔다. 실크 피브로인의 무작위적 코일 형상은 메탄올 처리로 β-시트 형상으로 변화시킬 수 있고, 메탄올 처리된 실크 피브로인은 결정성이 현저히 증가되었기 때문에 좀더 고차원적인 안정성을 나타낸다[Min B. M, Lee G, Kim S. H, Nam Y. S, Lee T. S, Park W. H. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro. Biomaterials 2004;25:1289-1297].

우수한 기계적 특성으로 인하여 실크 피브로인은 골재생뿐만 아니라 혈관내피세포와 평활근 세포가 주입되는 혈관이식편(관상 구조체)와 같이 다양한 조직공학 분야에서 널리 이용되고 있다[Sofia S, McCarthy M. B, Gronowicz G, Kaplan D. L. J. Functionalized silk-based biomaterials for bone formation. J. Biomed Mater Res 2001;54:139-148, Kim H. J, Kim U. J, Kim H. S, Li C, Wada M, Leisk G. G, Kaplan D L. Bone tissue engineering with premineralized silk scaffolds. Bone 2008;42:1226-1234]. 실크 피브로인은 좋은 생물의학 재료이긴 하지만, 기계적 특성과 가공성은 다양한 생물의학적 적용시 요구사항을 충족시키도록 용이하게 조절될 수 없다[Xia Y, Lu Y. Fabrication and properties of conductive conjugated polymers/silk fibroin composite fibers. Composites Science and Technology 2008;68:1471-1479].

폴리카프로락톤은 우수한 가공성과 생분해성으로 인하여 연질 및 경질 조직재생에 일반적으로 사용되고 있다. 구조체 재료는 표면 상에 최초의 세포부착이 잘 수행되어야 하므로 친수성을 띠어야 한다. 그러나, 생체재료로서 폴리카프로락톤은 본질적인 소수성(hydrophobicity) 및 생물활성 작용기가 없는 것 등 몇 가지 심각한 단점을 가지고 있다.

본 발명의 목적은 실크 피브로인 분말과 합성 폴리머를 이용하여 고도로 정렬된 전기방사 바이오복합재료를 제조하려는 것이다.

생물의학에 이용되는 폴리머들은 가공성과 생분해성이 우수해야 한다. 그러나, 폴리카프로락톤(PCL)은 본질적으로 소수성을 띠며 작용기도 없기 때문에 바이오재료로서는 부적합한 점이 있었다. 이 재료는 천연 바이오재료와 조합해야만 생물의학 재료로서 기계적인 면에서나 생물학적인 면에서 기능을 수행할 수 있을 것으로 판단되어 본 발명자들은 폴리카프로락톤과 생체적합성 및 기계적 특성이 매우 우수한 실크 피브로인을 이용하여 바이오복합재료를 제조하였다. 폴리카프로락톤은 기질 재료로 이용되었고, 실크 피브로인 분말은 기계적 특성, 세포 부착 및 번식을 강화하는 분산 재료로서 이용되었다. 상기 바이오복합재료는 전기방사를 거쳐 얻어지는데, 기계적으로 똑바로 뻗는 특성(mechanically orthotropic behavior)을 가진 복합재료 거미줄(composite webs)이 얻어진다. 이 바이오복합재료에서 폴리카프로락톤은 기질 재료로 이용되며 실크 피브로인은 분산 재료로 이용되어 결과적으로 기계적 특성 및 세포 작용을 증강시켰다. 순수 폴리카프로락톤과 비교할 때 폴리카프로락톤과 실크 피브로인을 이용한 바이오복합재료는 고도로 배열되는 특징이 있어 배열 방향으로 기계적 특성이 개선되었다. 또한, 본 발명자들은 상기 폴리카프로락톤과 실크 피브로인을 이용한 바이오복합재료로 고도로 정렬된 원통형 튜브를 제조하여 혈관이식편(vascular grafts) 및 말초신경도관(peripheral nerve conduits) 같은 생물의학 도관으로서 가능성을 조사하였다. 이 바이오복합재료의 생체적합성은 또한 래트 중간엽 줄기세포로부터 유도된 골수 배양을 통하여 평가하였다. 이 결과는 전기방사된 폴리카프로락톤과 실크 피브로인으로 제조된 바이오복합재료가 다양한 생물의학 도관 시스템에 이용될 수 있음을 말해준다.

