BR112018012223B1 - Membrana de camada única, método de fabricação de uma membrana, dispositivo de cultura celular, método de fabricação de um dispositivo de cultura celular, usos in vitro da membrana, método de preparação de um tecido biológico reconstruído in vitro e uso de um tecido biológico reconstruído in vitro - Google Patents

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Abstract

A presente invenção está relacionada com membranas contendo, pelo menos dois tipos de porosidade: - uma porosidade de pequena dimensão, mas de alta densidade, que permite o suporte e a nutrição de células de cultura, de forma a obter um modelo de tecido reconstruído, e - uma porosidade de maior dimensão, mas de baixa densidade, que permite a circulação de determinados tipos de células e a passagem de extensões citoplasmáticas de um compartimento para outro.

Description

[001] A presente invenção está relacionada com membranas e dispositivos para cultura celular, adaptados para a preparação de tecido biológico reconstruído.
[002] A técnica de tecido para aplicação na investigação, sobretudo em testes de segurança ou eficácia, baseia-se na reconstrução de tecido humano ou animal, contendo um ou mais tipos de células. Na maioria dos casos, estes tecidos são reconstruídos em encartes ou dispositivos para cultura celular depois de semeados e cultura em um meio e segundo condições definidas (composição adaptada ao meio, controlo da temperatura e condições de pH).
[003] Atualmente, estes sistemas 3D de reconstrução de tecidos usam membranas utilizadas como suporte para a colocação das células. Devido às limitações inerentes à respetiva técnica de fabrico, em particular no caso de membranas feitas de policarbonatos e outros polímeros químicos, todas as membranas existentes no mercado são propostas com poros de apenas um diâmetro.
[004] Por isso, a maioria das membranas usadas para sistemas de reconstrução 3D de tecidos usam membranas que dispõem de poros com um único diâmetro, definidas para permitir a difusão do meio nutritivo do compartimento inferior para o superior.
[005] Mais ainda, há membranas que possuem poros de um único diâmetro, definidas para permitir a migração de células de um compartimento para outro, nos testes de migração celular. No entanto, este tamanho único dos poros não é compatível com a reconstrução de um modelo tecidular, tal como o modelo de epiderme humana reconstruída.
[006] Porém, há muitas aplicações de modelos de tecido humano ou animal reconstruído, em que a circulação de células entre o compartimento inferior e superior do dispositivo celular ou a passagem de extensões citoplasmáticas entre os diferentes compartimentos pode revelar-se muito útil.
[007] Por esta razão, os modelos de epiderme humana reconstruída (“RHE”) usados no estudo de mecanismos inflamatórios não são representativos da maior parte das dermatoses inflamatórias (dermatite atópica, psoríase, lúpus...) uma vez que estão limitados pela ausência de células linfócitos. Regista-se, no entanto, a necessidade de modelos mais adequados para o estudo da inflamação crónica, em particular um modelo que permita a colonização de um epitélio reconstruído por células envolvidas na resposta inflamatória do organismo.
[008] Da mesma maneira, em certos epitélios animais ou humanos reconstruídos, a incorporação de diferentes tipos de células, entre as quais células imunocompetentes, como as células de Langerhans, seria interessante conseguir reproduzir a ativação destas células e a sua migração para fora da epiderme, como acontece in vivo em mecanismos de sensibilização.
[009] Finalmente, os epitélios humanos ou animais raramente contêm o corpo celular de células nervosas, mas são muitas vezes enervados por terminações nervosas. Seria, por isso, interessante dispor de modelos de reconstrução de epitélio 3D, enervados por dendrites cujos corpos celulares estão contidos em um compartimento separado.
[010] Verifica-se, assim, uma necessidade substancial de dispositivos de cultura celular que permitam a preparação de um modelo tecidular reconstruído, no qual seja possível a circulação de células ou a passagem de extensões citoplasmáticas entre os diferentes compartimentos.
[011] A presente invenção vai ao encontro desta necessidade.
[012] Os atuais inventores conseguiram de facto mostrar surpreendentemente que é possível fabricar membranas contendo dois tipos de porosidade: - uma porosidade de pequena dimensão, mas de alta densidade, que permite o suporte e a nutrição de células de cultura, de forma a obter um modelo de tecido reconstruído, e - uma porosidade de maior dimensão, mas de baixa densidade, que permite a circulação de determinados tipos de células e a passagem de extensões citoplasmáticas de um compartimento para outro.
[013] Os inventores revelaram que tais membranas eram perfeitamente adequadas à obtenção de modelos tecidulares reconstruídos, nos quais era possível a circulação de células ou a passagem de extensões citoplasmáticas entre os diferentes compartimentos.
[014] A presente invenção tem assim por objeto uma membrana de camada única para cultura celular, compreendendo, pelo menos, dois tipos de poros: (i) poros com um diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 a lxio8 poros por cm2 de membrana, e (ii) poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, com uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana, com os dois tipos de poros a atravessarem a espessura da membrana, de um lado para o outro.
[015] Os poros (i) com um diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm permitem especificamente a difusão do meio nutritivo, de um lado da membrana para o outro.
[016] De preferência, os poros (i) têm um diâmetro médio entre 0,2 e 0,9 μm, de preferência entre 0,3 e 0,8 μm, de preferência entre 0,4 e 0,7 μm, entre 0,4 e 0,6 μm ou entre 0,4 e 0,5 μm. Mas mais especialmente, os poros (i) devem ter um diâmetro médio de 0,4 μm.
