CN112752788A - 3d打印用生物墨水 - Google Patents

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罗伯特·哈迪诺托·乌塔马
文森特·蒂特·关·谭
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NewSouth Innovations Pty Ltd
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Abstract

本技术涉及一种由使用含双硫醇的具有至少两个巯基官能团的交联剂交联的含马来酰亚胺聚合物形成的3D打印水凝胶、制备该3D打印水凝胶的方法及其用途。

Description

3D打印用生物墨水
相关申请
本申请要求2018年7月24日提交的、名称为“3D打印用生物墨水”的澳大利亚临时专利申请2018902674的权益，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本技术广泛涉及3D打印用生物墨水。特别地，本技术涉及由使用交联剂交联的聚合物形成的3D打印水凝胶、制备该水凝胶的方法及其用途。
背景技术
细胞在体内三维存在于细胞外基质(ECM)内。细胞与ECM之间的相互作用在控制细胞的生物特征和行为方面发挥重要的作用。在癌症生物学中，三维(3D)体外细胞培养分析法用于在密切模拟细胞天然环境的环境中培养细胞。此类分析法维持了在二维单层培养中不存在的生理学上细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用。
3D生物打印采用3D技术将细胞与其他生物材料结合在一起来制备可模拟ECM的合成结构。一般地，3D生物打印机利用按需滴定或挤出打印技术打印3D体外分析。尽管按需滴定生物打印已被报道可在打印时保持高细胞活力，但由于当前3D生物墨水的粘度和细胞密度低，与其挤出技术相比，该技术仍然不太常使用。
水凝胶，无论是合成的还是天然的，皆已广泛用作ECM模拟物。特别地，合成水凝胶具有高度可再生性并能很好地控制物理和细胞响应性能，这对于用于体外研究的ECM模拟物是非常理想的。目前用于手动创建3D体外分析的方法主要使用
Figure BDA0002978135910000011
或胶原蛋白作为ECM模拟物。其他广泛使用的材料为透明质酸、壳聚糖和海藻酸。由于它们来源于天然产物，所以天然水凝胶一般具有生物相容性，并且在某些情况下携带细胞-基质相互作用所必需的生物分子。但是，天然水凝胶作为ECM模拟物是有限制的，因为它们易受批次间可变性的影响，缺乏物理和生物化学模块性，和/或难以处理。
为了克服天然水凝胶的各种限制，已制备了各种合成水凝胶。特别地，共价交联的合成水凝胶可提供比天然水凝胶更坚固和物理上更精确的系统。然而，许多这些合成水凝胶都缺少促进细胞-基质相互作用的生物化学特性。进一步，为了将共价交联的合成水凝胶应用于细胞的3D生物打印，材料应具有生物相容性，以使细胞在水凝胶内原位打印。例如，虽然聚(丙烯酰胺)poly(acrylamide)是在细胞生物学(Caliari与Burdick，2016)上使用的可生物相容的合成水凝胶，但是相应的水凝胶前体不具有生物相容性，因此不适合细胞的3D生物打印。
目前3D生物打印的方法包括UV引发的自由基交联反应，该反应可快速形成水凝胶(Murphy与Atala、2014；Donderwinkel等，2017:Jungst等、2016Lowe等，2014)。例如，人们发现，可光联接的丙烯酸化PEG和肽的喷墨打印适合生成用于包封间充质干细胞的3D水凝胶结构(Gao等人，2017；Gao等人，2015)。然而，虽然已经证明了这种方法在活细胞的3D生物打印中的潜在应用，但是使用UV照射来引发光交联可对活生物体中的DNA造成损伤，同时产生的自由基也会损伤敏感细胞。
近年来，3D生物打印技术取得了重大进展，有可能缓解目前3D体外细胞培养分析的局限性。然而，尽管3D打印细胞培养的益处已被充分证实，但3D打印体外分析在细胞生物学中的应用仍然受到其复杂性、劳动密集型和低产量的限制。因此，需要替代性ECM模拟物以用于3D生物打印。
