JP6744665B2 - 動物細胞組成物の培養方法、それを用いた動物細胞組成物の製造方法、及び動物細胞組成物 - Google Patents

Description

本発明は、動物細胞組成物の培養方法に関する。また、動物細胞組成物の培養方法を用いた動物細胞組成物の製造方法及び動物細胞組成物に関する。なお、本出願は日本国特許庁に２０１５年６月２５日に出願した特願２０１５−１２７７８３を基礎とする優先権を主張する出願であり、参照によってその明細書全体が本明細書中に取り込まれる。

近年、細胞を用いた治療技術の開発が活発化しており、国内外の多くの機関において臨床応用が試みられている。患者の生体から採取した細胞を生体外において培養し、再び患者本人に細胞を移植する方法、採取した細胞にある特定の遺伝子を導入して生体に戻す方法や、細胞をスキャフォールドと呼ばれる足場に播種し、三次元的に組織を構築して移植する方法など、様々な方法が開発されている。これらは再生医療分野の医療技術として用いられるものであり、従来の治療では根治が困難であった疾患に対しても治療できる可能性を秘めている。今後は、細胞を用いて数多くの疾患に適用できる根治治療技術の実用化が待ち望まれているところである。

従来の細胞を用いた治療は、生体外で培養して増殖させた細胞を治療に適した溶液に懸濁し、それを注射や点滴により移植する方法が用いられていた。しかし、移植した細胞の多くは、移植した部位に留まらず、ほとんどの細胞は患部以外へと流出してしまい、そのため治療効果は限定的となることが多かった。こうした課題を解決する目的で、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーを培養基材表面に被覆した細胞培養皿（温度応答性培養皿）が開発された（特許文献１）。当該細胞培養皿を用いて、培養皿表面に被覆されたポリマーの上限臨界溶解温度未満または下限臨界溶解温度以上にて細胞培養し、細胞がコンフルエントになる状態まで培養した後、上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度未満にすると、細胞をシート状かつ非侵襲的に回収することができる。従来、接着性の細胞を培養皿から回収するためにはトリプシンやディスパーゼ等のタンパク質分解酵素を用いなければならず、細胞表面に発現しているマトリックスタンパク質や、細胞と細胞とを結合するギャップジャンクションを構成するタンパク質を分解していた。こうした細胞の接着に必要なタンパク質を分解していたため、細胞がバラバラの状態で回収されることとなり、その結果、移植した場合は組織へ生着しにくい状態となっていた。一方、温度応答性培養皿により得られる細胞シートは、細胞表面のタンパク質がほとんど損傷を受けておらず、接着タンパク質の存在により、患部へ速やかに生着できるという従来には無い優れた特徴を有している。これにより細胞移植の効果を最大限高めることが可能となり、細胞移植技術を飛躍的に発展させた。このような技術は細胞シート工学と呼ばれ、この技術を応用し、現在では、皮膚、角膜、心臓、食道、膝軟骨、歯周組織等の疾患を治癒するための新たな治療技術が開発され、実用化が目指されているところである。

細胞シート工学が確立されたことにより、細胞治療の技術は劇的に変化を遂げたが、細胞移植では治療効果を示さないと考えられる重篤な患者に対しては、依然として臓器移植が有効な治療手段である。ところが、臓器移植を必要とする患者の数に対して、供給される臓器の数は圧倒的に少なく、臓器又は組織を構築し、供給する技術の開発が求められている状況である。こうした課題に対しても細胞シート工学の技術が応用されており、細胞シートを積層することで厚みをもった生体組織を構築する試みが行われている（特許文献２）。従来、細胞を細胞シートとして移植する場合、細胞シートの面積に比例した細胞数しか移植することができなかったが、細胞シートを複数層積層し、三次元的に細胞を積み上げる技術が開発されたことで、より多くの細胞を移植できるようになった。ところが、細胞シートを４層以上積層した場合、培養液中の栄養分や酸素が積層した細胞シートの内部まで到達できず、内部の細胞が壊死してしまうという問題を抱えていた。こうした問題を解決するため、動物の生体内で細胞シートを積層し、酸素を供給する血管網を細胞シート内に構築させて厚い組織を作製する方法（非特許文献１）や、インビトロにおいて血管床上に細胞シートを積層する方法（特許文献３、特許文献４）が開発された。細胞シート内に毛細血管網を構築することで、溶存酸素の拡散のみでは到達できなかった酸素を、細胞シート積層体内部の細胞に到達させることが出来るようになり、厚い組織を構築することができた。

特開平０２−２１１８６５号公報 国際公開第０２／００８３８７号パンフレット 国際公開第１２／０３６２２４号パンフレット 国際公開第１２／０３６２２５号パンフレット

Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔ ｇｒａｆｔｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｈｉｃｋ，ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．ＦＡＳＥＢ．Ｊ．，２０（６），７０８−７１０（２００６）

上述の動物の生体内で細胞シートを積層する方法では、毎日繰り返して移植部位を開口する必要があり、被移植体に多大な負担を強いるという問題があった。また、血管床を用いる方法では、培養液を灌流する装置が大がかりになるなどの問題も抱えており、より簡便でかつ安価な培養方法の開発が求められていた。本発明の目的は、上述の問題を解決し、簡便でかつ安価な方法により、厚みをもった動物細胞組成物を得ることを課題としてなされたものである。すなわち、本発明は、動物細胞組成物の低酸素状態を解消し、厚みをもった動物細胞組成物の培養方法、単細胞藻類を含む動物細胞組成物の製造方法、及び動物細胞組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、動物細胞は単細胞藻類存在下においても傷害を受けることなく培養可能であることを見出した。また、動物細胞と共培養条件下においても単細胞藻類は光合成能を有しており、単細胞藻類が産生する酸素により、従来と比較して、より厚みをもった細胞組成物を簡便かつ安価に得ることが出来ることを見出した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。

