CN108473930B - 用于重建的组织的包括具有不同直径的孔的膜 - Google Patents

用于重建的组织的包括具有不同直径的孔的膜 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包括至少两种类型的多孔结构的膜：‑尺寸小但密度高的多孔结构，该多孔结构允许培养细胞的支持物和营养以获得重建的组织模型；和‑尺寸大但密度低的多孔结构，该多孔结构允许从一个隔室到另一个隔室一些细胞类型的循环和细胞质延伸部分的通过。

Description

用于重建的组织的包括具有不同直径的孔的膜
技术领域
本发明涉及用于适于制备重建的生物组织的细胞培养的膜和装置。
背景技术
应用于研究(特别是安全性或效力测试)的组织工程基于重建含有一种或多种细胞类型的人或动物组织。这些组织最通常在接种并且在限定的条件(适合的培养基组成、受控的温度条件和pH条件)下于培养基中培养之后在用于细胞培养的插入物或装置中重建。
如今，这些3D组织重建系统使用膜作为细胞沉积的支撑物。由于膜、特别是由聚碳酸酯及其他化学聚合物制成的膜的制造技术所固有的限制，市场上的所有膜都被提出只有一种孔径。
因此，用于3D组织重建系统的大多数膜采用具有限定为允许营养培养基从下部隔室向上部隔室扩散的单一直径的孔的膜。
此外，存在具有限定为在细胞迁移测定中允许细胞从一个隔室迁移到另一个隔室的单一直径的孔的膜。然而，该单一孔径与组织重建模型(例如，重建的人表皮模型)不相容。
然而，重建的人或动物组织模型有许多应用，在重建的人或动物组织模型中，培养装置的下部隔室和上部隔室之间的细胞循环或不同隔室之间的细胞质延伸部分的通过可能非常有用。
因此，在炎性机制研究中使用的重建的人表皮(RHE)模型并不代表大多数炎性皮肤病(特应性皮炎、银屑病、狼疮......)，因为它们受限于不存在淋巴细胞。因此，需要更适合于研究慢性炎症的模型，特别是通过参与生物体的炎性反应的细胞准许重建的上皮定殖的模型。
同样，有趣的是，在一些重建的动物或人上皮中加入数种细胞类型的免疫活性细胞(例如，朗格汉斯细胞)能够如同在体内于敏化机制中发生的那样重现这些细胞的活化以及它们在表皮外部的迁移。
最后，人或动物上皮很少含有神经细胞的细胞体，但通常受神经末梢支配。因此，有趣的是受树突支配的3D上皮重建模型，而树突的细胞体则位于单独的隔室中。
因此，非常需要使得能够制备重建的组织模型的细胞培养装置，在该重建的组织模型中，能够实现不同隔室之间细胞的循环或细胞质延伸部分的通过。
本发明满足了该需要。
发明内容
本发明人确实出乎意料地表明可以制造包括两种类型的多孔结构的膜：
-尺寸小但密度高的多孔结构，该多孔结构允许培养细胞的支持物和营养以此方式获得重建的组织模型，和
-尺寸大但密度低的多孔结构，该多孔结构允许从一个隔室到另一个隔室一些细胞类型的循环和细胞质延伸部分的通过。
本发明人已经表明，这样的膜理想地适于获得重建的组织模型，在该重建的组织模型中，不同隔室之间细胞的循环或细胞质延伸部分的通过是可实现的。
因此，本发明的目的是一种用于细胞培养的单层膜，该单层膜包括至少两种类型的孔：
(i)平均直径为0.1至1μm、密度为1×105至1×108个孔/cm2膜的孔；和
(ii)平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔，
这两种类型的孔穿过膜的厚度从一侧到另一侧。
平均直径为0.1至1μm的孔(i)通常允许营养培养基从膜的一侧扩散到另一侧。
优选地，所述孔(i)的平均直径为0.2至0.9μm、优选地为0.3至0.8μm、优选地为0.4至0.7μm、0.4至0.6μm或0.4至0.5μm。最优选地，所述孔(i)的平均直径为0.4μm。
