CN101148656B - 一种组织工程化肝单元的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程化肝单元的构建方法及一种组织工程化肝单元。是将间充质干细胞在体外分别向肝细胞和血管内皮细胞进行预诱导，然后分别结合含有诱导因子的生物蛋白胶填充到一管状支架的内壁和外侧，并以一外包围体包裹形成细胞材料复合体；所述细胞材料复合体置于培养液中继续培养即制备成含有血管内皮细胞和肝细胞的组织工程化肝单元。本发明使用间充质干细胞获取肝组织工程的大量种子细胞，并将其与适当的生物活性材料结合后，制备肝功能辅助功能结构单位。该组织工程化肝单元可用于移植到肝功能衰竭患者体内，部分代偿/替代肝功能，从而为肝功能衰竭患者提供除肝移植外的新的治疗途径。

Description

一种组织工程化肝单元的构建方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及将干细胞在体外分别向肝实质细胞、血管内皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞与生物材料相结合，共同构建组织工程化肝单元的方法，利用此方法不仅可以获取肝组织工程的大量种子细胞，制备肝功能不全时的辅助功能结构单位，而且可以此为基础结构进一步构建具有特定结构和功能的可移植的生物人工肝组织。

背景技术

肝脏是人体最大的内脏器官，它担负着重要而复杂的生理功能，如各种物质代谢的中枢、分泌胆汁、合成蛋白和凝血因子以及解毒等，对维持生命和内环境的稳定起重要的作用，是人体最复杂的器官之一，目前，终未期肝病如急性肝衰竭，肝硬化、肝癌等危及生命，一直是医学界难以解决的问题，死亡率非常高。全世界约有3亿多肝病患者，其中三分之一在我国，我国是肝病大国，是世界上终末期肝病发病率最高的地区之一，每年因肝病而死亡者人数众多。原位肝移植是肝功能衰竭及先天性肝代谢疾病唯一成熟的治疗方法。美国UNOS报道，在过去十年里，全世界实施26040例肝移植；据中华器官移植学会及全国肝移植协作组的统计，1976年到2004年我国内地完成各种类型肝移植5000余例。供肝缺乏是世界各国面临的主要问题。尽管近来发展了背驮式、劈离式、活体劈离式等各种肝移植术式，最大程度利用供肝，但仍不能解决等待肝移植患者与供肝者之间的巨大差额，且因其具有操作复杂、患者常需终生免疫抑制、花费巨大等缺点，临床应用受到极大的限制。

随着20世纪90年代组织工程学概念的提出和不断发展，肝组织工程因其独有的优势日益成为治疗终末期肝病研究热点并取得显著进展。肝组织工程即将适当的种子细胞与生物支架材料相结合，在一定的微环境下，经过诱导培养，形成一定量的肝实质细胞和组织，再移植到患者体内发挥代偿或替代肝功能的作用。其主要面临的问题有：缺乏与患者免疫相容的可再生的功能性种子细胞；缺乏在机械、生物、化学方面均理想的生物支架；不能产生大型的、易与受体血液循环整合相通的血管化组织等。其中种子细胞的选择、体外扩增培养是肝组织工程构建的关键因素。

成熟肝细胞具有诸多不足而不能成为满意的细胞来源，如自肝功能衰竭获取肝细胞难度较大、异基因肝细胞可能产生免疫排斥反应、体外培养易失去活性与功能等。目前，肝组织工程种子细胞来源的研究主要集中于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)与成体干细胞(adult stem cell，ASC)上，二者虽各有优点，但ESC的应用仍有伦理、道德、法律方面的争议；目前ESC向肝细胞系诱导分化的培养体系尚不成熟，其基础研究和应用研究有待进一步深入。

研究发现，人体组织内具有一类能够不断自我更新和增殖，具有多向分化潜能的细胞群体—干细胞。它能够在体外培养、增殖并且分化成不同的组织细胞。其中来源于骨髓中的间充质干细胞可分化为髓质和非髓质细胞型，包括：脂肪细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、神经元、肌细胞、成骨细胞、肝细胞、以及内皮细胞。体外培养的骨髓间充质干细胞(MSC)体积小，成梭形，核浆比例大，其作为组织工程种子细胞有如下优点：1.相对容易获得；2.通过干细胞转导可能使子细胞恢复正常功能并扩增；3.干细胞移植临床上容易实施；4.与其它干细胞(胚胎或新生儿干细胞)相比，骨髓间充质干细胞更符合伦理观念。已有学者利用骨髓来源的间充质干细胞治疗儿童的成骨不全，并取得了较好的治疗效果。骨髓间质细胞中的间充质干细胞在体外适当的培养环境或体内固有的微环境下能够被诱导分化为肝细胞和血管内皮等组织。研究证实，肝细胞与内皮细胞种植在适当的生物支架材料上可以进行生长和增殖(Stephen S.Kim，1998，Satoshi Kaihara，2000)。内皮细胞与肝细胞在支架材料上共同生长，即形成具备含有血管系统的活的组织工程肝脏(Lan Sample，2002)。除骨髓以外，人们在胎盘、脐带、脂肪等组织中陆续分离出与骨髓中的MSC具有类似生物学特性的干细胞，而且，与骨髓来源的MSC相比，它们的大量获取更为简单，来源更加丰富，且采集方法相对简单，因此越来越受到关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用间充质干细胞作为种子细胞结合适当支架材料和结构形式共同构建工程组织肝单元的方法。