[１] 単細胞藻類の存在下で、光を照射しながら培養液中で動物細胞組成物を培養する方法。
[２] 前記動物細胞組成物が、２以上の細胞層を含む、[１]に記載の方法。
[３] 前記細胞層が、細胞シートを含む[２]に記載の方法。
[４] 前記細胞シートが、４層以上積層された細胞シートである[３]に記載の方法。
[５] 前記単細胞藻類が、緑藻類、単細胞性の藍藻類、単細胞性の紅藻類、単細胞性の車軸藻類及び／又は単細胞性のアオサ藻網の藻類を含む、[１]〜[４]に記載の方法。
[６] 前記単細胞藻類が、クロロコックム リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、アカリオクロリス マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、シアニジウム カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）、 パルティータ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及び／又はフィラメントス−ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）を含む[１]〜[５]に記載の方法。
[７] 前記動物細胞組成物が、哺乳動物細胞を含む[１]〜[６]に記載の方法。
[８] 前記動物細胞組成物が、心筋細胞又は筋芽細胞を含む[１]〜[７]に記載の方法。
[９] 前記培養液が哺乳動物細胞培養用培養液を含む、[１]〜[８]に記載の方法。
[１０] 前記単細胞藻類の少なくとも一部が、前記２以上の細胞層の間に播種されたものである[２]〜[９]に記載の方法。

[１１] 単細胞藻類の存在下で、光を照射しながら培養液中で動物細胞組成物を培養する単細胞藻類を含む動物細胞組成物の製造方法。

[１２] 動物細胞と、単細胞藻類とを含む動物細胞組成物。
[１３] 前記動物細胞組成物が、２以上の細胞層が積層されたものである[１２]に記載の動物細胞組成物。
[１４] 前記単細胞藻類の少なくとも一部が、前記２以上の細胞層の間に挟持されている[１３]に記載の動物細胞組成物。
[１５] 前記単細胞藻類が、クロロコックム リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、アカリオクロリス マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、シアニジウム カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）、ガルディエリア パルティータ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及び／又はフィラメントス−ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）を含む[１２]〜[１４]に記載の動物細胞組成物。

本発明の方法によれば、培養液中に溶解される酸素濃度を高めることができ、従来の方法であれば低酸素状態となっていた細胞組成物に、継続的に酸素を供給することが可能となる。また、培養液中のアンモニア濃度の上昇も抑制することが可能となる。その結果、細胞の傷害が緩和され、毛細血管網を有していなくても厚みをもった細胞組成物を得ることが可能となる。

本発明の細胞シート及び単細胞藻類を用いた細胞培養方法に使用する培養設備を示す図である。 クロロコックム リットラレから産生される酸素を測定するシステムを示す図である。（Ａ）本発明に用いられるシステムを図示したもののである。（Ｂ）単細胞藻類を培養している培養皿底面からの高さに対応する酸素濃度を示す図である。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による単層Ｃ２Ｃ１２細胞シート及び単層ラット心臓細胞シート培養による酸素濃度を示す図である。（Ａ）クロロコックム リットラレ非存在下、（Ｂ）クロロコックム リットラレ存在下における培養皿底面からの高さに対応する酸素濃度をプロットした図である。（Ｃ）クロロコックム リットラレ存在／非存在下であって、光照射あり／無条件における単層Ｃ２Ｃ１２細胞シートのＯＣＲを示す。（Ｄ）クロロコックム リットラレ存在／非存在下であって、光照射あり／無条件における単層心臓細胞シートのＯＣＲを示す。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による単層Ｃ２Ｃ１２細胞シートによる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出量を比較する図である。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による単層Ｃ２Ｃ１２細胞シートの組織学的観察結果を示す図である。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による単層Ｃ２Ｃ１２細胞シート（Ａ）及び心臓細胞シート（１層）（Ｂ）のグルコース消費量並びに乳酸産生量を示す図である。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による５層／１０層の心臓細胞シートのグルコース消費量を示す図である。培養開始から１日後、２日後、３日後の培養上清中のグルコース消費量を測定した。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による５層／１０層の心臓細胞シートの乳酸産生量を示す図である。培養開始から１日後、２日後、３日後の培養上清中のグルコース消費量を測定した。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による１０層の心臓細胞シートのクレアチンキナーゼの放出量（ユニット：Ｕ）を示す図である。 クロロコックム リットラレ存在／非存在下による５層の心臓細胞シートの組織学的観察結果を示す図である。 クロロコックム リットラレ非存在下（Ａ）／存在下（Ｂ）による１０層の心臓細胞シートを示す図である。 クロロコックム リットラレ存在（共培養）／非存在下における５層又は１０層の心臓細胞シートのアンモニア産生量（μｍｏｌ）を示す図である。 クロロコックム リットラレ存在（共培養）／非存在下における５層の心臓細胞シートの組織学的観察結果を示す図である。抗ＨＩＦ−１α抗体を用いてＨＩＦ−１α陽性細胞を染色した。（Ａ）５層心臓細胞シート、（Ｂ）５層心臓シート＋クロロコックム リットラレ（共培養）。