[017] De preferência, os poros (i) estão presentes na membrana, de acordo com a invenção, a uma densidade entre 2*105 e 9,5*107 poros por cm2 de membrana, preferencialmente entre 3*105 e 9*107, entre 4*105 e 8,5*107, entre 5*105 e 8*107, entre 6*105 e 7,5*107, entre 7*105 e 7*107, entre 8*105 e 6,5*107, entre 9*105 e 6*107, entre 1*106 e 5,5*107, entre 2*106 e 5*107, entre 3*106 e 4*107, entre 4*106 e 3*107, entre 5*106 e 2*107 ou entre 6*106 e 1*107 poros por cm2 de membrana. Em especial, os poros (i) estarão presentes na membrana, de acordo com a invenção, a uma densidade entre 1*106 e 8.5*107 poros por cm2 de membrana.
[018] Os poros (ii) com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, permitem especificamente a migração de células, em particular, células imunes, ou a passagem de extensões celulares, em particular extensões nervosas, através da membrana.
[019] De preferência, os poros (ii) devem ter um diâmetro médio entre 2,5 e 11 μm, preferencialmente entre 3 e 10 μm, entre 3,5 e 9 μm, entre 4 e 8 μm, entre 4,5 e 7 μm ou entre 5 e 6 μm. Em especial, os poros (ii) terão um diâmetro médio de 5 μm.
[020] O diâmetro médio preferido dos poros (ii) pode ser selecionado pelos especialistas na técnica, de acordo com o tipo de células para as quais se pretende a migração através da membrana. Por exemplo, quando as células para as quais se pretende a migração são astrócitos, o diâmetro médio dos poros (ii) será, de preferência, 12 μm. Quando as células para as quais se pretende a migração são leucócitos, neutrófilos, e/ou células neuronais, o diâmetro médio dos poros (ii) deverá ser, preferencialmente, 3 μm. Quando as células para as quais se pretende a migração são linfócitos, macrófagos, monócitos e/ou células dendríticas, o diâmetro médio dos poros (ii) deverá ser, preferencialmente, 5 μm. Quando as células para as quais se pretende a migração são células endoteliais, células epiteliais e/ou fibroblastos, o diâmetro médio dos poros (ii) deverá ser, preferencialmente, 8 μm.
[021] De preferência, os poros (ii) estão presentes na membrana, de acordo com a invenção, a uma densidade entre 1x102 e 4,5x103 poros por cm2 de membrana, preferencialmente entre 1,25x102 e 4x103, entre 1,5x102 e 3x103, entre 1,75x102 e 2x103, entre 2x102 e 1,5x103, entre 2,25x102 e 1x103, entre 2,5x102 e 9,5x102, entre 2,75x102 e 9x102, entre 3x102 e 8,5x102, entre 3,25x102 e 8x102, entre 3,5x102 e 7,5x102, entre 3,75x102 e 7x102, entre 4x102 e 6,5x102, entre 4,25x102 e 6x102, entre 4,5x102 e 5,75x102, entre 4,75x102 e 5.5x102 ou entre 5x102 e 5,25x102 poros por cm2 de membrana. Em especial, os poros (ii) devem estar presentes na membrana, de acordo com a invenção, a uma densidade entre 2,5x102, 5x102 ou 1x103 poros por cm2 de membrana.
[022] Em uma representação particular, os poros (ii) estão distribuídos de forma homogénea sobre toda a superfície da membrana.
[023] Em outra representação particular, os poros (ii) estão distribuídos de forma heterogénea sobre a superfície da membrana.
[024] Preferencialmente, os dois tipos de poros, (i) e (ii), deverão estar orientados na mesma direção.
[025] Em uma representação especialmente preferida, a membrana, de acordo com a invenção, é uma membrana de camada única para cultura celular, compreendendo pelo menos dois tipos de poros: (i) poros com um diâmetro médio de 0,4 μm, a uma densidade de 1x106 a 8.5x107 poros por cm2 de membrana, e (ii) poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, de preferência 5 μm, a uma densidade de 2,5x102 a 1xio3 poros por cm2 de membrana, preferencialmente a uma densidade de 2,5x102, 5xio2 ou lxio3 por cm2 de membrana, com os dois tipos de poros a atravessarem a espessura da membrana, de um lado para o outro, e orientados na mesma direção.
[026] Os poros (i) e (ii) da membrana, de acordo com a invenção, atravessam a espessura da membrana. Criam assim vias de passagem entre elementos localizados de um lado da membrana e elementos localizados do outro lado da membrana.
[027] Os poros (i) e (ii) da membrana, de acordo com a invenção, são, além disso, preferencialmente orientados na mesma direção. Consequentemente, os poros (i) e (ii) da membrana, de acordo com a invenção, formam preferencialmente vias de passagem substancialmente paralelas entre si. Assim, preferencialmente, os poros (i) e (ii) da membrana, de acordo com a invenção, não se cruzam.
[028] A membrana, de acordo com a invenção, é uma membrana de camada única. Ou seja, a membrana, de acordo com a invenção, é constituída por uma única camada de chapa de material.
[029] De preferência, a membrana, de acordo com a invenção, deve apresentar uma espessura entre 2 μm e 200 μm. Em especial, a membrana, de acordo com a invenção, possui uma espessura entre 5 μm e 100 μm, de preferência entre 5 e 50 μm, de preferência entre 8 e 25 μm, Em especial entre 10 μm e 20 μm, com maior preferência entre 11 μm e 15 μm.