本发明组织工程化肝单元的构建方法，包括以下步骤：

1)分离培养间充质干细胞，在体外将其分别向肝细胞和血管内皮细胞进行预诱导；

2)将向血管内皮细胞预诱导的内充细胞和含有诱导因子的生物蛋白胶一同种植在一管状支架内壁，该支架外具有一外包围体，将已向肝细胞分化的功能细胞和含有诱导因子的生物蛋白胶种植在所述支架与外包围体之间，形成细胞材料复合体；所述支架与外包围体壁面均有贯穿的微孔；

3)将细胞材料复合体置于含5～10％血清的DMEM培养液继续培养5～10天，即制备成含有BMSC来源的血管内皮细胞和肝细胞的组织工程化肝单元，保存备用。

其中，所述间充质干细胞为来自离体骨髓的骨髓间充质干细胞、来自离体脂肪组织的间充质干细胞、或来自离体胎盘或脐带组织的间充质干细胞。

其中，所述步骤1)中在所述间充质干细胞中先分别加入含有诱导因子的生物蛋白胶再进行预诱导。

上述构建方法中，所述步骤1)将间充质干细胞向肝细胞分化诱导条件为：以P2-P6代成体干细胞用条件培养液重悬，按1-5×10⁵/cm²接种于预先铺好Matrigel的96孔板内，每孔加200μl条件培养液，每3天换液一次；所述条件培养液为：5-10％胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/mlHGF、1ng/ml FGF-4、ITS，和、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、牛血清白蛋白2g/L、鸟氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及适量氯化锌、硫酸锌和氯化锰。

所述步骤1)将间充质干细胞向血管内皮细胞分化诱导条件为：将P₂-P₉成体干细胞以条件培养液重悬，按2-8×10³/cm²接种于预先铺好Matrigel的96孔板内，每孔加200μl条件培养液，每3天换液一次进行诱导培养，选取圆形或类圆细胞，将细胞消化处理，以普通培养基重悬制成细胞悬液；所述条件培养液为：L-DMEM，2％FBS，2％马血清，10ng/mlVEGF(R&D system)、2ng/ml bFGF(R&D system)、1×ITS(Sigma)、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、BSA2g/L、鸟氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及微量氯化锌、硫酸锌和氯化锰。

如上所述组织工程化肝单元的构建方法中，所述支架和外包围体所用的可降解生物材料为胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚L—乳酸、聚羟基烷酯、聚羟基丁酸酯和聚乳酸羟基乙酸中的一种，优选聚乳酸羟基乙酸。

所述支架和外包围体上微孔为自然形成或人工开设，所述微孔直径为100-200μm。所述支架为平面二分叉形式，主干和两分叉在同一平面上，且两分叉相对于主干呈一角度分布；或者所述支架为立体多维分级形式，主干下连接两分叉，每一分叉又分成若干下一级支分叉，支分叉与主干不在同一平面上。

本发明的另一目的，在于提供上述方法获得的一种工程组织肝单元。

采用以上技术方案，本发明对多种来源的间充质干细胞进行预诱导，令其向肝细胞和血管内皮细胞分化，用于获取肝组织工程的大量种子细胞，并将其与适当的生物活性材料结合，制备肝功能辅助功能结构单位。该组织工程化肝单元可用于移植到肝功能衰竭患者体内，(部分)代偿/替代肝功能，从而为肝衰竭患者提供除肝移植以外的新的治疗途径。

附图说明

图1为光学显微镜观察BMSC向血管内皮细胞EC诱导后1d、3d、5d、7d、14d、21d的细胞形态学变化图；其中，a)MSC×100；b)1d×40；c)3d×40；d)7d×100；e)14×100；f)21d×100。

图2为向EC诱导后BMSC在纤维蛋白凝胶中的组织学切片形态；图中，A：诱导后3d(×250)；B：诱导后7d(×125)；C：诱导后21d(×125)。

图3为BMSC向血管内皮细胞EC诱导后免疫荧光检测结果；其中，a)：诱导后的3d flt-1-FITC(×250)；b)：诱导后7d flt-1-FITC(×250)；c)：诱导后21d CD31-PE(×125)；d)：诱导后21d CD34-FITC(×125)；e)：诱导后21d flk-1-TRITC(×125)；f)：诱导后21dvWF-FITC(×125)。

