CN111793900A - 一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，由如下步骤制备：配制6～15wt％聚己内酯溶液，加入1～4wt％莫匹罗星；配制5～12wt％壳聚糖溶液，加入0.5～8wt％的盐酸利多卡因；将上述溶液分别装入静电纺丝设备的给料装置，给料速率为8～50μL/min，接受距离为10～20cm，接受器转速为100～250rpm/min；开启高压电源，施加15～25kV电压，溶液喷射至纤维接受器上成型；干燥脱去溶剂，得到该复合纳米纤维膜。该复合纳米纤维膜表现出优异的亲水性、溶胀率、吸收能力、热稳定性、机械性能和有效的血液凝结能力，还表出现优异的细胞相容性和抗菌活性；能够实现不同功能药物不同的释放曲线；且能够显著增强伤口愈合过程，达到伤口愈合的协同效应。

Description

一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料及其应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种壳聚糖/聚己内酯复合纳 米纤维膜材料及其应用。
背景技术
皮肤是人体最大的重要器官，在感觉功能、体温调节和保护人体免受外部 环境影响方面发挥着关键作用。尽管皮肤具有自我再生能力，但是当皮肤遭遇 急性伤口、大面积病变和慢性伤口时，会存在感染、延迟伤口愈合过程等问题， 因此需要对伤口进行包扎等处理。如今，用于包扎伤口的理想伤口敷料纤维膜 材料期望具有多种特性，例如具有生物相容性、最大限度地减少疼痛、抗菌、 凝血和止血等特性。为了达到期望的伤口敷料，目前已经使用冷冻干燥、自组 装、相-分离以及静电纺丝等技术来生产用作伤口敷料的微米至纳米级的纤维网 片。其中，由于静电纺丝制备的纤维具有高比表面积、高孔隙率、微小孔径等 特性，静电纺丝作为制造超细纤维的一种较为理想的技术，已经被广泛地和深 入地研究用于组织再生；采用静电纺丝技术制得的纤维是各种潜在伤口敷料等 应用的极佳候选材料。
然而，静电纺丝过程中涉及的变量包括溶液性质(聚合物种类、分子量、 浓度，溶剂的选择)、静电纺丝的系统设置(施加电压、进料量和接收距离) 和环境因素(温度和湿度)等均影响最终制备的纤维的属性。进一步，目前通 过静电纺丝技术制备的复合型纳米纤维伤口敷料研究较少。期望通过静电纺丝 技术制备的复合型的纳米纤维伤口敷料，存在因为多种高分子聚合物之间相互 作用、杂质问题、多物质可能诱导免疫反应，以及众多参数使得过程复杂化而 难以预测结果等技术问题，为复合型伤口敷料的创新研究带来了障碍，限制了 这类伤口敷料的应用。因此，到目前为止，临床上几乎没有能够满足皮肤伤口敷料所要求的理想的复合型伤口敷料。
此外，伤口敷料的药物释放的控制也是复合型伤口敷料的难题之一。例如， 期望敷料中抗菌药物能够持续缓慢释放，而对于止血止痛的药物(尤其对于急 性伤口)期望能够快速释放。
发明内容
本发明期望提供一种复合型具有静电止血、抗菌、药物释放和治疗作用等 多功能特性的基于静电纺丝技术的纳米纤维膜材料，以解决或至少部分解决上 述存在的技术问题。
具体地，为了实现上述技术目的，本发明提供一种壳聚糖/聚己内酯复合纳 米纤维膜材料，通过如下步骤制备：(1)配制聚己内酯(PCL)混合溶液：将 一定量聚己内酯溶解于第一有机溶剂中，得到6～15wt％的聚己内酯溶液，搅拌 获得均匀溶液，向溶液中加入1～4wt％的莫匹罗星，并继续搅拌一段时间，得 到混合溶液A；(2)配制壳聚糖(CS)混合溶液：将一定量壳聚糖溶解于第二 有机溶剂中，得到5～12wt％的壳聚糖溶液，然后向溶液中加入0.5～8wt％的盐 酸利多卡因，并搅拌一段时间，得到混合溶液B；(3)采用双重喷丝头静电纺 丝技术，制备壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜：将上述配制的两种混合溶液A 和B分别装入静电纺丝设备的两个给料装置中，两种混合溶液的给料速率各自 设置为8～50μL/min，给料装置的双重喷丝头与纤维接收器的距离设置为10～20 cm，纤维接收器的转速设置为100～250rpm/min；开启高压电源，向两个喷丝头 施加15～25kV电压，开启给料装置，两种混合溶液通过给料装置的喷丝头喷射 至纤维接收器上，得到壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜；(4)将步骤(3)制 得壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜干燥，去除残留的溶剂，得到壳聚糖/聚己内 酯复合纳米纤维膜材料。