概述
本发明人已研发了适用于3D打印的生物墨水，该生物墨水具有生物相容性并且能通过基本上无毒性化学路径快速形成水凝胶。
在第一方面，本技术提供了一种由使用具有至少两个巯基官能团的含双硫醇交联剂交联的含马来酰亚胺聚合物形成的3D打印水凝胶。
含双硫醇的交联剂可包括两个以上的巯基官能团。
在一个实施方案中，通过使用3D打印机将包含含马来酰亚胺聚合物(聚合物生物墨水)的溶液与包含含双硫醇交联剂(激活剂)的溶液合并在一起，形成水凝胶。
在一个实施方案中，3D打印水凝胶在从打印聚合物生物墨水和激活剂开始约30分钟或更短、10分钟或更短、1分钟或更短、30秒或更短、10秒或更短、1秒或更短的时间内形成。
在一个实施方案中，聚合物生物墨水与细胞生物相容。
在一个实施方案中，激活剂与细胞生物相容。
在一个实施方案中，聚合物生物墨水和激活剂在3D打印期间进行结合时形成与细胞生物相容的水凝胶。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺的聚合物选自含马来酰亚胺的多糖，如含果糖、蔗糖或葡萄糖单体的聚合物；合成聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)马来酰亚胺、聚(甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)马来酰亚胺、聚(ε-己内酯)(PCL)马来酰亚胺、聚(乙烯醇)(PVA)马来酰亚胺、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)马来酰亚胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAAM)马来酰亚胺、聚(富马酸丙烯酯)(PPF)马来酰亚胺、聚(亚乙基亚胺)(PEI)马来酰亚胺、聚(3-甲基丙烯酰胺丙基)三甲基铵(PMAETMA)马来酰亚胺、聚(L-赖氨酸)(PLL)马来酰亚胺、聚(丙烯酸)(PAA)马来酰亚胺、聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)马来酰亚胺、聚(丙烯酸-stat-二甲氨基乙基甲基丙烯酰胺)(P(AA-stat-DMAEMA))马来酰亚胺，和聚(甲基丙烯酸精氨酸)马来酰亚胺，或者以上物质的衍生物；含马来酰亚胺的生物聚合物，如明胶马来酰亚胺、纤维素马来酰亚胺、透明质酸马来酰亚胺和海藻酸盐马来酰亚胺；含马来酰亚胺的核碱基聚合物(即含有马来酰亚胺的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和/或胞嘧啶重复单元的聚合物)；或其任意组合。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物包括聚(乙烯醇)(PEG)马来酰亚胺。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物包括明胶马来酰亚胺。
在一个实施方案中，含双硫醇交联剂选自合成聚合物、生物聚合物、小分子、生物活性分子，或其任意组合。
在一个实施方案中，合成聚合物选自PEG双硫醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-双硫醇(NIPAAM-双硫醇)、聚(丙烯酸)-双硫醇、聚(甲基丙烯酸)-双硫醇，聚(苯乙烯磺酸盐)-双硫醇，聚(酰胺)-双硫醇，或其任意组合。在一个实施方案中，含双硫醇交联剂为PEG-双硫醇。
在一个实施方案中，生物聚合物选自硫醇-明胶、硫醇-纤维素、硫醇-壳聚糖、硫醇-透明质酸，或其任意组合。
在一个实施方案中，小分子为二硫苏糖醇(DTT)。
在一个实施方案中，生物活性分子选自具有至少两个半胱氨酸基团的短链肽、惰性短链肽、酶响应性短链肽、基质金属蛋白酶(MMP)响应性肽，或其任意组合。
在一个实施方案中，含双硫醇生物活性分子选自MMP响应性双半胱氨酸肽。