优选地，所述孔(i)以2×105至9.5×107个孔/cm2膜的密度存在于本发明的膜中，优选地以3×105至9×107、4×105至8.5×107、5×105至8×107、6×105至7.5×107、7×105至7×107、8×105至6.5×107、9×105至6×107、1×106至5.5×107、2×106至5×107、3×106至4×107、4×106至3×107、5×106至2×107或6×106至1×107个孔/cm2膜的密度存在于本发明的膜中。最优选地，所述孔(i)以1×106至8.5×107个孔/cm2膜的密度存在于本发明的膜中。
平均直径为2至12μm的孔(ii)通常允许细胞、特别是免疫细胞迁移，或者细胞延伸部分、特别是神经延伸部分通过所述膜。
优选地，所述孔(ii)的平均直径为2.5至11μm、优选地为3至10μm、3.5至9μm、4至8μm、4.5至7μm或5至6μm。最优选地，所述孔(ii)的平均直径为5μm。
本领域技术人员可以根据寻求迁移通过膜的细胞类型选择所述孔(ii)的优选平均直径。例如，当寻求迁移的细胞是星形胶质细胞时，所述孔(ii)的平均直径将优选地为12μm。当寻求迁移的细胞是白细胞、嗜中性粒细胞和/或神经元细胞时，所述孔(ii)的平均直径将优选地为3μm。当寻求迁移的细胞是淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞和/或树突状细胞时，所述孔(ii)的平均直径将优选地为5μm。当寻求迁移的细胞是内皮细胞、上皮细胞和/或成纤维细胞时，所述孔(ii)的平均直径将优选地为8μm。
优选地，所述孔(ii)以1×102至4.5×103孔/cm2膜的密度存在于本发明的膜中，优选地以1.25×102至4×103、1.5×102至3×103、1.75×102至2×103、2×102至1.5×103、2.25×102至1×103、2.5×102至9.5×102、2.75×102至9×102、3×102至8.5×102、3.25×102至8×102、3.5×102至7.5×102、3.75×102至7×102、4×102至6.5×102、4.25×102至6×102、4.5×102至5.75×102、4.75×102至5.5×102或5×102至5.25×102个孔/cm2膜的密度存在于本发明的膜中。最优选地，所述孔(ii)以2.5×102、5×102或1×103个孔/cm2膜的密度存在于本发明的膜中。
在一个具体实施方案中，所述孔(ii)均匀地分布在膜的整个表面上。
在另一个具体实施方案中，所述孔(ii)非均匀地分布在膜的表面上。
优选地，两种类型(i)和(ii)沿相同的方向取向。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的膜是用于细胞培养的单层膜，该膜包括至少两种类型的孔：
(i)平均直径为0.4μm、密度为1×106至8.5×107个孔/cm2膜的孔；和
(ii)平均直径为2至12μm、优选地为5μm，密度为2.5×102至1×103个孔/cm2膜、优选密度为2.5×102、5×102或1×103个孔/cm2膜的孔，
这两种类型的孔穿过膜的厚度从一侧到另一侧并且沿相同的方向取向。
本发明的膜的孔(i)和(ii)穿过所述膜的厚度。因此，它们在位于膜一侧的要素和位于膜另一侧的要素之间形成通道。
此外，本发明的膜的孔(i)和(ii)优选地沿相同的方向取向。因此，本发明的膜的孔(i)和(ii)优选地形成基本上相互平行的通道。因此，优选地，本发明的膜的孔(i)和(ii)不互连。
本发明的膜是单层膜。换言之，本发明的膜由单一材料层或材料片构成。
优选地，本发明的膜的厚度为2μm至200μm。更优选地，本发明的膜的厚度为5μm至100μm、优选地为5至50μm、优选地为8至25μm、更优选地为10μm至20μm、最优选地为11μm至15μm。
本发明的膜优选地为生物相容性膜。
在此，术语“生物相容性膜”是指由对细胞、特别是对细胞的活力、贴附、铺展、移动和/或分裂无有害作用的材料制成的膜。
所述膜可以是由聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚酯制成的半渗透膜。优选地，本发明的膜是聚碳酸酯膜。
本发明的膜可以进一步用涂层覆盖以促进细胞贴附。