进一步，所述步骤(3)静电纺丝在温度25～40℃，相对湿度30％～40％下 进行。
进一步，所述步骤(1)配制的混合溶液A中的聚己内酯浓度为10wt％， 莫匹罗星浓度为2wt％；所述步骤(2)配制的混合溶液B中的壳聚糖浓度为8 wt％，盐酸利多卡因浓度为1wt％。
进一步，所述混合溶液A和所述混合溶液B的给料速率设置为相同，均为 16.7μL/min；给料装置的双重喷丝头与纤维接收器的距离均设置为15cm，纤维 接收器的转速设置为200rpm/min，喷丝头施加的电压为19kV。
进一步，所述步骤(1)的第一有机溶剂为六氟异丙醇和二氯甲烷的混合溶 液，两者体积比为1:4～3:1；所述步骤(2)的第二有机溶剂为二氯甲烷和三氟乙 酸的混合溶液，两者体积比为1:7～1:1。
进一步，所述步骤(4)的干燥步骤为：采用真空烘箱干燥，干燥时间为72～200 h；或所述步骤(4)的干燥步骤为：先采用无水乙醇洗涤步骤(3)制得壳聚糖 /聚己内酯复合纳米纤维膜，然后采用真空烘箱干燥，干燥时间为72～200h。
进一步，所述聚己内酯的分子量为40000～200000；所述壳聚糖的分子量为 50000～1000000。
进一步，所述喷丝头为25G金属针头。
进一步，负载莫匹罗星的聚己内酯纳米纤维的直径为400～900nm，孔径为 4.2～12.1μm；负载盐酸利多卡因的壳聚糖纳米纤维的直径为100～500nm，孔径 为2.0～8.0μm。
本发明还提供上述壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料的应用，该复合纳 米纤维膜材料用作伤口敷料、止血材料、创伤面包覆材料、美容材料、药物释 放膜、药物输送膜或生物膜等方面。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明成功设计了一种负载有利多卡因盐酸盐(LID)和莫匹罗星的壳聚糖 /聚己内酯复合纳米纤维膜材料(标记为CSLD-PCLM)，是一种具有静电止血、 抗菌、不同药物释放控制和治疗作用等多功能特性的基于静电纺丝的复合纳米 纤维膜材料，可用作伤口敷料、止血材料、创伤面包覆材料等。
本发明选择壳聚糖(CS)聚合物，并在CS内负载LID，实现LID的爆发 释放。带有正电荷的CS可被用作止血剂，它可以促进红细胞聚集，增加血小板 粘附，完全凝血和止血。CS携带的正电荷还可以吸附在细菌或真菌带负电的细 胞壁上，在表面形成一层分子膜，从而改变细胞的通透性，干扰细菌或真菌的 正常代谢，并发挥抑菌作用。CS还被用作药物敷料的载体，以实现抗菌活性。 据报道，载有四环素的功能化CS纳米纤维膜对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳 性金黄色葡萄球菌显示出有效的抗菌活性，并具有促进愈合的抗菌敷料。然而， 随着多重耐药菌株的出现，细菌的耐药性问题变得更加严重，并且在释放抗菌 物质后，伤口敷料可能失去其抗菌活性。因此，单独使用CS作为伤口敷料等材 料时，存在抗菌药物释放过快，无法达到长期抗菌的效果。
本发明还同时选择聚己内酯(PCL)聚合物，并在PCL中负载莫匹罗星， 实现抗菌药物长期持续释放，以解决CS纳米纤维材料存在的无法长期抗菌的问 题。PCL为疏水性材料，影响吸附蛋白的构象，导致缺乏细胞识别位点，进而 导致细胞在膜上的附着力较弱。因此，本发明将PCL与CS聚合物结合使用， 还可以使得复合纳米纤维膜材料获得更高的生物相容性。
此外，本发明通过双喷丝头静电纺丝技术，制备的CSLD-PCLM复合纳米 纤维膜，获得了有益于伤口愈合的特性，例如优异的亲水性，溶胀率，吸收能 力，热稳定性和机械性能，促进伤口愈合的协同效应。本发明还评估了人类皮 肤成纤维细胞(HDFs)的CSLD-PCLM膜的细胞毒性，并且显示出比PCLM纳 米纤维膜更好的细胞相容性。该复合纳米纤维膜具有纳米纤维结构，其增强了 膜与血细胞之间的界面相互作用，并显示出优异的体外凝血能力。CSLD-PCLM 纳米纤维膜上负载有LID和莫匹罗星，并且负载在不同的纳米纤维中，分别实 现了LID的爆发释放和莫匹罗星的持续释放。