图4为BMSC向肝细胞诱导分化后光镜下形态；其中，A：P2-P9BMSC；B：诱导后3d；C：诱导后5d；D：诱导后7d；(×100)。

图5为向干细胞诱导后BMSC免疫组织化学荧光染色结果；其中，A：诱导后3d(AFP-TRITC×250)；B：诱导后7d(AFP-TRITC×250)；C：诱导后3d(Alb-FITC×250)；D：诱导后7d(Alb-FITC×250)。

图6为EC在材料表面贴附生长的形态；其中，a)PLGA×2000；b)PLGA×2000；c)PU×2000；d)PU×2000。

图7为支架管壁的微孔结构形态，图中箭头所指为微孔。

图8显示组织工程化肝单元结构。图8-A示出了其中一种平面对称二分叉支架形式，图8-B显示另一种立体多维支架形式。

图9为本发明构建的肝单元移植大鼠4周后取出标本图片。

图10为本发明构建的肝单元移植大鼠4周后取出标本冰冻切片荧光显微镜观察结果；其中，在紫外激发光下发蓝色光的细胞(如箭头所指)即为DAPI标记的细胞，可见标记细胞组成毛细血管的管腔样的结构。

图11为本发明构建的肝单元移植大鼠4周后取出标本组织切片免疫荧光检测结果(AFP-FITC)×100。

图12为本发明构建的肝单元移植大鼠4周后取出标本组织切片检测结果；其中，M：支架材料；H：肝细胞。A为100×，B为200×，C和D为400×。

具体实施方式

本发明的研究思路是：间充质干细胞(MSC)作为种子细胞，其来源于离体的骨髓、胎盘、脐带、脂肪等组织；血管支架内部种植向血管内皮细胞(EC)预诱导的MSC，包裹支架周围的是向肝细胞预诱导的MSC；血管支架壁上有孔道供血管内皮细胞向外游离趋化，生长进入周围的肝样组织中，形成毛细血管网。支架材料以生物降解型高分子材料为主，细胞与支架结合后，在生物反应器中模拟体内环境进行培养。以下结合具体实施例的试验步骤，详述本发明的构建方法。

实验过程中所用材料和试剂包括但不限于以下所注明的：

1)Percoll分离液(Sigma)的配制：将Percoll原液按9:1与0.1mol/L PBS混合，稀释到密度为1.073g/mL。

2)DMEM(Dulbecco｀s modified Eagle｀s medium)培养基(Gibco)：将10g低糖DMEM粉末溶于1L三蒸水，每升加入4g HEPES、3.7g Na2HCO3及0.3g谷胺酰铵，将pH调节到7.0—7.4，加入青霉素、链霉素至终浓度为100U/mL。0.22μm的微孔滤膜超滤除菌，每90mL加入10mL胎牛血清(fetal bovine serum，FCS)，4℃保存。

3)胎牛血清(fetal calf serum，FCS，Hyclone)

4)胰蛋白酶(Sigma)

5)ITS(insulin1.0g/l，sodium selenite0.67mg/l，transferring0.55g/l，sodiumpyruvate11.0g/l，Hyclone)

6)CD34—FITC、CD133-PE(Miltenyi Biotec)、CD31-PE(PharMingen)、CD11a-FITC、CD44-FITC、CD71-FITC、CD29-PE、CD45-FITC、CD90-FITC(Serotec)；

7)Matrigel、重组人bFGF、重组人VEGF165(R&D)

8)多聚甲醛、3％戊二醛等国产试剂

9)地塞米松、尼克酰胺(Sigma)、鸟氨酸、脯氨酸(Hyclone)

10)纤维蛋白凝胶(广州倍绣生物技术有限公司)

11)小鼠抗Flk-1单克隆抗体、山羊抗vWF多克隆抗体(Santa Gruz)；兔抗Flt-1多克隆抗体(BOSTER)；荧光标记的山羊抗兔IgG、抗小鼠IgG及兔抗山羊IgG(北京中杉金桥)

实施例一：

1.骨髓来源的间充质干细胞(BMSC)的分离培养及鉴定

1)骨髓来源：可以为骨髓库中的骨髓、外科手术中从弃离骨中挤出的骨髓，或通过骨髓穿刺获得。骨髓穿刺是临床上广泛应用的成熟而安全的获取骨髓组织的方法，因此骨髓穿刺抽吸可以作为本发明的一个特别来源。

2)向获取的骨髓液中加适量DMEM培养液，混匀后以200目筛网过滤，取筛下组分；

3)平衡密度离心，弃上清；用DMEM培养液重悬细胞，制成骨髓细胞悬液；

4)将细胞悬液滴加在比重1.073的Percoll分离液液面上进行密度梯度离心，取界面层单个核细胞，用PBS离心洗涤。

5)将分离得到的骨髓单个核细胞以2.0×10⁵/cm²的密度接种于完全培养液(DMEM+10％胎牛血清)中，置于37℃，5％CO₂饱和湿度的孵箱内培养72h，更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每2-3天换液一次，得到骨髓间充质干细胞(MSC)；或者，这些细胞可通过使用流式细胞仪分选或根据细胞的大小和基粒的有无进行分离，干细胞较小并相对无基粒。