涂层能包括生物分子或生物分子的衍生物：例如，聚合物，例如聚鸟氨酸或聚赖氨酸、肽或蛋白质；或者细胞外基质组分，例如，明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、糖胺聚糖、肽聚糖等。
涂层优选地覆盖膜的与细胞接触的整个表面。
涂层可以为半固体或凝胶形式，并且可以包含其它组分，例如生长因子。涂层可以是简单或复杂的生物分子混合物，并且可以模拟天然细胞外基质(ECM)或可以是天然细胞外基质(ECM)的复制品。特别地，涂层可以是由BD Biosciences销售的MatrigelTM基质。
本发明人还表明，可以通过特别是利用激光对只有尺寸小但密度高的孔隙结构的细胞培养膜进行穿孔以产生直径较大但密度低的孔，从而出乎意料地得到本发明的膜。
因此，本发明还涉及一种用于制造如上文所定义的膜的方法，该方法包括以下步骤：对用于细胞培养的单层膜进行穿孔以产生平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔，所述单层膜包括平均直径为0.1至1μm、密度为1×105至1×108个孔/cm2膜的孔。
优选地，本发明的制造方法包括以下步骤：
(a)提供用于细胞培养的单层膜，该单层膜包括平均直径为0.1至1μm、密度为1×105至1×108个孔/cm2膜的孔；和
(b)对所述膜进行穿孔以产生平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔。
优选地，已经存在于要进行穿孔步骤的膜中的孔、特别是步骤a)中提供的膜的孔的平均直径为0.2至0.9μm、优选地为0.3至0.8μm、优选地为0.4至0.7μm、0.4至0.6μm或0.4至0.5μm。最优选地，已经存在于要进行穿孔步骤的膜中的孔、特别是步骤a)中提供的膜的孔的平均直径为0.4μm。
优选地，已经存在于进行穿孔步骤的膜中的孔、特别是步骤a)中提供的膜的孔以2×105至9.5×107个孔/cm2膜的密度存在于膜中，优选地以3×105至9×107、4×105至8.5×107、5×105至8×107、6×105至7.5×107、7×105至7×107、8×105至6.5×107、9×105至6×107、1×106至5.5×107、2×106至5×107、3×106至4×107、4×106至3×107、5×106至2×107或6×106至1×107个孔/cm2膜的密度存在于膜中。最优选地，已经存在于进行穿孔步骤的膜中的孔、特别是步骤a)中提供的膜的孔以1×106至8.5×107个孔/cm2膜的密度存在于膜中。
在一个特别优选的实施方案中，进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜是用于细胞培养的单层膜，该膜以1×106至8.5×107个孔/cm2膜的密度包括平均直径为0.4μm的孔。
优选地，已经存在于进行穿孔步骤的膜中的孔、特别是步骤a)中提供的膜的孔穿过膜的厚度从一侧到另一侧。
进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜是单层膜。换言之，进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜由单层片状材料构成。
优选地，进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜的厚度为2μm至200μm。更优选地，进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜的厚度为5μm至100μm、优选地为5至50μm、优选地为8至25μm、更优选地为10μm至20μm、最优选地为11μm至15μm。
进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜优选地为如上文所定义的生物相容性膜。
