JP6698844B2 - いくつかの直径の細孔を含む再構築された組織のための膜 - Google Patents
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Description
本発明は、再構築された生体組織の調製のために適合された、細胞培養のための膜及びデバイスに関する。
研究、特に安全性又は有効性試験に応用するための組織工学は、1つ又は複数の細胞型を含むヒト又は動物組織の再構築に基づく。これらの組織は、ほとんどの場合、培地中及び規定条件(適合された培地組成、制御された温度、及びpH条件)下での播種及び培養後に、細胞培養のためのインサート又はデバイス内で再構築される。
今日、これらの3D組織再構築システムは、細胞の沈着のための支持体として使用される膜を使用する。その製造技術に固有の制約のため、特にポリカーボネート及び他の化学ポリマーで作られた膜に関しては、市場の膜の全てが、ただ1つの孔径で提案されている。
したがって、3D組織再構築システムに使用されている膜のほとんどが、下部区画から上部区画への栄養培地の拡散を可能にするように定義された、単一径の細孔を有する膜を使用している。
更に、細胞遊走アッセイにおいて1つの区画から別の区画への細胞の遊走を可能にするように定義された、単一径の細孔を有する膜が存在する。しかしながら、この単一径の細孔は、再構築されたヒト表皮モデル等の組織モデルの再構築との適合性がない。
しかしながら、培養デバイスの下部及び上部区画間の細胞の循環又は異なる区画間の細胞質突起の通過が非常に有用でありうる、再構築されたヒト又は動物組織モデルの多くの応用形態が存在する。
Mielkeら(2013) JLMN-Journal of Laser Micro/Nanoengineering 8:115〜123頁
したがって、炎症機構の研究に使用されている再構築されたヒト表皮(RHE)モデルは、リンパ球細胞の非存在によって制限されているため、ほとんどの炎症性皮膚症(アトピー性皮膚炎、乾癬、ループス・・・)を代表するものではない。したがって、慢性炎症の研究により適したモデル、特に、生物の炎症反応に関与する細胞による再構築された上皮のコロニー形成を許可するモデルの必要性が存在する。
同様に、ランゲルハンス細胞等の免疫担当細胞のいくつかの細胞型を組み込んだ、いくつかの再構築された動物又はヒト上皮において、これらの細胞の活性化及びそれらの表皮外への遊走を、それが感作機構においてインビボで起こるように再現することが可能になれば興味深いであろう。
最後に、ヒト又は動物の上皮は、神経細胞の細胞体を含むことは稀であり、むしろ多くの場合は神経終末によって神経支配されている。したがって、細胞体が別々の区画内に位置する樹状突起によって神経支配された3D上皮再構築モデルがあれば興味深いであろう。
したがって、異なる区画間の細胞の循環又は細胞質突起の通過が可能な再構築された組織モデルの調製を可能にする、細胞培養デバイスの大きな必要性が存在する。
本発明は、この必要性を満たす。
実際に、本発明者らは、驚くべきことに、
- 再構築された組織モデルを得るように培養細胞の支持及び栄養摂取を可能にする、小さなサイズだが高密度の多孔性と、
- 1つの区画から別の区画へのいくつかの細胞型の循環及び細胞質突起の通過を可能にする、大きなサイズだが低密度の多孔性と
の2種類の多孔性を含む膜の製造が可能であることを示した。
- 再構築された組織モデルを得るように培養細胞の支持及び栄養摂取を可能にする、小さなサイズだが高密度の多孔性と、
- 1つの区画から別の区画へのいくつかの細胞型の循環及び細胞質突起の通過を可能にする、大きなサイズだが低密度の多孔性と
の2種類の多孔性を含む膜の製造が可能であることを示した。
本発明者らは、そのような膜が、様々な区画間の細胞の循環又は細胞質突起の通過が可能な再構築された組織モデルを得るのに完全に適していたことを示した。
したがって本発明は、少なくとも2種類の細孔を含む細胞培養のための単層膜であって、
(i)膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔と、
(ii)膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12の間の平均直径を有する細孔と
を含み、2種類の細孔が、膜の厚さを一方の面から反対側まで貫通している、単層膜を目的とする。
(i)膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔と、
(ii)膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12の間の平均直径を有する細孔と
を含み、2種類の細孔が、膜の厚さを一方の面から反対側まで貫通している、単層膜を目的とする。
0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔(i)は、典型的には、膜の一方の面から反対側への栄養培地の拡散を可能にする。
好ましくは、細孔(i)は、0.2から0.9μmの間、好ましくは0.3から0.8μmの間、好ましくは0.4から0.7μmの間、0.4から0.6μmの間、又は0.4から0.5μmの間の平均直径を有する。最も好ましくは、細孔(i)は、0.4μmの平均直径を有する。
