CN114949369B - 一种人工组织器官的封装装置及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人工组织器官的封装装置及其制备方法和应用，所述封装装置设在人工组织器官的外围，所述封装装置对所述人工组织器官的包封率为20％～100％，所述封装装置具有100Pa～1GPa的硬度。该封装装置在体外阶段，对人工组织器官提供保护、支撑、按需组合、装配和功能维持等作用，可实现安全精准和大规模的人工组织器官培养与运输、构建、培养与换液等操作，进而实现生物发育研究、高通量药物检测、大气/环境/水体检测等应用；体内阶段，对人工组织器官提供移植手术的移植体转移、定位和固定、缝合、结构保护、营养代谢维持等作用，进而促进移植组织器官的体内存活、血管化、组织形成和重建等作用。

Description

一种人工组织器官的封装装置及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其涉及一种人工组织器官的封装装置及其制备方法和应用。

背景技术

人工组织器官，包括但不限于细胞/类器官/细胞团簇的集合体，或者细胞/类器官/细胞团簇/凝胶态生物材料的集合体，或者含有或者不含有细胞因子的凝胶态生物材料。人工组织器官的构建方法包括但不限于：生物三维打印、凝胶包裹法、悬滴培养法、微图案基底法、细胞片层法、细胞聚集法、细胞自发组装等各种方式。

人工组织器官呈现出与天然组织相似的物理性质(硬度、刚度、高含水量、亲疏水性等)，利用细胞间的自组装或者细胞-材料相互作用，可以形成具有一定功能的体外组织，填补了动物和常规的平面培养细胞等常用模型与天然人体组织之间的巨大差异。目前研究报道的人工组织器官涵盖了神经、脊椎、血管、皮肤、心肌、肾脏、肿瘤、肺、肠道、胃、肝脏、胰腺等多种人体组织和器官。因此，人工组织器官在药物测试与筛选、发育生物学研究、病损组织修复与替代、疾病治疗等现代医学的诸多方面发挥了不可替代的作用。

然而，由于现有技术制备的人工组织器官存在机械强度差、结构可操控性低、功能和力学性能不稳定等问题，导致人工组织器官在制备、培养、诱导、检测、应用、移植等过程中都存在技术瓶颈。

具体地，体外阶段：由于细胞、细胞团簇、凝胶态生物材料等物质较低的硬度、刚度、弹性和蠕变性能、较高的含水量和对外界刺激较低的耐受力，导致人工组织器官的换液和转运、规模化操作、流体刺激培养、空间组合和装配等操作困难，这是人工组织器官体外构建面临的难点问题。此外，人工组织器官发育和功能重建有时需要数月甚至更长的体外培养时间，这对于人工组织器官的长期稳定性和可操控性提出了很高的要求，也是本领域技术的重难点问题。

体内阶段：由于机械强度不足，目前所知的几乎所有人工组织器官都无法承受移植过程中的转移、定位、固定、缝合等手术过程；移植入体内后承受的挤压、牵拉等过程；以及植入后的排异、缺血等生物学影响。导致人工组织器官在移植过程和植入人体后的结构崩塌、错位、游离、坏死、无法与人体融合，达不到预期的修复和替代效果，甚至导致巨大的副作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种人工组织器官的封装装置及其制备方法和应用。

本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种人工组织器官的封装装置，所述封装装置设在人工组织器官的外围，所述封装装置对所述人工组织器官的包封率为20％～100％，所述封装装置具有100Pa～1GPa的硬度。

本发明提供一种设在人工组织器官外围且具有一定机械强度的封装装置，可以对人工组织器官至少起保护和支撑的作用，克服人工组织器官在体内或体外应用过程中因机械强度较弱而导致的一系列问题。

本发明所述封装装置的主材料为具有良好生物相容性、合适的力学性能和合适的降解速率的生物医用材料，具体可根据应用场景和需求进行选择。

优选地，所述生物医用材料选自：医用不锈钢、医用钴基合金、医用钛及其合金、医用镁合金、医用镍钛合金、硅橡胶、纤维素、纤维素衍生材料、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、聚已内酯、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈、聚偶磷氮、聚酸酐亚胺共聚物、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚羟基已酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、聚乙醇酸和聚乙二醇共聚物、左旋聚乳酸、左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物以及其任意组合。

更优选地，所述生物医用材料为聚乙醇酸、聚乙醇酸和聚乙二醇的嵌段共聚物或左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物。

进一步优选地，所述聚乙醇酸和聚乙二醇的嵌段共聚物的制备过程中加入芳香族碳酸酯以增加共聚物的聚合度，从而提高聚合物链长的同时降低材料脆性，提高加工性能。

所述左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物的制备方法包括：在催化剂乙酰丙酮锆的催化作用下，通过L-丙交酯和三亚甲基碳酸酯发生开环聚合反应制备。

本发明所述封装装置可由上述生物医用材料制备得到(制备过程中可根据制备情况酌情添加少量辅料)，也可在上述生物医用材料的基础上添加功能辅料，从而实现更多的功能。

本发明所述封装装置可加入造影剂，用于增强影像观察效果，实现无损检测。

所述造影剂可选自以下材料中的一种或多种：硫酸钡、碘化钠水溶液、泛影葡胺、碘他拉葡胺、碘克沙酸、碘苯六醇、碘普罗胺、碘必乐、碘曲伦、碘化油、碘苯酯等。

本发明所述封装装置在制造和使用过程中，可以加入细胞因子，用于调控人工组织器官和/或体内组织的生长、发育和生理功能，或实现治疗效果。

所述细胞因子包括但不限于以下的一种或多种：肝细胞生长因子、人抑瘤素M、激活素家族、纤维母细胞生长因子家族、表皮生长因子家族、血管内皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、干细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、白介素家族、干扰素家族、肿瘤坏死因子家族、转化生长因子家族、骨形态发生蛋白、血小板炎性生长因子、唾液素家族、五肽促胃酸激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、白血病抑制因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子、趋化因子家族、烟酰胺、烟碱酸、β-巯基乙醇、5-硫唑嘌呤、抗坏血酸、牛垂体提取物、动物纤维素、牛血清蛋白、叔丁基羟基茴香醚、肝素、丁酸钠、丙酮酸钠、氯酸钠、非必需氨基酸、谷氨酰胺等，优选肝细胞生长因子和/或血管内皮生长因子。例如，加入血管内皮生长因子，并可以通过选择不同降解速率的封装装置主体材料，实现对血管内皮生长因子释放速率的控制，达到增强血管再生、维持血管形态和功能的效果。

本发明所述封装装置在制造和使用过程中，可以加入生物活性良好的高分子生物材料，用于调控人工组织器官在体外或体内的生长、发育和生理功能。

所述高分子生物材料包括但不限于以下的一种或多种：多聚赖氨酸、层粘连蛋白、胶原、明胶、纤维蛋白原和纤维蛋白、丝素蛋白、甲壳素、壳聚糖、纤维素、淀粉、透明质酸、右旋糖酐、阿拉伯糖、海藻酸盐等，优选胶原和/或多聚赖氨酸。