在一个实施方案中，MMP响应性肽可以为GCIPVSLRSGCG、GCRDGPQGIWGQDRCG、GCRDPLGLDRCG、GCRDEAPLKQDRCG，或其任意组合。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物为PEG-马来酰亚胺；并且含双硫醇交联剂选自PEG-双硫醇、或MMP响应性肽，或者它们的组合。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物是被至少一个选自RGD、YIGSR和IKVAV的生物活性分子取代的PEG-马来酰亚胺，所述含双硫醇交联剂选自PEG-双硫醇、MMP响应性肽，或者它们的组合。
在一个实施方案中，MMP响应性肽为GCIPVSLRSGCG、GCRDPLGLDRCG，或着它们的组合。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物为明胶马来酰亚胺，含双硫醇交联剂为PEG-双硫醇。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物为明胶马来酰亚胺，含双硫醇交联剂为PEG-双硫醇。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物与含双硫醇交联剂的摩尔比的范围为约10:1～约1:10。含双硫醇交联剂中的硫醇基团与含马来酰亚胺聚合物中马来酰亚胺基团的比例可为大于约60％。
通过将一滴生物墨水打印到基底上，然后再打印一滴激活剂，形成水凝胶液滴，进而形成水凝胶，或者将一滴激活剂施用到基底上，然后再打印一滴聚合物生物墨水，形成水凝胶。重复打印步骤形成水凝胶。在打印过程中，细胞可以包含在聚合物生物墨水、激活剂中或者既包含在聚合物生物墨水又包含在激活剂中。此外或可选择地，细胞可包含在细胞培养基中。细胞培养基可包括在聚合物生物墨水、激活剂内，或者它可与聚合物生物墨水和激活剂分离。例如，细胞培养基可悬浮在由聚合物生物墨水和激活剂形成的3D打印水凝胶层之间，或者它可以沉积在水凝胶的表面上。
在一个实施方案中，基底选自任意适宜的容器。示例包括不同孔结构(6、24、48和96孔)的微滴定板、具有不同孔结构(6、24、48和96孔)的盖玻片底部的微滴定板、各种尺寸的荧光皿(fluorodish)、不同孔结构(1、2、4、8和16)的室载玻片、盖玻片或显微镜载玻片。容器可适用于包含、保持或生长细胞。
在一个实施方案中，3D打印水凝胶进一步包含生物活性分子。生物活性分子可与含马来酰亚胺聚合物或含双硫醇交联剂连接，或者既与含马来酰亚胺聚合物结合又与含双硫醇交联剂结合。此外或可选择地，游离的生物活性分子可存在于3D打印水凝胶中。游离的生物活性分子可存在于聚合物生物墨水、激活剂中；或者既存在于聚合物生物墨水中又存在于激活剂中。生物活性分子可选自肽、MMP响应性肽、蛋白质、多糖、药物、治疗剂、抗体、小分子抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、抗原、病原体、血小板、生长因子、细胞因子、氨基酸、营养素、条件培养基、抗生素、抗病毒药物、RNA及其任意组合。还可将纳米颗粒加入到3D打印水凝胶中。
在一个实施方案中，生物活性分子选自CRGDS、CIKVAV、CYIGSR、含C末端未配对半胱氨酸的VEGF、蛋白质(例如，层粘连蛋白、胶原蛋白)和MMP响应性肽(例如，GCIPVSLRSGCG、GCRDGPQGIWGQDRCG、GCRDPLGLDRCG、GCRDEAPLKQDRCG)；及其任意组合。
在一个实施方案中，3D打印水凝胶进一步包含细胞培养基。适宜培养基的示例包括Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、最低基本培养基(MEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、Media 199、Ham F10、Ham F12、McCoy 5A和Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)培养基。细胞培养基可存在于聚合物生物墨水、激活剂中，或者既存在于聚合物生物墨水中又存在于激活剂中。