好ましくは、細孔(i)は、膜1cm2当たり細孔2×105個から9.5×107個の間、好ましくは膜1cm2当たり細孔3×105個から9×107個の間、4×105個から8.5×107個の間、5×105個から8×107個の間、6×105個から7.5×107個の間、7×105個から7×107個の間、8×105個から6.5×107個の間、9×105個から6×107個の間、1×106個から5.5×107個の間、2×106個から5×107個の間、3×106個から4×107個の間、4×106個から3×107個の間、5×106個から2×107個の間、又は6×106個から1×107個の間の密度で、本発明による膜に存在する。最も好ましくは、細孔(i)は、膜1cm2当たり細孔1×106個から8.5×107個の密度で、本発明による膜に存在する。
2から12μmの間の平均直径を有する細孔(ii)は、典型的には、膜を通した、細胞、特に免疫細胞の遊走、又は、細胞突起、特に神経突起の通過を可能にする。
好ましくは、細孔(ii)は、2.5から11μmの間、好ましくは3から10μmの間、3.5から9μmの間、4から8μmの間、4.5から7μmの間、又は5から6μmの間の平均直径を有する。最も好ましくは、細孔(ii)は、5μmの平均直径を有する。
細孔(ii)の好ましい平均直径は、膜を通した遊走が求められる細胞の種類に従って、当業者によって選択されてよい。例えば、遊走が求められる細胞がアストロサイトであるとき、細孔(ii)の平均直径は、好ましくは12μmである。遊走が求められる細胞が白血球、好中球、及び/又は神経細胞であるとき、細孔(ii)の平均直径は、好ましくは3μmである。遊走が求められる細胞がリンパ球、マクロファージ、単球、及び/又は樹状細胞であるとき、細孔(ii)の平均直径は、好ましくは5μmである。遊走が求められる細胞が内皮系細胞、上皮系細胞、及び/又は線維芽細胞であるとき、細孔(ii)の平均直径は、好ましくは8μmである。
好ましくは、細孔(ii)は、膜1cm2当たり細孔1×102個から4.5×103個の間、好ましくは膜1cm2当たり細孔1.25×102個から4×103個の間、1.5×102個から3×103個の間、1.75×102個から2×103個の間、2×102個から1.5×103個の間、2.25×102個から1×103個の間、2.5×102個から9.5×102個の間、2.75×102個から9×102個の間、3×102個から8.5×102個の間、3.25×102個から8×102個の間、3.5×102個から7.5×102個の間、3.75×102個から7×102個の間、4×102個から6.5×102個の間、4.25×102個から6×102個の間、4,5×102個から5.75×102個の間、4.75×102個から5.5×102個の間、又は5×102個から5.25×102個の間の密度で、本発明による膜に存在する。最も好ましくは、細孔(ii)は、膜1cm2当たり細孔2.5×102個、5×102個、又は1×103個の密度で、本発明による膜に存在する。
特定の実施形態において、細孔(ii)は、膜の全表面にわたって均一に分布している。
別の特定の実施形態では、細孔(ii)は、膜の表面にわたって不均一に分布している。
好ましくは、(i)及び(ii)の2種類は、同じ方向を向いている。
特に好ましい実施形態において、本発明による膜は、少なくとも2種類の細孔を含む細胞培養のための単層膜であって、
(i)膜1cm2当たり細孔1×106〜8.5×107個の密度で0.4μmの平均直径を有する細孔と、
(ii)膜1cm2当たり細孔2.5×102〜1×103個の密度、好ましくは膜1cm2当たり2.5×102、5×102、又は1×103の密度で、2から12μmの間、好ましくは5μmの平均直径を有する細孔と
を含み、2種類の細孔が、膜の厚さを一方の面から反対側まで貫通しており、同じ方向を向いている、単層膜である。
(i)膜1cm2当たり細孔1×106〜8.5×107個の密度で0.4μmの平均直径を有する細孔と、
(ii)膜1cm2当たり細孔2.5×102〜1×103個の密度、好ましくは膜1cm2当たり2.5×102、5×102、又は1×103の密度で、2から12μmの間、好ましくは5μmの平均直径を有する細孔と
を含み、2種類の細孔が、膜の厚さを一方の面から反対側まで貫通しており、同じ方向を向いている、単層膜である。
本発明による膜の細孔(i)及び(ii)は、膜の厚さを貫通している。したがって、細孔は、膜の一方の面に位置する要素と膜の反対の面に位置する要素との間に通路を作る。
本発明による膜の細孔(i)及び(ii)は、更に、好ましくは同じ方向を向いている。その結果、本発明による膜の細孔(i)及び(ii)は、好ましくは、互いに対して実質的に平行である通路を形成する。したがって、本発明による膜の細孔(i)及び(ii)は、相互接続していないことが好ましい。
本発明による膜は、単層膜である。言い換えると、本発明による膜は、物質の単一の層又はシートから構成されている。
好ましくは、本発明による膜は、2μmから200μmの間の厚さを有する。より好ましくは、本発明による膜は、5μmから100μmの間、好ましくは5から50μmの間、好ましくは8から25μmの間、より好ましくは10μmから20μmの間、最も好ましくは11μmから15μmの間の厚さを有する。
本発明による膜は、好ましくは生体適合膜である。
本明細書における「生体適合膜」という用語は、細胞に、特に細胞の生存能、接着、拡散、移動性、成長、及び/又は分裂に有害作用を及ぼさない物質で作られている膜を意味する。
膜は、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート(PET)、又はポリエステルの半透性膜であってもよい。好ましくは、本発明による膜は、ポリカーボネート膜である。
本発明による膜は、細胞接着を促進するためにコーティングで更に覆われていてもよい。