此外，本发明进一步的研究表明， 与CSLD膜相比，含有莫匹罗星的膜可增强对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)， 大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗菌活性。在全厚度皮肤 缺损模型中，CSLD-PCLM膜显著增强了伤口愈合过程，具有完全的上皮再生和 增强的胶原蛋白沉积。综合本发明的研究结果可知，本发明提供的CSLD-PCLM 复合纳米纤维膜可以理想地满足伤口愈合过程中的各种要求，并有望作为伤口 敷料在未来的临床应用中获得广泛应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描 述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明CSLD-PCLM纳米纤维膜的制备过程示意图。
图2为本发明制备的纳米纤维膜(CSLD，PCLM和CSLD-PCLM)的形态 表征、亲水性和溶胀度分析结果。
图3为纳米纤维膜的理化特性分析结果。
图4为纳米纤维膜体外凝血试验结果。
图5为纳米纤维膜的体外细胞相容性和增殖结果。
图6为纳米纤维膜的药物释放特性与抗菌性分析结果。
图7为通过全层皮肤缺损模型分析纤维膜的伤口愈合性能的结果。
图8为伤口愈合各个阶段的组织形态学分析结果。
图9为MT染色下不同阶段的伤口愈合过程结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。下述 实施例中涉及的操作方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明通过静电纺丝技术，探索出一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材 料，最终制备的复合纳米纤维材料包括负载莫匹罗星的聚己内酯纳米纤维和负 载盐酸利多卡因的壳聚糖纳米纤维，两种纤维呈交织无序排列结构，该复合纳 米纤维标记为CSLD-PCLM。
本发明使用的部分原料如下：
壳聚糖(CS，中等分子量)、聚己内酯(PCL，分子量＝80000)、3-(4,5- 二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)购自Sigma-Aldrich(美国密 苏里州圣路易斯)。三氟乙酸(TFA)、盐酸利多卡因(LID)、莫匹罗星(Mupirocin) 和EdU细胞增殖试剂盒购自SangonBiotech(中国上海)。二氯甲烷(DCM) 和六氟异丙醇(HFIP)购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)。Dojindo(Japan) 提供了Calcein-AM/PI双重染色试剂盒。除非另有说明，否则其他化学品和材 料购自Beyotime(中国上海)。人皮肤成纤维细胞(HDFs)来自中国重庆市陆 军医科大学附属大坪医院皮肤科。陆军医科大学伦理委员会批准了本研究，所 有实验均按照相关的准则和法规进行(2017-28)。组织样本来自提供书面知情 同意书的患者。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，ATCC 27853)，大肠杆菌(E.coli， ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 29213)的细菌菌株购自陆 军医科大学大坪医院检验科，中国重庆。
图1示出了CSLD-PCLM纳米纤维膜的制备过程。如图1所示，该复合纳 米纤维通过如下步骤制备：首先，配制合适浓度的两种聚合物溶液作为静电纺 丝的母液，然后采用双重喷丝头静电纺丝技术，制备壳聚糖/聚己内酯复合纳米 纤维膜材料。具体地，该制备方法包括(1)配制聚己内酯(PCL)混合溶液： 将一定量聚己内酯溶解于第一有机溶剂中，得到6～15wt％的聚己内酯溶液，搅 拌获得均匀溶液，向溶液中加入1.0～4.0wt％的莫匹罗星，并继续搅拌一段时间， 得到混合溶液A；(2)配制壳聚糖(CS)混合溶液：将一定量壳聚糖溶解于第 二有机溶剂中，得到5～12wt％的壳聚糖溶液，然后向溶液中加入0.5～8.0wt％ 的盐酸利多卡因，并搅拌一段时间，得到混合溶液B；(3)采用双重喷丝头静 电纺丝技术，制备壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜：将上述配制的两种混合溶 