进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜可以是由聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚酯制成的半渗透膜。优选地，进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜是聚碳酸酯膜。
如上所述，进行穿孔步骤的膜、特别是步骤a)中提供的膜可以进一步用涂层覆盖以促进细胞贴附。
优选地，通过激光穿孔对膜进行穿孔。
在此，术语“用激光穿孔”、“激光穿孔”或“用激光进行穿孔”意为借助于激光刺穿物体的动作。激光穿孔技术对于本领域技术人员而言是公知的，并且例如描述于Mielke等(2013)JLMN-Journal of Laser Micro/Nanoengineering 8：115-123中。
可以使用产生超短脉冲的飞秒型激光，其持续时间为约几飞秒至几百飞秒。
优选地，在本发明的制造方法中实施的用激光穿孔是激光微穿孔，更优选飞秒激光微穿孔。
通常，使用飞秒激光实施用激光穿孔，优选地使用优选地为约100纳焦耳/孔的单贝塞尔光束脉冲。
在本发明的制造方法中的穿孔步骤中形成的孔允许细胞迁移或细胞延伸部分通过所述膜。
优选地，在穿孔步骤中形成的孔的平均直径为2.5至11μm、优选地为3至10μm、3.5至9μm、4至8μm、4.5至7μm或5至6μm。最优选地，在穿孔步骤中形成的孔的平均直径为5μm。
如在上文中所指出的，在穿孔步骤中形成的孔的平均直径可由本领域技术人员根据寻求迁移通过膜的细胞的类型来选择。
优选地，在穿孔步骤中形成的孔在膜中、特别是步骤a)中提供的膜中以1×102至4.5×103个孔/cm2膜的密度穿孔，优选地以1.25×102至4×103、1.5×102至3×103、1.75×102至2×103、2×102至1.5×103、2.25×102至1×103、2.5×102至9.5×102、2.75×102至9×102、3×102至8.5×102、3.25×102至8×102、3.5×102至7.5×102、3.75×102至7×102、4×102至6.5×102、4.25×102至6×102、4.5×102至5.75×102、4.75×102至5.5×102或5×102至5.25×102个孔/cm2膜的密度穿孔。最优选地，在步骤b)中形成的孔在步骤a)中提供的膜中以2.5×102、5×102或1×103个孔/cm2膜的密度穿孔。
在一个特别优选的实施方案中，穿孔步骤由以下步骤构成：用激光对膜、特别是在步骤a)中提供的膜进行穿孔，以产生平均直径为3至8μm、优选地为5μm，密度为2.5×102至1×103个孔/cm2膜、优选地为2.5×102、5×102或1×103个孔/cm2膜的孔。
优选地，在穿孔步骤中形成的孔穿过膜的厚度从一侧到另一侧。
优选地，在穿孔步骤中形成的孔沿与最初存在于膜中的孔相同的方向取向。
当本发明的膜是细胞培养装置的一部分时，它对于细胞培养特别有用。
因此，本发明的目的还在于一种细胞培养装置，该细胞培养装置包括至少一个隔室，该至少一个隔室的至少一个壁包括本发明的膜或由本发明的膜构成。
术语“细胞培养装置”和“插入物”在此无差别地使用。
在此，术语“插入物”是指包括一个或多个槽或孔的支撑物，其可放置在容器中、通常放置在多孔培养板中。
优选地，本发明的细胞培养装置包括两个隔室，其中，所述壁包括分隔两个隔室的本发明的膜或由该膜构成。
插入物的底部优选地由本发明的膜构成，因此，该膜将由插入物的孔形成的隔室与插入物的第二隔室或由插入物放置在其中的容器形成的隔室分隔开。
插入物可以具有任何形状和任何尺寸。特别地，所述插入物的直径可以为3至80mm、4至75mm、4.26至70mm、4.5至65mm、5至60mm、5.5至55mm、6至50mm、6.5至45mm、7至40mm、7.5至35mm、8至30mm、8.5至25mm、9至24mm、9.5至23mm、10至22mm、11至21mm、12至20mm、13至19mm、14至18mm、15至17mm或15至16mm。
插入物可以被布置成定位在细胞培养板孔中而不与所述孔的底部接触。
