CN107299079A - 一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体及其三维构建方法 - Google Patents

一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体及其三维构建方法 Download PDF

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Abstract

一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体及其三维构建方法，主要通过GelMA水凝胶携载bFGF构建GelMA‑bFGF水凝胶复合体，作为牙髓干细胞三维培养的活性载体，能够为牙髓干细胞的培养提供支撑作用、交换作用以及活性微环境等作用，可以有效获得大量有活性的牙髓干细胞，有利于牙髓干细胞的增殖以及快速生长，可以有效获得有活性的三维培养牙髓干细胞应用于神经组织工程研究。

Description

一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体及其三维 构建方法
技术领域
本发明具体涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体及其三维构建方法。
背景技术
周围神经损伤(Peripheral nervous injury，PNI)是临床上常见的一种创伤性疾病，在世界范围内PNI的发病率均较高，且经过临床系统治疗后患者神经功能完全恢复的比例低于50％，严重影响患者的日常生活能力，使患者的生活质量急剧下降，并给社会、家庭和个人带来极大的经济负担。目前，临床上PNI的治疗方法主要是自体神经移，但是自体神经来源有限，且常伴随供区的功能受损，还受可修复长度、疤痕等问题的限制；异体神经移植又有较强的免疫排斥反应。随着组织工程学这一交叉学科的迅速发展，人们开始研究利用神经组织工程在体外构建神经组织活性复合体来替代自体神经移植，以达到PNI的快速修复及功能重建的理想目标。神经组织工程的三要素为支架材料、种子细胞和活性因子。其中，传统用于神经组织工程的种子细胞为雪旺氏细胞(Schwann cells，SCs)，但SCs是终末分化细胞，增殖能力有限；随后，也有应用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)以及骨髓基质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)作为神经组织工程的种子细胞，但存在伦理学以及取材受限等问题，在临床应用上受到一定限制。牙髓干细胞(Dental pulp stemcells，DPSCs)是一种来源于口腔“医疗废弃物”的成体干细胞，来源丰富、取材简单、免疫原性低，具有间充质干细胞的特性，高度表达CD44、CD105、CD146及Stro-1等间充质干细胞表面标志物，并具有高度增殖能力和多向分化潜能。同时，DPSCs主要来自于颅神经嵴，能够共表达多种神经细胞表面特有标志物如Nestin、GFAP、NeuN及S100等，说明DPSCs具有更易于向神经细胞进行分化的潜能。因此，牙髓干细胞(DPSCs)能够作为神经组织工程主要的种子细胞来源。但是，牙髓干细胞在神经组织工程实际应用过程中，存在一个较为突出的问题就是细胞需求量较大且细胞生长处于三维环境，因此，如何获得大量有活性的三维培养牙髓干细胞是一个亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体及其三维构建方法，通过GelMA水凝胶携载bFGF构建GelMA-bFGF水凝胶复合体，作为牙髓干细胞三维培养的活性载体，能够为牙髓干细胞的培养提供支撑作用、交换作用以及活性微环境等作用，可以有效获得大量有活性的牙髓干细胞。
本发明采用的技术解决方案是：一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体，所述的三维活性复合体为DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶三维支架。
一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体的三维构建方法，包括以下步骤：
(1)牙髓干细胞(DPSCs)的分离、培养；
(2)GelMA粉末的制备：在50℃环境温度以及磁力搅拌条件下，取明胶溶于DPBS溶液中，得到均匀透明的明胶溶液，将甲基丙烯酸酐(MA)以0.5mL/min的速率缓慢滴加到明胶溶液中，同时，利用调节溶液pH值，使整个反应体系的pH值稳定在7.4-8之间，反应3h后，透析，透析溶剂为水，透析温度为50℃，每隔2d更换一次透析溶剂，5-7d后，收集冻干，即可得到GelMA粉末；
(3)bFGF-GelMA水凝胶的制备：在50℃恒温水浴环境中，取一定量的GelMA粉末溶于PBS中，配成GelMA无色透明溶液；然后，在室温条件下取GelMA溶液，加入bFGF直至完全溶解，得到bFGF-GelMA水溶液，最后，在bFGF-GelMA水溶液中加入无水乙醇溶解的水溶性光引发剂I2959，利用紫外灯进行照射，即可得到bFGF-GelMA水凝胶；
(4)DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶的制备：取DPSCs制备成细胞悬液，1000rpm条件下离心5min，收集细胞，滴加bFGF-GelMA溶液后反复吹打DPSCs直至细胞均匀分散，加入光引发剂I2959，利用UV进行照射，即可得到DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶。