液A和B分别装入静电纺丝设备的两个给料装置中，两种混合溶液的给料速率 各自设置为8～50μL/min，给料装置的双重喷丝头与纤维接收器的距离设置为 10～20cm，纤维接收器的转速设置为100～250rpm/min；开启高压电源，向两个 喷丝头施加15～25kV电压，开启给料装置，两种混合溶液通过给料装置的喷丝 头喷射至纤维接收器上，得到壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜；(4)将步骤(3) 制得壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜干燥，去除残留的溶剂，得到壳聚糖/聚己 内酯复合纳米纤维膜材料。
本发明成功设计由PCL和CS组成的载有药物的杂化纤维，这种多功能纤 维可同时提供活性成分并长时间防止细菌生长，因此在未来的伤口治疗中显示 出很高的潜力。
进一步，配制的混合溶液A中的聚己内酯浓度为9-12wt％，更优选为10 wt％，莫匹罗星浓度为1.0-2.5wt％，更优选为2.0wt％；所述步骤(2)配制的 混合溶液B中的壳聚糖浓度为5-10wt％，更优选为8wt％，盐酸利多卡因浓度 为0.5-3.0wt％，更优选为1wt％；所述混合溶液A和所述混合溶液B的给料速 率为15～25μL/min，更优选为16.7μL/min；给料装置的双重喷丝头与纤维接收 器的距离均设置为12-15cm，更优选为15cm，纤维接收器的转速设置为120-200 rpm/min，更优选为180rpm/min，喷丝头施加的电压为15-20kV，更优选为19kV。 本发明探索了静电纺丝过程中的涉及的变量(聚合物种类、溶液浓度、静电纺 丝的施加电压、进料量和接收距离)对最终制备的复合纳米纤维属性的影响。 经发明人研究发现：配制的静电纺丝用的混合溶液A和B的浓度影响复合纳米 纤维材料的成型，混合溶液中聚合物浓度过大，会导致喷射混合溶液无法成丝； 混合溶液中聚合物浓度过小，喷射的溶液到达纤维接收器时，溶剂无法挥发至 限定量，到达接收器的溶液依然呈液滴状，导致无法成丝。静电纺丝的施加电 压过大，会导致纤维成丝不均一，影响纤维最终的形态；施加电压过小，将导 致喷射的混合溶液无法达到纤维接收器。接收距离设置太远，喷射的溶液无法 到达接收器；设置太近，则到达接收器的溶液溶剂无法挥发，无法成丝。
实施例1 CSLD-PCLM纳米纤维膜的制备
一种CSLD-PCLM纳米纤维膜的制备过程，包括以下步骤：
1.制备PCL聚合物溶液：以体积比1：3的添加适量的HFIP/DCM有机溶 剂来制备10wt％(即，100ml溶液中包括10g PCL聚合物)的PCL溶液，并 在室温下磁力搅拌过夜，以获得均匀溶液。随后，向PCL溶液内加入2wt％的 莫匹罗星并搅拌24小时。
2.制备CS聚合物溶液：将8wt％的CS溶解在30％DCM和70％TFA中 48小时，然后将1wt％的LID溶解在CS溶液中并搅拌12小时。
3.制备CSLD-PCLM纳米纤维膜：采用双重喷丝头静电纺丝技术，具体地， 将上述制备的添加了药物的两种聚合物溶液分别装入两个注射泵(Longer Precision Pump，中国保定)，该注射泵控制PCL-莫匹罗星(PCLM)和CS-LID (CSLD)的流速，注射泵的前端采用25号金属针头。使用高压电源(中国天 津东文高压电源厂)对金属针进行充电，并将纤维收集在电接地的铝箔片上。 施加的电压为19kV，两个针到箔的距离设置为15cm，两种溶液的注射流速保 持在1mL/h，铝箔片的转速为180rpm/min。电纺丝实验在室温(25℃)、相 对湿度30％-40％的环境下进行。
4.将制备的纳米纤维膜在真空烘箱中于室温下干燥1周，以除去残留的溶 剂，然后再使用。
上述两种聚合物混合溶液的制备顺序没有限制。
本发明还采用上述方法，在其他变量相同的情况下，利用单喷丝头静电纺 丝技术，分别制备负载盐酸利多卡因的壳聚糖(CSLD)纳米纤维膜和负载莫匹 罗星的聚己内酯(PCLM)纳米纤维膜。
实施例2
设置静电纺丝的变量，制备不同变量下的CSLD-PCLM纳米纤维膜，具体 制备方法与实施例1的方法相同。表1示出不同的静电纺丝变量情况下，制备 的CSLD-PCLM复合纳米纤维。
Figure BDA0002538919880000101