본 발명은 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상과 실크 피브로인 분말을 혼합하여 전기방사법으로 제조되는 바이오복합재료를 제공한다. 본 발명에서는 실크 피브로인 분말을 혼합함으로써 전기방사시 바이오복합재료에 배향성을 부여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 실크 피브로인 분말이 0.01~30중량% 함유됨을 특징으로 하는 바이오복합재료를 제공한다. 0.01중량% 미만이면 실크 피브로인 분말 혼합에 의한 배향성 증진 효과가 거의 없고, 30중량%를 넘는 경우에는 전기방사가 불가능해진다. 상기 실크 피브로인 분말은 1~15중량% 범위로 혼합하여 바이오복합재료를 형성하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 전기방사법에서 종래 사용되던 롤링 수집기가 아닌 링 수집기(ring collector)를 이용함을 특징으로 하는 바이오복합재료를 제공한다. 링 수집기는 도 1의 (b)에 도시된 바와 같이, 모터에 연결된 축을 중심으로 하여 회전 가능한 링 모양으로 형성되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 바이오복합재료로 제조되는 인공도관을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인공도관이 신경 도관 또는 혈관 용도로 이용되는 것을 특징으로 한다. 상기 인공도관은 신경 도관, 혈관 외에도 도관 형상의 인체 기관이나 조직 대용 목적으로 다양하게 이용할 수 있다.

본 발명의 합성 폴리머와 실크 피브로인으로부터 제조된 바이오복합재료는 기계적 특성이 우수하고, 세포 부착 및 증식 효과가 우수하였다.

도 1은 (a) 보조전극이 부가된 전기방사 공정, (b) 링 수집기가 부가된 변형 전기방사 공정의 개념도이고, (c) 종래 전기방사 공정 및 (d) 변형 전기방사 공정으로 바이오의학용 도관을 제조하기 위해 전기방사된 바이오복합재료(biocomposite)의 최초 및 인장된 분출물이다.
도 2는 (a) 순수 PCL 및 (b) PCL 용액 내에 실크 피브로인 분말 2중량%가 함유된 바이오복합재료, (c) 실크피브로인 분말 5중량% 함유된 바이오복합재료, 및 (d) 실크 피브로인 분말 8중량% 함유 바이오복합재료의 개시 방사 분출물(initial spun jets)이다.
도 3은 전기방사 섬유 직경에 미치는 개시 분출 길이(initial jet length) 및 표면장력의 영향을 나타내는 그래프이다. 표는 PCL/SF 용액에서 전기전도도와 표면장력을 나타낸다.
도 4는 (a) PCL, 순수 실크 피브로인, PCL/실크 피브로인(2, 5 및 8중량%)의 FT-IR 결과 및 (b) 파수 1700 cm^-1에서 실크 피브로인 농도에 따른 피크 강도를 나타낸 것이다.
도 5는 회전 수집기 13.4 m/s의 속도로 (a) 전기방사된 PCL 섬유, (b) PCL/실크 2wt%, (c) PCL/실크 5wt%, 및 (d) PCL/실크 8wt%의 주사전자현미경 사진 및 크기분포이다. (e) 순수 PCL 및 (f)~(h) PCL/실크 피브로인 각각 2wt%, 5wt% 및 8wt% 전기방사된 섬유의 배열을 나타낸다.; (i) 바이오복합재 내의 다양한 실크 피브로인 농도 함수로서 반치폭(FWHM).
도 6은 인장 속도 0.5mm/s에서 회전 수집기 속도 (a) 3.4 및 (b) 13.4 m/s일 때 PCL 및 PCL/SF(2wt%)의 응력 변형 곡선(Stress strain curves)이다. 표는 각기 다른 회전 수집기 속도에서 PCL과 바이오복합재(PCL 내에 2wt% 실크 피브로인 함유)의 인장특성을 나타낸다.
도 7은 순수 PCL 및 PCL/SF(2wt%, 5wt% 및 8wt%)을 전기방사한 섬유의 물 접촉각도를 여러 번 측정한 결과이다.
도 8은 (a) 전기방사한 PCL 및 다양한 바이오복합재료에 시드한 골수 유래 중간엽 줄기세포의 초기 세포부착을 보여준다. (b) 세포배양 7일 후의 세포 부착 및 증식을 비교한 것이다.
도 9 위는 실크 피브로인이 2wt% 함유된 PCL 바이오복합재료로 제조된 원통형 도관의 구조적 형상을 나타내는 광학 이미지이며, 아래는 길이 방향으로 배열된 전기방사 섬유를 보여주는 바이오복합재료의 내외 표면 주사전자현미경 이미지이다.