所述的步骤(3)中GelMA的质量浓度为5-10％，加入的bFGF的终浓度为10-20ng/ml。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体及其三维构建方法，主要通过GelMA水凝胶携载bFGF构建GelMA-bFGF水凝胶复合体，作为牙髓干细胞三维培养的活性载体，能够为牙髓干细胞的培养提供支撑作用、交换作用以及活性微环境等作用，可以有效获得大量有活性的牙髓干细胞，有利于牙髓干细胞的增殖以及快速生长，可以有效获得有活性的三维培养牙髓干细胞应用于神经组织工程研究。
说明书附图
图1为DPSCs原代培养14d光镜图片。
图2为DPSCs表达间充质干细胞表面标记物的免疫荧光图片。
图3为DPSCs表面标记物流式细胞仪检测结果。
图4为DPSCs表达神经细胞表面标记物的免疫荧光图片。
图5为GelMA-bFGF水凝胶的SEM图片，其中A为水凝胶的表面结构，B为水凝胶的截面结构，实验结果可知，水凝胶成多孔网络结构。
图6为GelMA-bFGF水凝胶中bFGF体外释放曲线图。
图7为CCK-8检测结果。
图8为活死细胞双染检测结果。其中A为细胞包载在水凝胶内部生长，B为细胞接种在水凝胶表面生长。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的分离、培养以及鉴定：
从临床上收集正畸科患者(18-30岁)拔除的第三磨牙，提取相关牙髓组织并将牙髓组织剪碎，利用终浓度为3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml中性蛋白酶的混合酶在37℃、180rpm的恒温摇床环境中消化5-10min，得到的细胞悬液接种于T25细胞培养瓶中进行培养，每隔3天更换一次培养基。7-9天后观察克隆形成情况，当细胞融合率达到80％-90％时(12-14天)，传代培养。
DPSCs是一种来源于牙齿相关组织的成体间充质干细胞，能够表达间充质干细胞表面特有标记物，如阳性表达CD90、CD73、CD146、Stro-1以及阴性表达CD34、CD14等，可以通过免疫荧光染色以及流式细胞仪检测对DPSCs进行染色鉴定。1)免疫荧光染色DPSCs在6孔板爬片培养5d后，加入4％多聚甲醛固定15min；PBS洗3次；0.5％Triton X-100(PBS配置)室温通透20min，PBS漂洗3次，每次7min；1％BSA室温封闭30min，PBS漂洗3次，每次7min；分别加Stro-1(1∶50)、CD146(1∶200)抗体，4℃孵育过夜；置室温复温1h，弃一抗，PBST漂洗3次，每次3min；加荧光二抗室温避光孵育1h，PBST漂洗3次，每次5min；DAPI复染胞核6min，PBST漂洗3次，每次6min；滴加抗荧光淬灭剂，封片，荧光显微镜下观察。2)流式细胞仪检测取对数生长期的DPSCs，调整细胞悬液浓度为6×106，加入50μl stain buffer，随后分别加入5μl CD90、20μl CD73、20μl CD34以及20μl HLA-DR，用stain buffer补充到100μl每管，于4℃避光孵育30min，空白对照不加抗体；孵育结束后，加入1ml Stain Buffer，1000rpm离心5min，洗2次；最后，加入400μl stain buffer重悬，4℃避光保存，流式细胞仪检测。
牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)神经细胞表面标记物Nestin以及GFAP、的免疫荧光染色：
取对数生长期的DPSCs，以1.5×105个/ml的密度接种于6孔板中，细胞60-70％汇合后，弃培养基，PBS漂洗2-3次；4％多聚甲醛室温固定30min，PBS漂洗3次，每次3min；0.5％Triton X-100(PBS配置)室温通透20min，PBS漂洗3次，每次7min；1％BSA室温封闭30min，PBS漂洗3次，每次7min；加入Nestin(1∶1000)以及GFAP(1∶200)一抗，4℃孵育过夜。然后，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次6-7min，加入荧光二抗；最后，室温继续孵育1.5h，DAPI核复染7min，PBS漂洗3次，每次7min，滴加适量抗荧光淬灭剂，荧光显微镜下观察。
bFGF-GelMA水凝胶的制备及其性能检测：
GelMA粉末的制备及鉴定：首先，在50℃环境温度以及磁力搅拌条件下，取一定量的明胶(TypeA，bloom300)溶于DPBS溶液中，得到均匀透明的明胶溶液；其次，将计量的甲基丙烯酸酐(MA)以0.5mL/min的速率缓慢滴加到明胶溶液中，同时，利用5M NaOH来调节溶液pH值，使整个反应体系的pH值稳定在7.4-8之间；反应3h后，透析，透析溶剂为水，透析温度为50℃，每隔2天更换一次透析溶剂；5-7d后，收集冻干，即可得到GelMA粉末。
bFGF-GelMA水凝胶的制备：首先，在50℃恒温水浴环境中，取一定量的GelMA粉末溶于PBS中，配成GelMA无色透明溶液(mg/μL)；然后，在室温条件下取一定量的GelMA溶液，加入适量的bFGF直至完全溶解，得到bFGF-GelMA水溶液；最后，在bFGF-GelMA水溶液中加入无水乙醇溶解的水溶性光引发剂Irgacure 2959，利用紫外灯(UV)进行照射，即可得到bFGF-GelMA水凝胶。其中，GelMA的浓度为10％，bFGF的终浓度为20ng/ml。