本発明は、動物細胞組成物を培養する方法、その培養方法を用いた動物細胞組成物の製造方法及びそれにより製造される動物細胞組成物に関するものである。本発明において、動物細胞組成物とは、動物細胞を含むいかなる組成物も含むものである。例えば、細胞と細胞外マトリックスを構成するコラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、エンタクチン、テネイシン、エラスチン等が混合された組成物であってもよく、細胞とその細胞が産生する細胞外マトリックスを含む組成物であってもよい。また、細胞外マトリックスを構成するタンパク質は、遺伝子組換えタンパク質であってもよく、それをコードする遺伝子が組み込まれた、又はベクター等により遺伝子導入された細胞から産生されるタンパク質であってもよい。また、動物細胞組成物の形態は、層状の細胞が複数積層された形態であってもよく、細胞を、細胞外マトリックスを含んだゲルに懸濁して型（モールド）に流し込んで得られた物であってもよい。また、動物細胞組成物には、後述する単細胞藻類を含んでいてもよく限定されない。

本発明に用いられる細胞の動物種の由来は、特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。本発明の細胞組成物をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタの治療に用いる場合はブタ、サルの治療に用いる場合はサル、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した細胞であってもよく（自家細胞）、他人の細胞から採取した細胞を用いてもよく（他家細胞）、市販の細胞株であってもよい。

本発明に用いる細胞種、細胞数、割合等については、移植や評価モデルとして用いられる生体の組織、臓器、部位、用途等に応じて適宜選択、又は調整すればよい。例えば、心筋組織の再生、或いは心筋機能を評価する方法を目的とした場合、使用する細胞としては心筋細胞、心筋芽細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。肝組織の再生、肝組織を模擬した人工肝臓の作製、或いは肝組織の機能を評価する方法等を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、肝実質細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。腎組織の再生、腎組織を模擬した人工腎臓の作製、或いは腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、腎細胞、顆粒細胞、集合管上皮細胞、壁側上皮細胞、足細胞、メサンギウム細胞、平滑筋細胞、尿細管細胞、間在細胞、糸球体細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。副腎組織の再生、副腎を模擬した人工副腎の作製、或いは副腎機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、副腎髄質細胞、副腎皮質細胞、球状層細胞、束状層細胞、網上層細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。皮膚の再生、或いは皮膚機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、表皮角化細胞、メラノサイト、立毛筋細胞、毛包細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。粘膜組織の再生、或いは粘膜組織の機能を評価する方法を目的とした場合、例えば、使用する細胞としては、粘膜を構成する組織から採取される細胞を使用すればよい。粘膜の種類としては、頬側粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜などが挙げられる。粘膜組織から採取される細胞のうち、いずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したもの等が挙げられ、その種類については何ら制約されるものではない。また、これらの細胞はＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、間葉系幹細胞などから分化誘導された細胞であってもよく、特に限定されない。

本発明において、細胞組成物を構成する細胞として生体組織をミンス（ｍｉｎｃｅ)することにより得られる細胞を用いることができる。この場合、生体組織由来の細胞には、多種類の細胞が混在している。例えば、本発明の実施例では、ラットの心臓組織をミンスし、そこに含まれる心筋細胞を用いて細胞シートを作製しているが、当該細胞シートには、心筋細胞以外にも心臓組織由来の線維芽細胞、壁細胞、血管内皮細胞などが含まれており、目的に応じて細胞をセルソーターや抗体を用いて不要な細胞を除いたり、逆に必要な細胞を加えることができる。本明細書における実施例中の「心臓細胞シート」とは、上述の心筋細胞以外に、線維芽細胞、壁細胞、血管内皮細胞などが含まれているものを指す。

本発明における細胞シートは細胞組成物の一態様であり、細胞培養器材上で培養し、細胞器材上から剥離させて得られる１層、または複数層のシート状の細胞層からなる細胞群をいう。細胞シートを得る方法としては特に限定されるものではないが、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した細胞培養器材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の条件を変えて、細胞培養器材表面を変化させることで、細胞間の接着状態は維持しつつ、細胞培養器材表面から細胞をシート状に剥離する方法、任意の細胞培養器材にて細胞を培養し、細胞培養器材の端部から、物理的にピンセット等により剥離する方法等が挙げられる。特に好ましいのが、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養し、細胞をシート状に剥離させる方法である。その際、細胞は、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃付近が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。

細胞種によっては、細胞培養器材上に接着しにくいものがあり、そのような場合は、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物を細胞培養器材上に被覆して培養してもよい。これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を器材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法が挙げられる。

本発明の方法において、細胞層の一態様である細胞シートを作製するために播種する細胞数は使用細胞の動物種や細胞種によって異なるが、一般的に０．４×１０⁶〜１０×１０⁶個／ｃｍ²が良く、好ましくは０．５×１０⁶〜８×１０⁶個／ｃｍ²が良く、さらに好ましくは０．２５×１０⁶〜５×１０⁶個／ｃｍ²が良い。本発明においては、培養した細胞シートを温度応答性培養器材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養器材の温度を、被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、培養器材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培養液を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培養液については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培養液でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培養液でもよい。

以上のことを、温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの器材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養器材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、培養器材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。

本発明に用いられる細胞シート作製用の細胞培養器材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。培養する細胞が上皮系の細胞である場合、セルインサートを用いると、細胞の上下に培養液が触れさせることができ、細胞が重層化し、好ましい。被覆を施される細胞培養器材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。

本発明における細胞層の一態様である細胞シートは、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、細胞培養器材から剥離された細胞シートは接着性蛋白質を有し、細胞をシート状に剥離させた際には細胞−細胞間のデスモソーム構造が保持されている。このことにより、細胞シートを生体患部に貼付したり、細胞シートを積層する場合、接着することができ、効率良く生着できるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−器材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。