采用SEM对实施例1和实施例2a-2f制备的复合纳米纤维材料进行表面形 态观察，得出实施例1制备的复合纳米纤维中PCL-M纤维和CS-LID纤维形态 最佳，其次为实施例2a和2b以及实施例2d的复合纳米纤维。当本发明将上述 静电纺丝变量调整超出本发明探究的变量范围时，复合纳米纤维成丝失败，成 丝率较低，或成丝之后纤维形态不一。
实施例3实施例1制备的CSLD-PCLM纳米纤维膜的性能测试
对实施例1制备的CSLD-PCLM复合纳米纤维膜以及CSLD纳米纤维膜和PCLM纳米纤维的亲水性、溶胀率、微观结构、热重、机械拉伸性能、体外凝 血性能、体外生物相容性、药物释放、抗菌活性、组织学等性能进行了测试， 并且构建了施用CSLD-PCLM复合纳米纤维膜的全层皮肤缺陷模型以模拟体内 伤口愈合。
图2示出了三种纳米纤维膜(CSLD，PCLM和CSLD-PCLM)的形态表征、 亲水性和溶胀度分析结果。其中，图2a示出了采用SEM观察的CSLD，PCLM 和CSLD-PCLM纳米纤维膜的表面形态，由图2a可知，PCLM混纺纤维粗糙， 均匀且无珠，而CSLD纤维则显示出光滑的表面并带有小珠。而这些表面形态 特征在负载有LID和莫匹罗星的CSLD-PCLM纳米纤维膜的SEM图像中也能够 观察到，表明CSLD-PCLM膜成功通过双重喷丝头静电纺丝方法制造出来，且 两种纤维之间在成型过程中表面形态没有相互干扰，成型的纤维形态均一。图 2b示出三种纤维膜的纤维直径统计结果，图2c示出三种纤维膜的纤维孔径统计 结果。如图2b所示，CSLD纤维的平均纤维直径(211.18nm)显着低于PCLM 纤维的平均纤维直径(623.35nm)；而CSLD-PCLM纤维的平均直径为439.46 nm，处于纳米纤维膜纤维直径以及离散纤维直径分布的中间。此外，CSLD， PCLM和CSLD-PCLM的平均孔径分别为4.19μm，7.05μm和5.02μm(见图2c)，该孔径大小有利于需要物质交换和细胞浸润的伤口敷料。图2d示出了用以表征 膜的润湿性的水接触角(WCA)值的动态变化，如图2d所示，CSLD膜的WCA (27.08°)极低，表明该材料是亲水性的，10s后CSLD膜的WCA趋近于0； PCLM膜的WCA为60.13°，在10s的测试中略有变化；而CSLD-PCLM膜的 WCA仅为35.88°，在10s内达到11.24°。WCA的降低可能是由于CSLD-PCLM 膜的孔径大于亲水性CSLD膜的孔径，有助于水分子的接触。图2e示出CSLD、PCLM和CSLD-PCLM膜在37℃温度下，浸泡在PBS中24小时后的溶胀程 度。由图2e可知，CSLD和CSLD-PCLM纳米纤维膜比PCLM膜表现出更高的 溶胀度。高的溶胀度在吸收伤口积液(例如血液，坏死组织和渗出液)，保持 伤口清洁方面具有明显优势。
图3示出了负载有LID和莫匹罗星的CSLD-PCLM纳米纤维膜的理化特性。 其中，图3a示出CSLD-PCLM纳米纤维膜的傅里叶变换红外光谱(FTIR)图， 结果显示，在CSLD-PCLM纳米纤维膜的FTIR光谱结果中显示了莫匹罗星、 LID、PCL和CS的特征谱带，表明本发明在制备复合纳米纤维膜的过程中，莫 匹罗星、PCL、LID和CS之间不存在化学相互作用。图3b示出了CSLD-PCLM 纳米纤维膜的XRD图谱，结果显示，CSLD-PCLM纳米纤维膜的XRD图谱中 同样显示莫匹罗星、LID以及PCL和CS所有特征性的结晶峰，表明本发明采 用的制备方法不会影响药物衍射。XRD数据结果同时验证了FTIR光谱分析获 得的结果。
为了进一步研究纳米纤维膜的理化特性，将CSLD-PCLM纳米纤维膜的热 重分析(TGA)和微分热重分析(DTG)曲线与原始LID、莫匹罗星、CS和PCL 的TGA和DTG曲线进行了比较，结果分别如图3c和3d所示，由结果可以推 断出聚合物在不同温度下的分解情况。对于CSLD-PCLM纳米纤维膜，观察到 四个明显的失重步骤：第一个分解温度为42℃是由于结合水的汽化，而第二 个和第三个步骤是从130℃至355℃，由于LID和CS的分解。最后的质量损失发生在355℃-480℃范围内，并对应于398℃下DTG曲线中的一个峰 值，这是由于莫匹罗星和PCL的损失。结果表明，CSLD-PCLM纳米纤维膜具 有良好的热稳定性。