이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

아래 실시예에서는 실크 피브로인과 혼합하여 바이오복합재료를 형성하는 폴리머로서 폴리카프로락톤을 예로 들었으나, 본 발명의 범위가 폴리카프로락톤과 실크 피브로인을 혼합한 바이오복합재료로만 한정되는 것이 아님을 분명히 한다. 또한, 이하의 실시예 및 도면에서 "실크 피브로인"은 "실크"라는 용어와 혼용하였으나, 이는 동일하게 실크로부터 추출한 실크 피브로인을 의미하는 것이다.

재료

폴리카프로락톤(Catalogue No. 440 744; Sigma-Aldrich)은 평균 분자량 Mn 60,000g/mol이고 녹는점 60℃이다. 용매인 다이메틸 포름아마이드(DMF; Junsei Chemical)와 메틸렌 클로라이드(MC; Junsei Chemical)는 방사용액 제조에 이용되었다. 전기방사 용액은 80wt%의 메틸렌클로라이드와 20wt%의 다이메틸 포름아마이드를 17wt%의 PCL과 혼합하여 제조하였고, 실크 피브로인은 봄빅스 모리(Bombyx mori) 누에고치에서 얻었다[Kim U. J, Park J, Li C, Jin H. J, Valluzzi R, Kaplan D. L. Structure and Properties of Silk Hydrogels. Biomacromol 2004;5:786]. 실크 피브로인 용액 제조는 다음과 같이 실시하였다. 고치는 0.02M Na₂CO₃ 수용액에서 20분 동안 끓였다. 그 후 세리신 단백질을 제거하기 위하여 증류수로 세척하였다. 그 후 피브로인은 60℃에서 5시간 동안 9.3M LiBr 용액에서 용해시켰다. 용액은 30℃로 3일간 투석하여 염을 제거하였고, 불순물은 원심분리로 제거하였다. 용액은 동결건조기(SFDSM06; Samwon, 한국)로 -76℃에서 3일간 동결건조하였고, 동결제분공정을 이용하여 실크 피브로인 분말을 제조하였다. 분말화된 실크 피브로인은 2㎛ 메쉬로 수 회 체쳐서 고운 분말을 얻었다. 실크 분말은 각각 2, 5 및 8wt%로 17wt% PCL 용액에 혼합한 후 24시간 동안 교반하였다.

바이오복합재료 제조

도 1(a)와 같은 부착된 보조전극으로 일반적인 전기방사공정을 수행하여 전기방사 바이오복합재료를 제조하였다. 직경 ｄ가 22㎜인 원통형 보조전극을 테일러 원뿔의 끝을 떠나는 첫번째 방사체의 불안정성을 감소시키기 위하여 보조전극으로 이용하였다[Kim G. H, Kim W. D. Formation of oriented nanofibers using electrospinning Appl. Phys. Lett 2006;88 :233101]. 시료 용액은 G-20 주사바늘로 20㎖ 유리 주사기 내에 주입하였다. 용액 주입속도(2㎖/h)는 주사기 펌핑 시스템(KDS 230; KD Scientific, Holliston, MA)으로 정확히 조절되었다. 적용된 전기장은 0.17~0.2kV/mm 범위였다. 고압 전력공급기(SHV300RD-50K; Convertech)를 이용하여 적용 전압을 조절하였다. 주사바늘과 회전 수집기 사이의 일정 간격은 120㎜였고, 수집기 회전 속도는 3.4 및 13.4m/s였다.