6)待培养瓶中细胞长到80％融合时，用0.25％的胰酶消化传代，以8.0×10³/cm²的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养；或最终的分离和重悬浮之后，用标准的细胞培养基进行扩大培养，以增加干细胞的数量。常用的标准培养基如添加5％～15％(例如10％)血清(包括胎牛血清，马血清等)的DMEM或者D/F12培养基。培养传代的细胞形态显示贴壁生长的原代(P₀)BMSC数量稀少，散落存在，呈细而小长梭形，随着BMSC的迅速增殖，7d后出现较大的克隆，14天左右细胞生长达80％-90％融合.传代后，自P₂至P₉其形态呈较均一的长梭形或多边形，成群生长时排列整齐如刷状，生长旺盛时呈旋涡样；P₉之后，BMSC形态变的较为宽大，间有分叉。因此，在本发明中采用P₂-P₉BMSC。

7)对获得的骨髓间充质干细胞表面标志的鉴定，用流式细胞仪检测

取第5代培养扩增的骨髓间充质干细胞，去掉培养液，用1:1的0.1％的胰蛋白酶和0.01％EDTA混合液消化；用含2％BSA的PBS洗涤后制成900ul含有1.5×10⁶个MSC的单细胞悬液，等分为7份，分别加入7个Eppendof管中，a管为标准对照，加入5μLIgG1-PE及IgG1-FITC；b管加入5μL CD133-FITC和5μLCD11b-PE单克隆抗体；c管加入5μL CD34-PE和5μLCD71-FITC单克隆抗体；d管加入5μLCD29-PE和5μL CD45-FITC单克隆抗体；e管加入5μLCD31-PE和5μLCD90-FITC单克隆抗体；f管加入5μLCD11a-FITC单克隆抗体；g管加入5μLCD44-FITC单克隆抗体；室温孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后，用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。鉴定结果显示，扩增后的BMSC成体干细胞表型为CD45^-、CD31^-、CD11a^-、CD34^-、CD133^-、CD71^low、CD29⁺、CD44⁺、CD90⁺。

2.脂肪组织来源的间充质干细胞(ADSCs)的分离培养及鉴定

1)脂肪组织可通过任何适当的方法获得，如从手术弃离物中获得、或通过脂肪抽吸术而获得。脂肪抽吸术是目前医学上应用最为普遍的安全的方法，因此脂肪抽吸物是本发明细胞的一个丰富来源。

2)获取的脂肪组织以PBS反复冲洗，以除去损伤组织、血液和红细胞等。

3)在脂肪组织中加入2倍体积0.2％I型胶原酶胶原酶和1倍体积牛血清白蛋白(BSA)，移入50ml离心管，37℃消化45min，并不时摇动。

4)200目筛网过滤消化物，滤液使用平衡密度离心方法1200转/min离心5min收集富含脂肪组织来源的干细胞群体的部分(沉淀)细胞，随后用PBS悬浮沉淀部分，再以1200转/min离心5min来洗涤细胞2遍.

5)最终细胞用含有10％FBS的LG-DMEM完全培养液重悬，以2.0×10⁵/cm²的密度接种于25cm²的培养瓶，置于37℃、5％CO₂的孵箱中进行常规的细胞扩大培养.

6)脂肪组织来源的干细胞表面标志的鉴定

取第5代培养扩增的脂肪组织来源的干细胞，胰酶消化收集细胞，离心。以PBS洗涤细胞2～3次后，用1ml PBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，按5×10⁵个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC标记的多个抗体进行组合，加入各管中，室温下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后，用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。鉴定结果显示，扩增后的ADSCs成体干细胞表型为CD45^-、CD34^-、CD133^-、CD106^-、CD71^low、CD49d^low CD29⁺、CD44⁺、CD90⁺。

3.胎盘组织来源的MSC

1)胎盘组织可来自于足月顺产或剖腹产中弃离的胎盘组织。

2)剥除母体侧蜕膜，剪取小块胎儿蜕膜侧胎盘组织，PBS冲洗，去除血迹，剪成碎片。

3)加入0.1％IV型胶原酶，37℃消化30min，过100目筛网，收集细胞悬液，加入配好的培养基(含DMEM，FBS，bFGF)，调整培养细胞密度为1×105/ml，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的CO2培养箱培养，每3～4d进行换液。

4)细胞按常规方法传代、冻存、复苏。

5)胎儿脱膜侧胎盘组织消化后获得细胞中仅有少量的贴壁细胞，经2周后逐渐形成扁平单层细胞，呈漩涡状生长或成簇生长；在细胞长满培养瓶时，胞体变得细长，形态类似成纤维细胞。