在一个实施方案中，水凝胶中含有细胞。
在一个实施方案中，细胞存在于聚合物生物墨水中、存在于激活剂中、既存在于聚合物生物墨水又存在于激活剂中，或者在进行3D打印之前先存在于单独的培养基中以允许打印含细胞的水凝胶。
在一个实施方案中，细胞悬浮在一部分水凝胶内。
在一个实施方案中，细胞大体上均匀地悬浮在整个水凝胶中。
打印细胞的浓度范围可以为大约1×105～大约5×108个细胞/mL。将理解，可打印较低或较高浓度的细胞，形成含细胞的打印水凝胶。
在一个实施方案中，细胞可选自肝细胞、胃肠道细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、乳腺细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、雪旺细胞、脂肪细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、周细胞、间皮细胞、内分泌组织衍生细胞、基质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、内胚层衍生细胞、外胚层衍生细胞或中胚层衍生细胞，或其任意组合。细胞可包括癌细胞。
在第二方面，本技术提供了一种制备3D打印水凝胶的方法，该方法包括以下步骤：
提供聚合物生物墨水，所述聚合物生物墨水包括含马来酰亚胺聚合物；
提供激活剂，所述激活剂包括含双硫醇交联剂，所述交联剂具有至少两个巯基官能团；以及
打印聚合物生物墨水和激活剂，形成3D打印水凝胶。
在一个实施方案中，该方法进一步包括提供细胞，形成含细胞的3D打印水凝胶。细胞可存在于聚合物生物墨水中、存在于激活剂中、既存在于聚合物生物墨水中又存在于激活剂中，或者在进行3D打印之前先存在于单独的培养基中。
在一个实施方案中，3D打印水凝胶在从聚合物生物墨水和激活剂打印开始30分钟或更短，或者10分钟或更短，或1分钟或更短，或30秒或更短，或10秒或更短，或1秒或更短的时间内形成。
在一个实施方案中，在打印前将聚合物墨水、激活剂、或二者均调节至大约pH7.4。
在一个实施方案中，使用NaOH调节pH。
可使用该方法来制备根据第一方面的3D打印水凝胶。
在第三方面，本技术提供了一种3D打印用试剂盒，该试剂盒包含：
聚合物生物墨水，所述聚合物生物墨水包含含马来酰亚胺聚合物；和
激活剂，所述激活剂包含含双硫醇交联剂，所述交联剂具有至少2个巯基官能团。
在一个实施方案中，试剂盒进一步包含细胞。
在一个实施方案中，试剂盒进一步包含打印基底。
在第四方面，本技术提供了一种细胞分析法，包括根据第一方面的含细胞的3D打印水凝胶。
在第五方面，本技术提供了一种根据第一方面的用于细胞分析的含细胞的3D打印水凝胶的用途。
定义
以下是现有技术中所用术语的一些定义，可有助于理解本发明。这些定义旨在作为一般定义，并且不应以任何方式将本发明的范围仅限于那些术语，而是为了更好地理解以下描述而提出的。
除非上下文另有要求或特别说明，否则本文中作为单数整数、步骤或元素叙述的本发明的整数、步骤或元素清楚地包含所叙述整数、步骤或元素的单数和复数形式。
如本文所用，术语“大约”意指所叙述值的±10％。
如本文所用，术语“交联剂(cross-linker)”和“交联试剂(cross-linkingagent)”可以互换使用，并且意指能够共价交联含马来酰亚胺聚合物的化学化合物。本技术的交联剂包含至少两个巯基官能团，在本文中称为“含双硫醇交联剂”或“含双硫醇交联试剂”。含双硫醇交联试剂可包含两个以上的巯基官能团，例如三个、四个、五个、六个或更多的巯基官能团。
如本文所用，术语“聚合物生物墨水”是指溶液，优选水溶液，包括含马来酰亚胺聚合物，或两种或两种以上的含马来酰亚胺聚合物的组合。如本文所用，术语“激活剂”是指包含至少一种含双硫醇交联试剂的溶液，优选水溶液。当聚合物生物墨水和本技术的激活剂混合时，即在3D打印期间，发生硫醇-马来酰亚胺交联反应，形成水凝胶。
如本文所用，与物质相关的术语“可生物相容”意指该物质对活细胞或组织大体上无毒性。
如本文所用，术语“生物活性分子”是指可与培养细胞一起使用的具有生物活性的分子。