本发明所述封装装置在制造和使用过程中，可以加入药物，用于调控人工组织器官在体外/或体内的生长、发育和生理功能，或实现治疗效果。例如，添加抗肿瘤药物，并可以设计和制造微米级的囊泡结构，在红外线照射等特定的刺激条件下，按需实现抗肿瘤药物的释放，达到增强肿瘤治疗的效果。

本发明所述封装装置可定制化设计和制造成为各种形状、尺寸和结构，以适应各类人工组织器官、满足各种用途的要求。

具体地，本发明所述封装装置的尺寸以实现对所述人工组织器官包封率为20％～100％为准，优选地，在所述人工组织器官被包封区域，所述封装装置的内表面与所述人工组织器官的外表面之间的距离为10-5000um。

本发明所述封装装置可设计和制造成为各种形状的立体结构，用于满足不同应用场景的需求。例如，将封装装置设计和制造成类似肝脏基本单元——肝小叶的六边形棱柱结构，用于人工类肝组织的培养和后续使用(如图1中A所示)；又例如，将封装装置设计成中空管状结构，用于人工神经组织的培养和使用(如图1中C所示)。

本发明所述封装装置可设计和制造成单元结构，并根据需求定制化地进行单元结构的装配和组装，以形成更为复杂的结构。例如，本发明所述封装装置可设计成边缘有卡扣、搭扣、凹槽等结构，以便将不同的封装装置单元按需进行“积木”式拼接和装配，如图2所示。

设计成单元结构还可适应不同类型和不同个数的人工组织器官组装的需求。如构建小肠组织-肝组织-肾组织多器官共培养人工组织器官，用于模拟药物在体内经肠内吸收、肝脏代谢以及肾脏排泄的过程，用于体外检测候选药物安全性和进行药物有效性评估。

本发明所述封装装置可定制化设计和制造成整体阵列式提篮结构，以方便地实现人工组织器官的高效规模化换液、快速稳定转移等操作。

本发明所述封装装置可设计和制造成为半封闭式结构，用于人工组织器官的长途运输。

本发明所述封装装置可定制化设计和制造出微流道和宏观贯通流道等附属结构，用于人工组织器官的动态培养。

本发明所述封装装置可定制化设计和制造出支撑、挂钩和半通透等结构，用于人工组织器官的悬空培养和气液培养等需求。

本发明所述封装装置可根据需求设计成复杂/梯度/异质/不规则结构用于组织移植与再生修复、或体内移植组织渗出液收集和检测。

本发明所述封装装置可根据需求设计成具有多腔室的复杂结构，方便与传感器等装置的联动使用，进而检测、反馈和控制人工组织器官和体内组织的生理特征。

第二方面，本发明提供上述人工组织器官的封装装置的制备方法，所述制备方法包括将所述封装装置的材料成型的步骤。

优选地，采用三维打印成型或模具成型。

对于结构较为复杂的封装装置，优先选择三维打印方式，具体可选择以下一种或多种打印方式集成：熔融挤出式三维打印、立体光固化成型技术、选择性激光烧结技术、分层实体制造技术。

封装装置与人工组织器官的结合方式可采用同步制造法或分步制造法。

同步制造法是指同时制造出人工组织器官与封装装置，制造的同时完成人工组织器官与封装装置的结合与装配，如图3中A所示。该方式主要依托三维打印技术，在完成封装装置和人工组织器官打印的同时，完成其结合和装配过程。

分步制造法是指分别制造封装装置和人工组织器官，然后选择合适的时间点，将构建和培养好的人工组织器官与封装装置装配起来，进行后续的人工组织器官的培养、观察、生长调节、药物检测和体内移植等操作，如图3中B所示，此时封装装置可设计独立的盖子，盖子与侧面可以设计成仿螺丝扣合、六角卡扣扣合、侧边卡扣扣合、侧边套合、镶嵌式扣合等方式，以便在人工组织器官与封装装置完成装配后，实现装置的封闭。

采用分步制造法的情况下，封装装置的制造方法包括但不限于三维打印技术和模具成型技术。人工组织器官的制造方法包括但不限于生物三维打印、凝胶包裹法、悬滴培养法、微图案基底法、细胞片层法、细胞聚集法、细胞自发组装等技术。

可根据封装装置和人工组织器官的物质成分、结构、尺寸和最终应用目标选择具体构建方法。

第三方面，本发明提供上述封装装置的应用，包括1)体内阶段、2)体外阶段、3)检测与控制方面。

具体地，体外阶段，封装装置对人工组织器官提供保护、支撑、按需组合、装配和功能维持等作用，可实现安全精准和大规模的人工组织器官培养与运输、高通量人工组织/类器官构建、高通量静态/动态培养与换液等操作，进而实现生物发育研究、高通量药物检测、大气/环境/水体检测等应用。体内阶段，封装装置对人工组织器官提供移植手术的移植体转移、定位和固定、缝合、结构保护、营养代谢维持等作用，进而促进移植组织器官的体内存活、血管化、组织形成和重建等作用，并可以与检测技术结合，实现人工组织器官的体内移植后的结构功能检测、体内生理/病理/肿瘤模型构建，调控疾病发生和发展、药物测试与治疗等临床和临床前研究的需求。此外，封装装置可与传感器整合，具有检测、反馈和控制功能，可检测并调控装置内部和/或外部的组织的生理特征，该功能在体外阶段和体内阶段均可实现，可根据具体需求选择。所述传感器可选自以下传感器中的至少一种：氧气传感器、pH传感器、用于测量胰岛素分泌的电化学传感器等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

在体外阶段，本发明提供的人工组织器官的封装装置，可以对人工组织器官提供保护和支撑，并可以实现不同类型和不同个数的人工组织器官按需组合、装配、联合培养和功能维持等作用，可实现安全精准和大规模的人工组织器官培养与运输、高通量人工组织/类器官构建、高通量静态/动态培养与换液等操作。

本发明提供的人工组织器官的封装装置，可以为对人工组织器官提供力学支撑，增加人工组织器官的稳定性，延长人工组织器官的体外培养时间，实现生物发育研究、长期生理/病理模型的构建。本发明的人工组织器官封装装置由可生物降解或不可生物降解的材料构成，降解速率可调，从几周、几月到几年，以适应不同组织再生的要求。如，肠、肺、肝、肾等软组织和器官的体内再生周期在几周到几月，可以使用天然多糖、天然蛋白等易吸收、降解速度快的材料构成人工组织器官封装装置；骨骼等硬组织或者心肌组织等体内再生周期在几月到几年，可以使用天然高分子等降解周期慢的材料构成人工组织器官封装装置。

在体内阶段，本发明提供的人工组织器官的封装装置可以为人工组织器官提供力学保护，保证人工组织器官在体内移植过程中和植入体内后的结构完整性和长期体内培养的稳定性。

本发明提供的人工组织器官的封装装置可以设计并制作微结构，如挂耳、吊环等微结构，便于封装装置在体内的定位、缝合、固定，避免植入组织的易位，避免人工组织器官的损伤崩塌；还可以通过对封装装置的材料进行修饰/涂覆等加工，促进人工组织器官和封装装置与体内组织的融合、免疫保护，体内血管化、组织形成和重建等作用。