6)用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定，胎盘间充质干细胞表达CD29、CD44、CD105，但不表达CD11b、CD34、CD45、CD19、CD106、CD40、CD40L、CD28、CD80和CD86等表面抗原分子。

实施例二：体外诱导BMSC向血管内皮细胞(EC)分化及鉴定

1)条件培养液的配制：含2％胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/mlVEGF(R&Dsystem)、2ng/mlbFGF(R&D system)、1×ITS(Sigma)、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、牛血清白蛋白(BSA)2g/L、鸟氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及适量微量元素(氯化锌、硫酸锌和氯化锰)等；

2)P₂-P₉代BMSC以条件培养液重悬，按2×10⁴/cm²接种于预先铺好Matrigel(1：3比例稀释)的96孔板内，每孔加200ul条件培养液，每3天换液一次；3)光学显微镜观察:动态观察BMSC诱导后1d、3d、5d、7d、14d、21d的细胞形态学变化。结果参见图1，其中，a)MSC100×；b)1d40×；c)3d40×；d)7d100×；e)14100×；f)21d100×。图片显示诱导后1d，细胞由原来的长梭形变短、变粗，成多角形；诱导后3d，细胞伸出伪足相互连接，成管网状排列；诱导后7d，细胞排列成条索状，并形成血管腔样结构；14-21d，血管腔样结构密度增加，管腔直径变的宽大，条索状结构长度增加，管腔样结构周围有呈铺路石样排列的内皮样细胞。

纤维蛋白凝胶立体培养及组织学切片

1)将诱导后7d、14d、21d的BMSC分别消化以10％胎牛血清的低糖DMEM重悬；

2)悬液与纤维蛋白原混合后接种于96孔板，最后加入凝血酶2U/孔，混合液总体积为100ul/孔，纤维蛋白原终浓度为2mg/ml；

3)加入凝血酶后纤维蛋白原变成纤维蛋白，呈半透明半固体凝胶，细胞均匀分布在立体凝胶中；

4)光学显微镜下观察纤维蛋白凝胶中有无血管样结构形成；

5)将各组纤维蛋白凝胶取出，10％甲醛固定，组织学切片(垂直于每孔平面纵行切面)，HE染色观察。

结果参见图2，图中，A：诱导后3d(250×)；B：诱导后7d(125×)；C：诱导后21d(125×)。显示诱导后7d、14d、21d的细胞在纤维蛋白凝胶中同样形成条索状与血管腔样结构。诱导后第3d、5d、7d、14d、21d分别行纤维白凝胶切片(如图2)，诱导后第3d开始见内皮样细胞散在分布，由单个细胞的细胞浆围成一毛细血管腔样结构(图2细箭头所示)；7d后部分区域内皮样细胞相对密集分布，由2个以上细胞构成毛细血管样结构(图2粗箭头所示)或细胞排列成条索状、巢状(图2双箭头所示)，周围围绕一周基底膜样结构，这为其应用中建立与体内循环的联系奠定了基础。

免疫荧光检测

1)未诱导的BMSC与诱导后1d、3d、5d、7d、14d、21d的BMSC培养板，用PBS洗涤3次，每次5min；

2)4％的多聚甲醛室温原位固定15min，PBS洗涤3次，每次5min；

3)0.1％Triton和3％过氧化氢孵育10min；

4)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min；

5)20％马血清37℃孵育15min；

6)倾去血清，分别加CD34-FITC、CD133-PE直标荧光抗体工作液与Flk-1、vWF、Flt-1抗体工作液各50μL，置于湿盒中于37℃孵育30min放4℃过夜；阴性对照用0.01mmoL/L的PBS代替一抗；

7)4℃过夜后，CD34、CD133直标荧光抗体组经PBS冲洗3次，直接在荧光显微镜下观察；其余各组滴加荧光标记的二抗(山羊抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-TRITC及兔抗山羊IgG-FITC)工作液37℃孵育30min，PBS冲洗3次，在荧光显微镜下观察；

结果参见图3显示未诱导的BMSC免疫组化荧光染色CD34、CD31、Flt-1、Flk-1、vWF均为阴性；诱导后3d，即有部分细胞开始出现Flt-1阳性表达，而CD34、CD31、Flk-1、vWF则在诱导后7d才开始出现阳性表达；此后荧光染色阳性率逐渐增加。部分上述表面标志荧光染色阳性的细胞参与构成血管腔样结构或成铺路石样排列。

本实施例以BMSC为例说明种子细胞如何向血管内皮细胞诱导，其它来源(如脂肪组织、胎盘组织)的间充质干细胞向血管内皮细胞诱导过程与此相同，不再一一赘述。

实施例三：骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞诱导分化及鉴定

实验中所用试剂及抗体有：小鼠抗人AFP单克隆抗体，兔抗人Alb抗体(SantaCruz)；荧光标记的山羊抗兔IgG、抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司)；靛青绿(Indocyanine green，ICG)(辽阳第三制药厂)；其余同前。