如本文所用，术语“细胞聚合物生物墨水”是指与包含至少一种含马来酰亚胺聚合物的聚合物生物墨水混合的细胞。如本文所用，术语“细胞激活剂”是指与包含至少一种含双硫醇交联剂的激活剂混合的细胞。本技术的细胞聚合物生物墨水和细胞激活剂可以是一种或多种类型的细胞悬浮在其中的生物活性分子的水溶液，并且仍可悬浮在整个3D生物打印过程中。
术语“细胞培养基”是指可用于储存、维持、生长或培养细胞的液体。
如本文所用，与3D生物打印相关的术语“按需滴定”是指一种打印过程，其中生物墨水的输送基于离散液滴的产生。按需滴定生物打印可包括但不限于热喷墨、压电喷墨和基于微阀的生物打印。
如果在本申请的整个描述和权利要求中给出了值的范围，则所述范围旨在包括该范围内的任何值。
本说明书中对文件、法案、材料、装置、物品等的任何讨论仅为提供本发明的背景。不应视为承认这些事项中的任何或所有事项构成现有技术基础的一部分或与本发明相关的领域中的公知常识，因为它们在本说明书的每个权利要求的优先权日之前就已经存在。
在本申请中，除非上下文另有要求，否则“包括”一词或“包含”或“含有”等变体应理解为包含所述元素、整数或步骤，或一组元素、整数或步骤，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或一组元素、整数或步骤。
术语“由…组成”意指“仅由…包含”，即包括并限于所述元素、整数或步骤，不包括任何其他元素、整数或步骤。术语“基本上由..组成”意指包括所述元素、整数或步骤，但也可包括不会实质性改变或有助于本发明工作的其他元素、整数或步骤。
为了更清楚地理解本技术，将参考以下附图和实施例来描述优选实施方案。
附图说明
图1是3D生物打印过程的代表性示意图。
图2示出了(a)UV分析；和(b)通过1H NMR对CRGDS修饰4臂PEG-Mal的CRGDS共轭分析进行定量分析。
图3示出了(a)频率；(b)应变；(c)刚度；和(d)由4臂PEG-Mal水凝胶制备的水凝胶的粘度流变学研究的结果，该水凝胶具有2.5mM RGD(10wt％)，并与PEG双硫醇和MMP-2响应性双半胱氨酸肽(以50:50硫醇摩尔浓度混合)交联。
图4示出了(a)以7.5wt％与PEG-双硫醇交联的空白4臂PEG-Mal水凝胶和(b)与MMP响应性双半胱氨酸肽激活剂交联的PEG-三肽水凝胶的刚度流变研究的结果。
具体实施方式
本技术涉及3D打印水凝胶。3D打印水凝胶能够在较长时间内支持细胞活力。本技术的水凝胶是通过3D打印聚合物生物墨水和激活剂而制备得到的，该聚合物生物墨水和激活剂具有生物相容性并且在打印时快速形成水凝胶，从而允许3D细胞结构的高通量生产和分析。
特别地，本发明人已发现，使用含双硫醇交联剂共价交联的含马来酰亚胺聚合物允许在生理条件下、在无任何共反应物的辅助下经生物相容交联路径快速形成均匀的水凝胶，并且不产生任何毒副产物。因此，本技术的3D打印水凝胶是通过将包含含马来酰亚胺聚合物与含具有至少两个巯基官能团的双硫醇交联剂的激活剂组合形成的。
聚合物生物墨水
本技术的聚合物生物墨水包含含马来酰亚胺聚合物或包含两个或以上含来酰亚胺聚合物的组合物。含马来酰亚胺聚合物可以是形成水凝胶的含马来酰亚胺反应基团的任意聚合物。含游离马来酰亚胺基团的聚合物也可以存在于水凝胶中。
可在聚合物生物墨水中使用具有各种分子质量、分子结构、分子分布和功能性的含马来酰亚胺聚合物。例如，含马来酰亚胺聚合物的分子质量的范围可以为大约1kDa～大约10,000kDa，或者大约5kDa～大约10,000kDa，或者大约5kDa～大约5,000kDa，或者大约5kDa～大约1,000kDa，或者大约10kDa～大约1,000kDa，或者大约20kDa～大约1,000kDa，或者大约10kDa～大约500kDa。含马来酰亚胺聚合物可具有任意适宜的分子结构，例如，线性、嵌段、支链、星形，环形、梳形或刷形聚合物等，或其任意组合。分子分布，是指单体单元沿聚合物骨架的分布，可包括homo分布、块分布、统计分布、随机分布或多块分布等或其任意组合。功能性(即单体的类型)可包括但不限于羟基、胺、硫醇羧酸、烯烃、炔烃和多元碳环等。聚合物可含有一个功能或者两个或以上的功能(即共聚物)。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物具有生物相容性。