插入物可以包括凸耳、钩或任何其他允许该插入物与细胞培养板孔的底部保持适当距离的构件。
因此，本发明还涉及用于制造本发明的细胞培养装置的方法，该方法包括由对细胞培养装置的单层膜进行穿孔以产生平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔的步骤构成的步骤，其中所述细胞培养装置包括至少一个隔室，所述至少一个隔室的至少一个壁包括该单层膜或者由该单层膜构成，该单层膜以1×105至1×108个孔/cm2膜的密度包括平均直径为0.1至1μm的孔。
优选地，本发明的细胞培养装置的制造方法包括以下步骤：
A)提供包括至少一个隔室的细胞培养装置，所述至少一个隔室的至少一个壁包括单层膜或者由该单层膜构成，该单层膜以1×105至1×108个孔/cm2膜的密度包括平均直径为0.1至1μm的孔，和
B)对所述膜进行穿孔以产生平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔。
要进行穿孔步骤的所述细胞培养装置的膜、特别是步骤A)中提供的装置的膜为如上文定义的在本发明的膜的制造方法中特别是步骤a)中提供的要进行穿孔步骤的膜。
优选地，其膜进行穿孔步骤的细胞培养装置、特别是步骤A)中提供的装置包括两个隔室，其中所述壁包括分隔两个隔室的所述膜或者由所述膜构成。
其膜进行穿孔步骤的细胞培养装置、特别是步骤A)中提供的装置通常可以是可商购的插入物，例如Nunc销售的具有0.5cm2或4cm2培养表面的细胞培养用插入物，或Corning销售的具有0.38cm2或1.2cm2培养表面的细胞培养用插入物。
优选地，通过用激光穿孔来对膜进行穿孔。
可以在与针对本发明的膜的制造方法和产生具有相同特征的孔的方法中的穿孔步骤所定义的相同条件下实施穿孔步骤。
本发明人已经表明，本发明的膜和细胞培养装置对于细胞培养特别有用，并且特别是对于细胞能够朝向所述膜或从所述膜循环产生重建的生物组织特别有用。
因此，本发明的目的还在于本发明的膜或本发明的细胞培养装置用于细胞培养的体外用途。
因此，本发明的目的还在于本发明的膜或本发明的细胞培养装置用于制备重建的生物组织的用途。
在此，术语“生物组织”是指任何相似细胞组及具有相同的来源、被分组为簇、网络或束的任何组。特别地，所述生物组织可以是上皮、结缔组织、肌肉或神经组织。优选地，生物组织是上皮组织。
它可以是来自任何人体器官的组织，例如表皮组织、真皮组织、心脏组织、肝组织、肾组织等。
因此，本发明还涉及重建的生物组织，该重建的生物组织在本发明的膜上包括至少一个细胞群(i)，该至少一个细胞群(i)包括至少一种第一细胞类型。
优选地，所述膜允许所述生物组织的某些细胞和/或某些细胞的细胞质延伸部分通过，特别是通过直径为2至12μm的孔。
优选地，细胞群(i)中所含的所述至少一种第一细胞类型由上皮细胞构成。
在此，术语“上皮细胞”是指作为上皮的一部分的任何细胞。
本发明的重建的生物组织的上皮细胞可以例如是表皮、阴道、口腔、肺、肠或角膜上皮细胞以及所有存在于这些上皮组织中的细胞。因此，本发明的重建的生物组织的细胞群(i)可以构成表皮、阴道、口腔、肺、肠或角膜上皮等同物。
在本发明的上下文中使用的上皮细胞优选地为上皮的细胞。将优先使用角化细胞。
细胞群(i)还可以包括除第一细胞类型之外的其他细胞类型，例如免疫细胞。
在一个特定实施方案中，所述细胞群(i)还包括免疫细胞。
在此，术语“免疫细胞”是指涉及生物体免疫应答的任何细胞。特别地，免疫细胞包括淋巴细胞，例如淋巴结淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的重建的生物组织包括：
-细胞群(i)，该细胞群(i)包括至少一种如上文所定义的第一细胞类型，和
-细胞群(ii)，该细胞群(ii)包括至少一种第二细胞类型，
其中，细胞群(i)和(ii)由本发明的膜分隔。
优选地，细胞群(ii)中所含的所述至少一种第二细胞类型由神经细胞构成。