도 1(b)의 변형된 전기방사장치는 전기방사 침적시간 40분으로 동일한 전기장을 이용하여 전기방사된 섬유로 구성된 원통형 바이오복합재료 튜브를 제조하는데 이용되었다. 링 수집기의 회전 속도는 13.4m/s로 고정되었다(도 1(b)).

도 1(c) 및 (d)는 전기방사 섬유의 최초 분출물 및 인장 동작을 보여준다. 이 도면들은 최초의 분출물이 보조전극으로 인하여 안정적이었음을 보여주며, 인장된 섬유가 회전 수집기 상에 위치함을 보여준다. 도 1(d)는 고속 회전 수집기로 인하여 야기되는 공기저항때문에 인장된 전기방사 섬유가 수집기로부터 곡선 경로를 따라감을 보여준다.

바이오복합재료 특성 규명

상기 바이오복합재료의 기계적 특성은 마이크로텐실 시험기(Toptech 2000; Chemilab, South Korea)를 인장 모드(tensile mode)로 하여 조사하였다. 5×15mm 시료를 제조하였다. 기계적 특성 데이타는 다섯 번의 독립적인 실험을 실시하여 얻었고, 모든 데이타는 평균값과 표준편차로 나타내었다. 표본 두께는 하나의 광학 현미경 하에서 다섯 군데에서 측정하였고, 측정값을 평균내었다. 제조된 섬유 매트의 기계적 움직임을 관찰하기 위하여 시료는 단축으로 정렬된 섬유매트의 회전 운동 방향에 평행하도록 제조되었다. 시료는 실온에서 0.5mm/s의 인장 속도로 파단될 때까지 늘렸다. 전기방사된 매트의 형태는 디지탈 카메라와 연결된 광학현미경(BX FM-32; Olympus) 및 주사전자현미경(SEM; Sirion)을 이용하여 관찰하였다. 매트는 관찰 전에 금으로 스퍼터링하였다.

전기방사된 바이오복합재료 내의 실크 피브로인의 양을 관찰하기 위하여 순수 실크 및 2, 5, 8wt%의 PCL/실크의 적외선 스펙트럼을 FT-IR(Fourier transform infrared) 분광계 (Model 6700; Nicolet, West Point, PA, USA) 감쇠 전반사 모드(attenuated total reflection mode)로 측정하였다. 시료는 파우더로 분쇄되어 FT-IR을 통하여 해상도 8cm^-1, 범위 400~4000cm^-1의 조건으로 측정하였다. 적층된 전기방사 매트의 물 접촉각은 접촉각 분석기(Phoenix 300; Surface and Electro-Optics, Ansan, 한국)로 측정하였고, 다섯 군데의 접촉각을 평균내었고, 평균값±표준편차로 나타내었다. 전기방사 섬유의 직경과 배열은 주사전자현미경 이미지를 이용하여 분석하였다. 전기전도도는 다중변수분석기(multiparameter analyzer; Model C861; Montreal Biotech. Inc.)로 측정하였고, 표면장력은 모세관 상승법으로 측정하였다. 도 3 하단의 표는 다양한 용액 농도에 따른 전기전도도와 표면장력을 나타낸다.