[030] A membrana, de acordo com a invenção, deve ser biocompatível.
[031] O termo "membrana biocompatível", neste caso, significa uma membrana feita de um material que não afeta negativamente as células, em particular a viabilidade, adesão, distribuição, mobilidade, crescimento e/ou divisão celular.
[032] A membrana pode ser uma membrana semipermeável de policarbonato, polietileno, polipropileno, politereftalato de etileno (“PET”) ou poliéster. De preferência, a membrana, de acordo com a invenção, deve ser uma membrana de policarbonato.
[033] A membrana, de acordo com a invenção, pode ainda ser coberta com um revestimento, para promover a adesão celular.
[034] O revestimento pode conter biomoléculas ou derivados de biomoléculas, tais como um polímero do tipo poliornitino ou polilisina, peptidos ou proteínas, ou componentes de matriz extracelular, como gelatina, fibronectina, laminina, colagénio, um glicosaminoglicano, um peptidoglicano, etc.
[035] O revestimento deve cobrir, de preferência, toda a superfície da membrana em contacto com as células.
[036] O revestimento pode ser em forma semissólida ou em formato de gel, e pode conter componentes adicionais, tais como fatores de crescimento. O revestimento pode ser uma mistura simples ou complexa de biomoléculas e pode simular ou ser uma réplica de uma matriz extracelular natural (“ECME”). Em particular, o revestimento pode ser a matriz MatrigelTM vendida por BD Biosciences.
[037] Os inventores mostraram ainda que a membrana, de acordo com a invenção, pode ser surpreendentemente obtida por perfuração, em particular por meio de laser, de uma membrana de cultura celular que apresente apenas uma dimensão pequena, mas com alta densidade, de forma a produzir poros com um diâmetro mais elevado, mas a baixa densidade.
[038] A presente invenção relaciona-se assim igualmente com um método de fabrico de membrana, tal como atrás definido, compreendendo a operação que consiste em perfurar uma membrana de camada única para cultura celular, contendo poros de diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 a 1 xio8 poros por cm2 de membrana, de forma a produzir poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, a uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana.
[039] De preferência, o método de fabrico, de acordo com a invenção, compreende os seguintes passos: (a) obter uma membrana de camada única para cultura celular, contendo poros com um diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 to 1x108 poros por cm2 de membrana, e (b) perfurar a referida membrana de forma a produzir poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, a uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana.
[040] De preferência, os poros já presentes na membrana que irá ser submetida à operação de perfuração, em particular os poros da membrana fornecidos no passo a), têm um diâmetro médio entre 0,2 e 0,9 μm, preferencialmente entre 0,3 e 0,8 μm, preferencialmente entre 0,4 e 0,7 μm, entre 0,4 e 0,6 μm ou entre 0,4 e 0,5 μm. Em especial, os poros já presentes na membrana que será sujeita a perfuração, em particular os poros da membrana fornecida no passo a), devem ter um diâmetro médio de 0,4 μm.
[041] Preferencialmente, os poros já presentes na membrana submetida a perfuração, em particular os poros da membrana fornecida no passo a), estão presentes na membrana a uma densidade entre 2x105 e 9,5x107 poros por cm2 de membrana, de preferência entre 3x105 e 9x107, entre 4x105 e 8,5x107, entre 5x105 e 8x107, entre 6x105 e 7,5x107, entre 7x105 e 7x107, entre 8x105 e 6,5x107, entre 9x105 e 6x107, entre 1x106 e 5,5x107, entre 2x106 e 5x107, entre 3x106 e 4x107, entre 4x106 e 3x107, entre 5x106 e 2x107 ou entre 6x106 e 1x107 poros por cm2 de membrana. Em especial, os poros já presentes na membrana sujeita a perfuração, em particular os poros da membrana fornecida no passo a), estão presentes na membrana a uma densidade entre 1x106 e 8,5x107 poros por cm2 de membrana.
[042] Em uma reprodução particularmente preferida, a membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), é uma membrana de camada única para cultura celular, contendo poros com um diâmetro médio de 0,4 μm, a uma densidade de 1xi06 a 8.5x107 poros por cm2 de membrana.
[043] De preferência, os poros já presentes na membrana sujeita a perfuração, em particular os poros da membrana fornecida no passo a), atravessam a espessura da membrana de um lado para o outro.
[044] A membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), é uma membrana de camada única. Ou seja, a membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), é constituída por uma única camada de chapa de material.
[045] De preferência, a membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), deve ter uma espessura entre 2 μm e 200 μm. Em especial, a membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), deve ter uma espessura entre 5 μm e 100 μm, preferencialmente entre 5 e 50 μm, preferencialmente entre 8 e 25 μm, em especial entre 10 μm e 20 μm, mais especialmente entre 11 μm e 15 μm.
[046] A membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), deve ser preferencialmente uma membrana biocompatível, como anteriormente definida.
[047] A membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), pode ser uma membrana semipermeável de policarbonato, polietileno, polipropileno, politereftalato de etileno (PET) ou poliéster. De preferência, a membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), deve ser uma membrana de policarbonato.
[048] A membrana sujeita a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), pode ainda ser coberta com um revestimento, para promover a adesão celular, tal como anteriormente definido.
[049] De preferência, a membrana deve ser sujeita a perfuração a laser.