本発明における複数の細胞層を有する細胞組成物を作製する方法については、特に限定されるものではないが、例えば、細胞を細胞培養器材に播種し、その上に細胞外マトリックスタンパクを構成するタンパク（ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、カドヘリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、フィブリン、エラスチン、キチン、キトサン、ビトロネクチン等）を含むゲルを塗布後、さらに細胞を播種して積層し、細胞層を有する細胞組成物を得る方法や、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させる方法などにより得られる。その際、培養液の温度は、培養器材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域（例えば、１０℃以下）、あるいは培養細胞が死滅するような高温域（例えば５０℃以上）における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培養液については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培養液でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培養液でもよい。また、必要に応じ、細胞シートを移動させるための治具を利用しても良い。そのような治具としては、剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば材質、形状共に何ら限定されるものではないが、それらの材質としては、通常、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリングルー等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として細胞シートに接触させて使用される。

本発明に用いられる藻類とは、光合成により酸素を産生する生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものの総称をいう。藻類は光合成に必要な環境が整えば、酸素と栄養分を自ら作り出すことができ、増殖することができる。本発明は、藻類の光合成により産生される酸素により、培養液中の酸素濃度を増加させ、動物細胞組成物へ直接的または間接的に酸素を供給する。また、本発明において、藻類は、動物細胞の代謝産物であるアンモニアを固定することが可能で有り、それによって動物細胞の培養に有害となるアンモニア濃度の上昇を抑制することが可能となる。藻類は、培養液中の動物細胞組成物に直接又は間接的に酸素を供給する役割を果たし、アンモニア濃度の上昇を抑制する役割を果たすため、培養液中で浮遊培養可能な単細胞藻類であることが好ましい。本明細書において「単細胞藻類」とは、藻類の中でも、個体が単一の細胞からなる藻類をいい、複数の単細胞藻類個体が集まり、群体を形成する単細胞藻類も含む。例えば、クロロフィルａ及びｂを葉緑体の主要色素とする緑藻類、クロロフィルｄを主要色素とする単細胞性の藍藻類（シアノバクテリア）、クロロフィルａ及びフィコビリンタンパク質を主要色素とする単細胞性の紅藻類が単細胞藻類の例として挙げられる。さらに詳しく例を挙げると、緑藻類では、緑藻綱クラミドモナス目のクラミドモナス レインハルドティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（和名：クラミドモナス）、ドナリエラ目のドナリエラ サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）（和名：ドナリエラ）、オオヒゲマワリ目のボルボックス カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ）（和名：ボルボックス）、クロロコックム目のクロロコックム リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、ヨコワミドロ目のヒドロディクティオン レティキュラツム（Ｈｙｄｒｏｄｉｃｔｙｏｎ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）（和名：アミミドロ）、ペディアストラム デュプレックス（Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ ｄｕｐｌｅｘ）（和名：クンショウモ）、セネデスムス ディモルファウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）（和名：イカダモ）、トレボウキシア藻綱クロレラ目のクロレラ バルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（和名：クロレラ）、ユーグレナ植物門ユーグレナ藻綱ユーグレナ目のユーグレナ グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）及びユーグレナ プロキシマ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｐｒｏｘｉｍａ）（和名：ミドリムシ）などが挙げられる。単細胞性の藍藻類では、藍色細菌門のアカリオクロリス マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）などが挙げられる。単細胞性の紅藻類では、紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のシアニジウム カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ）（和名：イデユコゴメ）又は紅藻植物門イデユコゴメ綱イデユコゴメ目のガルディエリア パルティータ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）などが挙げられる。単細胞性の車軸藻類では、緑色植物門の車軸藻網クレブソルミディウム目のスティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）が挙げられる。また、単細胞性のアオサ藻網の藻類であるフィラメントス−ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）が挙げられる。本発明に用いられる単細胞藻類は、上記で挙げられた単細胞藻類の遺伝子操作が行われた遺伝子組換え体であってもよい。

本発明に用いられる単細胞藻類は、動物細胞用の培養液中で培養可能であることが好ましい。また、培養する温度は、用いられる動物細胞の細胞種や、単細胞藻類の種類によって適宜選択すればよい。動物細胞と単細胞藻類の両方において生育可能であり、なおかつ単細胞藻類が光合成可能な温度を選択すればよい。培養可能な温度範囲は、例えば、１９℃〜５０℃、２０℃〜４９℃、２１℃〜４８℃、２２℃〜４７℃、２３℃〜４６℃、２４℃〜４５℃、２５℃〜４４℃、２６℃〜４３℃、２７℃〜４２℃、２８℃〜４１℃、又は２９℃〜４０℃の範囲であってもよい。

本発明に用いられる哺乳動物細胞用の培養液は、動物種や細胞種によって適宜選択できるものであり、特に限定されない。また、哺乳動物細胞と共培養する前の単細胞藻類を培養するための培養液も特に限定されるものではなく、単細胞藻類の種類に応じて定法に従い、適宜選択すればよい。培養液はバイオリアクタ等を用いて灌流させてもよく、攪拌翼をもった培養層内で攪拌させてもよく、単細胞藻類の種類や動物細胞の動物種、細胞種の性質に応じて適宜選択すればよい。

本発明に用いる光照射方法は特に限定されないが、例えば、市販の蛍光灯や、ＬＥＤ、白熱球などを用いることができる。用いられる単細胞藻類が有する光合成色素の吸収スペクトルに応じ、適宜な光源を選択することで光合成効率を最大限高めることも可能である。例えば、クロロフィルａを有する単細胞藻類の場合は４００〜４５０ｎｍ付近及び６５０〜７００ｎｍ付近、クロロフィルｂを有する単細胞藻類の場合は、４５０〜４８０ｎｍ付近及び６３０〜６７０ｎｍ付近、クロロフィルｄを有する単細胞藻類の場合は、７００〜７５０ｎｍ付近、フィコビリンタンパク質を有する単細胞藻類の場合は、５００〜６５０ｎｍ付近の波長をもつ光源により光を照射すればよい。複数のクロロフィル及び／又はフィコビリンタンパク質を有する単細胞藻類を用いる場合は、上記波長を組み合わせた光源を照射すればよい。