本发明的封装装置可与传感器整合，具有检测、反馈和控制功能，可检测并调控装置内部和/或外部的组织的生理特征，该功能在体外阶段和体内阶段均可实现，可根据具体需求选择，进而实现调控组织降解速率、促进移植物的，并可以与体内无损检测技术结合，实现人工组织器官的体内移植、组织再生与检测、体内生理/病理/肿瘤模型构建，辅助疾病发生和发展、药物测试与开发和疾病治疗等临床和临床前研究的需求。

附图说明

图1为本发明的封装装置的三种结构设计图，A是近似六边形棱柱体结构设计，B是近似空心正方体结构设计，C是近似中空的管状设计；

图2为单元式封装装置以及组合成一个更大体积的封装装置的实物图；

图3为本发明的同步制造法和分步制造法示意图，A为利用三维打印技术和同步制造法制备封装装置和人工组织器官的示意图，B为分步制造法制造封装装置和人工组织器官示意图；

图4为本发明实施例5中含有人工肝组织的封装装置的显微镜观察结果；

图5为本发明实施例7中含有人工肝组织的封装装置在裸鼠体内移植6周后的实物图(A)和组织切片HE染色图(B)；

图6为本发明实施例15中胰腺组织在封装装置中经过动态培养后的分泌功能检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1-9提供一种封装装置与人工肝组织的同步制造技术以及组织培养和应用方法。

实施例1、封装装置主体材料合成

本实施例合成聚乙醇酸和聚乙二醇共聚物作为封装装置的主体材料。通过将聚乙醇酸与聚乙二醇的羟基发生酯交换反应和聚合反应得到多嵌段共聚物，通过随后加入芳香族碳酸酯来增加共聚物的聚合度，提高聚合物链长的同时降低材料脆性，以便提高加工性能。

具体实施方法为：本发明的多嵌段共聚物是通过在催化剂的存在下将聚乙醇酸和聚乙二醇进行酯交换反应制得的，理论上会得到中间体ABA共聚物；通过添加芳香族碳酸酯4-对甲苯基碳酸酯，可以提高ABA共聚物的聚合度，从而得到(AB)n型多嵌段共聚物。其中，ABA共聚物的制备方法为：将32g干燥的聚乙醇酸颗粒，5.7g聚乙二醇在氮气保护下，于235℃搅拌熔融混合，以35mg三氧化二锑为催化剂，在上述条件下搅拌30分钟。后加入1.0g4-对甲苯基碳酸酯，搅拌混合2分钟，将内容物在氮气吹扫下冷却，得到(聚乙醇酸和聚乙二醇)_n的嵌段共聚物。经气相和液相色谱检测，本实施例中合成的聚乙醇酸和聚乙二醇共聚物材料的单体残留量＜1％，溶剂残留＜0.05％；经原子吸收光谱检测，合成的共聚物重金属＜10ppm；硫酸盐灰分＜0.05％。材料的分子量5w，打印性良好。

实施例2、封装装置功能辅料的选择

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种细胞因子，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，血管内皮生长因子主要有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内细胞迁移增殖和血管形成的作用，可以诱导新生血管的生成，所以血管内皮生长因子近些年常被用来治疗良性的血管增生，以及血管增生相关的肿瘤方面的抑制作用。本实施例中选用血管内皮生长因子A(美国，Abcam，ab55566)，在体外培养过程中为细胞提供更好的新陈代谢环境，在体内移植过程中促进移植物快速、充分血管化，提高人工组织器官的活性以及与体内组织的融合度和重建率。

实施例3、封装装置单元结构制造

使用捷诺飞生物科技股份有限公司的多喷头挤出式三维打印设备(Regenovo，Bio-architect X)，该设备同时配备高温/低温温控高精度喷头，使用该设备可实现复杂封装装置单元结构的制造。

将实施例1中合成的聚乙醇酸和聚乙二醇共聚物与实施例2中的血管内皮生长因子A(美国，Abcam，ab55566)混合均匀，收集至无菌料筒内，装载到生物三维打印设备的高温喷头中。对打印程序进行设置：对于高温喷头，打印机以支持速度、轮廓速度、网格速度和挤出速度分别为80mm/s,80mm/s,80mm/s,80μL/s的参数条件下，在无菌的可温控的底面平台上三维打印，底面平台温度设置为25℃，喷头温度设置为180℃。按照设计好的CAD文件与计算机路径，可以构建多种具有复杂结构的三维立体结构。本实施例中制造了边长为1cm、高度为2mm的空心六边形棱柱体结构，表面带有正弦曲线样的镂空花纹，如图1中的A所示，其硬度为110kPa。

本实施例中的封装装置可作为单元，进行积木式组合拼接。例如，本实施例中可将7个六边形棱柱体封装装置进行拼接，内置人工组织器官后可置于6cm培养皿内培养，便于封装装置内人工组织器官的整体式高效规模化换液、快速稳定转移和大规模培养。拼接示意图如图2中B所示。

实施例4、整体阵列式提篮结构制造

本实施例中的封装装置可以设计成阵列式提篮结构，即对应常用的市售24孔板，每个封装装置单元对应一个培养孔，每相邻封装装置间桥接，形成对应24孔板的4×6的阵列式提篮结构，可实现封装装置内人工肝组织的整体式高效规模化换液、快速稳定转移和大规模培养，还可实现不同装置单元对应不同的培养液，一个提篮结构可以进行多组别的药物筛选试验，是高通量药物筛选的基础。

实施例5、同步制造整体式封装装置

5.1人工肝组织的细胞与材料准备

5.1.1制备人工肝组织的细胞的获得与培养

人HepaRG细胞是衍生自人肝原代细胞系的终末分化肝细胞，保留了原代人肝细胞的许多特征。使用扩增培养基对人HepaRG细胞(Sigma)进行平面贴壁培养，每2天更换培养液，当细胞达到85％汇合时按照1:3的比例传代。人正常HepaRG细胞的培养基的成分为：DMEM培养液(Gibco,11960044)中添加10％FBS血清(Gibco,16000)，0.05％的胰岛素(Sigma,I9278)，5×10^-5M半琥珀酸钠氢化可的松(Sigma,H4881)，1％青链霉素(Gibco,15140122)。

5.1.2用于制造人工肝组织的打印墨水的制备

配制21％的聚乙醇酸(Sigma，457620，粘度1.4dL/g)溶液和21％的纤维蛋白原溶液(Sigma-Aldrich，F3879)。

对增殖期间的人HepaRG细胞，先加入PBS润洗表面，然后加入胰酶(Gibco，25200072)覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min后收集，离心得到人HepaRG细胞的沉淀，用基础培养基重悬，得到单细胞悬液。

将人HepaRG细胞悬液与提前加热的聚乙醇酸溶液/纤维蛋白原溶液混合均匀，获得单细胞悬液：人HepaRG细胞浓度为0.5×10⁷个细胞/mL，7％聚乙醇酸溶液和7％纤维蛋白原溶液。

5.2使用三维打印技术同步制造封装装置与人工肝组织

使用捷诺飞生物科技股份有限公司的多喷头挤出式三维打印设备(Regenovo，Bio-architect X)，该设备同时配备高温/低温温控高精度喷头，使用该设备的双喷头实现封装装置与人工肝组织的同步制造。且该打印机配备了非破坏性光学相干层析成像(OCT)系统，可以实现在打印过程中的无损监测，以保证样品质量，减少批次内和批次间差异。