コーティングは、生体分子又は生体分子の誘導体、例えばポリマー、例えばポリオルニチン若しくはポリリジン、ペプチド若しくはタンパク質、又は細胞外マトリックス成分、例えばゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ペプチドグリカン等を含みうる。
コーティングは、細胞に接触している膜の全表面を覆うことが好ましい。
コーティングは半固体又はゲル形態であってもよく、成長因子等の追加の成分を含んでいてもよい。コーティングは、生体分子の単純混合物であっても複合混合物であってもよく、天然の細胞外マトリックス(ECM)を模倣しても、その複製物であってもよい。特に、コーティングは、BD Biosciences社により販売されているMatrigel(商標)マトリックスとすることができる。
本発明者らは更に、本発明による膜が、驚くべきことに、小さなサイズだが高密度の多孔性のみを有する細胞培養膜を、より大きな直径を有するが低密度における細孔を生成するように、特にレーザーを用いて穿孔することによって得られうることを示した。
したがって本発明は、本明細書上記に定義された膜を製造する方法であって、膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む細胞培養のための単層膜を、膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように穿孔することからなる工程を含む方法にも関する。
好ましくは、本発明による製造方法は、
(a)膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む細胞培養のための単層膜を準備する工程と、
(b)膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように前記膜を穿孔する工程と
を含む。
(a)膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む細胞培養のための単層膜を準備する工程と、
(b)膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように前記膜を穿孔する工程と
を含む。
好ましくは、穿孔の工程に供される膜に既に存在する細孔、特に工程a)において準備された膜の細孔は、0.2から0.9μmの間、好ましくは0.3から0.8μmの間、好ましくは0.4から0.7μmの間、0.4から0.6μmの間、又は0.4から0.5μmの間の平均直径を有する。最も好ましくは、穿孔の工程に供される膜に既に存在する細孔、特に工程a)において準備された膜の細孔は、0.4μmの平均直径を有する。
好ましくは、穿孔の工程に供される膜に既に存在する細孔、特に工程a)において準備された膜の細孔は、膜1cm2当たり細孔2×105個から9.5×107個の間、好ましくは膜1cm2当たり細孔3×105個から9×107個の間、4×105個から8.5×107個の間、5×105個から8×107個の間、6×105個から7.5×107個の間、7×105個から7×107個の間、8×105個から6.5×107個の間、9×105個から6×107個の間、1×106個から5.5×107個の間、2×106個から5×107個の間、3×106個から4×107個の間、4×106個から3×107個の間、5×106個から2×107個の間、又は6×106個から1×107個の間の密度で、膜に存在する。最も好ましくは、穿孔の工程に供される膜に既に存在する細孔、特に工程a)において準備された膜の細孔は、膜1cm2当たり細孔1×106個から8.5×107個の密度で、膜に存在する。
特に好ましい実施形態において、穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、膜1cm2当たり細孔1×106〜8.5×107個の密度で0.4μmの平均直径を有する細孔を含む細胞培養のための単層膜である。
好ましくは、穿孔の工程に供される膜に既に存在する細孔、特に工程a)において準備された膜の細孔は、膜の厚さを一方の面から反対側まで貫通している。
穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、単層膜である。言い換えると、穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、物質の単一の層又はシートから構成されている。
好ましくは、穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、2μmから200μmの間の厚さを有する。より好ましくは、穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、5μmから100μmの間、好ましくは5から50μmの間、好ましくは8から25μmの間、より好ましくは10μmから20μmの間、最も好ましくは11μmから15μmの間の厚さを有する。
穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、好ましくは、本明細書上記に定義された生体適合膜である。
穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート(PET)、又はポリエステルの半透性膜であってもよい。好ましくは、穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、ポリカーボネート膜である。
穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜は、本明細書上記に定義されているように、細胞接着を促進するためにコーティングで更に覆われていてもよい。
好ましくは、膜は、レーザー穿孔によって穿孔される。
本明細書における「レーザーを用いた穿孔」、「レーザー穿孔」、又は「レーザーで穿孔する」という用語は、レーザーの手段によって物体に穴を開ける行為を意味する。レーザー穿孔の技術は当業者に周知であり、例えば、Mielkeら(2013) JLMN-Journal of Laser Micro/Nanoengineering 8:115〜123頁に記載されている。
持続時間がおよそ数フェムト秒から数百フェムト秒の超短パルスを生成するフェムト秒型のレーザーを使用することができる。
好ましくは、本発明による製造の方法において実施されるレーザーを用いた穿孔は、レーザーを用いた微小穿孔、より好ましくはフェムト秒レーザー微小穿孔である。
典型的には、レーザーを用いた穿孔は、好ましくは孔1つ当たり約100ナノジュールの、好ましくは単一のベッセルビームパルスを有する、フェムト秒レーザーを使用して実施される。
本発明による製造方法の穿孔の工程において形成される細孔は、膜を通した細胞の遊走又は細胞突起の通過を可能にする。
好ましくは、穿孔の工程において形成される細孔は、2.5から11μmの間、好ましくは3から10μmの間、3.5から9μmの間、4から8μmの間、4.5から7μmの間、又は5から6μmの間の平均直径を有する。最も好ましくは、穿孔の工程において形成される細孔は、5μmの平均直径を有する。
穿孔の工程において形成される細孔の平均直径は、本明細書上記に示されるように、膜を通した遊走が求められる細胞の種類に従って、当業者によって選択されてよい。
好ましくは、穿孔の工程において形成される細孔は、膜1cm2当たり細孔1×102個から4.5×103個の間、好ましくは膜1cm2当たり細孔1.25×102個から4×103個の間、1.5×102個から3×103個の間、1.75×102個から2×103個の間、2×102個から1.5×103個の間、2.25×102個から1×103個の間、2.5×102個から9.5×102個の間、2.75×102個から9×102個の間、3×102個から8.5×102個の間、3.25×102個から8×102個の間、3.5×102個から7.5×102個の間、3.75×102個から7×102個の間、4×102個から6.5×102個の間、4.25×102個から6×102個の間、4,5×102個から5.75×102個の間、4.75×102個から5.5×102個の間、又は5×102個から5.25×102個の間の密度で、特に工程a)において準備された特定の膜に穿孔される。最も好ましくは、工程b)において形成される細孔は、膜1cm2当たり細孔2.5×102個、5×102個、又は1×103個の密度で、工程a)において準備された膜に穿孔される。
特に好ましい実施形態において、穿孔の工程は、工程a)において準備された特定の膜を、膜1cm2当たり細孔2.5×102〜1×103個の密度、好ましくは膜1cm2当たり2.5×102個、5×102個、又は1×103個の密度で、3から8μmの間、好ましくは5μmの平均直径を有する細孔を生成するように、レーザーで穿孔することからなる。
好ましくは、穿孔の工程において形成された細孔は、膜の厚さを一方の面から反対側まで貫通している。
好ましくは、穿孔の工程において形成された細孔は、膜に最初に存在する細孔と同じ方向を向いている。
本発明による膜は、それが細胞培養デバイスの一部であるとき、細胞培養に特に有用である。
したがって本発明は、壁部のうちの少なくとも1つが本発明による膜を含むか又はそれによって構成されている少なくとも1つの区画を含む細胞培養デバイスも目的とする。
「細胞培養デバイス」及び「インサート」という用語は、本明細書では無差別に使用される。
本明細書における「インサート」という用語は、容器内、典型的にはマルチウェル培養プレート内に入れることのできる、1つ若しくは複数のトラフ又はウェルを含む支持体を意味する。
好ましくは、本発明による細胞培養デバイスは、2つの区画を含み、その壁部は、2つの区画を分離する本発明による膜を含むか又はそれによって構成されている。
インサートの基部は、好ましくは、本発明による膜によって構成されており、したがってこの膜は、インサートのウェルによって形成された区画と、インサートの第2の区画又はインサートが入れられる容器によって形成された区画とを分離する。
インサートは、任意の形状及び任意のサイズであってよい。インサートは、特に、3から80mmの間、4から75mmの間、4.26から70mmの間、4.5から65mmの間、5から60mmの間、5.5から55mmの間、6から50mmの間、6.5から45mmの間、7から40mmの間、7.5から35mmの間、8から30mmの間、8.5から25mmの間、9から24mmの間、9.5から23mmの間、10から22mmの間、11から21mmの間、12から20mmの間、13から19mmの間、14から18mmの間、15から17mmの間、又は15から16mmの間の直径を有することができる。
インサートは、細胞培養プレートのウェル内に、前記ウェルの底部と接触することがない形で位置するように配置されてもよい。
インサートは、突出部、フック、又はインサートを細胞培養プレートのウェルの底部から好適な距離に維持することを可能にする任意の他の手段を含んでいてもよい。