本発明において、単細胞藻類と哺乳動物細胞との共培養は、単細胞藻類を培養液に懸濁して浮遊させた状態で培養してもよく、哺乳動物細胞と単細胞藻類とを懸濁して培養皿に播種して培養してもよく、細胞層と細胞層の間に単細胞藻類を播種し、細胞層の間に単細胞藻類が挟持された状態で培養してもよく、これらの培養方法を組み合わせて培養してもよい。４層以上の細胞シートを積層化した厚みをもった細胞組成物を得るためには、上記複数の方法を組み合わせた方が好ましい。培養開始時における単細胞藻類の細胞数は、単細胞藻類の種類や動物細胞の種類などに応じて適宜調節すればよいが、例えば、培養液１ｍＬあたり、０．１×１０⁷個〜１０×１０⁷個、０．１５×１０⁷個〜９．５×１０⁷個、０．２×１０⁷個〜９×１０⁷個、０．２５×１０⁷個〜８．５×１０⁷個、０．３×１０⁷個〜８×１０⁷個、又は０．３５×１０⁷個〜７．５×１０⁷個の単細胞藻類であってもよい。

本明細書において、「好気呼吸」及び「嫌気呼吸」とは、当業者において公知の用語と同一の用語を指す。一般に「好気呼吸」とは、ミトコンドリアを有する真核生物の細胞において、酸素を利用することができる異化代謝系をいう。「好気呼吸」は、大きく分けて、解糖系、クエン酸回路、酸化的リン酸化の３つの代謝系からなり、これらの代謝系を経ることで、糖類が二酸化炭素及び水へと分解される。その過程を経ることでＡＴＰが産生される。好気呼吸の場合、酸化的リン酸化過程において酸素が必要であり、酸素が十分存在する条件下において、例えば、１分子のグルコースから上述の３つの代謝系を経ることで約３０分子のＡＴＰが産生される。一方、酸素が十分に存在しない条件下では、上述の酸化的リン酸化反応を行うことができず、この場合に行われる呼吸を一般的に「嫌気呼吸」という。嫌気呼吸は、好気呼吸と同様、解糖系を経る。これにより、例えば、１分子のグルコース分子から、２分子のピルビン酸を経て、２分子の乳酸が産生され、その過程で２分子のＡＴＰが産生される。従って、ＡＴＰ産生量の観点から、好気呼吸の方がエネルギー効率において優れているといえる。さらに、嫌気呼吸で産生される乳酸は、細胞毒性を与えることが知られており、乳酸の産生を抑制した培養方法が好ましい。

本明細書において、「好気呼吸」及び「嫌気呼吸」の割合については、培養液中に存在するグルコース消費量と乳酸産生量の割合（Ｌ／Ｇ比）によって予測することが可能である。仮に、全ての呼吸が嫌気呼吸である場合、グルコース１分子は、２分子の乳酸へと変換されるため、Ｌ／Ｇ比は２に近くなる。逆に、好気呼吸であれば、産生される乳酸量が存在しないため、Ｌ／Ｇ比は０に近くなる。すなわち、Ｌ／Ｇ比の変化によって、好気呼吸と嫌気呼吸の割合の変化を予測することが可能となる。

本発明により、従来の培養方法では酸素が不足するために壊死していたと考えられる動物細胞組成物が、単細胞藻類の存在下において、例えば、単細胞藻類との共培養により、壊死することなく、厚みを持った動物細胞組成物として得られるようになった。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

（使用した細胞、培養方法及び細胞シートの作製方法）
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞株（大日本住友製薬社（大阪、日本））はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマアルドリッチ社（セントルイス、アメリカ））にて培養を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞シートは、Ｙ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉらの方法（Ｙ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｓｔａｃｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（２０１２）８５０−８５８．、及び、Ｙ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ１６（２０１０）６８５−６９２．）に従い、温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社、東京、日本）を用いて作製した。

新生児ラット心臓細胞は一日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ （ＳＤ）ラット（ＣＬＥＡ社、東京、日本）の心室から単離して、哺乳動物細胞培養用培養液（商品名：組織灌流培養用培地、コージンバイオ社、埼玉、日本）にて培養した。心臓細胞シートの作製及び積層細胞シートは、Ｙ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉらの方法（Ｙ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ｓｔａｃｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７（２０１２）８５０−８５８．）、Ｈ．Ｓｅｋｉｎｅらの方法（Ｈ．Ｓｅｋｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｆｕｓａｂｌｅ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ， Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４（２０１３）１３９９．）及びＫ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉらの方法（Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３（２０１３）１３１６．）に従い、温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社、東京、日本）を用いて作製した。

（単細胞藻類の培養）
単細胞藻類クロロコックム リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（東京、日本）より購入し、ダイゴＩＭＫ培地（和光純薬工業社、東京、日本）及び人工海水（商品名：ダイゴ人工海水ＳＰ、日本製薬社）を用い、連続光源（約５００−７００ルクス）の下、室温（約２７−２８℃）で培養した。単細胞藻類（２．５×１０⁷細胞）は、３５ｍｍのポリスチレン培養皿（ベクトンディッキンソン社、フランクリンレイク、ニュージャージー州、米国）にて、哺乳動物細胞培養用培養液、及びダイゴＩＭＫ培地を用い、３０℃の温度条件、連続光源（１３１３±４５ルクス（ｎ＝３））の下、０日または１日間培養（表１）し、後述する酸素濃度測定システムにて酸素産生量を測定した。輝度は、ルミノメーター（アズワン社、東京、日本）にて測定した。