含马来酰亚胺聚合物是通过将两个或以上的马来酰亚胺反应基团加入到聚合物中合成制备得到的。该两个或以上的马来酰亚胺基团可通过碳化二亚胺耦合、Steglich酯化反应及硫醇马来酰亚胺与过量双马来酰亚胺分子的偶联反应等本领域公知的任意适宜方法加入到聚合物中。此外或可选择地，可使用可商业获得的含马来酰亚胺聚合物。
适用于本技术中聚合物生物墨水的含马来酰亚胺聚合物的非限制性示例包括：含马来酰亚胺的多糖，如含果糖、蔗糖或葡萄糖单体的聚合物；合成聚合物，如聚(乙二醇)(PEG)马来酰亚胺、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)马来酰亚胺、聚(ε-己内酯)(PCL)马来酰亚胺、聚(乙烯醇)(PVA)马来酰亚胺、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)马来酰亚胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAAM)马来酰亚胺、聚(富马酸丙烯酯)(PPF)马来酰亚胺、聚(亚乙基亚胺)(PEI)马来酰亚胺、聚(3-甲基丙烯酰胺丙基)三甲基铵(PMAETMA)马来酰亚胺、聚(L-赖氨酸)(PLL)马来酰亚胺、聚(丙烯酸)(PAA)马来酰亚胺、聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)马来酰亚胺、聚(丙烯酸-stat-二甲氨基乙基甲基丙烯酰胺)(P(AA-stat-DMAEMA))马来酰亚胺，和聚(甲基丙烯酸精氨酸酯)马来酰亚胺，或者以上物质的衍生物；含马来酰亚胺生物聚合物，如明胶马来酰亚胺、纤维素马来酰亚胺、透明质酸马来酰亚胺和海藻酸盐马来酰亚胺；以及含马来酰亚胺核碱基聚合物(即，含有马来酰亚胺的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和/或胞嘧啶重复单元的聚合物)；或其任意组合。
PEG是用于制备作为ECM模拟物的合成水凝胶的特别引人注目的材料，因为其在商业上可获得，具有惰性，在生物应用中无毒性，并且对各种化学修饰有多种用途。进一步，基于PEG的聚合物生物墨水因PEG聚合物前驱体的分子重量较低而可具有相对较低的粘度，从而使得其特别适于进行按需滴定生物打印。因此，在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物为含有至少两个马来酰亚胺反应基团的聚乙二醇(PEG)聚合物(PEG-马来酰亚胺)。PEG-马来酰亚胺可具有任意适宜的分子结构，包括但不限于3臂PEG马来酰亚胺(3-arm PEG-maleimide)、4臂PEG马来酰亚胺(4-arm PEG-maleimide)、具有至少两个马来酰亚胺基团的PEG嵌段共聚物，或其任意组合。PEG基团可具有任意适宜的分子重量。例如，PEG基团的分子质量的范围可以为大约1kDa～大约50kDa，或者大约1kDa～大约40kDa，或者大约1kDa～大约30kDa，或者大约5kDa～大约30kDa，或者大约5kDa～大约20kDa，或者大约5kDa～大约10kDa，或者大约10kDa～大约20kDa。在一个实施方案中，PEG基团的分子质量为大约5kDa，或者大约10kDa，或者大约20kDa。
术语“3臂PEG马来酰亚胺”是指具有以下结构的聚合化合物(n＝38-3,788):
Figure BDA0002978135910000081
术语“4臂PEG马来酰亚胺”是指具有以下结构的聚合化合物(n＝28-2,841):
Figure BDA0002978135910000091
含有马来酰亚胺聚合物的性能可通过对具有一个或多个官能团或其他部分的马来酰亚胺基团进行部分修饰来针对特定应用而定制。部分修饰意指至少一个、优选至少两个马来酰亚胺基团保持完整，以与含双硫醇交联剂交联。因此，如果将生物活性分子加入含有马来酰亚胺聚合物中，则含马来酰亚胺聚合物包含至少两个且通常至少三个马来酰亚胺基团。该方法允许待保持聚合物的再生性和模块化，同时将相关的生物学特性引入3D打印水凝胶中。因此，在一个实施方案中，可以用一种或多种生物活性分子部分修饰含马来酰亚胺聚合物的马来酰亚胺基团。