세포 배양

시료는 세포 배양을 위하여 직경 1.6㎝의 원형으로 제조하여 70% 에탄올과 자외선으로 살균한 후 배양배지에서 오버나잇하였다. 골수 유래 래트 중간엽 줄기세포를 고영호 박사(한림대 의대, 한국)로부터 입수하였다. 분리된 중간엽 줄기세포는 10% 우태혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 부가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포는 최대 14계대까지 유지되었고, 트립신-EDTA 처리로 수집하였다. 세포는 구조체 상에 1×10⁵ 세포/시료 밀도로 시드한 후 37℃에서 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 배지는 이틀마다 갈아주었다. 세포/구조체 구조물(constructs)은 2.5% 글루타르알데하이드 내에 고정되었고, 일련의 농도 구배 에탄올에서 탈수되었다. 건조시킨 구조체는 은으로 코팅하여 주사전자현미경으로 15kV 하에서 시험하였다. 세포 성장은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시험법(Cell Proliferation Kit I; Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)으로 측정하였다. 이 측정법은 살아 있는 세포 내의 미토콘드리아 탈수소효소가 노란 테트라졸리움 염 MTT를 분해하여 보라색 포마잔 결정을 형성시킨다는 원리를 이용한 것이다. 바이오복합재료 상의 세포는 0.5㎎/㎖ MTT와 함께 4시간 동안 37℃로 배양하였고, 마이크로플레이트 판독기로 570㎚ 흡광도를 측정하였다. 모든 데이타는 평균값±표준편차로 나타내었다. 7일째의 바이오복합재료 내의 세포 분포를 관찰하기 위하여 세포 배양매트를 1:400으로 희석한 액틴-특이적 마커 팔로이딘-알렉사-568(phalloidin-Alexa-568, Invitrogen, USA)과 함께 실온에서 두 시간 동안 교반하며 배양하였다. 구조체는 0.2% Triton X-100이 함유된 0.1M 인산 완충용액으로 세척한 다음 벡타쉴드(Vectashield; Vecta Laboratory, USA)로 마운트하였다. 올림푸스 형광현미경에 부착된 디지탈 카메라로 디지탈 영상을 캡쳐하였다.

<결과>

전기방사공정을 안정화시키는데 있어 균일한 개시 방사 분출물(Constant initial spun jets)이 일반적으로 매우 중요하다. 전기방사 시스템에서, 혼합용액으로 마이크로/나노파이버를 제조하는 것은 혼합용액 구성물질의 전기전도도가 다르고 공정 동안 매트릭스 물질 내의 마이크로/나노 크기 입자의 불안정한 흐름으로 인해 용이하지 않다. 본 발명자들은 시스템을 안정화하기 위하여 방사 노즐과 연결된 원통형 보조전극을 사용하였다. 최초의 분출물 용액은 방사축에서 전기장을 집중시키는 보조 전극으로 안정화될 수 있다 [Kim G. H, Kim W. D. Formation of oriented nanofibers using electrospinning Appl. Phys. Lett 2006;88 :233101]. 도 2는 개시 방사 분출물 및 인장된 마이크로/나노파이버를 나타낸다. 본 발명자들은 원통형 보조전극을 이용하여 안정된 개시방사용액을 얻었다. 개시 방사 분출물의 길이는 도 2의 (a) 및 (b)와 같이 순수한 PCL 및 PCL/SF 용액에서 서로 달랐다. 이는 5 wt% PLC/SF (k = 1.42ｕS/cm, s = 0.17 N/m)의 전기전도도 k 및 표면장력 s가 순수 PCL (k = 0.85ｕS/cm, s = 0.29 N/m)의 그것과 현저히 다르기 때문이다. 압출된 전기방사 섬유는 양전하를 띠며, 전하를 띠는 섬유 간의 척력(repulsion forces)은 전기전도도를 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 또한, 낮은 용액 표면 장력은 섬유 간의 척력을 증가시켰고, 그리하여 전기방사 섬유는 낮은 전기전도도와 높은 표면장력을 가진 전기방사 섬유와 비교하여 잘 인장될 수 있었다. 이러한 결과는 실크 피브로인 분말 농도를 증가시킴으로써 전기방사된 PCL/SF 마이크로/나노파이버의 직경을 감소시킬 수 있음을 가리킨다.