[050] Os termos "perfuração com laser", "perfuração a laser" ou "perfurar com um laser", neste caso, significa a ação de perfurar um objeto por meio de um laser. As técnicas de perfuração a laser são bem conhecidas dos especialistas desta arte, estando, por exemplo, descritas em Mielke et al. (2013) JLMN-Journal of Laser Micro/Nanoengineering 8:115-123.
[051] Pode ser usado um laser do tipo femtosegundos, que produz impulsos ultracurtos, com uma duração de cerca de alguns femtosegundos a algumas centenas de femtosegundos.
[052] De preferência, a perfuração com um laser implementada no método de fabrico, de acordo com a invenção, é uma microperfuração por meio de um laser, mais preferencialmente uma microperfuração a laser de tipo femtosegundos.
[053] Tipicamente, a perfuração com um laser é implementada usando um laser femtosegundos, de preferência com um único impulso de feixe de bessel, preferencialmente de cerca de cem nanojoules por orifício.
[054] Os poros formados na operação de perfuração no método de fabrico, de acordo com a invenção, permitem a migração de células ou a passagem de extensões celulares através da membrana.
[055] De preferência, os poros formados na operação de perfuração devem ter um diâmetro médio entre 2,5 e 11 μm, preferivelmente entre 3 e 10 μm, entre 3,5 e 9 μm, entre 4 e 8 μm, entre 4,5 e 7 μm ou entre 5 e 6 μm. Em especial, os poros formados na operação de perfuração devem ter um diâmetro médio de 5 μm.
[056] O diâmetro médio dos poros formados na operação de perfuração pode ser selecionado pelos especialistas nesta técnica, de acordo com o tipo de células para as quais se pretende a migração através da membrana, como atrás indicado.
[057] De preferência, os poros formados na operação de perfuração são perfurados na membrana, em particular, na fornecida no passo a) a uma densidade entre 1x102 e 4,5xi03 poros por cm2 de membrana, preferencialmente entre 1,25x102 e 4xi03, entre 1.5x102 e 3x103, entre 1,75x102 e 2x103, entre 2x102 e 1,5x103, entre 2,25x102 e 1x103, entre 2,5x102 e 9,5x102, entre 2,75x102 e 9x102, entre 3x102 e 8.5x102, entre 3.25x102 e 8x102, entre 3,5x102 e 7,5x102, entre 3.75x102 e 7x102, entre 4x102 e 6,5x102, entre 4,25x102 e 6x102, entre 4,5x102 e 5,75x102, entre 4,75x102 e 5,5x102 ou entre 5x102 e 5,25x102 poros por cm2 de membrana. Mais especialmente, os poros formados no passo a) com uma densidade entre 2,5x102, 5x102 ou 1x103 poros por cm2 de membrana.
[058] Em uma reprodução particularmente preferida, a operação de perfuração consiste em perfurar com um laser a membrana especial fornecida no passo a), de forma a produzir poros com um diâmetro médio entre 3 e 8 μm, de preferência 5 μm, a uma densidade de 2,5x102 a 1x103 poros por cm2 de membrana, preferencialmente a uma densidade de 2,5x102, 5x102 ou 1x103 por cm2 de membrana.
[059] De preferência, os poros formados no passo de perfuração atravessam a espessura da membrana, de um lado para o outro.
[060] De preferência, os poros formados no passo de perfuração são orientados na mesma direção que os poros inicialmente presentes na membrana.
[061] A membrana, de acordo com a invenção, é particularmente útil para cultura celular, quando integrada em um dispositivo de cultura celular.
[062] Por isso, esta invenção tem igualmente por objetivo um dispositivo de cultura celular, contendo, pelo menos, um compartimento no qual, pelo menos, um dos lados é constituído pela membrana, de acordo com a invenção.
[063] Os termos "dispositivo para cultura celular" e "encarte" são aqui utilizados indiferentemente.
[064] O termo “encarte”, neste caso, significa um suporte que contém uma ou mais tinas ou poços que podem ser colocados em um contentor, geralmente uma placa de cultura de poços múltiplos.
[065] De preferência, o dispositivo de cultura celular, de acordo com a invenção, deve conter dois compartimentos, com a divisória contendo ou sendo constituída pela membrana, de acordo com a invenção, a separar os dois compartimentos.
[066] A base do encarte deverá ser preferencialmente constituída pela membrana, de acordo com a invenção, que, por isso, separa o compartimento formado pelo poço do encarte e um segundo compartimento do encarte, ou o compartimento formado pelo contentor onde se coloca o encarte.
[067] O encarte pode ser de qualquer formato ou tamanho. Em particular, pode ter um diâmetro entre 3 e 80 mm, entre 4 e 75 mm, entre 4,26 e 70 mm, entre 4,5 e 65 mm, entre 5 e 60 mm, entre 5,5 e 55 mm, entre 6 e 50 mm, entre 6,5 e 45 mm, entre 7 e 40 mm, entre 7,5 e 35 mm, entre 8 e 30 mm, entre 8,5 e 25 mm, entre 9 e 24 mm, entre 9,5 e 23 mm, entre 10 e 22 mm, entre 11 e 21 mm, entre 12 e 20 mm, entre 13 e 19 mm, entre 14 e 18 mm, entre 15 e 17 mm ou entre 15 e 16 mm.
[068] O encarte pode ser organizado de forma a ser colocado em um poço de placa de cultura celular, sem ficar em contacto com o fundo do referido poço.