したがって本発明は、本発明による細胞培養デバイスを製造する方法であって、壁部のうちの少なくとも1つが膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む単層膜を含むか又はそれによって構成されている少なくとも1つの区画を含む細胞培養デバイスの単層膜を、膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように穿孔することからなる工程を含む方法にも関する。
好ましくは、本発明による細胞培養デバイスの製造方法は、
A) 壁部のうちの少なくとも1つが膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む単層膜を含むか又はそれによって構成されている少なくとも1つの区画を含む細胞培養デバイスを準備する工程と、
B) 膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように前記膜を穿孔する工程と
を含む。
A) 壁部のうちの少なくとも1つが膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む単層膜を含むか又はそれによって構成されている少なくとも1つの区画を含む細胞培養デバイスを準備する工程と、
B) 膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように前記膜を穿孔する工程と
を含む。
穿孔の工程に供される細胞培養デバイスの、特に工程A)において準備されたデバイスの膜は、本発明による膜の製造方法の穿孔の工程に供される膜、特に工程a)において準備された膜について本明細書上記に定義されたとおりである。
好ましくは、膜が穿孔の工程に供される細胞培養デバイス、特に工程A)において準備されたデバイスは、2つの区画を含み、その壁部は、2つの区画を分離する前記膜を含むか又はそれによって構成されている。
膜が穿孔の工程に供される細胞培養デバイス、特に工程A)において準備されたデバイスは、典型的には、市販のインサート、例えば、Nunc社によって販売されている培養表面が0.5cm2若しくは4cm2の細胞培養のためのインサート、又はCorning社によって販売されている培養表面が0.38cm2若しくは1.2cm2の細胞培養のためのインサートとすることができる。
好ましくは、膜は、レーザーを用いた穿孔によって穿孔される。
穿孔の工程は、本発明による膜を製造するため、及び同じ特徴を有する細孔を生成するための方法の、穿孔の工程について定義された条件と同じ条件で実施することができる。
本発明者らは、本発明による膜及び細胞培養デバイスが、細胞培養のため、そして特に、それを通して細胞が循環することのできる再構築された生体組織を生成するために、特に有用であったことを示した。
したがって本発明は、細胞培養のための、本発明による膜又は本発明による細胞培養デバイスのインビトロ使用も目的とする。
したがって本発明は、再構築された生体組織の調製のための、本発明による膜又は本発明による細胞培養デバイスの使用も目的とする。
本明細書における「生体組織」という用語は、クラスター、ネットワーク、又はビームにグループ分けされた、同様かつ同起源の任意の細胞セットを意味する。生体組織は、特に、上皮系組織、結合組織、筋組織、又は神経組織でありうる。生体組織は、好ましくは、上皮系組織である。
これは、表皮組織、真皮組織、心臓組織、肝組織、腎組織等、いかなるヒト臓器由来の組織であってもよい。
このように、本発明は、本発明による膜上に、少なくとも1つの第1の細胞型を含む少なくとも1つの細胞群(i)を含む、再構築された生体組織にも関する。
好ましくは、前記膜は、特に2から12μmの間の直径の細孔を通した、前記生体組織のある特定の細胞及び/又はある特定の細胞の細胞質突起の通過を可能にする。
好ましくは、細胞群(i)に含まれる前記少なくとも1つの第1の細胞型は、上皮細胞から構成されている。
本明細書における「上皮細胞」という用語は、上皮の一部であるあらゆる細胞を意味する。
本発明による再構築された生体組織の上皮細胞は、例えば、表皮、膣、口腔、肺、腸、又は角膜の上皮の細胞、並びにこれらの上皮系組織内に存在する全ての細胞でありうる。したがって、本発明による再構築された生体組織の細胞群(i)は、表皮、膣、口腔、肺、腸、又は角膜の上皮等価物を構成しうる。
本発明の文脈で使用される上皮細胞は、好ましくは上皮系細胞である。ケラチノサイトが優先的に使用される。
細胞群(i)は、免疫細胞等、第1の細胞型以外の細胞型を更に含みうる。
特定の実施形態において、前記細胞群(i)は、免疫細胞を更に含む。
本明細書における「免疫細胞」という用語は、生物の免疫反応に関与するあらゆる細胞を指す。免疫細胞としては、特に、リンパ球、例えばリンパ節リンパ球、白血球、マクロファージ、単球、樹状細胞、及びランゲルハンス細胞が挙げられる。
本発明の好ましい実施形態において、本発明による再構築された生体組織は、
- 本明細書上記に定義された少なくとも1つの第1の細胞型を含む細胞群(i)と、
- 少なくとも1つの第2の細胞型を含む細胞群(ii)と
を含み、細胞群(i)及び(ii)は、本発明による膜によって分離されている。
- 本明細書上記に定義された少なくとも1つの第1の細胞型を含む細胞群(i)と、
- 少なくとも1つの第2の細胞型を含む細胞群(ii)と
を含み、細胞群(i)及び(ii)は、本発明による膜によって分離されている。
好ましくは、細胞群(ii)に含まれる前記少なくとも1つの第2の細胞型は、神経細胞から構成されている。