将实施例1中的聚乙醇酸和聚乙二醇共聚物与实施例2中的血管内皮生长因子A混合均匀，收集至无菌料筒内，装载到生物三维打印设备的高温喷头中；将步骤1.2中获得的单细胞悬液收集至无菌料筒内，装载到生物三维打印设备的低温喷头中。对打印程序进行设置：对于高温喷头，打印机以支持速度、轮廓速度、网格速度和挤出速度分别为80mm/s,80mm/s,80mm/s,80μL/s的参数条件下，在无菌的可温控的底面平台上三维打印，底面平台温度设置为25℃，喷头温度设置为180℃；对于低温喷头，打印机以支持速度、轮廓速度、网格速度和挤出速度分别为50mm/s,50mm/s,50mm/s,50μL/s的参数条件下，在无菌的可温控的底面平台上三维打印，底面平台温度设置为25℃，喷头温度设置为10℃。按照设计好的CAD文件与计算机路径，可以构建多种具有复杂结构的三维立体结构。本实施例中制造了实施例4中的整体阵列式提篮结构，提篮结构为对应24孔板的4×6的阵列式提篮结构，其中每个单元边长为1cm、高度为2mm的空心六边形棱柱体结构，表面带有正弦曲线样的镂空花纹，每两个相邻单元间有悬臂梁结构连接，提篮结构两端有提手结构，方便提篮结构整体的稳定转移。

本实施例中使用三维打印的方法构建人工肝组织。采用实施例5中1.2方法制备含有活细胞的打印墨水，使用捷诺飞生物科技股份有限公司的挤出式三维打印设备(Regenovo，Bio-architect X)配合低温温控高精度喷头构建人工肝组织。本实施例中，构建大小为边长0.8cm、高度1.8mm的六边形棱柱体结构，其中每层由10根微丝构成，第二层为夹角90°后的10根微丝，一共10层。

本实施例中，采用同步制造法制备封装装置与人工肝组织，先采用高温喷头，打印封装装置的底面和侧边，随后切换为低温喷头，在封装装置内部打印人工肝组织，随后再切换回高温喷头打印封装装置的顶盖。同步制造的示意图如图3中A所示。

本实施例中，将同步制造法构建完成后的人工肝组织以及封装装置置于含有HepaRG细胞培养液的24孔板内，于37℃、5％CO₂条件下培养30天。

5.3同步制造的封装装置和人工肝组织的大规模培养和换液

本实施例中的封装装置设计成阵列式提篮结构，为对应常用的市售24孔板的4×6的阵列式提篮结构，每个封装装置单元对应一个培养孔，每相邻封装装置间有悬臂梁桥接，可实现封装装置内人工肝组织的整体式高效规模化换液、快速稳定转移和大规模培养，还可实现不同装置单元对应不同的培养液，一个提篮结构可以进行多组别的药物筛选试验，是高通量药物筛选的基础；每个封装装置单元结构的棱柱体边缘设计了一对挂耳结构，便于封装装置单元结构的体内移植和固定。

培养期间，用光学显微镜(Olympus,CX40)每天观察细胞形态变化。培养至第10天时，对封装装置内的人工肝组织进行活死染色检测：使用2uM Calcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。结果如图4所示，A为装载了人工肝组织的封装装置的光学显微镜照片，图中的黑色虚线为封装装置底面的轮廓；B为对人工肝组织进行活死染色，阳性染色的细胞为活细胞。结果显示人工肝组织维持了结构的长期稳定性，培养30天后细胞保持存活，并发育成为类器官。

实施例6、同步制造的封装装置和人工肝组织用于药物检测

本实施例中同步制造获得的封装装置和人工肝组织可用于药物筛选。本实施例中选择胺碘酮药物来评价其肝脏毒性。胺碘酮是一种临床常用的心律失常抑制剂，临床数据表明，高剂量使用胺碘酮和长期治疗频繁地引发病人的肝损伤症状，因为胺碘酮可以累积并且可以在肝组织中持续存在，甚至在治疗停止后很长时间，总累积剂量会造成持续性肝损伤。胺碘酮肝毒性的原因可能是对脂质双分子层的破坏和干扰溶酶体和/或线粒体功能。胺碘酮可能引起严重的肝损伤，导致肝功能衰竭和死亡。

如实施例5中所述，本实施例中的封装装置设计成4×6的阵列式提篮结构，对应常用的市售24孔板。以3个复孔为一个组别，6列依次设计成0μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、1000Mm，将封装装置和人工肝组织暴露于药物24h后，检测胺碘酮的半抑制浓度(IC50值)。

采用CCK8(索莱宝，CA1210)试剂检测给药后的细胞活力。具体操作步骤按CCK8试剂说明书所示：1)向每孔加入10μL CCK-8溶液；2)将培养板在培养箱内孵育1-4小时；3)用酶标仪测定在450nm处的吸光度；4)细胞活力(％)＝[A(加药)－A(空白)]/[A(0加药)－A(空白)]×100，其中A(加药)为具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度，A(空白)为具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度，A(0加药)为具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。在获得不同浓度胺碘酮给药24h后的细胞活力后，可以得到胺碘酮浓度-细胞活力曲线，进而得到细胞活力在50％时的胺碘酮浓度，为本模型中的胺碘酮IC50值。本实施例获得的封装装置和人工肝组织测得的胺碘酮IC50值为15.6μM，相较于目前已有的肝脏细胞/细胞系，更接近于胺碘酮的最大血药浓度0.81μM。

实施例7、同步制造的封装装置和人工肝组织用于体内移植

实施例5中通过同步制造的方式3D打印了封装装置和人工肝组织的4×6阵列式提篮结构，可从提篮结构中剪下一个单元结构，用于体内移植。实施例6中构建的封装装置选用的为实施例1中合成的聚乙醇酸和聚乙二醇共聚物材料，该共聚物的单体为FDA批准临床使用的材料，生物相容性和力学性能好，可以在体内/外为人工肝组织提供支撑、保护的作用；封装装置的单元结构为边长为1cm高度2mm六边形棱柱体，尺寸上适合体内移植；本实施例构建的封装装置结构上模拟了体内肝脏组织的基本结构单元——肝小叶的形状，尺寸上适合体内移植，仿生的结构设计为人工肝组织的形态仿生提供基础；本实施例中的封装装置的构建时在材料内添加了内皮细胞生长因子，在持续培养时可以随着材料的降解进行因子的释放，促进人工肝组织的功能成熟，以及与体内血管的融合和组织内血管化；本实施例中的封装装置利用三维打印技术的优势，在侧边构建精细镂空结构，保证了内置人工肝组织在体外/体内的营养物质交换，同时镂空结构可以促进移植入体内的封装装置与体内组织的融合，促进体内血管与装置内人工组织器官的重建；本实施例中的封装装置在柱体结构的对角设计了挂耳结构，便于封装装置体内移植时通过挂耳结构对装置的体内固定，防止移植后装置在体内的移动、挤压和破坏。本实施例中的封装装置与人工肝组织可用于小鼠体内移植，以及肝损小鼠的体内肝功能重建。