（単細胞藻類を含有する積層細胞シートの作製）
前述の方法で単層のラット心臓細胞シートを作製した。ラット心臓細胞シートを作製した温度応答性培養皿から培養液を除去し、２．５×１０⁸個の単細胞藻類クロロコックム リットラレを含む哺乳動物細胞培養用培養液６ｍＬを加え、その後培養液を全てピペットで吸い取ってラット心臓細胞シートをピペット内へ回収した。６０ｍｍのポリスチレン培養皿（ベクトンディッキンソン社、フランクリンレイク、ニュージャージー州、米国）に、単細胞藻類及び心臓細胞シートを含む培養液を排出し、心臓細胞シートを吸わないように再び培養液を同一のピペットで吸い取った。
再び温度応答性培養皿から剥離した心臓細胞シートを上記の単細胞藻類を含む培養液で回収し、１枚目の心臓細胞シートが入っているポリスチレン培養皿に、心臓細胞シートと単細胞藻類を含む培養液を排出した。この時、２枚目の心臓細胞シートを１枚目の細胞シートへ重ねた。上記作業を繰り返し、５層及び１０層積層した心臓細胞シートを作製した。作製に使用した単細胞藻類が含まれる培養液は、その後の培養にそのまま使用した。これにより、細胞シートと細胞シートの間に単細胞藻類が含まれる積層細胞シートを得た。単細胞藻類を含有しない積層細胞シートは、上記手順で使用した培養液から単細胞藻類を除いたこと以外、同一の手順で作製した。

（細胞シートと単細胞藻類の共培養）
哺乳動物細胞シートと藻類との共培養は前述の表１に示す条件で実施した。単層又は複数層積層した細胞シート組織は、アクリル製の培養箱にて、３０℃、加湿雰囲気、５％ＣＯ２、連続光源（１３１３±４５ルクス（ｎ＝３））の条件にて培養した（図１）。培養液は２４時間毎に交換し、回収した培養後の培養液は、代謝活性及び細胞の生存率の測定に用いた。

（生化学試験及び細胞存率試験）
細胞シート組織の代謝活性は、培養液中のグルコース消費量及び乳酸産生量を測定することにより観察した。細胞は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、心細胞を含む筋肉細胞はクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の放出量を、細胞の傷害性及び細胞の生存率の共通指標として利用した。グルコース濃度はヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）ＵＶ法、乳酸濃度は乳酸酸化酵素（ｌａｃｔｉｃ ｏｘｉｄａｓｅ）法、ＬＤＨ活性はＬＤＨアッセイキット（Ｓｉｃａｌｉｑｕｉｄ ＬＤＨ Ｊ）（関東化学社、東京、日本）を用いた方法、ＣＫ活性は酵素解析法によりそれぞれ測定し、Ｙ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉらの方法（Ｙ．Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ１６（２０１０）６８５−６９２．）、Ｗ．Ｓｅｋｉｎｅらの方法（Ｗ．Ｓｅｋｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ａｎｄ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｂｙ ａ ｐｏｒｏｕｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｐ．Ｔｉｓｓｕｅ ｃｈｉｐ．Ｓ２（２０１１）００１．）及びＴ．Ｓｈｉｏｙａｍａらの方法（Ｔ．Ｓｈｉｏｙａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１５（２０１３）１００−１０３．）に従って行った。また、培養液中のアンモニア濃度は、カロリメトリック法を用いる検査会社（ＳＲＬ、東京、日本）の外注サービスを利用して決定した。

（培養液中の酸素濃度の計測）
近年、本発明者らは酸素微小電極センサー（先端直径８−１２μｍのガラス製のクラーク型酸素マイクロセンサー（ＯＸ−１０））（ユニセンス社、デンマーク）及び高精密電子天秤（ＨＴＲ−２２０）（新光電子社、日本）を用いた酸素濃度測定システムを開発した。この装置は、培養皿の底からの酸素センサー先端の位置を計測できるシステムである（図２Ａ）（参考：Ｓｅｋｉｎｅ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；４５２：８３４−８３９．）。酸素濃度の測定はグローブボックス低酸素ワークステーション（ＩＮＶＩＶＯ₂ ３００）（ルスキン テクノロジー社）中にて、２０％酸素、及び５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で測定した。培養細胞の酸素濃度・酸素消費率（ＯＣＲｓ）は、光源あり（１１０３±２５ルクス（ｎ＝２））又は無しの条件にて評価した。測定は培養皿の３点にて行い、平均値を計算した。ＯＣＲの計算はフィックの拡散法則（Ｆｉｃｋ’ｓ ｌａｗｓ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）を基に計算した（参考：Ｋ．Ｓｅｋｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４５２（２０１４）８３４−８３９． Ｙ．Ｋａｇａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｐａｔｉａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１５ Ｊｕｎ；１１２（６）：１２６３−１２７４）。

（組織学的解析）
１日〜３日間培養した後に、単層又は複数層積層した細胞シートを４％パラホルムアルデヒド溶液（武藤化学社、東京、日本）にて固定した。固定した試料はパラフィンに包埋し、組織切片を作製後、ヘマトキシリン―エオシン染色を行った。また、作製した試料は、外注サービスを利用して、ウサギポリクローナル抗ＨＩＦ−１α抗体を用いた染色を行った（協同病理社、神戸、日本）。準備した組織は光学顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ８００）（ニコン社、東京、日本）にて観察した。画像はイメージングシステム（ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（ニコン社、東京、日本）にて処理した。