1、体外诱导BMSC向肝细胞分化：将P₂-P₉BMSC以条件培养液重悬，按5×10³/cm²接种于预先铺好Matrigel(1：3比例稀释)的96孔板内，每3天换液一次进行诱导培养。动态观察BMSC诱导后3d、5d、7d的细胞形态学变化，参见图4，诱导后3d，长梭形细胞逐渐变短、变粗，成多角形或肝细胞样圆形细胞。诱导后5-7d，肝细胞样圆形细胞密度比例逐渐增多。其中形态变为圆形或类圆的，判定有成熟肝细胞分化的趋势，将细胞消化处理，以普通培养基(DMEM/F12)重悬制成细胞悬液，备用；

条件培养液的配制：含2％胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/ml HGF、1ng/mlFGF-4、1×ITS、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、牛血清白蛋白(BSA)2g/L、鸟氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及适量微量元素(氯化锌、硫酸锌和氯化锰)等。

2、免疫荧光检测

1)未诱导的BMSC与诱导后3d、5d、7d的BMSC培养板，用PBS洗涤3次，每次5min；

2)4％的多聚甲醛室温原位固定15min，PBS洗涤3次，每次5min；

3)0.1％Triton和3％过氧化氢孵育10min；

4)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min；

5)20％马血清37℃孵育15min；

6)倾去血清，分别加AFP、Alb抗体工作液各50μL，置于湿盒中于37℃孵育30min放4℃过夜；阴性对照用0.01mmoL/L的PBS代替一抗；

7)4℃过夜后，滴加荧光标记的二抗(山羊抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-TRITC)工作液37℃孵育30min，PBS冲洗3次，在荧光显微镜下观察。

结果参见图5，显示未诱导的及诱导后3d的BMSC免疫组化荧光染色AFP、Alb均为阴性；诱导后5-7d，细胞开始出现AFP、Alb阳性表达，并逐渐增加阳性率。3、ICG摄取、排泌实验

1)将诱导3d、5d、7d的BMSC用PBS冲洗后，加入1mg/mL ICG，于37℃孵育15min；

2)显微镜下观察细胞颜色的变化；

3)PBS冲洗2遍，换回完全培养液继续培养并观察颜色的变化；

肝细胞具有特有的ICG摄取、排泌功能，实验结果显示，诱导后3d、5d、7d的细胞培养体系中加入ICG孵育15min后，形态无变化的及诱导后3d的BMSC未着色，而诱导后5d、7d的肝细胞样圆形细胞被染成深绿色(参见图5中深色点)，换回常规培养基培养4小时后，着色细胞的绿色褪去，提示细胞具有类似肝细胞的ICG摄取和排泌功能；上述结果表明，BMSC已逐渐分化为AFP、Alb阳性并具备活性功能的成熟肝细胞。

综合以上实验表明，骨髓来源的具备多分化潜能的成体干细胞在体外适当条件下可分别向血管内皮细胞、肝细胞分化，BMSC可作为肝组织工程中稳定的肝特异性功能的种子细胞。Matrigel、纤维蛋白凝胶、VEGF、bFGF、HGF、FGF及诱导后表达的flt-1、flk-1等表面分子在骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞、肝细胞分化的过程中可以提供适宜的微环境并起重要作用。

本实施例以BMSC为例说明种子细胞如何向肝细胞诱导，其它来源(如脂肪组织、胎盘组织)的间充质干细胞向肝细胞诱导过程与此相同，不再一一赘述。实施例四：支架材料及结构的设计

支架的目的是为细胞提供环境以使种子细胞粘附聚集生长以形成特定结构和形状的组织。支架材料本身应具有可生物降解性和生物相容性(包括血液相容和组织相容)，支架结构上要尽可能增加吸附种子细胞的表面积，并能引导细胞的生长方向。

本发明的支架可选用具有孔洞结构的组织工程材料，可选用的材料如胶原、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚L—乳酸、聚羟基烷酯(PHA)、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚乳酸羟基乙酸(PLGA)、和聚氨酯(PU)，实验验证其中聚乳酸羟基乙酸和聚氨酯与血液相容性更好；更进一步实验表明，两种优选材料对骨髓成体干细胞和内皮细胞都具有良好的相容性(参见图6)。

这些材料可以使用NaCl颗粒制孔/浸出法制备成多孔薄膜材料，进而制备成本发明中的支架；在本发明中，支架材料的微观结构参见图7该材料壁面微孔均匀，孔隙相互贯通，参见图7(b)中箭头所指，最好还具有较大的贯穿整个壁面的较大的微孔通道，如图7(a)中箭头所指。当材料本身微孔不具有贯穿性时，需要人工在支架上开设微孔通道，该微孔通道直径在100～200μm。