在此，术语“神经细胞”是指涉及神经系统的任何细胞，包括神经胶质细胞。神经细胞尤其包括神经元，例如运动神经元、敏感神经元和关联神经元；星形胶质细胞；少突胶质细胞和施万细胞。优选地，包含在本发明的重建的组织中的神经细胞是具有细胞质延伸部分的神经细胞。
因此，在一个优选实施方案中，所述膜允许所述生物组织的细胞群(ii)的细胞质延伸部分，特别是由直径为2至12μm的孔，通过到细胞群(i)。
在另一个优选实施方案中，所述膜允许所述生物组织的细胞群(ii)的神经细胞的细胞质延伸部分，特别是由直径为2至12μm的孔，通过到细胞群(i)。
在一个特定实施方案中，本发明的重建的生物组织是重建的皮肤模型。
因此，在该特定实施方案中，重建的生物组织的细胞群(i)优选地构成表皮等同物。
在该表皮等同物(i)中，所述至少第一细胞类型由上皮细胞构成，所述上皮细胞优选为表皮细胞，特别是选自由角化细胞、黑素细胞及其混合物组成的组中的细胞。
优选地，表皮等同物(i)包含如上文所定义的免疫细胞，特别是朗格汉斯细胞和/或朗格汉斯细胞的前体。
优选地，这些朗格汉斯细胞位于表皮等同物(i)的上基部部分。
本发明的目的还在于一种用于在本发明的细胞培养装置中制备包含至少一种细胞类型的重建的生物组织的方法，该方法包括以下步骤：
a)在培养装置的隔室中接种待重建的组织的第一细胞类型，以允许所述第一细胞类型贴附至培养装置的膜，和
b)在适于进行组织的特征性细胞构建的条件下保持培养中的细胞一段时间。
在一个特定实施方案中，该方法用于制备包括至少两种细胞类型的重建的生物组织的方法，该方法包括以下步骤：
a1)在培养装置的隔室中接种待重建的组织的第一细胞类型，
a2)在使得细胞贴附至培养装置的膜所需的一段时间之后，接种第二种细胞类型，和
b)在适于进行组织的特征性细胞构建的条件下保持培养中的细胞一段时间。
优选地，待重建的组织的第一细胞类型是如上文所定义的上皮细胞。
在一个特定实施方案中，接种待重建的组织的第一细胞类型的步骤a)或a1)可以包括接种数种细胞类型，该数种细胞类型将构成第一组重建的生物组织。因此，在一个特定实施方案中，接种待重建的组织的第一细胞类型的步骤a)或a1)包括同时或连续接种数种类型的上皮细胞，优选地同时或连续接种角化细胞和黑素细胞。接种待重建的组织的第一细胞类型的步骤a)或a1)还可包括同时或连续接种如上文所定义的免疫细胞，特别是朗格汉斯细胞或朗格汉斯细胞的前体。
优选地，待重建的组织的第二细胞类型是神经细胞(例如上文所定义的)或免疫细胞(例如上文所定义的)。
在步骤b)中，在适于进行组织的特征性细胞构建的条件下将所接种的细胞保持培养一段时间，例如在37℃下于含有2至10％CO2的空气气氛中。
可以将本发明的重建的生物组织的所有细胞都放置在适合于维持和/或适合于组织的每种细胞类型的生长和/或增殖的培养基中培养。
许多可能适合于实施本发明的培养基可以在商业上获得。作为适于本发明的培养基的实例，可以提及达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、MCDB153或其他衍生品、最低必需培养基(MEM)、M199、RPMI1640或Iscove氏改良达尔伯克氏培养基(EDMEM)、Ham氏F-12、Ham氏F-10、NCTC 109和NCTC135。
这些培养基可以补充有常规地用于细胞培养的任何添加剂诸如，例如磷脂的前体、非必需氨基酸、核酸、维生素、抗生素、辅酶因子、矿物盐、胰岛素、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、乙醇胺、o-磷酰基-乙醇胺或生长因子。
通常用于补充细胞培养基的各种添加剂的浓度可由本领域技术人员特别地根据待培养细胞的类型来确定和调节。
此外，也可以使用各种培养基的混合物，特别是上述培养基的混合物，例如DMEM/Ham氏F-12混合物。
一般而言，可以在标准培养条件下，将本发明的重建的生物组织在培养条件下、在维持或存活条件下和/或在生长条件下和/或在细胞增殖条件下维持约5至24天的时间。