（データ解析）
全てのデータは平均値±標準偏差（ＳＤ）で表している。２つのグループを比較するためにｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔを行った。ｐ値が０．０５より小さくなったとき、有意差があるものとした。

（実施例１）
（単細胞藻類からの酸素産生の検出）
単細胞藻類クロロコックム リットラレが、哺乳動物細胞用の培養液で培養可能であり、なおかつ光合成により酸素を産生できるかどうかを確かめた（図２）。飽和酸素濃度を、気層と接する培養液面付近の酸素濃度と定義した（図２Ｂにおいて、培養皿底面から最も遠い領域の酸素濃度：約７．４ｇ／ｍ³）。単細胞藻類は、藻類用の培養液を用いたときと同様、哺乳動物細胞培養用の培養液を用いて培養した場合においても、光合成により飽和濃度以上の酸素を産生することが可能であり、また、哺乳動物細胞用の培養液を用いても培養可能であることが明らかとなった。

（実施例２）
（哺乳動物細胞と単細胞藻類との共培養）
哺乳動物細胞を用いて細胞シートと単細胞藻類との共培養を行った（表１）。Ｃ２Ｃ１２細胞シートが存在しない培養皿底面近くの培養液の酸素濃度は飽和状態であったが、Ｃ２Ｃ１２細胞シートが存在する底面部（図１Ａ左の領域）の培養液の酸素濃度はゼロ近くのレベルまで減少しており（図３Ａ）、これより細胞シートが活発に酸素を消費していることが明らかとなった。光照射下で単細胞藻類だけが存在する領域の酸素濃度は、飽和酸素濃度よりも高かった（図３Ｂ）。光照射条件下で細胞シートと単細胞藻類とが共存在する領域（図２Ａ右の領域）の培養液の酸素濃度は、飽和レベルであった。これらのことから哺乳動物細胞と単細胞藻類とは共培養が可能であり、なおかつ共培養したとしても酸素を十分に産生する能力を有することが明らかとなった。
光を照射せずに単細胞藻類と細胞シートを共培養した場合、その培養液の酸素濃度は細胞シート単独の場合よりも減少しており（図３Ｂ、Ｃ）、単細胞藻類の代謝が、光合成から呼吸へと転換していることが示唆された。そのため、光を照射せずに共培養した場合の酸素消費量は、哺乳動物細胞単独で培養した場合の酸素消費量よりも多くなっているのではないかと考えられる。同様の傾向は、単細胞藻類とラット心臓細胞シートの共培養の場合であっても観察された（図３Ｄ）。単細胞藻類の酸素産生／供給能は、光の有無のみで制御可能であることが示された。

単細胞藻類との共培養が、哺乳動物細胞にどのように影響を与えるかを調べた。細胞傷害の指標であるＬＤＨの放出量は、単細胞藻類存在／非存在のいずれの条件においても有意差はなかった。（図４）。また組織学的解析でも、単細胞藻類の有無に関わらず、いずれの細胞シートも形態学的に変わらなかった（図５Ａ、Ｂ）。この結果は、単細胞藻類と哺乳動物細胞とを共培養したとしても、単細胞藻類が哺乳動物細胞に傷害を与え無いことを示唆している。

細胞シートの代謝を調べたところ、単細胞藻類とＣ２Ｃ１２細胞シートとの共培養は、細胞シート単独の培養と比較してグルコース消費量と乳酸産生量がともに２０％減少した（図６）。Ｃ２Ｃ１２細胞は、正常酸素状態よりも低酸素状態においてグルコースの取り込み量及び乳酸産生量が有意に増加するとの報告がある（Ｗ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｈｙｐｏｘｉａ：ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１３（２０１３）３２６−３４６．）。単細胞藻類との共培養によるグルコース消費量及び乳酸産生量の減少は、単細胞藻類からの酸素供給による低酸素状態から通常酸素状態への転換によるものと推察される。

（実施例３）
（単細胞藻類とラット心臓細胞の共培養）
より厚い心筋組織を作製するために、単細胞藻類を含む／含まない条件にて、５層または１０層の心臓細胞シートを積層した。単細胞藻類と共に５層及び１０層積層した心臓細胞シートは、細胞シート単独で培養した組織に比べて有意にグルコース消費量と乳酸産生量が減少した（図７、図８）。

細胞のグルコース消費量に対する乳酸産生量の割合（Ｌ／Ｇ比）は好気呼吸又は嫌気呼吸であるかを調べるための指標として利用した。嫌気呼吸において、グルコース代謝の最終産物であるピルビン酸がすべて乳酸へ変換された場合、Ｌ／Ｇ比は２である。一方、好気呼吸においては、ピルビン酸の一部がミトコンドリアへ取り込まれ、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ回路）によって完全に酸化され、その結果Ｌ／Ｇ比は２より小さくなる。本実施例におけるＬ／Ｇ比の結果を表２に示す。

細胞シートを積層してから１日後に単細胞藻類を含まない５層又は１０層の心臓細胞シートのＬ／Ｇ比を測定すると、それぞれ１．８４又は１．７０であった（表２）。一方、単細胞藻類とともに積層した５層又は１０層の心臓細胞シートの積層１日後のＬ／Ｇ比はそれぞれ１．５２又は１．４１であった（表２）。これは、単細胞藻類によって産生された酸素により、一部、嫌気呼吸から好気呼吸へと変換されたことを示唆している。好気呼吸では１モルのグルコースから３８モルのＡＴＰが産生される。一方、嫌気呼吸では、１モルのグルコースからは２モルのＡＴＰしか産生されない。そのため、ラット心臓細胞と単細胞藻類との共培養によるグルコース消費量及び乳酸産生量の減少は、好気呼吸の効率的なエネルギー産生と関連している可能性がある。