[069] O encarte pode conter separadores, ganchos ou quaisquer outros meios que permitam mantê-lo a uma distância adequada do fundo de um poço de placa de cultura celular.
[070] A presente invenção relaciona-se, por isso, com um método de fabrico de um dispositivo de cultura de células, de acordo com a invenção, contendo a operação que consiste em perfurar a membrana de camada única de um dispositivo de cultura celular, que contenha, pelo menos, um compartimento em que, pelo menos um das paredes divisórias compreende ou é constituída por esta membrana de camada única, a qual contém poros com um diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 a 1 xio8 poros por cm2 de membrana, de forma a produzir poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, a uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana.
[071] De preferência, o método de fabrico de um dispositivo de cultura celular, de acordo com a invenção, deve conter os seguintes passos: A) fornecer um dispositivo de cultura celular que contenha, pelo menos, um compartimento, do qual, pelo menos, uma das divisórias seja constituída ou contenha uma membrana de camada única que disponha de poros com um diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 a 1x108 poros por cm2 de membrana, e B) perfurar a referida membrana de forma a produzir poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, a uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana.
[072] A membrana do dispositivo de cultura celular que será submetida a perfuração, em particular do dispositivo fornecido no passo A), é, tal como acima referido, para a membrana submetida a perfuração, em particular a membrana fornecida no passo a), do método de fabrico da membrana, de acordo com a invenção.
[073] Preferencialmente, o dispositivo de cultura celular cuja membrana é submetida a perfuração, em particular o dispositivo fornecido no passo A), deve compreender dois compartimentos, com a divisória constituída ou formada pela referida membrana a separar os dois compartimentos.
[074] O dispositivo de cultura celular cuja membrana é submetida a perfuração, em particular o dispositivo fornecido no passo A), pode especificamente ser um encarte comercialmente disponível, como um encarte para cultura celular de 0,5 cm2 ou 4 cm2 de superfície de cultura, vendido por Nunc, ou um encarte para cultura celular de 0,38 cm2 ou 1,2 cm2 de superfície de cultura, vendido por Corning.
[075] Preferencialmente, a membrana deverá ser perfurada por um laser.
[076] A operação de perfuração pode ser implementada segundo as mesmas condições que as definidas para a operação de perfuração do método de fabrico da membrana, de acordo com a invenção, e para produzir poros com as mesmas características.
[077] Os inventores revelaram que a membrana e o dispositivo de cultura celular, de acordo com a invenção, eram especialmente úteis para cultura celular, e em particular para produzir tecidos biológicos reconstruídos para os quais ou dos quais podem circular células.
[078] A presente invenção tem, por isso, com objetivo a utilização in vitro da membrana, de acordo com a invenção, ou do dispositivo de cultura celular, de acordo com a invenção, para cultura celular.
[079] A presente invenção tem assim como finalidade o uso da membrana, de acordo com a invenção, ou do dispositivo de cultura celular, de acordo com a invenção, para preparação de um tecido biológico reconstruído.
[080] O termo "tecido biológico", neste caso, significa qualquer conjunto de células iguais e com a mesma origem, agrupadas em um cacho, rede ou feixe. O tecido biológico pode, em especial, ser um tecido epitelial, conjuntivo, muscular ou nervoso. O tecido biológico deve ser, preferencialmente, um tecido epitelial.
[081] Pode ser um tecido proveniente de qualquer órgão humano, tal como um tecido da epiderme, da derme, do coração, do fígado, do rim, etc.
[082] A presente invenção é assim relativa a um tecido biológico reconstruído compreendendo, na membrana, de acordo com a invenção, pelo menos um grupo de células (i) que contenha, pelo menos, um primeiro tipo de células.
[083] De preferência, a referida membrana deve permitir a passagem de certas células e/ou extensões citoplasmáticas de certas células do referido tecido biológico, em particular através de poros com um diâmetro entre 2 e 12 μm.
[084] De preferência, pelo menos um dos primeiros tipos de células referidos, contidos no grupo de células (i) deve ser constituído por células epiteliais.
[085] O termo “células epiteliais”, neste caso, significa qualquer célula que faça parte do um epitélio. As células epiteliais do tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, podem ser, por exemplo, células da epiderme ou do epitélio vaginal, oral, pulmonar, intestinal ou da córnea, bem como todas as células contidas nestes tecidos epiteliais. Assim, o grupo de células (i) do tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, pode constituir um epitélio equivalente epidérmico, vaginal, oral, pulmonar, intestinal ou córneo.
[086] As células epiteliais usadas no contexto da invenção devem ser, preferencialmente, células epiteliais. Recomenda-se a utilização preferencial de queratinócitos.
[087] O grupo de células (i) pode, além disso, compreender outros tipos de células diferentes do primeiro tipo de células, tais como células imunológicas.
[088] Em uma reprodução particular, o referido grupo de células (i) compreende ainda células imunológicas.
[089] O termo "células imunológicas", neste caso, refere-se a qualquer célula envolvida nas respostas imunes de um organismo. As células imunológicas incluem, em especial, linfócitos, tais como linfócitos de nó linfático, células de leucócitos, macrófagos, monócitos, células dendríticas e células de Langerhans.
[090] Em uma reprodução preferida da invenção, o tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, compreende: - um grupo de células (i) contendo, pelo menos, um primeiro tipo de células, como acima definido, e - um grupo de células (ii) contendo, pelo menos, um segundo tipo de células, sendo os grupos de células (i) e (ii) separados pela membrana, de acordo com a invenção.