如上所述，适于获得重建的组织模型并允许细胞循环的膜的使用特别适合于实施对可能调节人组织(例如，上皮)的炎性或免疫反应的化合物的筛选或鉴定测定。
适于获得重建的组织模型并允许细胞质延伸部分通过的膜的用途也特别适于实施对可能通过与存在于组织中的神经末梢相互作用来调节人组织的感觉反应的化合物的筛选或鉴定测试。
因此，本发明的目的还在于本发明的重建的生物组织用于筛选或鉴定可能调节生物组织、特别是上皮的涉及免疫细胞的活化和迁移的炎性反应的试剂的用途或者用于筛选可能通过与存在于组织中的神经末梢相互作用调节生物组织的感觉反应的试剂的用途。
本发明的目的还在于用于筛选可能调节生物组织、特别是上皮的涉及免疫细胞的活化和迁移的炎性反应的试剂的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)在存在显示出涉及免疫细胞的活化和迁移的炎性反应的本发明的重建的生物组织的情况下将待筛选的试剂放置于该重建的生物组织中，
b)确定重建的生物组织中免疫细胞的活化和迁移的可能变化，并且
c)如果在步骤b)中确定了变化，则由此推断待筛选的试剂是可能调节组织(特别是上皮)的涉及免疫细胞的活化和迁移的炎性反应的试剂。
优选地，在这些实施方案中，重建的生物组织的膜允许免疫细胞从重建的生物组织通过，特别是通过如上所定义的直径为2至12μm的孔，到另一隔室反之亦然。
优选地，显示出涉及免疫细胞的活化和迁移的炎性反应的重建的生物组织是如上文所定义的重建的皮肤模型，其为炎症模型，特别是通过参与炎性反应的细胞、特别是免疫细胞定殖所得的上文所定义的重建的皮肤模型，所述免疫细胞例如为淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞。
本发明的目的还在于用于筛选可能通过与存在于生物组织、特别是上皮中的神经末梢相互作用来调节所述组织的感觉反应的试剂的体外方法，该方法包括以下步骤：
a)在存在本发明的重建的生物组织的情况下放置待筛选的试剂，所述重建生物组织包括细胞群(i)和细胞群(ii)，所述细胞群(i)包括至少一种第一细胞类型，所述细胞群(ii)包括神经细胞，所述细胞群(i)和细胞群(ii)由本发明的膜分隔，所述膜允许细胞群(ii)的神经细胞的细胞质延伸部分通过到细胞群(i)的通过，
b)通过测量神经细胞中的电活动和/或由神经细胞释放的物质P，确定重建的生物组织中神经细胞活性的可能变化，以及
c)如果在步骤b)中确定了变化，则由此推断待筛选的试剂是可能通过与存在于组织、特别是上皮中的神经末梢相互作用来调节所述组织的感觉反应的试剂。
优选地，在存在重建的生物组织的情况下于有助于与所述组织相互作用的条件下放置待筛选的试剂，特别是通过与培养的至少一种细胞类型和/或与所述细胞的至少一种培养基相接触，特别是放置在插入物和/或孔中。
在下文中，将通过附图和实施例对本发明进行更详细的说明。
附图说明
图1：Nunc插入物的聚碳酸酯膜的光学显微镜照片，该聚碳酸酯膜具有高密度的0.4μm的孔，其中添加了低密度的5μm的孔。
图2：在只有0.4μm的多孔结构的常规膜上或在添加了5μm的孔的膜上重建的表皮的组织切片的照片。
实施例
实施例1：制造本发明的膜和插入物
本发明人已经表明，可以使用市场上用于细胞培养和组织重建的工业插入物来制造具有两种或更多种不同直径的孔的系统。
利用激光穿孔技术对Nunc插入物(Cat N°140700)进行穿孔以产生直径为5μm、密度为250、500和1000个孔/cm2的孔，所述Nunc插入物包括0.5cm2且厚度为11μm的聚碳酸酯膜，该聚碳酸酯膜具有0.4μm的密度为<0.85×108个孔/cm2膜的孔(图1)。
这些孔更精确地通过使用飞秒型激光以约100纳焦耳/孔的单贝塞尔光束脉冲产生。
实施例2：在本发明的膜上重建组织
使用用于重建人上皮模型的常规技术，本发明人在实施例1的膜上重建了具有与标准RHE skinethic模型等同的形态(组织学)和功能(细胞活力、屏障功能)特征的重建的人表皮(RHE)(图2)。
在用角化细胞接种插入物后，将插入物直接放置于气-液界面处并且持续重建17天而不更换培养基。