도 3은 각기 다른 개시 분출물 길이 및 표면 장력을 가지는 전기방사 섬유의 직경을 보여준다. 도 3 하단의 표와 같이, 실크 피브로인 농도를 증가시키면 전기전도도가 증가되고 표면장력은 감소된다. Fridrikh et al.의 결과와 같이, 전기방사 분출물의 직경 d _t 는 단순화된 수식 d _t ∝(r)^1/3(1/lnk)^1/3에 의하여 정해진다. 여기에서 r은 표면장력이고, k는 노즐 직경에 대한 개시 분출물 길이 비이다[Fridrikh S. V, Yu J. H, Brenner M. P, Rutledge G. C, Controlling the Fiber Diameter during Electrospinning. Phys Rev Lett 2003;90:144502]. 이 수식에서, 전기방사 시스템 내에서 전기방사 섬유의 흐름이 유사하다면 바이오복합재료(PCL/SF)의 개시 방사 분출물 길이는 순수 PCL의 그것보다 짧고, 바이오복합재료(PCL/SF)의 표면장력이 순수 PCL보다 낮기 때문에 크기 감소는 이치에 맞는다. 도면은 상기 수식에 기초한 예측이 바이오복합재료에 대한 실험 결과와 일치함을 보여준다.

본 발명자들은 전기방사 바이오복합재료에서 실크 분말의 양을 결정하기 위하여 FT-IR 측정을 수행하였다. 도 4(a)는 전기방사된 순수 PCL 매트, 순수 분말 실크 피브로인(SF)과, 2, 5 및 8wt%의 PCL/실크 피브로인 매트의 피크를 나타낸다. 본 발명자들은 전기방사 매트 내의 실크 성분의 양을 정확히 정량하지는 못했지만, 바이오복합재료 내에 함유된 실크 성분이 직선을 형성함을 관찰하였다(도 4(b)).

도 5(a) ~ (d)는 각각 13.4 m/s의 속도로 회전수집기 상에 쌓인 전기방사된 PCL 섬유와 2, 5 및 8wt%의 PCL/SF 섬유의 SEM 현미경 사진이다. 내부의 그래프는 실크 피브로인 분말 농도가 증가하면 순수 PCL 웹과 비교하여 바이오복합재료의 크기가 감소하고 섬유 직경의 균일성이 증가함을 관찰할 수 있다.

조직공학에서 폴리머 나노섬유의 배열은 세포 방향성을 조절하는 매우 중요한 특성이다. 왜냐하면, 생체 조직 내의 세포는 종종 규칙적으로 배열되어 있고, 이러한 방향성은 조직의 기능에 매우 중요하기 때문이다[Teo W. E, Ramakrishna S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology 2006;17:89-106, Agarwal S, Wendorff J. H, Greiner A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer 2008;49:5603-5621]. 예를 들어, 인대를 따라 존재하는 섬유아세포의 방향성은 그 조직의 인장강도를 향상시킬 수 있고, 상피세포는 혈관 내의 혈액 흐름 방향으로 배열된다. 반면, 평활근 세포(smooth muscle cells)는 높은 혈압을 견디기 위해 각 혈관 주위에 집중적으로 위치한다[Agarwal S, Wendorff J. H, Greiner A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer 2008;49:5603-5621].