[091] De preferência, o referido segundo tipo de células contido no grupo de células (ii) deve ser constituído por células nervosas.
[092] O termo "células nervosas" refere aqui, qualquer célula envolvida no sistema nervoso, incluindo células gliais. As células nervosas incluem, em particular, neurónios, entre os quais moto-neurónios, neurónios sensitivos e neurónios de associação, astrócitos, oligodendrócitos e células de Schwann. De preferência, a célula nervosa incluída no tecido reconstruído, de acordo com a invenção, deve ser uma célula nervosa com uma extensão citoplasmática.
[093] Assim, em uma reprodução preferida, a referida membrana deve permitir a passagem de extensões citoplasmáticas do grupo de células (ii) do referido tecido biológico para o grupo de células (i), em particular através de poros com 2 a 12 μm de diâmetro.
[094] Em outra reprodução preferida, a dita membrana permite a passagem de extensões citoplasmáticas de células nervosas do grupo de células (ii) do referido tecido biológico para o grupo de células (i), em particular através de poros de 2 a 12 μm de diâmetro.
[095] Em uma reprodução especial, o tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, é um modelo de pele reconstruída.
[096] Assim, nesta reprodução especial, o grupo de células (i) do tecido biológico reconstruído deve constituir, preferencialmente, um equivalente da epiderme.
[097] Neste equivalente epidérmico (i), o referido primeiro tipo de células, pelo menos, é constituído por células epiteliais, de preferência células epidérmicas, em particular células selecionadas de um grupo constituído por queratinócitos, melanócitos e combinações destes.
[098] De preferência, o equivalente epidérmico (i) é constituído por células imunológicas, como atrás definido, em particular, células de Langerhans e/ou precursores de células de Langerhans.
[099] De preferência, estas células de Langerhans deverão estar localizadas na porção suprabasal do equivalente epidérmico (i).
[0100] A presente invenção tem ainda por objetivo um método para preparar um tecido biológico reconstruído contendo, pelo menos, um tipo de células, em um dispositivo de cultura celular, de acordo com a invenção, compreendendo os seguintes passos: a) semear um primeiro tipo de célula do tecido a reconstruir, em um compartimento do dispositivo de cultura, de forma a permitir a sua adesão à membrana do dispositivo de cultura, e b) manter as células em cultura por um período de tempo e em condições adequadas para permitir a organização celular característica do tecido.
[0101] Em uma reprodução particular, o método é para preparar um tecido biológico reconstruído, compreendendo pelo menos dois tipos de células, e consta dos seguintes passos: a1) semear um primeiro tipo de células do tecido a ser reconstruído, em um compartimento do dispositivo de cultura, a2) depois de um período de tempo necessário para permitir a adesão das células à membrana do dispositivo de cultura, semear o segundo tipo de células, e c) manter as células em cultura por um período de tempo e em condições adequadas para permitir a organização celular característica do tecido.
[0102] De preferência, o primeiro tipo de células do tecido a ser reconstruído devem ser células epiteliais, tal como atrás definido.
[0103] Em uma reprodução especial, o passo a) ou a1) de semear o primeiro tipo de células do tecido a reconstruir pode incluir a introdução de vários tipos de células, que irão constituir uma primeira parte do tecido biológico reconstruído. Assim, em uma reprodução particular, o passo a) ou a1) de semear o primeiro tipo de células do tecido a reconstruir inclui a introdução simultânea ou consecutiva de vários tipos de células epiteliais, preferencialmente a introdução simultânea ou consecutiva de queratinócitos e melanócitos. O passo a) ou a1) de semear o primeiro tipo de células do tecido a reconstruir pode ainda incluir a introdução simultânea ou consecutiva de células imunológicas, como atrás definido, em particular células de Langerhans ou precursores de células de Langerhans.
[0104] De preferência, o segundo tipo de células do tecido a reconstruir serão células nervosas, tal como atrás definido, ou uma célula imunológica, como atrás definido.
[0105] As células semeadas são mantidas em cultura no passo b) por um determinado período e em condições adequadas para permitir a organização celular característica do tecido, como por exemplo, em uma atmosfera de ar contendo 2 a 10% CO2 a 37° C.
[0106] Todas as células do tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, podem ser colocadas em cultura em um meio adequado para manutenção e/ou crescimento e/ou proliferação de cada um dos tipos de células do tecido.
[0107] Muitos meios de cultura com capacidade para se adequarem à implementação da invenção podem ser obtidos pelas vias comerciais. Como exemplos de meios de cultura adequados à invenção, poderemos mencionar Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), MCDB 153 ou outros derivados, Minimal Essential Medium (MEM), M199, RPMI 1640 ou Iscove's Modified Dulbecco's Medium (EDMEM), Ham's F-12, Ham's F-10, NCTC 109 e NCTC 135.
[0108] Estes meios podem ser complementados com qualquer aditivo geralmente utilizado em cultura celular, tais como, por exemplo, precursores de fosfolípidos, aminoácidos não essenciais, ácidos nucleicos, vitaminas, antibióticos, cofatores enzimáticos, sais minerais, insulina, transferrina, triodotironina, etanolamina, o-fosfohoril-etanolamina ou fatores de crescimento.
[0109] As concentrações dos diferentes aditivos normalmente utilizados para complementar os meios de cultura celular podem ser determinados e adaptados pelos especialistas nesta técnica, em particular de acordo com o tipo de células a ser cultivado.