本发明人使用了两种类型的膜：其中直径为5μm的孔均匀地分布在膜的整个表面上的膜，和其中直径为5μm的孔非均匀地分布在膜上的膜。
此外，还对直径为5μm的孔的数个密度进行了测试：250个孔/cm2、500个孔/cm2和1000个孔/cm2。
将在这些膜上获得的RHE模型与在只有直径为0.4μm的孔的标准膜上制备的RHE模型进行比较。
在本发明的膜上获得的RHE模型具有与在标准膜上获得的RHE模型相同的表皮形态学特征(基底层、棘状层、颗粒状层和角质层)。然而，在本发明的膜上获得的RHE模型具有允许细胞和/或细胞质延伸部分通过膜的额外优点，该通过对于标准膜而言是不可能的。
在该实施例中，在该RHE模型的聚碳酸酯膜中直径为5μm的孔的存在实际上允许细胞从下部隔室到上部隔室的通过，以模拟淋巴囊肿侵袭的过程，例如在某些炎性皮肤障碍中观察到的那些。

Claims (13)

1.用于细胞培养的单层膜，所述单层膜包括至少两种类型的孔：
(i)平均直径为0.1至1μm、密度为1×105至1×108个孔/cm2膜的孔；和
(ii)平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔，
这两种类型的孔从一侧到另一侧穿过所述膜的厚度。
2.根据权利要求1所述的单层膜，其中，所述两种类型的孔沿相同的方向取向。
3.根据权利要求1或2所述的单层膜，所述膜是聚碳酸酯膜。
4.用于制造根据权利要求1至3中任一项所述的膜的方法，包括如下步骤：由对用于细胞培养的单层膜进行穿孔的步骤组成的步骤，以产生平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔，其中所述单层膜包括平均直径为0.1至1μm、密度为1×105至1×108个孔/cm2膜的孔。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，通过激光穿孔对所述膜进行穿孔。
6.一种细胞培养装置，所述细胞培养装置包括至少一个隔室，所述至少一个隔室的至少一个壁包括根据权利要求1至3中任一项所述的膜或由根据权利要求1至3中任一项所述的膜构成。
7.根据权利要求6所述的装置，所述装置包括两个隔室，并且所述壁包括分隔所述两个隔室的所述膜或者由分隔所述两个隔室的所述膜构成。
8.一种用于制造根据权利要求6或7所述的细胞培养装置的方法，包括如下步骤：由对用于细胞培养的所述单层膜进行穿孔的步骤组成的步骤，以产生平均直径为2至12μm、密度为0.5×102至5×103个孔/cm2膜的孔，其中所述细胞培养装置包括至少一个隔室，所述至少一个隔室的所述壁中的至少一个包括膜或者由膜构成，所述膜包括平均直径为0.1至1μm、密度为1×105至1×108个孔/cm2膜的孔。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的膜或根据权利要求6或7所述的装置用于细胞培养的体外用途。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的膜或根据权利要求6或7所述的装置用于制备重建的生物组织的用途。
11.一种重建的生物组织，所述重建的生物组织在根据权利要求1至3中任一项所述的膜上包括至少一个细胞群(i)，所述至少一个细胞群(i)包括至少一种第一细胞类型。
12.一种用于在根据权利要求6或7所述的细胞培养装置中制备包括至少一种细胞类型的重建的生物组织的方法，包括以下步骤：
a)在所述培养装置的隔室中接种待重建的组织的第一细胞类型，以允许所述第一细胞类型粘附至所述培养装置的所述膜，和
b)在适于进行所述组织的特征性细胞构建的条件下保持培养中的细胞一段时间。
13.根据权利要求11所述的重建的生物组织用于筛选可能调节组织的涉及免疫细胞的活化和迁移的炎性反应的试剂或用于筛选可能通过与存在于组织中神经末梢相互作用来调节所述组织的感觉反应的试剂的用途。
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