본 발명자들은 도 5에서 전기방사 바이오복합재료의 배열을 측정하기 위하여 SEM 이미지를 분석하였다. 도 5(e) ~ (h)는 전기방사 바이오복합재료에서 섬유 배열을 보여준다. 이 그림들은 임의의 섬유 배열이 전기방사 섬유 표면에서 표면 전하 밀도를 감소시키며, 실크 피브로인 농도가 증가할수록 배열이 증가함을 보여준다. 양전하로 충전된 전기방사 섬유가 수집기 접지에 쌓이면 회전수집기에 의해 배열된 섬유는 전하의 강도 및 축적된 섬유에 이미 미치는 척력에 의하여 방향이 정해진다. 이 수집된 하전된 섬유는 다가오는 유사 전하 섬유를 밀치고 전하 소산(消散)이 용이하도록 회전체 상의 전도점(conducting points) 가까이로 이동시킬 수 있다. 놓인 섬유와 다가오는 섬유 사이의 정전기적 척력은 평행한 배열을 좀더 강화시킨다. 왜냐하면 이 형태가 하전된 섬유 배열 시스템에서 가장 낮은 에너지 배치를 나타내기 때문이다 [Li D, Wang Y. L, Xia Y. N. Electrospinning of Polymeric and Ceramic Nanofibers as Uniaxially Aligned Arrays. Nano Lett 2003;3:1167-1171]. 이러한 전기방사 섬유의 자기 배열은 높은 전기전도도를 갖는 시료 용액에서 강화된다. Uyar 등은 이와 유사한 현상을 관찰하였다[D. Li, Y. L. Wang and Y. N. Xia, Nano Lett 3, 1167 (2003)]. 도 5(i)는 다양한 농도의 실크 피브로인에 따른 반치폭(full width at half maximum; FWHM) 값을 나타내는데, 실크 피브로인 농도가 증가할수록 전기방사 바이오복합재료의 정렬 정도가 높아짐을 알 수 있다.

전기방사 섬유를 직사각형 표본으로 잘라서 30℃ 온도에서 인장 모드로 0.5 mm/s 속도로 인장장치를 이용하여 인장시켰다. 도 6은 순수 PCL과 각기 다른 회전 수집기 속도(3.4 및 13.4 m/s)로 제조된 2% 실크 피브로인 함유 바이오복합재료의 인장 스트레스 및 장력탄성률(tensile modulus)을 나타낸다. 일반적으로 전기방사 매트가 끊어질 때 탄성계수(elastic modulus), 최대 응력(maximum stress) 및 변형률(strain)은 매트의 섬유 배열과 밀접한 관련이 있다. 시료의 응력-변형률 곡선은 회전 수집기와 유사하다. 수집기의 회전속도가 증가하면 순수 PCL 및 2% 실크 피브로인 함유 바이오복합재료 모두 기계적 성질이 향상된다. 바이오복합재료가 순수 PCL보다 영률(Young’s modulus)이 높다. 반면 파단시 응력은 순수 PCL이 더 높다. 도 6의 표에는 회전 방향으로 평행한 시료의 자세한 인장특성이 기재되어 있다.

비록 구조체의 친수성이 세포 행동에 미치는 영향이 분명히 정의되지는 않았지만, 구조체의 친수성은 일반적으로 세포 부착 및 증식과 같은 생물학적 반응에 영향을 미치는 것으로 보인다 [T. Uyar, I. Cianga, L. Cianga, F. Besenbacher and Y. Yagci, Mater. Lett. 63, 1638 (2009)]. 본 발명자들은 PCL/실크 피브로인 바이오복합재료의 물 접촉각(water contact angle, WCA)을 측정하고 순수 PCL로 짜인 웹과 비교하여 실크 피브로인이 바이오복합재료의 친수성에 미치는 영향을 확인하였다. 도 7은 8wt% PCL/실크 피브로인 바이오복합재료의 물 접촉각(WCA)이 4분 후 121±2.6°이고, 반면 순수 PCL의 물 접촉각이 4분 후 126±1.4°임을 보여준다. 순수 PCL과 바이오복합재료 간의 물 접촉각 차이가 작기 때문에 바이오복합재료의 친수성이 증가되었다고 정확히 단언할 수는 없지만, PCL/SF 바이오복합재료가 순수 PCL과 비교하여 친수성이 증가되었기 때문에 세포와 좀더 잘 부착되고 세포가 더 잘 증식할 수 있을 것임을 알 수 있다.