単細胞藻類と単層Ｃ２Ｃ１２細胞シートを共培養した際、並びに単細胞藻類と単層の心臓細胞シートを共培養した際、Ｌ／Ｇ比の有意な変化はほとんど観察されなかった（表２）。一方、グルコース消費量及び乳酸産生量は、単細胞藻類との共培養によって減少した（図６）。酸素供給によるＬ／Ｇ比の変化は細胞種に依存する可能性がある。生体組織の種類や細胞の種類によっては、嫌気的状況下で生存しているものがあり、それらはグルコースから乳酸を産生しているものと考えられる。骨格筋は他の組織と比較して少ない数のミトコンドリアしか有しておらず、低酸素の状況に高い耐性を示す組織であると考えられる。

１０層のラット心臓細胞シートはＣＫを大量に放出しており、心筋細胞の傷害が激しかった（図９）。一方、単細胞藻類と共培養した１０層の心臓細胞シートは、ＣＫの放出量が１／５にまで減少しており、細胞の傷害が緩和されることが明らかとなった（図９）。５層積層した心臓細胞シートのうち、培養皿に近い細胞シート層は層間剥離をおこしており、傷害を受けていた（図１０）。一方、単細胞藻類とともに５層積層した細胞シートは、積層しても生存することが観察された。単細胞藻類を含まない１０層積層した心臓細胞シートは、培養後６日以内に培養皿より剥がれてしまい、深刻な傷害を受けていた（図１１Ａ）。しかしながら、単細胞藻類を挟み込み、なおかつ単細胞藻類と共培養した１０層の細胞シートは６日間培養しても、剥離することなく培養皿に接着して生存していた（ｎ＝５、図１１Ｂ）。

（実施例４）
（単細胞藻類との共培養によるアンモニア産生量への影響）
動物細胞を培養すると、その代謝活動によってアンモニアが培養液中に放出される。アンモニアの濃度上昇は、動物細胞の生育を阻害する。単細胞藻類との共培養が心臓細胞シートから放出されるアンモニア濃度の上昇にどのような影響を与えるかを調べるために、培養液中のアンモニア濃度を測定した。その結果、５層及び１０層の細胞シートのいずれにおいても、単細胞藻類を用いて共培養することによって、培養液中のアンモニア量を著しく減少させ、動物細胞の培養環境を改善することが明らかとなった（図１２）。

（実施例５）
（単細胞藻類との共培養による低酸素状態解消への影響）
細胞シートの積層枚数が増加すると、積層細胞シートの細胞培養液面から遠い部位が酸素不足に陥り、細胞が壊死してしまう。細胞が低酸素状態になると、低酸素誘導因子のＨＩＦ−１αタンパク質が検出される。そのため、ＨＩＦ−１αタンパク質の発現の有無を調べることで組織内の低酸素状態を知ることが出来る。そこで、単細胞藻類の有無が、５層の細胞シートの低酸素状態にどのような影響を与えるか確かめるため、抗ＨＩＦ−１α抗体を用いて免疫組織学的観察を行った（図１２）。その結果、単細胞藻類を用いずに５層の細胞シートを培養した場合、下部の細胞層は、ＨＩＦ−１α陽性であり、なおかつ、組織が脆くなっていた（図１２（Ａ））。一方、単細胞藻類と共培養した５層の細胞シートは、抗ＨＩＦ−１α抗体で染色している部位が少なく、下部の細胞層において低酸素状態が改善することが確認された（図１２（Ｂ））。

（実施例６）
（動物細胞用培養液を用いた単細胞藻類の培養）
上述の単細胞藻類クロロコックム リットラレ以外の藻類も動物細胞用培養液で培養可能であるかどうかを確かめた。アカリオクロリス マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）もクロロコックム リットラレと同様の条件で培養可能であり、本発明の用途に用いることが可能であった。さらに、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及びフィラメントス−ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）も、動物細胞用培養（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃おいて培養することが可能で有り、本発明の用途に用いることが可能であった。

本発明に示される製造方法であれば、厚みのある細胞組成物を簡便に作製することができるようになる。このような厚みのある細胞組成物は、生体様組織として、さまざまな組織・臓器の再生医療に有用なものであると同時に、治療を目的とする薬剤の効果を評価するモデルとしても有用である。

Claims (6)

1. 単細胞藻類の存在下で、光を照射しながら培養液中で動物細胞組成物を培養する、動物細胞組成物の製造方法であって、ここで、前記動物細胞組成物が、４層以上積層された細胞シートを含み、前記単細胞藻類の少なくとも一部が、前記積層された細胞シートの各層の間に播種されている、方法。
2. 前記単細胞藻類が、緑藻類、単細胞性の藍藻類、単細胞性の紅藻類、単細胞性の車軸藻類及び／又は単細胞性のアオサ藻網の藻類を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記単細胞藻類が、クロロコックム リットラレ（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｌｉｔｔｏｒａｌｅ）、アカリオクロリス マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、スティココックス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）及び／又はフィラメントス−ウルボフィテ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−ｕｌｖｏｐｈｙｔｅ）を含む請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記動物細胞組成物が、哺乳動物細胞を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記動物細胞組成物が、心筋細胞又は筋芽細胞を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記培養液が哺乳動物細胞培養用培養液を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。