在本发明中，支架2制备成管状，管壁设有微孔通道21，管内填充已向内皮细胞预分化诱导的细胞3及生物胶4，管外填充已向肝细胞预分化诱导的细胞5及营养基质6，最外层再覆以同样材料制备的外包围体1，外包围体上同样应有大量微孔通道11。由此形成的组织工程化肝单元结构参见图8所示。

支架本身结构形式可以有各种变化。8-A示出了一种平面对称二分叉形式支架2，该种形式两分叉22和主干23在同一平面上且相对于主干23呈一角度并对称分布。另一种支架的变化形式可参见图8-B，该支架为立体多维分级的形式，主干23下连接两分叉22，每一分叉22又继续分成若干下一级支分叉24(图中示出两个分支叉24)，支分叉24与主干23不在同一平面上，这样形成的支架2具有多维立体构象，更易于形成毛细血管网。所有形式的支架其端口均可伸出外包围体，从而形成既有内部微环境又可与外界环境交互的组织工程化肝单元。

实施例五：含有成体干细胞来源的血管内皮细胞和肝细胞的组织工程化肝单元构建

1、BMSC与支架结合体内诱导培养

1)将无菌的DAPI储存液加入培养的MSC上清中，至终浓度为50mg/L；37℃孵育染色30min；Hanks平衡盐溶液冲洗6遍，除去未结合的DAPI。

2)BMSC-DAPI以条件培养液(组成参见实施例二)重悬，置于冰上至少1h备用；

3)悬液与纤维蛋白原混合后，以2.0×10⁵/cm²的密度接种于96孔板，最后加入凝血酶2U/孔，混合液总体积为100ul/孔，纤维蛋白原终浓度为2mg/ml；

4)加入凝血酶后纤维蛋白原变成纤维蛋白，呈半透明半固体凝胶，细胞均匀分布在立体凝胶中；

5)将纤维蛋白凝胶自细胞培养板中挑出，放入支架管内壁；

6)将支架及种植之细胞种植于肝损伤的NOD-SCID裸鼠腹腔中(或腹膜外或包裹于大网膜中)，诱导培养四周成为肝单元。

2、BMSC与支架结合体外诱导培养

1)BMSC以条件培养液分别重悬，EC(血管内皮细胞)条件培养液与实施例二相同，其中需加入10ng/mlVEGF、2ng/mlbFGF；肝细胞条件培养液与实施例三相同，其中需加入10ng/mlHGF、1ng/mlFGF-4；

2)将以上分别得到的BMSC悬液与纤维蛋白元(广州倍绣生物技术有限公司)混合后，分别以2.0×10⁵/cm²的密度接种于96孔板，最后加入凝血酶2U/孔，混合液总体积为100ul/孔，纤维蛋白原终浓度为2mg/ml；

3)然后分别加入凝血酶后纤维蛋白原变成纤维蛋白，呈半透明半固体凝胶，细胞均匀分布在立体凝胶中，分别置于37℃，5％CO₂饱和湿度的孵箱内，进行诱导分化培养3-5天；

4)将含有向血管内皮细胞预诱导分化细胞(内充细胞)的纤维蛋白凝胶自细胞培养板中挑出，注入支架管内壁；将含有向肝细胞预诱导分化细胞(功能细胞)的纤维蛋白凝胶自细胞培养板中挑出，注入支架管与外包围体之间形成细胞材料复合体；

5)最后将细胞材料复合体置入含5～10％血清的DMEM培养液继续培养5～10天，即制备成含有BMSC来源的血管内皮细胞和肝细胞的组织工程化肝单元，保存备用。

3、BMSC与支架结合体外诱导培养

另一种体外诱导培养，1)依据实施例二和实施例三先将BMSC分别向EC细胞(内充细胞)和肝细胞(功能细胞)预诱导；2)然后分别加入含有诱导因子的生物蛋白胶中，其中需加入10ng/mlVEGF、2ng/mlbFGF；肝细胞生物蛋白胶中需加入10ng/mlHGF、1ng/mlFGF-4；3)将含有EC细胞的生物蛋白胶注入支架管内壁，将含有肝细胞的生物蛋白胶注入支架管与外包围体之间形成细胞材料复合体；4)将细胞材料复合体置入含5～10％血清的DMEM培养液继续培养5～10天，即制备成含有BMSC来源的血管内皮细胞和肝细胞的组织工程化肝单元，保存备用或移植入肝损伤动物的腹腔中。

本实施例以BMSC为例说明骨髓来源的间充质干细胞在预诱导分化后如何与支架结合形成组织工程化肝单元，其它来源(如脂肪组织、胎盘组织)的间充质干细胞预诱导后与支架结合的形式与此相同，不再一一赘述。