此外，本发明还对CSLD-PCLM纳米纤维膜的拉伸强度和断裂伸长率做了 测试，结果分别如图3e和图3f所示。如图3e所示，CSLD膜的拉伸强度为1.77 ±0.37MPa(图3e)，高于已有报道的CS海绵敷料(0.48MPa)；而CSLD-PCLM 膜的拉伸强度(3.55±0.34MPa)又明显高于CSLD膜；良好的拉伸性能能够为 组织再生期间的细胞生长和增殖提供足够的机械支持。如图3f所示，PCLM膜 的断裂伸长率值(67.3±13.5％)显着大于其他膜。此外，PCLM的加入对CSLD 膜的断裂伸长率值影响很小。与CSLD膜(7.4±1.1％)相比，将PCLM掺入 CSLD膜(10.8±0.9％)导致断裂伸长率增加，这表明CSLD-PCLM膜的柔韧 性增强。伸长率是软组织工程应用中的关键功能特性，它使材料适合组织再生 过程。
图4示出了体外凝血试验结果。通过血液凝固试验评价纤维膜的止血能力。 如图4a所示，在医用纱布和PCLM膜中，用于冲洗样品的水由于存在未凝结的 血液而变成红色，表明血液未充分凝结。相反，血液在CSLD和CSLD-PCLM 膜上完全凝结，漂洗水的颜色几乎是透明的，这表明CSLD的加入对PCLM膜 的凝血能力具有至关重要的影响。对医用纱布(空白对照，Ctrl)和PCLM，CSLD 和CSLD-PCLM膜上的血红蛋白浓度进行定量，并以100μL的血液为参考。血 液凝结程度与血红蛋白浓度呈正相关。医用纱布和PCLM膜上的血红蛋白浓度 分别达到34.47g/L和36.77g/L(图4b)，表明它们在5分钟后几乎没有凝结作 用。与医用纱布相比，CSLD和CSLD-PCLM膜具有良好的凝血能力。医用纱 布(对照)以及PCLM，CSLD和CSLD-PCLM纳米纤维膜的凝结时间如图4c 所示，对于CSLD和CSLD-PCLM膜，观察到的凝结时间分别约为89.5±10.5s 和79.5±9.3s，分别比医用纱布(294±14.8s)和PCLM膜(178±10.6s)短。CSLD膜促进血液凝固，CSLD-PCLM膜进一步缩短了凝血时间，表现出复合纤 维膜的协同效应。此外，CSLD和CSLD-PCLM膜的血液吸收能力高于PCLM 膜(图4d)，这与纤维膜溶胀率分析结果一致(图2e)。这些结果表明CSLD-PCLM 膜缩短了血液凝固时间并迅速增强了凝血。
图5示出了纳米纤维膜的体外细胞相容性和增殖结果。通过活细胞/死细胞 染色，研究了人真皮纤维细胞(HDF)与纤维膜之间的细胞相容性，其中活细 胞呈亮绿色荧光，而死细胞呈红色荧光。图5a显示了HDF与PCLM，CSLD和 CSLD-PCLM纳米纤维膜培养24小时后的荧光显微镜图像，其中图中Ctrl代表 空白对照组。如图5a所示，除PCLM组外，所有图像均呈现非红色荧光染色。 图5b显示在CSLD或CSLD-PCLM膜上几乎没有发现死细胞，与对照组无显著 差异。为了进一步定量分析膜上的细胞增殖情况，通过EdU染色评估了HDF 细胞，其中核DNA通过Hoechst染色。如图5c和5d所示，EdU染色图像显示， 除对照组(Ctrl)外，在CSLD和CSLD-PCLM膜上还发现了许多红色荧光细胞， 而在PCLM膜上却观察到了很少的EdU细胞。这表明CSLD-PCLM膜在数小时 内对细胞增殖没有不利影响。还通过MTT测定法分析了在PCLM，CSLD和 CSLD-PCLM纳米纤维膜存在下HDF的存活率(如图5e所示)。在培养过程中， 用PCLM膜培养的HDF的存活率低于对照组以及CSLD和CSLD-PCLM膜。在 第一天，用CSLD膜培养的细胞数量略低于空白对照组。然而，在培养两天后， 用CSLD和CSLD-PCLM膜培养的细胞的存活率高于空白对照组。与CS混合的 PCL纤维毡发现了显著促进细胞增殖且细胞形态扩展的细胞，而未掺混的CS显 示出较低的细胞粘附力。上述研究结果显示，CSLD-PCLM纳米纤维膜具有良好 的细胞相容性和增强的细胞增殖性。
本发明还对CSID-PCLM纳米纤维膜中LID和莫匹罗星的释放特性作出了 分析，结果分别如图6a和6b所示。结果显示，CSLD-PCLM纳米纤维膜中的 LID在较短时间内进行了快速释放，最初30分钟内释放了大约73％的LID，6 小时后CSLD-PCLM纳米纤维膜上释放了92％的LID，然而已有研究中虽然观 察到了LID类似的控释曲线，但在30分钟内，只有约50％的LID从载药膜(DLS) 中扩散出来。本发明CSID-PCLM纳米纤维膜中的莫匹罗星则是缓慢释放，120h 内仅释放38.1％(图6b)，说明该复合纤维膜能够具有长期抗菌活性。本发明CSLD-PCLM纳米纤维膜可以实现控制不同的药物释放，并进一步实现良好的伤 口愈合性能。