将实施例5中制备得到并培养了30天的封装装置与人工肝组织移植入免疫缺陷裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，BALB/c-nude，N＝9，八周龄，雌鼠)腹腔内。本实施例中，将9只BALB/c小鼠分为三组，每组3只。第一组：腹腔内植入同步制造的封装装置和人工肝组织；第二组：腹腔内植入封装装置；第三组：假手术组。

对9只BALB/c小鼠进行称重，小鼠体重均在20±2g范围内。对小鼠进行麻醉，腹腔注射戊巴比妥(剂量：50mg/kg)进行麻醉。将麻醉后的小鼠仰面平躺固定，剖开腹腔。对第一组的3只小鼠，分别将3个封装装置和人工肝组织移植入3只小鼠的腹腔内，并通过封装装置上的挂耳结构，将封装装置固定于小鼠的肠系膜上，移植后进行缝合；对于第二组的3只小鼠，分别将3个封装装置(不含人工肝组织)植入3只小鼠的腹腔内，并通过封装装置上的挂耳结构，将封装装置固定于小鼠的肠系膜上，移植后进行缝合；对于第三组假手术组，剖开腹腔后直接缝合。手术后小鼠自由饮食，分组饲养于SPF级环境中，12h/12h日照黑暗，持续培养6周。

体内移植6周后，9只小鼠状态良好，对小鼠腹腔注射过量戊巴比妥进行麻醉处死，按照120mg/kg的剂量进行注射。将小鼠仰面平躺固定，剖开腹腔，将移植物取出，用10％福尔马林固定。

剖开腹腔发现，封装装置结构完好，且位置无变化；封装装置内人工组织器官无破损，且通过封装装置的镂空结构与体内组织融合。

本实施例中的动物实验在清华大学动物实验中心内进行，符合中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(IACUC)的规定。

实施例8、体内无损检测

非破坏性光学相干层析成像(Optical Coherence tomography,OCT)技术是一种无损伤的光学成像方法，能够在微米尺度上提供实时的一维深度、二维横截面和三维形体图像。脉冲光在样品不同深度处反射回来的时间是不同的，通过测量脉冲光从样品中反射回来的时间延迟，就可以得到样品深度方向的结构信息。OCT具有非侵入、非接触、非损坏等特点，在生物、医疗、材料等方面有广泛的应用前景，如无损检测、组织/材料厚度测量、表面粗糙度测量、表面和截面成像以及体积损耗测量等，该技术也多用于三维微血管造影，来获得组织内部血流灌注的三维活体成像，临床上多用于眼组织、冠状动脉、消化道、呼吸道、脑皮层、癌症、皮肤等生物组织的成像。

实施例1～5中，同步制造封装装置和人工肝组织使用的是捷诺飞生物科技股份有限公司的多喷头挤出式三维打印设备配备了OCT系统，在构建过程中可以实现对同步制造的封装装置和人工肝组织的无损检测，减少封装装置和人工组织器官批次内和批次间的差异。

实施例7中，可以通过OCT技术对移植入小鼠腹腔内的封装装置和人工肝组织进行实时无损的检测和观察，可进行非侵入性的对体内移植物的活体三维成像，实时观察封装装置/人工组织器官形态、与体内组织融合形态、组织内血管形成情况等。

实施例9、组织再生效果评价

对实施例7中的三组小鼠进行观察发现，均未出现小鼠排异反应。

对实施例7中的三组小鼠进行称重，发现三组间小鼠体重无显著性差异，小鼠体重均在合理增长范围内，为22±2g。毛色柔顺，三组小鼠均无异常，状态良好。

对实施例7中获得的移植物与人工肝组织进行组织做石蜡切片，并进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜(DP70,Olympus)下观察移植物切片，结果如图5所示，可见封装装置保护人工肝组织完成移植过程，并且在后续体内肝组织再生过程中生物降解的同时维持人工肝组织的贯通管道结构，从而促进血管再生和血管化肝组织的形成。

取本实施例中获得的移植物与人工肝组织进行组织切片，进行免疫荧光染色。用0.3％Triton-X(Sigma,X100)破膜处理10min；用10％牛血清白蛋白(bovine serumalbumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)封闭1h；加入一抗溶液，包括anti-ALB antibody(Abcam,ab207327)，anti-CD31 antibody(Abcam,ab28364)。一抗中含有0.3％Triton-X和1％BSA。4℃过夜。用PBS洗涤3次，每次3分钟；加入对应二抗，如Alexa594(Abcam，150080，稀释1000倍)、Alexa/>488(Abcam，150113，稀释1000倍)，室温避光孵育2h后，用磷酸缓冲液(Sigma)冲洗组织3次，每次5分钟；加入1μg/ml的DAPI染色细胞核，室温避光孵育15min。利用激光共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)进行观察。

免疫荧光蛋白表达检测结果表明，植入的封装装置和组织形态良好，封装装置的镂空花纹促进了植入组织与小鼠体内组织的融合，封装装置添加了造血干因子，促进体内毛细血管延镂空结构伸入且维持了成熟肝细胞标志性分泌蛋白(ALB)和内皮细胞标志性蛋白(CD31)的表达。

从体内移植结果可以看出，本发明提供的封装装置在体内缓慢降解，装置内的人工类胰腺组织与小鼠体内组织融合良好，且移植物重建为血管化组织，这些组织具有对应组织的形态特征，并且观察到大量血管和红细胞的存在，证明再生了丰富的功能性血管。

实施例10-19提供一种封装装置与血管化胰腺微球的分步制造技术以及组织培养和应用方法。

实施例10、封装装置的材料选择

10.1封装装置的主体材料合成

本实施例合成左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物材料。在催化剂乙酰丙酮锆的催化作用下，通过L-丙交酯和三亚甲基碳酸酯发生开环聚合反应制备形成左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物。

具体实施方法如下：将15.0gL-丙交酯，8.0g三亚甲基碳酸酯以及12mg乙酰丙酮锆加入聚合管中，将聚合管装在真空装置上，通氮气排空气数次，然后在氮气保护下将原料融化，使之充分混合；一段时间后冷却固化，更换扩散泵抽高真空至4kPa，封管。将聚合管放入温度为190℃的反应烘箱内反应96h。反应完成后，将制得的聚合物取出碾碎，用二氯甲烷溶解，通过砂芯漏斗过滤，然后加入甲醇洗涤多次除去未反应的单体，之后在50℃下真空干燥至恒定重量。产物的聚合物分子量约为2w，反应产率在95％以上。经气相和液相色谱检测，本实施例中合成的左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物的单体残留量＜1％，溶剂残留＜0.05％；经原子吸收光谱检测，合成的共聚物重金属＜10ppm；硫酸盐灰分＜0.05％。

10.2封装装置的功能辅料选择

免疫抑制药物是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。主要用于防止器官移植中的排斥反应和抑制某些自身免疫性疾病的进展等。临床研究表明，在1型糖尿病患者的血液中可查出多种自身免疫抗体，如谷氨酸脱羧酶抗体(GAD抗体)、胰岛细胞抗体(ICA抗体)等。这些异常的自身抗体可以损伤人体胰岛分泌胰岛素的B细胞，使之不能正常分泌胰岛素，因此对于胰腺功能障碍的机体往往存在对胰腺组织的免疫排斥反应，必须给予免疫排斥抑制剂。本实施例中选用临床常用的免疫抑制药物——环孢素，来抑制封装装置植入体内后的免疫排斥反应。