bFGF-GelMA水凝胶的性能检测：①扫描电镜观察(SEM)bFGF-GelMA水凝胶铺在圆形不锈钢片上，浸入液氮中5min，然后通过真空冷冻干燥机临界点干燥24h，取样品的表面和截面粘台、喷金、扫描电镜观察。②bFGF的体外释放检测将100μL的bFGF-GelMA(含bFGF的量为100ng)水凝胶放入500μL无菌PBS浸提介质中，在37℃环境中分别于1h、3h、5h、7h、12h、1d、3d、5d、7d、14d、21d以及28d离心(12000g，10min)收集上清，每个时间段取出上清后更换同等体积新的浸提介质，然后通过ELISA(Westang system，Shanghai，China)试剂盒检测上清中bFGF的浓度，并绘制bFGF的体外释放曲线。
GelMA-bFGF-DPSCs三维活性复合体的构建及其性能检测：
DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶的制备：取生长状态良好的DPSCs，制备成细胞悬液，离心(1000rpm，5min)，收集细胞，滴加bFGF-GelMA溶液反复吹打DPSCs直至细胞均匀分散，加入光引发剂Irgacure 2959，利用UV进行照射，即可得到DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶。
DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶生物学性能检测：①CCK-8检测在96孔板中接种DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶200μL(DPSCs的终浓度为2×104个/ml)，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续培养。4h后，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值，即可检测DPSCs细胞的活性。②活死细胞双染检测主要通过活死细胞双染试剂盒(Invitrogen，USA)检测GelMA水凝胶内部DPSCs的生长情况。200μL的DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶接种于96孔板中(DPSCs的终浓度为2×104个/ml)，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，2d和5d后，按照活死细胞双染试剂盒的方法加入相关试剂，继续培养15min，然后在倒置荧光显微镜下(IX71，Olympus)观察。
实验结果：
如图1所示，实验结果可知，细胞呈典型的成纤维细胞形态。
如图2所示，实验结果可知，细胞阳性表达CD146、STRO-1。
如图3所示，结果显示，DPSCs阳性表达CD73、CD90以及阴性表达CD34、HLA-DR。
如图4所示，实验结果可知，DPSCs阳性表达神经细胞表面标记物Nestin以及GFAP。
如图5所示，实验结果可知，水凝胶成多孔网络结构。
如图6所示，实验结果可知，GelMA-bFGF水凝胶对于bFGF具有较好的缓控释作用，同时，7d以后缓控释作用比较平缓。
如图7所示，实验结果可知，GelMA-bFGF水凝胶对DPSCs的生长有明显的促进作用，明显高于对照组。
如图8所示，实验结果可以，DPSCs在GelMA-bFGF水凝胶内部和表面均能较好生长，说明GelMA-bFGF水凝胶是DPSCs生长的较好的三维载体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体，其特征在于，所述的三维活性复合体为DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶三维支架。
2.一种权利要求1所述的神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体的三维构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)牙髓干细胞(DPSCs)的分离、培养；
(2)GelMA粉末的制备：在50℃环境温度以及磁力搅拌条件下，取明胶溶于DPBS溶液中，得到均匀透明的明胶溶液，将甲基丙烯酸酐(MA)以0.5mL/min的速率缓慢滴加到明胶溶液中，同时，利用调节溶液pH值，使整个反应体系的pH值稳定在7.4-8之间，反应3h后，透析，透析溶剂为水，透析温度为50℃，每隔2d更换一次透析溶剂，5-7d后，收集冻干，即可得到GelMA粉末；
(3)bFGF-GelMA水凝胶的制备：在50℃恒温水浴环境中，取GelMA粉末溶于PBS中，配成GelMA无色透明溶液；然后，在室温条件下取GelMA溶液，加入bFGF直至完全溶解，得到bFGF-GelMA水溶液，最后，在bFGF-GelMA水溶液中加入无水乙醇溶解的水溶性光引发剂I2959，利用紫外灯进行照射，即可得到bFGF-GelMA水凝胶；
(4)DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶的制备：取DPSCs制备成细胞悬液，1000rpm条件下离心5min，收集细胞，滴加bFGF-GelMA溶液后反复吹打DPSCs直至细胞均匀分散，加入光引发剂I2959，利用UV进行照射，即可得到DPSCs-bFGF-GelMA水凝胶。
3.根据权利要求2所述的神经组织工程用牙髓干细胞的三维活性复合体的三维构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)中GelMA的质量浓度为5-10％，加入的bFGF的终浓度为10-20ng/ml。
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