[0110] Além disso, é igualmente possível usar misturas de vários meios, em particular dos acima mencionados, tal como, por exemplo, uma mistura DMEM/Ham's F-12.
[0111] Geralmente, um tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, pode ser mantido em condições de cultura, ou de sobrevivência e/ou de crescimento e/ou de proliferação celular, por um período de cerca de 5 a 24 dias, em condições de cultura standard.
[0112] Tal como acima indicado, o uso de uma membrana adequada à obtenção de modelos de tecido reconstruído e que permite a circulação de células, é particularmente adequada para implementar testes de análise ou identificação de compostos capazes de modular uma resposta inflamatória ou imunológica de um tecido humano como, por exemplo, um epitélio.
[0113] A utilização de uma membrana adequada à obtenção de modelos de tecido reconstruído e que permita a passagem de extensões citoplasmáticas é também especialmente adequada para implementar testes de análise ou identificação de compostos capazes de modular uma resposta sensorial de um tecido humano, através de interação com as terminações nervosas presentes no tecido.
[0114] A presente invenção tem assim igualmente por objetivo o uso de um tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, para analisar ou identificar agentes capazes de modular uma resposta inflamatória de um tecido biológico, em particular de um epitélio, envolvendo a ativação e a migração de células imunológicas para agentes de análise para modular uma resposta sensorial de um tecido biológico, através da interação com as terminações nervosas presentes no tecido.
[0115] A presente invenção tem também como objetivo um método in vitro para analisar agentes capazes de modular uma resposta inflamatória de um tecido biológico, em particular de um epitélio, envolvendo a ativação e a migração de células imunológicas, de que constam os seguintes passos: d) colocar o agente a analisar na presença de um tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, visualizar uma resposta inflamatória envolvendo a ativação e migração de células imunológicas neste tecido biológico reconstruído, e) determinar uma possível alteração na ativação e migração de células imunológicas no tecido biológico reconstruído, e f) se for determinada uma alteração no passo b), deduzir a partir dela que o agente a analisar é um agente capaz de modular a resposta inflamatória de um tecido, em particular, de um epitélio, envolvendo a ativação e migração de células imunológicas.
[0116] De preferência, nestas reproduções, a membrana do tecido biológico reconstruído deve permitir a passagem, em particular através de poros de 2 a 12 μm de diâmetro, de células imunológicas, como acima definido, do tecido biológico reconstruído para outro compartimento, e inversamente.
[0117] De preferência, o tecido biológico reconstruído que apresenta uma resposta inflamatória que envolve a ativação e migração de células imunológicas deverá ser um modelo de pele reconstruído, como acima definido, que é um modelo de inflamação, em particular um modelo de pele reconstruída, tal como acima definido, colonizado por células envolvidas na resposta inflamatória, em particular células imunológicas tais como linfócitos, macrófagos, monócitos, células dendríticas e células de Langerhans.
[0118] A presente invenção tem igualmente por objetivo um método in vitro para análise de agentes capazes de modular uma resposta sensorial de um tecido biológico, em particular um epitélio, através da interação com terminações nervosas presentes no tecido, e que consta dos seguintes passos: g) colocar o agente a analisar em presença de um tecido biológico reconstruído, de acordo com a invenção, contendo um grupo de células (i) com, pelo menos, um primeiro tipo celular, e um grupo de células (ii) contendo células nervosas, com os grupos de células (i) e (ii) separados pela membrana, de acordo com a invenção, o que permite a passagem de extensões citoplasmáticas de células nervosas do grupo de células (ii) para o grupo de células (i), h) determinar uma possível alteração na atividade das células nervosas no tecido biológico reconstruído, medindo a atividade elétrica das células nervosas e/ou da libertação de substância P pelas células nervosas, e i) se for determinada uma alteração no passo b), deduzir daí que o agente a analisar é um agente capaz de modular a resposta sensorial de um tecido, em particular de um epitélio, interagindo com as terminações nervosas presentes no tecido.
[0119] O agente a analisar deve ser preferencialmente colocado em presença do tecido biológico reconstruído, em condições que favoreçam uma interação com o referido tecido, em particular por contacto com, pelo menos, um dos tipos celulares em cultura e/ou com, pelo menos, um meio de cultura das ditas células, em particular em um encarte e/ou em um poço.
[0120] Esta invenção será ilustrada em mais pormenor por meio das imagens e exemplos apresentados a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0121] - Figura 1: Foto de microscópio óptico da membrana de policarbonato de um encarte Nunc com alta densidade de poros de 0,4 μm, a que se adicionou uma baixa densidade de poros de 5 μm.
[0122] - Figura 2: Foto de uma secção histológica de epiderme reconstruída em uma membrana convencional, com uma porosidade de apenas 0,4 μm ou em membranas em que se acrescentaram poros de 5 μm.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: FABRICO DE MEMBRANAS E ENCARTES, DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0123] Os inventores mostraram que era possível usar encartes industriais existentes no mercado para cultura celular e reconstrução de tecido, a fim de construir um sistema com dois ou mais diâmetros diferentes de poros.
[0124] Encartes Nunc (Cat N° 140700) compreendendo uma membrana de policarbonato de 0,5 cm2 e de 11 μm de espessura, equipada com poros de 0,4 μm, com uma densidade < 0,85 x 108 poros/cm2 foram perfurados por meio de uma técnica de perfuração a laser, de forma a produzir poros com um diâmetro de 5 μm, com uma densidade de 250, 500 e 1000 poros por cm2 (Figura 1).