造影剂是为增强影像观察效果而注入(或服用)到人体组织或器官的化学制品。这些制品的密度高于或低于周围组织，形成的对比用某些器械显示图像。碘曲伦是目前常用的水溶性造影剂，可用于CT造影。

实施例11、封装装置单元结构制造

使用捷诺飞生物科技股份有限公司的多喷头挤出式三维打印设备(Regenovo，Bio-architect X)，该设备同时配备多个高温/低温温控高精度喷头，使用该设备可实现复杂封装装置单元结构的制造。

将实施例10中的左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物与抑制剂(环孢素)混合均匀，收集至无菌料筒内，装载到生物三维打印设备的1号高温喷头中；将实施例10中的左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物与造影剂(碘曲伦)混合均匀，收集至无菌料筒内，装载到生物三维打印设备的2号高温喷头中。对打印程序进行设置：对于双高温喷头，打印机的支持速度、轮廓速度、网格速度和挤出速度均为80mm/s,80mm/s,80mm/s,80μL/s，在无菌的可温控的底面平台上三维打印，底面平台温度设置为25℃，喷头温度设置为180℃。按照设计好的CAD文件与计算机路径，可以构建多种具有复杂结构的三维立体结构。本实施例中1号高温喷头和2号高温喷头进行切换，即1号喷头打印一层含环孢素的左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物材料，立即切换成2号喷头打印一层含碘曲伦的左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物材料。本实施例制造了边长为1cm、高度为1cm的空心正方体结构，表面带有正弦曲线样的镂空花纹，如图1中B所示，其硬度为560kPa。

实施例12、胰腺细胞微球制备

12.1细胞的培养和分化

人脂肪来源间充质干细胞(Adipose-derived stem cell，ADSC)(Sciencell,7510)在ADSC细胞扩增培养液中进行培养，ADSC细胞扩增培养液按照MSCM培养基试剂盒(Sciencell,7501)进行配制；培养瓶预先使用无菌水稀释8倍的PLL溶液(Sigma,P4832)进行铺底，铺底1h；当细胞90％汇合时按照1:3的比例传代，每2-3天更换一次培养液。

人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)(ATCC,PCS-100-010)在HUVEC细胞扩增培养液中进行培养。HUVEC细胞扩增培养液按照EBM-2培养基试剂盒(LONZA,CC-3162)进行配制。当细胞90％汇合时按照1:3的比例传代，每2-3天更换一次培养液。

使用第4代的ADSC细胞进行分化。分化前使用上述方法对普通24孔板进行铺底。将ADSC细胞用0.25％的trypsin/EDTA(Gibco,25200)的消化液消化后，1200rpm离心5min收集细胞沉淀，以2×10⁵个/ml的密度悬浮在ADSC细胞分化培养液中，得ADSC细胞溶液，24孔板每个孔加入1ml ADSC细胞溶液。分化液的成分为在1:1体积比混合的DMEM培养基(Gibco,11965)和DMEM/F-12培养基(Gibco,11320)中，加入10mM烟酰胺(Sigma,72340)，2nM激活素A(R&D,294-HG)，10nM唾液素4(Sigma,E7144)，10nM五肽胃泌素(Sigma,B1636)，100pM肝细胞生长因子(Sigma,SRP6014)，2％B-27补充剂(Gibco,17504)，1％N-2补充剂(Gibco,A13707)，1％青链霉素(Gibco,15140122)，每2-3天进行换液，共分化7天，得类胰腺(ILC,islet-like cell)细胞团。然后收集2个24孔板中平面预分化得到的类胰腺细胞团，用0.25％的trypsin/EDTA的消化液消化后，500rpm离心1min收集细胞团簇，用320μL ADSC细胞分化培养液重悬，得到类胰腺细胞团溶液。

12.2材料准备

本实施例中使用海藻酸钠、明胶和基质胶材料构建血管化胰腺细胞微球。

海藻酸钠溶液的配置方法：将海藻酸钠粉末(Sigma,A2033)与0.9％氯化钠溶液按照质量比为4:100的比例混合，将溶液振荡涡旋1分钟，在60℃条件下加热2小时，再重复此振荡涡旋和加热的操作2次，最终使其均匀溶解，于4℃低温保存。

明胶溶液的配制方法：将明胶粉末(Sigma,G1890)与0.9％氯化钠溶液按照质量比为15:100的比例混合，将溶液振荡涡旋1分钟，在60℃条件下加热2小时，再重复此振荡涡旋和加热的操作2次，最终使其均匀溶解，分装后低温保存。

基质胶溶液的配置方法：将基质胶(Corning,356234)4℃解冻后，在冰上将其分装，于-20℃低温保存。使用前在4℃解冻，并在24h内使用。

12.3胰腺细胞微球的制备

采用海藻酸钠/明胶/基质胶体系作为微球主体材料，用非接触式高压静电发生器制成凝胶态实心多孔细胞微球：用0.25％的trypsin/EDTA消化液消化第3代HUVEC细胞，用120μl HUVEC细胞扩增培养液进行重悬，得HUVEC细胞悬液，细胞浓度为6×10⁶个/ml；ILC细胞团溶液和HUVEC细胞溶液混合，得到多种细胞的细胞悬液；取海藻酸钠溶液400μL、基质胶480μL在冰上和细胞溶液混合，置于37℃的细胞培养箱5min；加入明胶溶液400μL，混合后得打印溶液，并将其装载到10mL一次性无菌注射器中。

连接非接触式高压静电微球发生器，本设备的高压静电发生装置采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压10kV；打印液推进装置采用LongerPump公司TS2-60型注射泵，推进速度10mL/h，采用内径为191μm的针头，收集器为直径60mm的玻璃培养皿，固化液为100mmol/L的氯化钙溶液。

在5分钟内收集细胞微球，用生理盐水洗涤两次后观察记录，细胞微球形状圆整光滑，粒径为300μm。常规条件下(37℃，5％CO2孵箱)培养胰腺细胞微球7天，使用ADSC细胞分化培养基和HUVEC细胞扩增培养基1:1体积比混合得到的混合培养基进行培养，培养过程中每2～3天换液。

实施例13、体外动态培养封装装置内的血管化胰腺细胞微球

将实施例12中培养7天后的胰腺细胞微球置于实施例11得到的封装装置内，每个封装装置放置500个胰腺微球，动态培养于封装装置单元内的胰腺细胞微球。将封装装置置于微重力生物反应器(比瑞生物科技，RCCS-1)中进行动态培养，连续培养7天。微重力生物反应器可以模拟微重力环境，具有充分的氧和营养物质交换和独特的流体力学特征等优点。对封装装置内的细胞微球换液时仅需将封装装置转移至新鲜培养基内，一步实现对细胞微球的大规模换液。持续动态培养7天，每天换液。同时将无封装装置的等量胰腺微球直接置于微重力生物反应器中进行动态培养，持续动态培养7天，每天换液。另取等量微球做时间平行的静态培养对照。