本发明还使用菌落形成方法，选择了三种细菌(金黄色葡萄球菌S.aureus， 铜绿假单胞菌P.aeruginosa和大肠杆菌E.coli)，评估CSLD-PCLM纳米纤维 膜的抗菌活性，结果如图6c所示。结果显示，对照板(Ctrl)覆盖有致密的金 黄色葡萄球菌，大肠杆菌和铜绿假单胞菌菌落。当在37℃下用PCLM和 CSLD-PCLM膜覆盖2小时后，只有极少数细菌存活。CSLD-PCLM膜的表面活 菌中金黄色葡萄球菌为14.5％，大肠杆菌为12.9％，铜绿假单胞菌为6.6％PCLM 膜的活菌中金黄色葡萄球菌为13.2％，大肠杆菌13.6％，铜绿假单胞菌6.1％(如 图6d-f)。结果表明，CSLD-PCLM膜的出色抗菌活性显示出有效预防伤口被细 菌感染的巨大潜力。
本发明通过全层皮肤缺损模型中研究了纤维膜的伤口愈合性能，结果如图7 所示。在图7a-c中，显示在第0天，第7天和第14天的医用纱布(对照，Ctrl) 和CSLD，PCLM和CSLD-PCLM纳米纤维膜的伤口收缩情况。在第7天，所有 组均显示伤口面积减小了一定程度，而CSLD和CSLD-PCLM膜的伤口收缩比 医用纱布和PCLM膜的伤口收缩更好。在第7天，CSLD-PCLM膜表现出最大 的伤口收缩面积(94.4％)，伤口的收缩面积超过医用纱布的近23％，超过PCLM 膜的13.4％。用CSLD-PCLM膜治疗的伤口在第14天完全闭合，而CSLD膜仍具有约2％的伤口收缩未愈合，PCLM膜治疗的伤口在第14天具有4.1％的伤口 未愈合，表明CSLD-PCLM纳米纤维膜可实现更快的伤口愈合特性。结果显示， CSLD-PCLM膜在伤口收缩方面显示出优异的治疗效果，并且在不同的伤口愈合 阶段显示出良好的效果。
本发明还对伤口愈合各个阶段的组织形态学进行了评价，结果如图8和图9 所示。伤口愈合过程涉及多个重叠阶段：止血、炎症阶段、增殖阶段和重塑阶 段。本发明采用HE和MT染色用于研究不同阶段的伤口愈合过程，HE染色结 果如图8a所示，MT染色结果如图9所示。本发明在伤口愈合在第7天和第14 天检查并评分出血、炎性细胞、坏死、上皮化、胶原沉积以及肉芽组织和表皮 的形成并统计。结果显示，在第7天，CSLD-PCLM膜显示出较低的炎症反应， 而其他组显示出严重的急性炎症细胞浸润。与医用纱布(对照)以及CSLD和 PCLM纳米纤维膜相比，CSLD-PCLM膜周围的肉芽组织充满，包括成纤维细胞 和一些炎性细胞，这归因于复合纤维膜出色的生物相容性和抗炎特性。炎性阶 段不仅包括炎性细胞进入受伤的组织，还包括伤口愈合过程中的止血。在第7 天，与其他组相比，CSLD-PCLM膜表现出相对较少的出血。这些结果还证实了 图3所示的观察结果，即CSLD-PCLM膜缩短了血液凝固时间并迅速增强了凝 血功能。在第14天，所有组的伤口出血和炎症均得到改善，但是CSLD-PCLM膜仍然是最适合伤口愈合的伤口敷料。
肉芽组织由积累的细胞外基质，生长因子和丰富的成纤维细胞组成，因此， 较厚的肉芽组织是评估伤口愈合过程的关键指标。对于CSLD-PCLM组，在第7 天，在缺损部位观察到大量胶原蛋白表达和肉芽组织生长(图8a和9)。在第 14天，进一步研究肉芽组织的厚度，结果如图8b所示。CSLD-PCLM膜处理的 伤口中的肉芽组织比医用纱布(对照组)厚约300μm，比PCLM组厚约220μm， 并沉积了更多的胶原蛋白。此外，表皮的再生至关重要，因为它是防止水分流 失和感染的屏障，确定并统计四组实验第14天的新表皮厚度(结果如图8c所示)，结果显示CSLD-PCLM组中形成了一个新的表皮层，并且观察到薄而致 密的真皮正在生长。
综上所述，本发明制备的复合CSLD-PCLM纳米纤维敷料具有多种功能， 包括优异的亲水性，吸收能力，机械性能，细胞相容性和抗菌性能，已通过双 重喷丝板静电纺丝技术成功开发，并且该膜具有出色的体外凝血能力。将LID 和莫匹罗星包封到不同组成的复合纳米纤维中，实现了LID的快速释放和莫匹 罗星的持续释放。此外，CSLD-PCLM纳米纤维膜在全层皮肤缺损模型中表现出 增强的伤口愈合过程，具有完全的上皮再生和胶原蛋白沉积。所有这些结果表 明，具有多功能特性的CSLD-PCLM纳米纤维膜可以大大促进治疗性伤口愈合 效果，实现伤口愈合的协同效应，且可以理想地满足伤口愈合过程的各种要求。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解： 在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、 替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，通过如下步骤制备：