[0125] Estes poros são mais rigorosamente produzidos utilizando um laser tipo femtosegundo com um impulso único de feixe de bessel de cerca de cem nanojoules por orifício.
EXEMPLO 2: RECONSTRUÇÃO DE UM TECIDO NA MEMBRANA, DE ACORDO COM A INVENÇÃO
[0126] Usando as técnicas convencionais de reconstrução de modelos de epitélio humano, os inventores reconstruíram na membrana do Exemplo 1 uma epiderme humana reconstruída (“RHE”) com características morfológicas (histologia) e funcionais (viabilidade celular, função de barreira) equivalentes às do modelo RHE Skinethic standard (Figura 2).
[0127] Depois de semear os encartes com queratinócitos, estes foram colocados diretamente na interface Ar-Líquido e a reconstrução continuou durante 17 dias, sem alterar o meio.
[0128] Os inventores usaram dois tipos de membranas: membranas em que os poros de 5 μm de diâmetro estão distribuídos de forma homogénea sobre toda a superfície da membrana, e membranas em que os poros de 5 μm de diâmetro têm uma distribuição heterogénea sobre a membrana.
[0129] Várias densidades de poros de 5 μm de diâmetro foram posteriormente testadas: 250 poros por cm2, 500 poros por cm2 de 1000 poros por cm2.
[0130] Os modelos RHE obtidos nestas membranas foram comparados com os modelos RHE preparados em uma membrana standard que dispunha apenas de poros com 0,4 μm de diâmetro.
[0131] Os modelos RHE obtidos nas membranas, de acordo com a invenção, possuem as mesmas características morfológicas que uma epiderme (camada basal, camada espinhosa, camada granulosa e estrato córneo), como um modelo RHE obtido em uma membrana standard. No entanto, apresentam a vantagem adicional de permitir a passagem de células e/ou extensões citoplasmáticas através da membrana, uma passagem que se revela impossível nas membranas standard.
[0132] A presença de poros de 5 μm de diâmetro na membrana de policarbonato deste modelo RHE permite realmente a passagem, neste exemplo, de células do compartimento inferior para o compartimento superior, para imitar o processo de invasão linfocítica, como os observados em determinadas alterações de pele inflamatórias.

Claims (12)

1. MEMBRANA DE CAMADA ÚNICA para cultura celular, caracterizada por compreender dois tipos de poros: (i) poros com um diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 a lxio8 poros por cm2 de membrana, e (ii) poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, a uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana, com os dois tipos de poros atravessando a espessura da membrana de um lado para o outro.
2. MEMBRANA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos dois tipos de poros estarem orientados na mesma direção.
3. MEMBRANA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pela dita membrana ser uma membrana de policarbonato.
4. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UMA MEMBRANA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender a etapa que consiste em perfurar uma membrana de camada única para cultura celular, contendo poros de diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 a 1x108 poros por cm2 de membrana, de forma a produzir poros que tenham um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, a uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela membrana ser perfurada por laser.
6. DISPOSITIVO DE CULTURA CELULAR, caracterizado por compreender um compartimento do qual uma das divisórias compreende ou é constituída de uma membrana, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
7. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender dois compartimentos e a referida divisória ser constituída ou conter a dita membrana separando os dois compartimentos.
8. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UM DISPOSITIVO DE CULTURA CELULAR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado por compreender a etapa que consiste em perfurar a membrana de camada única para cultura celular, que contém um compartimento do qual uma das divisórias compreende ou é constituída de uma membrana com poros com um diâmetro médio entre 0,1 e 1 μm, a uma densidade de 1x105 a 1 xio8 poros por cm2 de membrana, de forma a produzir poros com um diâmetro médio entre 2 e 12 μm, a uma densidade de 0,5x102 a 5x103 poros por cm2 de membrana.
9. USO IN VITRO DA MEMBRANA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou do dispositivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado por ser para cultura celular.
10. USO IN VITRO DA MEMBRANA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou do dispositivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado por ser para preparação de um tecido biológico reconstruído.
11. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM TECIDO BIOLÓGICO RECONSTRUÍDO IN VITRO, caracterizado por compreender um tipo de célula, em um dispositivo de cultura celular, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 7, compreendendo os seguintes passos: a) semear um primeiro tipo de célula do tecido a reconstruir, em um compartimento do dispositivo de cultura, de forma a permitir a sua adesão à membrana do dispositivo de cultura, e b) manter as células em cultura por um período de tempo e em condições adequadas para permitir a organização celular característica do tecido.
12. USO DE UM TECIDO BIOLÓGICO RECONSTRUÍDO IN VITRO compreendendo uma membrana, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e na dita membrana um grupo de células (i) compreendendo um primeiro tipo de célula, caracterizado por ser para analisar agentes capazes de modular uma resposta inflamatória de um tecido, envolvendo a ativação e a migração de células imunológicas ou para análise de agentes capazes de modular uma resposta sensorial de um tecido, interagindo com as terminações nervosas presentes no tecido.
BR112018012223-8A 2015-12-17 2016-12-19 Membrana de camada única, método de fabricação de uma membrana, dispositivo de cultura celular, método de fabricação de um dispositivo de cultura celular, usos in vitro da membrana, método de preparação de um tecido biológico reconstruído in vitro e uso de um tecido biológico reconstruído in vitro BR112018012223B1 (pt)

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