培养至第14天时，分别对静态培养和动态培养的胰腺微球进行活死染色检测：使用2uM Calcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。

结果显示，封装装置内培养的胰腺微球形态完整，存活率最高，为92.15±0.17％；无封装装置的胰腺微球在动态培养时由于路径不受限，出现大量的机械撞击，导致微球结构破损，大量细胞外溢，存活率为75.41±0.34％；静态培养的胰腺微球出现了明显的核心坏死现象，且细胞团直径较动态培养组小，存活率为85.3±0.97％。结果显示，有封装装置的胰腺微球存活率显著高于无封装装置的胰腺微球和静态培养的胰腺微球，说明动态培养优于静态培养；其次，在动态培养过程中，封装装置可以为胰腺微球提供力学保护和支撑，约束细胞微球运动路径，减少和避免细胞微球的机械损伤，维持细胞微球的形态完整，提高微球内细胞的存活率。

实施例14、封装装置内的血管化胰腺细胞微球的长途运输

将血管化胰腺细胞微球至于实施例11获得的封装装置单元内进行培养。每个封装装置单元内装200～300个微球。将独立的封装装置单元进行拼接，每5个封装装置拼接成一个单元，则一个封装装置单元内共有500个微球。每个封装装置单元置于6cm培养皿内并利用无菌封口膜进行固定，皿内灌满ADSC细胞分化培养基和HUVEC细胞扩增培养基1:1体积比混合得到的混合培养基。封装装置单元可以用于长途运输。

本实施例中的封装装置为半封闭结构，可以保证内部胰腺微球的营养物质和代谢物质的交换；封装装置采用聚合物材料，力学性能好，为胰腺微球提供了力学支撑；在每个封装装置内置入适量的微球，可以固定胰腺微球的运动路径，减少运输/转移过程中的颠簸给胰腺微球造成的撞击和机械损伤；封装装置的半封闭结构，保证了胰腺微球在运输过程中的营养物质的获取和代谢废物的排出。

实施例15、对封装装置和胰腺细胞微球的体外功能评价

15.1免疫荧光染色检测胰腺微球的胰岛细胞蛋白表达

使用常规免疫荧光染色法检测实施例13中胰岛细胞团关键蛋白的表达。具体操作步骤为：

吸去培养液，用磷酸缓冲液(phosphatic buffer solution,PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤1次；用4％多聚甲醛在室温下固定5分钟，用PBS洗涤1次；用0.3％Triton-X(Sigma,X100)破膜处理10min；用10％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)封闭1h；加入一抗溶液，包括anti-PAX6 antibody(Abcam,ab5790)，anti-Isl1antibody(Abcam,ab86472)，anti-PDX1 antibody(Abcam,ab47383)，anti-insulin antibody(Abcam,ab7842)。一抗中含有0.3％Triton-X和1％BSA。4℃过夜。用PBS洗涤3次，每次3分钟；加入对应二抗，如Alexa594(Abcam，150080，稀释1000倍)、Alexa/>488(Abcam，150113，稀释1000倍)，室温避光孵育2h后，用磷酸缓冲液(Sigma)冲洗组织3次，每次5分钟；加入1μg/ml的DAPI染色细胞核，室温避光孵育15min。利用激光共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)进行观察。

15.2酶联免疫吸附法检测胰腺微球的胰岛细胞蛋白表达

在实施例13中培养终点时收集胰腺微球的上清液，检测上清液中胰岛素分泌水平，评估胰腺微球的功能水平。本实施例中使用Abcam公司的人胰岛素Elisa检测试剂盒(Abcam，ab100578)进行检测。

具体操作步骤为：

(1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μL，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μL，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μL分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μL，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μL弃掉，再各取50μL分别加到第五、第六孔中。

(2)再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50uL，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μL分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第七、第八孔中分别取50μL加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第九第十孔中各取50μL弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为24mU/L，16mU/L，8mU/L，4mU/L，2mU/L)。

(3)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液50μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

(5)配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

(7)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。

(8)温育：操作同3。

(9)洗涤：操作同5。

(10)显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

(11)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(12)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

检测结果如图6所示。胰腺微球先常规静态培养7天，后置于封装装置内动态培养7天。在封装装置内动态培养7天的胰腺微球的胰岛素分泌量显著性高于静态培养的胰腺微球的胰岛素分泌量。且动态培养的胰腺微球的胰岛素分泌量是平面培养的胰腺细胞分泌量的4倍以上，数据呈显著性差异，***表示p<0.001。说明有动态培养的有封装装置的胰腺微球功能更好。

实施例16、分步制造的封装装置和胰腺细胞微球用于体内移植

在实施例11中，可获得主体材料为左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物，添加材料为造影剂(碘曲伦)和免疫抑制药物(环孢素)的封装装置。将培养了7天的胰腺细胞微球至于含有上述两种添加物的封装装置内进行动态培养7天。每个封装装置内装100个微球。将封装装置与胰腺微球移植入2型糖尿病小鼠模型(T2DM小鼠)(北京赛业生物公司，C57BL/6J，N＝12，八周龄，雌鼠)腹腔内。本实施例中，将12只C57BL/6J小鼠分为三组，每组4只。第一组：腹腔内植入添加了免疫抑制药物和造影剂的封装装置和胰腺微球；第二组：腹腔内植入胰腺微球(无封装装置)；第三组：假手术组。对12只C57BL/6J小鼠进行称重，小鼠体重均在20±2g范围内。对小鼠进行麻醉，腹腔注射戊巴比妥(剂量：50mg/kg)进行麻醉。将麻醉后的小鼠仰面平躺固定，剖开腹腔。对第一组的4只小鼠，分别将添加了免疫抑制药物和造影剂的封装装置和胰腺微球移植入每只小鼠的腹腔内，并通过封装装置上的挂耳结构，将封装装置固定于小鼠的肠系膜上，移植后进行缝合；对于第二组的4只小鼠，每只小鼠分别植入100个胰腺微球于小鼠的腹腔内；对于第三组假手术组，剖开腹腔后直接缝合。

术后每24h给予小鼠腹腔注射50mg/kg的环孢素，分笼饲养于SPF级环境中，自由饮食。培养6周后，对小鼠腹腔注射过量戊巴比妥进行麻醉处死，按照120mg/kg的剂量进行注射。将小鼠仰面平躺固定，剖开腹腔，将移植物取出。

本实施例中的动物实验在清华大学动物实验中心内进行，符合中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(IACUC)的规定。

实施例17、分步制造的封装装置和胰腺细胞微球的无损检测

实施例11得到的封装装置添加了造影剂(碘曲伦)，可以实现封装装置及移植物的体内/外的无损检测。碘曲伦是目前常用的水溶性造影剂，可用于CT造影。在实施例16中，将封装装置及胰腺细胞微球移植入小鼠体内后，对小鼠进行CT造影，可以对小鼠体内移植的封装装置和移植物进行实时的无损检测，可观察到小鼠体内封装装置的位置、形态，以及内部胰腺微球的位置和组织融合情况。