「神経細胞」という用語は、本明細書では、グリア細胞を含め、神経系に関与するあらゆる細胞を指す。神経細胞としては、特にニューロン、とりわけ運動ニューロン、感受性ニューロン、及び連合ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びシュワン細胞が挙げられる。好ましくは、本発明による再構築された組織に含まれる神経細胞は、細胞質突起を含む神経細胞である。
したがって、好ましい実施形態において、前記膜は、特に直径2〜12μmの細孔を通した、細胞群(i)に対する前記生体組織の細胞群(ii)の細胞質突起の通過を可能にする。
別の好ましい実施形態において、前記膜は、特に直径2〜12μmの細孔を通した、細胞群(i)に対する前記生体組織の細胞群(ii)の神経細胞の細胞質突起の通過を可能にする。
特定の実施形態において、本発明による再構築された生体組織は、再構築された皮膚モデルである。
したがって、この特定の実施形態では、再構築された生体組織の細胞群(i)は、好ましくは、表皮等価物を構成する。
この表皮等価物(i)において、前記少なくとも第1の細胞型は、上皮細胞、好ましくは表皮細胞、特に、ケラチノサイト、メラノサイト、及びそれらの混合物からなる群から選択される細胞から構成されている。
好ましくは、表皮等価物(i)は、本明細書上記に定義されているように、免疫細胞、特にランゲルハンス細胞及び/又はランゲルハンス細胞の前駆体を含む。
好ましくは、これらのランゲルハンス細胞は、表皮等価物(i)の基底上部分内に位置する。
本発明は、本発明による細胞培養デバイスにおいて、少なくとも1つの細胞型を含む再構築された生体組織を調製する方法であって、
a)培養デバイスの区画に、再構築される組織の第1の細胞型を、培養デバイスの膜にそれが接着することを可能にするように播種する工程と、
b)組織の特徴的な細胞構成を可能にするのに好適な期間及び条件で、細胞を培養下に維持する工程と
を含む方法も目的とする。
a)培養デバイスの区画に、再構築される組織の第1の細胞型を、培養デバイスの膜にそれが接着することを可能にするように播種する工程と、
b)組織の特徴的な細胞構成を可能にするのに好適な期間及び条件で、細胞を培養下に維持する工程と
を含む方法も目的とする。
特定の実施形態において、本方法は、少なくとも2つの細胞型を含む再構築された生体組織を調製するためのものであり、
a1)培養デバイスの区画に、再構築される組織の第1の細胞型を播種する工程と、
a2)培養デバイスの膜への細胞の接着を可能にするために必要な期間の後、第2の細胞型を播種する工程と、
b)組織の特徴的な細胞構成を可能にするのに好適な期間及び条件で、細胞を培養下に維持する工程と
を含む。
a1)培養デバイスの区画に、再構築される組織の第1の細胞型を播種する工程と、
a2)培養デバイスの膜への細胞の接着を可能にするために必要な期間の後、第2の細胞型を播種する工程と、
b)組織の特徴的な細胞構成を可能にするのに好適な期間及び条件で、細胞を培養下に維持する工程と
を含む。
好ましくは、再構築される組織の第1の細胞型は、本明細書上記に定義された上皮細胞である。
特定の実施形態において、再構築される組織の第1の細胞型を播種する工程a)又はa1)は、第1の再構築された生体組織セットを構成する、いくつかの細胞型の播種を含みうる。したがって、特定の実施形態において、再構築される組織の第1の細胞型を播種する工程a)又はa1)は、いくつかの種類の上皮細胞の同時又は連続的播種、好ましくはケラチノサイト及びメラノサイトの同時又は連続的播種を含む。再構築される組織の第1の細胞型を播種する工程a)又はa1)は、本明細書上記に定義された免疫細胞、特にランゲルハンス細胞又はランゲルハンス細胞の前駆体の同時又は連続的播種を更に含んでもよい。
好ましくは、再構築される組織の第2の細胞型は、本明細書上記に定義されたような神経細胞、又は本明細書上記に定義されたような免疫細胞である。
播種された細胞は、工程b)において、組織の特徴的な細胞構成を可能にするのに好適な期間及び条件で、例えば、37℃で2〜10%のCO2を含む空気の雰囲気中で、培養下に維持される。
本発明による再構築された生体組織の細胞の全ては、組織の細胞型のそれぞれの維持並びに/又はその成長及び/若しくは増殖に好適な培地中で培養下に置くことができる。
本発明を実施するのに好適である可能性が高い多くの培養培地が、商業的に入手可能である。本発明に好適な培養培地の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、MCDB 153又は他の誘導体、基礎培地(MEM)、M199、RPMI 1640又はイスコフ改変ダルベッコ培地(EDMEM)、Ham's F-12、Ham's F-10、NCTC 109、及びNCTC 135を挙げることができる。
これらの培地には、細胞培養において簡便に使用されている任意の添加剤、例えば、リン脂質、非必須アミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物質、酵素補因子、無機塩、インスリン、トランスフェリン、トリヨードチロニン、エタノールアミン、o-ホスホリル-エタノールアミン、又は成長因子の前駆体等を補充してもよい。
細胞培養培地に補充するのに通常使用される様々な添加剤の濃度は、特に、培養される細胞の種類に従って、当業者によって決定及び適合されてよい。
更に、様々な培地の、特に前述の培地の混合物、例えばDMEM/Ham's F-12混合物等を使用することも可能である。
概して、本発明による再構築された生体組織は、培養、維持、又は生存、及び/又は成長、及び/又は細胞増殖の条件に、標準的な培養条件下で、約5〜24日間にわたって維持されうる。