최초의 세포 부착 및 세포 증식에 관한 바이오복합재료의 효과를 평가하기 위하여 골수 유래 중간엽 줄기세포를 순수 PCL 전기방사 매트 및 실크 피브로인 2 및 5wt% 함유 PCL/SF 바이오복합재료 상에 깊숙이 끼워넣었다. 섬유상 구조의 마이크로/나노 스케일은 부피에 대하여 높은 표면적을 나타내므로 일반적으로 세포 성장을 촉진시킨다. 전기방사 매트 상에 골수 유래 중간엽 줄기세포의 최초 세포 부착은 MTT 어세이를 이용하여 측정하였다 (도 8(a)). 순수 PCL 매트는 가장 낮은 최초 세포부착을 나타내었다. 순수 PCL 및 바이오복합재료 표면 상에 중간엽 줄기세포 부착은 예컨대 액틴 세포골격 구조에 대하여 팔로이딘(phalloidin)과 같은 세포-특이적 마커를 이용하여 시험하였다. 도 8(b)는 전기방사 매트 표면 상에 세포 부착을 보여준다. 세포 부착은 세포 배양 7일 후에 관찰되었다. 도면은 바이오복합재료 표면 상에 세포들이 실크 피브로인 농도가 증가할수록 더 잘 증식함을 보여준다.

직접 종단 신경 접합(Direct end-to-end nerve sutures)은 신경 손상 환자의 신경을 재생하는데 필요하다. 손상 부위를 치료하는 일반적인 방법은 손상된 신경 토막 사이에 자기이식편을 이식하여 브리지를 만드는 것이다. 다양한 방향성을 가진 말초신경들이 액손 재생을 안내하고 신경 토막 재생을 촉진하기 위하여 적용되었다 [K. Rezwan, Q. Z. Chen, J. J. Blaker and A. R. Boccaccini, Biomaterials 26, 3413 (2006), R. V. Bellamkonda, Biomaterials 27, 3515 (2006), J. Cai, X. Peng, K. D. Nelson, R. Eberhart and G. M. Smith, J. Biomed. Mater. Res. A 75, 374(2005)]. 그러나, 그와 같은 세포증식방향으로 정렬된 마이크로/나노섬유 도관은 전기방사법을 이용하여 제조되지 않는다. 본 발명자들은 변형된 전기방사법을 이용하여 세포 증식 방향으로 배열된 도관을 제조하였다. 도 9는 이 바이오복합재료 도관(2 wt%의 실크 피브로인 함유 PCL/SF 바이오복합재료)의 광학 이미지와 주사전자현미경 이미지이고, 섬유들은 도관의 길이 방향으로 고도로 정렬되어 있다.

결론

본 발명자들은 전기방사로 PCL/SF 바이오복합재료를 제조하였다. PCL/SF 바이오복합재료에서 실크 피브로인 농도를 다양하게 하여 직경이 더 작고 고도로 정렬된 섬유를 얻었으며, 상기 바이오복합재료에서 중간엽 줄기세포의 최초 세포 부착 및 증식은 종래와 비교하여 개선되었다. 또한, 본 발명자들은 전기방사 시스템의 롤링 수집기(rolling collector)를 변형하여 전기방사 바이오복합재료 섬유로 된 고도로 정렬된 도관을 획득하였다. 제조된 바이오복합재료 도관은 말초 신경 도관 또는 혈관 등에 응용할 수 있다.

Claims (5)

1. 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상과 실크 피브로인 분말을 혼합하여 전기방사법으로 제조되되,
   모터에 연결된 축을 중심으로 회전 가능한 링 모양으로 형성된 링 수집기를 이용하여 전기방사되는 섬유를 권취하되, 링의 외주면에 섬유가 권취되어 섬유의 정렬성이 개선된 것을 특징으로 하는 바이오복합재료.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   실크 피브로인은 0.01~30중량% 함유됨을 특징으로 하는 바이오복합재료
   
3. 삭제
4. 청구항 1 또는 청구항 2의 바이오복합재료로 제조되는 인공도관
   
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 인공도관은 신경 도관 또는 혈관 용도로 이용되는 것을 특징으로 하는 인공도관
   

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