实施例18、分步制造的封装装置和胰腺细胞微球的传感和控制

本发明中的封装装置可以连接传感器，实现对封装装置内人工组织器官的检测、反馈和控制功能。

本实施例中，可以在封装装置上安装一个动态血糖仪(雅培瞬感动态血糖仪)的微型传感器，该传感器长为直径34mm、长6mm的圆柱体，内置一个长5mm、直径0.4mm的柔性探头，探头可通过组织液测量移植物的血糖分泌水平，可在体内/外实现对封装装置内移植物血糖分泌水平的实时监测。

本实施例中封装装置可再连接一个控制器。通过传感器将血糖分泌数据实时发送至控制器。当血糖分泌水平低于设定值时，控制器可释放培养体系里的葡萄糖水平，维持封装装置及细胞微球体系内的血糖稳态环境。

实施例19、分步制造的封装装置和胰腺细胞微球存活和功能评价

本实施例中的12只小鼠均存活。对小鼠剖开腹腔发现，第一组封装装置结构完好，且位置无变化；第一组内的封装装置内胰腺组织通过封装装置的镂空结构与体内组织融合，且无明显免疫排斥反应；第二组内胰腺微球位置移动，微球结构被吸收，胰腺组织已弥散性扩散在腹腔内，无法识别。可知封装装置可以有效为移植物提供力学支撑，保护移植人工组织器官在小鼠体内的完整性；且封装装置的挂耳结构可以使移植物在体内的固定，并避免微球类移植物的扩散和破损。

本实施例中对T2DM小鼠进行胰腺微球移植，小鼠对移植物产生免疫排斥反应，需持续给予足量的免疫抑制药物。本实施例中，移植后给予小鼠腹腔注射半量环孢菌素。第一组封装装置的内添加了免疫抑制药物(环孢素)，在体内培养时，可以在体内缓慢释放药物，移植物与小鼠体内组织融合良好，移植物附近无明显的免疫排斥反应。第二组无封装装置，胰腺细胞微球在腹腔内扩散，且在胰腺微球附近出现了免疫排斥反应。

本实施例中的封装装置基于3D打印技术，可以装置侧面构建精细镂空结构，保证了内置人工肝组织在体外/体内的营养物质交换，同时镂空结构可以促进移植入体内的封装装置与体内组织的融合，促进体内血管与装置内人工组织器官的重建。

对本实施中获得的移植物与胰腺组织进行组织做冰冻切片，并进行苏木精-伊红染色。从体内移植结果可以看出，本发明提供的胰腺微球结构在体内被降解和吸收，微球内胰腺细胞团形成人工胰腺组织；封装装置在体内缓慢降解；第一组的封装装置可以在体内缓慢释放免疫抑制药物，装置内的人工类胰腺组织与小鼠体内组织融合良好，且移植物重建为血管化组织，这些组织具有对应组织的形态特征，并且观察到大量血管和红细胞的存在，证明再生了丰富的功能性血管；第二组因为无封装装置，胰腺微球在小鼠腹腔内无序弥散，已无法获取移植物的完整形态。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (13)

1.一种人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述封装装置设在人工组织器官的外围，所述封装装置对所述人工组织器官的包封率为20%~100%，所述封装装置具有100Pa~1GPa的硬度；在所述人工组织器官被包封区域，所述封装装置的内表面与所述人工组织器官的外表面之间的距离为10-5000um；所述封装装置的主材料为聚乙醇酸和聚乙二醇的嵌段共聚物；或者，所述封装装置的主材料为左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物；

所述聚乙醇酸和聚乙二醇的嵌段共聚物的制备方法包括：将32g干燥的聚乙醇酸颗粒，5.7g聚乙二醇在氮气保护下，于235℃搅拌熔融混合，以35mg三氧化二锑为催化剂，在上述条件下搅拌30分钟，后加入1.0g 4-对甲苯基碳酸酯， 搅拌混合2分钟，将内容物在氮气吹扫下冷却；

所述左旋聚乳酸-聚三亚甲基碳酸酯共聚物的制备方法包括：将15.0gL-丙交酯，8.0g三亚甲基碳酸酯以及12mg乙酰丙酮锆加入聚合管中，将聚合管装在真空装置上，通氮气排空气数次，然后在氮气保护下将原料融化，使之充分混合；一段时间后冷却固化，更换扩散泵抽高真空至4kPa，封管；将聚合管放入温度为190℃的反应烘箱内反应96h；反应完成后，将制得的聚合物取出碾碎，用二氯甲烷溶解，通过砂芯漏斗过滤，然后加入甲醇洗涤多次除去未反应的单体，之后在50℃下真空干燥至恒定重量。

2.根据权利要求1所述的人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述封装装置还包括功能辅料，所述功能辅料包括造影剂、细胞因子、高分子生物材料、药物中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述细胞因子包括以下的一种或多种：肝细胞生长因子、人抑瘤素M、激活素家族、纤维母细胞生长因子家族、表皮生长因子家族、血管内皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、干细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、白介素家族、干扰素家族、肿瘤坏死因子家族、转化生长因子家族、骨形态发生蛋白、血小板炎性生长因子、唾液素家族、五肽促胃酸激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、白血病抑制因子、神经生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子、趋化因子家族、烟酰胺、烟碱酸、β-巯基乙醇、5-硫唑嘌呤、抗坏血酸、牛垂体提取物、动物纤维素、牛血清蛋白、叔丁基羟基茴香醚、肝素、丁酸钠、丙酮酸钠、氯酸钠、非必需氨基酸、谷氨酰胺；

和/或，所述高分子生物材料包括以下的一种或多种：多聚赖氨酸、层粘连蛋白、胶原、明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、丝素蛋白、甲壳素、壳聚糖、纤维素、淀粉、透明质酸、右旋糖酐、阿拉伯糖、海藻酸盐。

4.根据权利要求3所述的人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述细胞因子为肝细胞生长因子和/或血管内皮生长因子；

和/或，所述高分子生物材料为胶原和/或多聚赖氨酸。

5.根据权利要求1所述的人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述封装装置为单元结构或多个单元结构的组合。

6.根据权利要求5所述的人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述单元结构边缘设有组装连接部件，包括卡扣、搭扣、凹槽中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述封装装置为规则或不规则结构。

8.根据权利要求7所述的人工组织器官的封装装置，其特征在于，所述封装装置为整体阵列式提篮结构，

或，所述封装装置为半通透结构，

或，所述封装装置为多腔室结构，

和/或，所述封装装置设有附属结构，所述附属结构包括微流道、流道、支撑件、悬挂件中的一种或多种。

9.权利要求1~8任一项所述的人工组织器官的封装装置的制备方法，其特征在于，包括将所述封装装置的材料成型的步骤。

10.根据权利要求9所述的人工组织器官的封装装置的制备方法，其特征在于，采用三维打印成型或模具成型。

11.根据权利要求9所述的人工组织器官的封装装置的制备方法，其特征在于，所述封装装置与所述人工组织器官同步制备或分步制备。

12.权利要求1~8任一项所述的人工组织器官的封装装置在1）人工组织器官的培养、组合、装配、换液、转运、功能维持，2）检测与控制方面的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，将所述封装装置与传感器结合，用于实现人工组织器官的检测、反馈和控制。