本明細書上記に示したように、再構築された組織モデルを得ること及び細胞の循環を可能にすることに適した膜の使用は、例えば上皮等のヒト組織の炎症又は免疫反応を調節する可能性が高い化合物のスクリーニング又は同定アッセイを実施するために特に好適である。
再構築された組織モデルを得ること及び細胞質突起の通過を可能にすることに好適な膜の使用は、組織内に存在する神経終末と相互作用することによってヒト組織の感覚反応を調節する可能性が高い化合物のスクリーニング又は同定アッセイを実施するためにも特に好適である。
したがって本発明は、免疫細胞の活性化及び遊走を伴う、生体組織、特に上皮の炎症反応を調節する可能性が高い薬剤をスクリーニング若しくは同定するため、又は組織内に存在する神経終末と相互作用することによって生体組織の感覚反応を調節する可能性が高い薬剤をスクリーニングするための、本発明による再構築された生体組織の使用も目的とする。
本発明は、免疫細胞の活性化及び遊走を伴う、生体組織、特に上皮の炎症反応を調節する可能性が高い薬剤をスクリーニングするためのインビトロ法であって、
a) 本発明による再構築された生体組織において免疫細胞の活性化及び遊走を伴う炎症反応を示す、この再構築された生体組織の存在下に、スクリーニングされる薬剤を置く工程と、
b) 再構築された生体組織内の免疫細胞の活性化及び遊走の、起こりうる変化を判定する工程と、
c) 工程b)において変化が判定された場合、スクリーニングされる薬剤が、免疫細胞の活性化及び遊走を伴う、組織、特に上皮の炎症反応を調節する可能性が高い薬剤であることを、そこから推定する工程と
を含むインビトロ法も目的とする。
a) 本発明による再構築された生体組織において免疫細胞の活性化及び遊走を伴う炎症反応を示す、この再構築された生体組織の存在下に、スクリーニングされる薬剤を置く工程と、
b) 再構築された生体組織内の免疫細胞の活性化及び遊走の、起こりうる変化を判定する工程と、
c) 工程b)において変化が判定された場合、スクリーニングされる薬剤が、免疫細胞の活性化及び遊走を伴う、組織、特に上皮の炎症反応を調節する可能性が高い薬剤であることを、そこから推定する工程と
を含むインビトロ法も目的とする。
好ましくは、これらの実施形態において、再構築された生体組織の膜は、本明細書上記に定義された免疫細胞が、特に直径2から12μmの間の細孔を通して、再構築された生体組織から別の区画へ、またその逆へ通過することを可能にする。
好ましくは、免疫細胞の活性化及び遊走を伴う炎症反応を示す再構築された生体組織は、炎症モデルである、本明細書上記に定義された再構築された皮膚モデル、特に、炎症反応に関与する細胞、特に免疫細胞、例えばリンパ球、白血球、マクロファージ、単球、樹状細胞、及びランゲルハンス細胞によってコロニー形成された、本明細書上記に定義された再構築された皮膚モデルである。
本発明は、組織内に存在する神経終末と相互作用することによって、生体組織、特に上皮の感覚反応を調節する可能性が高い薬剤をスクリーニングするためのインビトロ法であって、
a) 少なくとも1つの第1の細胞型を含む細胞群(i)と、神経細胞を含む細胞群(ii)とを含む(ここで、細胞群(i)及び(ii)は、細胞群(i)に対する細胞群(ii)の神経細胞の細胞質突起の通過を可能にする、本発明による膜によって分離されている)、本発明による再構築された生体組織の存在下に、スクリーニングされる薬剤を置く工程と、
b) 再構築された生体組織内の神経細胞の活性の、起こりうる変化を、神経細胞内及び/又は神経細胞による物質Pの放出の電気的活動を測定することによって判定する工程と、
c) 工程b)において変化が判定された場合、スクリーニングされる薬剤が、組織内に存在する神経終末と相互作用することによって、組織、特に上皮の感覚反応を調節する可能性が高い薬剤であることを、そこから推定する工程と
を含むインビトロ法も目的とする。
a) 少なくとも1つの第1の細胞型を含む細胞群(i)と、神経細胞を含む細胞群(ii)とを含む(ここで、細胞群(i)及び(ii)は、細胞群(i)に対する細胞群(ii)の神経細胞の細胞質突起の通過を可能にする、本発明による膜によって分離されている)、本発明による再構築された生体組織の存在下に、スクリーニングされる薬剤を置く工程と、
b) 再構築された生体組織内の神経細胞の活性の、起こりうる変化を、神経細胞内及び/又は神経細胞による物質Pの放出の電気的活動を測定することによって判定する工程と、
c) 工程b)において変化が判定された場合、スクリーニングされる薬剤が、組織内に存在する神経終末と相互作用することによって、組織、特に上皮の感覚反応を調節する可能性が高い薬剤であることを、そこから推定する工程と
を含むインビトロ法も目的とする。
スクリーニングされる薬剤は、好ましくは、特にインサート及び/又はウェルにおける、特に培養下の細胞型のうちの少なくとも1つ及び/又はこの細胞の少なくとも1つの培養培地との接触により、再構築された生体組織との相互作用を助長する条件下で、再構築された生体組織の存在下に置かれる。
図面及び本明細書以下の実施例により、本発明をより詳細に例示する。
(実施例1)
本発明による膜及びインサートの製造
本発明者らは、細胞培養及び組織再構築に使用されている市場の産業的インサートを使用して2つ以上の異なる細孔直径を有するシステムを製造することが可能であることを示した。
本発明による膜及びインサートの製造
本発明者らは、細胞培養及び組織再構築に使用されている市場の産業的インサートを使用して2つ以上の異なる細孔直径を有するシステムを製造することが可能であることを示した。