实施例六：组织工程化肝单元的应用

将实施例五之2构建的肝单元植于肝损伤的NOD-SCID裸鼠腹腔中(或腹膜外或包裹于大网膜中)；4周后，取出植入肝单元作为标本，行组织学切片，HE染色观察。

免疫荧光检测

1)标本冰冻切片以PBS洗涤3次，每次5min；

2)4％的多聚甲醛室温原位固定15min，PBS洗涤3次，每次5min；

3)0.1％Triton和3％过氧化氢孵育10min；

4)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min；

5)20％马血清37℃孵育15min；

6)倾去血清，分别加AFP抗体工作液各50μL，置于湿盒中于37℃孵育30min放4℃过夜；阴性对照用0.01mmoL/L的PBS代替一抗；

7)4℃过夜后，滴加荧光标记的二抗(抗小鼠IgG-TRITC)工作液37℃孵育30min，PBS冲洗3次，在荧光显微镜下观察。

结果：

1、移植后的形态学观察：移植后4周，见移植物表面为纤维组织包裹，呈鲜红色，部分切面呈颗粒状，质硬，前与腹膜粘连，后与受损肝脏紧密相连，与腹膜肝脏间有血供相连，间有微小血管，分离后有出血及渗血(参见图9)。

2、DAPI与免疫荧光检测：DAPI是一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有高度的亲和力，与DNA结合后会发出强烈的荧光。参见图10，荧光显微镜下，在紫外激发光下发蓝色光的细胞(图中箭头所指)即为DAPI标记的细胞。可见标记细胞组成毛细血管的管腔样的结构。

免疫荧光染色显示AFP-FITC标记阳性细胞形成肝索样结构，参见图11。

3、石蜡切片HE染色：参见图12可见大量肝细胞样细胞(如图中H标注)，彼此相互连接，成条索样，条索之间可见内皮样细胞间断排列，内可见红细胞，形成肝脏所特有的肝索与肝血窦样结构，

通过以上具体描述可以获知，本发明确立了将成体干细胞(间充质干细胞)在体外/体内分别向肝细胞和向内皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞与生物材料相结合，共同构建组织工程化肝单元的方法，该方法可用于制备肝功能不全时的辅助功能结构单位。

Claims (8)

1.一种组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在体外将间充质干细胞分别向肝细胞和血管内皮细胞进行预诱导；

2)将向血管内皮细胞预诱导的细胞和含有诱导因子的生物蛋白胶一同种植在一管状支架内壁，该支架外具有一外包围体，将已向肝细胞分化的功能细胞和含有诱导因子的生物蛋白胶种植在所述支架与外包围体之间，形成细胞材料复合体；所述支架与外包围体壁面均有贯穿的直径为100-200μm的微孔；

3)将细胞材料复合体置于含5～10％血清的DMEM培养液继续培养5～10天，即制备成含有骨髓间充质干细胞来源的血管内皮细胞和肝细胞的组织工程化肝单元，保存备用。

2.根据权利要求1所述组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中在所述间充质干细胞中先分别加入含有诱导因子的生物蛋白胶再进行预诱导。

3.根据权利要求2所述组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，所述步骤1)将间充质干细胞向肝细胞分化诱导条件为：以P₂-P₆代成体干细胞用条件培养液重悬，按1-5×10⁵/cm²接种于预先铺好Matrigel的96孔板内，每孔加200μl条件培养液，每3天换液一次；所述条件培养液为：5-10％胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/mlHGF、1ng/ml FGF-4、ITS，和尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、牛血清白蛋白2g/L、鸟氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及适量氯化锌、硫酸锌和氯化锰。

4.根据权利要求2所述组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，所述步骤1)将间充质干细胞向血管内皮细胞分化诱导条件为：将P₂-P₉成体干细胞以条件培养液重悬，按2-8×10³/cm²接种于预先铺好Matrigel的96孔板内，每孔加200μl条件培养液，每3天换液一次进行诱导培养，选取圆形或类圆细胞，将细胞消化处理，以普通培养基重悬制成细胞悬液；所述条件培养液为：L-DMEM，2％FBS，2％马血清，10ng/mlVEGF、2ng/ml bFGF、1×ITS、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1μmoL/L、BSA 2g/L、鸟氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1g/L、半乳糖2g/L及微量氯化锌、硫酸锌和氯化锰。

5.根据权利要求1至4任一所述组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，所述支架和外包围体所用的可降解生物材料为胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基烷酯、聚羟基丁酸酯和聚乳酸羟基乙酸中的一种。

6.根据权利要求5所述组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，所述支架和外包围体所用材料为聚乳酸羟基乙酸。

7.根据权利要求5所述组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，所述支架和外包围体上微孔为自然形成或人工开设的。

8.根据权利要求7所述组织工程化肝单元的构建方法，其特征在于，所述支架为平面二分叉形式，主干和两分叉在同一平面上，且两分叉相对于主干呈一角度分布；或者所述支架为立体多维分级形式，主干下连接两分叉，每一分叉又分成若干下一级支分叉，支分叉与主干不在同一平面上。

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