(1)配制聚己内酯混合溶液：将一定量聚己内酯溶解于第一有机溶剂中，得到6～15wt％的聚己内酯溶液，搅拌获得均匀溶液，向溶液中加入1～4wt％的莫匹罗星，并继续搅拌一段时间，得到混合溶液A；
(2)配制壳聚糖混合溶液：将一定量壳聚糖溶解于第二有机溶剂中，得到5～12wt％的壳聚糖溶液，然后向溶液中加入0.5～8wt％的盐酸利多卡因，并搅拌一段时间，得到混合溶液B；
(3)采用双重喷丝头静电纺丝技术，制备壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜：将上述配制的两种混合溶液A和B分别装入静电纺丝设备的两个给料装置中，两种混合溶液的给料速率各自设置为8～50μL/min，给料装置的双重喷丝头与纤维接收器的距离设置为10～20cm，纤维接收器的转速设置为100～250rpm/min；开启高压电源，向两个喷丝头施加15～25kV电压，开启给料装置，两种混合溶液通过给料装置的喷丝头喷射至纤维接收器上，得到壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜；
(4)将步骤(3)制得壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜干燥，去除残留的溶剂，得到壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，所述步骤(3)静电纺丝在温度25～40℃，相对湿度30％～40％下进行。
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，所述步骤(1)配制的混合溶液A中的聚己内酯浓度为10wt％，莫匹罗星浓度为2wt％；所述步骤(2)配制的混合溶液B中的壳聚糖浓度为8wt％，盐酸利多卡因浓度为1wt％。
4.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，所述混合溶液A和所述混合溶液B的给料速率设置为相同，均为16.7μL/min；给料装置的双重喷丝头与纤维接收器的距离均设置为15cm，纤维接收器的转速设置为200rpm/min，喷丝头施加的电压为19kV。
5.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，所述步骤(1)的第一有机溶剂为六氟异丙醇和二氯甲烷的混合溶液，两者体积比为1:4～3:1；所述步骤(2)的第二有机溶剂为二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液，两者体积比为1:7～1:1。
6.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，所述步骤(4)的干燥步骤为：采用真空烘箱干燥，干燥时间为72～200h；或所述步骤(4)的干燥步骤为：先采用无水乙醇洗涤步骤(3)制得壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜，然后采用真空烘箱干燥，干燥时间为72～200h。
7.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，所述聚己内酯的分子量为40000～200000；所述壳聚糖的分子量为50000～1000000。
8.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，所述喷丝头为25G金属针头。
9.根据权利要求1所述的一种壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料，其特征在于，负载莫匹罗星的聚己内酯纳米纤维的直径为400～900nm，孔径为4.2～12.1μm；负载盐酸利多卡因的壳聚糖纳米纤维的直径为100～500nm，孔径为2.0～8.0μm。
10.一种权利要求1-9所述的壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料的用途，其特征在于，所述壳聚糖/聚己内酯复合纳米纤维膜材料用作伤口敷料、止血材料、创伤面包覆材料、美容材料、药物释放膜、药物输送膜或生物膜。
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