0.85x108個未満の細孔/cm2の密度で0.4μmの細孔を備えた、0.5cm2で厚さ11μmのポリカーボネート膜を含むNunc社のインサート(Cat N°140700)を、1cm2当たり細孔250個、500個、及び1000個の密度で直径5μmの細孔を生成するように、レーザー穿孔技術によって穿孔した(図1)。
これらの細孔は、孔1つ当たり約100ナノジュールの単一のベッセルビームパルスを有するフェムト秒型レーザーを使用することにより、より正確に生成される。
(実施例2)
本発明による膜上の組織の再構築
ヒト上皮モデルを再構築するための従来の技術を使用し、本発明者らは、実施例1の膜上に、標準的なRHE skinethicモデルの特徴と同等な形態学的特徴(組織学)及び機能的特徴(細胞生存能、バリア機能)を有する、再構築されたヒト表皮(RHE)を再構築した(図2)。
本発明による膜上の組織の再構築
ヒト上皮モデルを再構築するための従来の技術を使用し、本発明者らは、実施例1の膜上に、標準的なRHE skinethicモデルの特徴と同等な形態学的特徴(組織学)及び機能的特徴(細胞生存能、バリア機能)を有する、再構築されたヒト表皮(RHE)を再構築した(図2)。
インサートにケラチノサイトを播種した後、インサートを気液界面に直接置き、17日間にわたって培地を変えずに再構築を続けた。
本発明者らは、直径5μmの細孔が膜の全表面にわたって均一に分布している膜と、直径5μmの細孔が膜に不均一に分布している膜との、2種類の膜を使用した。
直径5μmの細孔では、次のいくつかの密度を更に試験した: 1cm2当たり細孔250個、1cm2当たり細孔500個、及び1cm2当たり細孔1000個。
これらの膜で得られたRHEモデルを、直径0.4μmの細孔のみを有した標準的な膜上に調製されたRHEモデルと比較した。
本発明による膜で得られたRHEモデルは、標準的な膜で得られたRHEモデルと同じ表皮の形態学的特徴(基底層、棘層、粒状層、及び角質層)を有する。しかしながら、それらは、標準的な膜では不可能な、膜を通した細胞及び/又は細胞質突起の通過を可能にするという追加の利点を有する。
このRHEモデルのポリカーボネート膜における直径5μmの細孔の存在は、ある特定の炎症性皮膚障害で観察されるもの等のリンパ球浸潤の過程を模倣するために、この実施例では下部区画から上部区画への、細胞の通過を実際に可能にする。
Claims (13)
- 少なくとも2種類の細孔を含む細胞培養のための単層膜であって、
(i)膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔と、
(ii)膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔と
を含み、2種類の細孔が、膜の厚さを一方の面から反対側まで貫通している、単層膜。 - 2種類の細孔が同じ方向を向いている、請求項1に記載の単層膜。
- 前記膜がポリカーボネート膜である、請求項1又は2に記載の単層膜。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の膜を製造する方法であって、膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む細胞培養のための単層膜を、膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように穿孔することからなる工程を含む方法。
- 膜がレーザー穿孔によって穿孔される、請求項4に記載の製造方法。
- 壁部のうちの少なくとも1つが請求項1から3のいずれか一項に記載の膜を含むか又はそれによって構成されている少なくとも1つの区画を含む細胞培養デバイス。
- 前記デバイスが、2つの区画を含み、前記壁部が、2つの区画を分離する前記膜を含むか又はそれによって構成されている、請求項6に記載のデバイス。
- 請求項6又は7に記載の細胞培養デバイスを製造する方法であって、壁部のうちの少なくとも1つが膜1cm2当たり細孔1×105〜1×108個の密度で0.1から1μmの間の平均直径を有する細孔を含む膜を含むか又はそれによって構成されている少なくとも1つの区画を含む、細胞培養のための単層膜を、膜1cm2当たり細孔0.5×102〜5×103個の密度で2から12μmの間の平均直径を有する細孔を生成するように穿孔することからなる工程を含む方法。
- 細胞培養のための、請求項1から3のいずれか一項に記載の膜又は請求項6若しくは7に記載のデバイスのインビトロ使用。
- 再構築された生体組織の調製のための、請求項1から3のいずれか一項に記載の膜又は請求項6若しくは7に記載のデバイスの使用。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の膜上に、少なくとも1つの第1の細胞型を含む少なくとも1つの細胞群(i)を含む、再構築された生体組織。
- 請求項6又は7に記載の細胞培養デバイスにおいて、少なくとも1つの細胞型を含む再構築された生体組織を調製する方法であって、
a)培養デバイスの区画に、再構築される組織の第1の細胞型を、培養デバイスの膜にそれが接着することを可能にするように播種する工程と、
b)組織の特徴的な細胞構成を可能にするのに好適な期間及び条件で、細胞を培養下に維持する工程と
を含む方法。 - 免疫細胞の活性化及び遊走を伴う組織の炎症反応を調節する可能性が高い薬剤をスクリーニングするため、又は組織内に存在する神経終末と相互作用することによって組織の感覚反応を調節する可能性が高い薬剤をスクリーニングするための、請求項11に記載の再構築された生体組織の使用。
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