本技术的聚合物生物墨水可制备作为水溶液，该水溶液在本领域公知的任意适宜制剂中包含含马来酰亚胺聚合物。例如，聚合物生物墨水可制备作为水性制剂，该水性制剂包含至少一种含马来酰亚胺聚合物及任选的一种或多种生物活性分子。例如，水性制剂可以是在pH缓冲溶液或细胞培养基中的包含含马来酰亚胺聚合物的溶液。在一些实施方案中，聚合物生物墨水可包含两种任意比例的含马来酰亚胺聚合物，例如，比例为大约10:1～大约1:10，例如，大约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
在一个实施方案中，聚合物生物墨水可以包含含马来酰亚胺聚合物的水性溶液的形式提供。一般地，聚合物生物墨水可通过将含马来酰亚胺聚合物溶于溶液、优选细胞培养基中制备得到。在一些实施方案中，聚合物生物墨水可包含两种或以上含马来酰亚胺聚合物的混合物。聚合物生物墨水在溶液中可含有任意适宜浓度的含马来酰亚胺聚合物。例如，聚合物生物墨水溶液中含马来酰亚胺聚合物的浓度的范围可以为大约1wt％～50wt％或者大约1％～40wt％或者大约1wt％～30wt％、大约5wt％～20wt％、大约5wt％～15wt％或者大约10wt％～20wt％。聚合物生物墨水可包含一种或多种与含马来酰亚胺聚合物共价结合的生物活性分子。此外或可选择地，聚合物生物墨水在溶液中可包含一种或多种游离生物活性分子。聚合物生物墨水中生物活性分子的浓度的范围可以为大约0.1mM～10mM、大约0.5mM～10mM、大约1mM～10mM、大约1mM～5mM、大约2mM～5mM或者大约2mM～3mM。
在一个实施方案中，制备聚合物生物墨水为无菌溶液。制备无菌溶液的适宜方法或者对聚合物生物墨水进行灭菌的方法对本领技术人员来说是公知的。
在一个实施方案中，聚合物生物墨水具有生物相容性。
激活剂
本技术的激活剂包括含双硫醇交联剂。含双硫醇交联剂可以是含至少两种巯基官能团的任意化合物，本文也称为双硫醇。优选地，巯基官能基团为末端巯基官能团。
在一个实施方案中，含双硫醇交联剂具有生物相容性。
在一个实施方案中，含双硫醇交联剂可以是含双硫醇聚合物，优选地，含末端双硫醇的合成聚合物。适宜的含双硫醇的合成聚合物包括但不限于PEG-双硫醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-双硫醇(NIPAAM-双硫醇)、聚(丙烯酸)-双硫醇、聚(甲基丙烯酸)-双硫醇、聚(苯乙烯磺酸盐)-双硫醇、聚(酰胺)-双硫醇，或其任意组合。此外，含双硫醇交联剂可以为含双硫醇生物聚合物，优选地，含末端双硫醇生物聚合物。适宜的含双硫醇生物聚合物包括但不限于硫醇-明胶(例如，来源于牛、猪和冷鱼)、硫醇-透明质酸(例如，来源于马链球菌、牛和人脐带)，或其任意组合。
在一个实施方案中，含双硫醇交联剂为PEG双硫醇。PEG双硫醇可具有任意适宜的分子结构，包括但不限于线形、枝状和星形PEF结构等。在一个实施方案中，PEG双硫醇是线形PEG双硫醇。可改变PEG基团的分子质量，例如，PEG基团的分子质量的范围可以为大约1kDa～大约50kDa，或者大约1kDa～大约40kDa，或者大约1kDa～大约30kDa，或者大约5kDa～大约30kDa，或者大约5kDa～大约20kDa，或者大约5kDa～大约10kDa，或者大约10kDa～大约20kDa。在一个实施方案中，PEG基团的分子质量为大约5kDa或者大约10kDa或者大约20kDa。
线形PEG双硫醇的示例具有以下结构(n＝11-1,136)：
Figure BDA0002978135910000101
在一些实施方案中，含双硫醇交联剂可以是含双硫醇小分子。适宜的含双硫醇分子包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)(与或不与硼酸钠或硼一起使用)，或其任意组合。在其他实施方案中，含双硫醇交联剂可以是具有至少2个半胱氨酸氨基酸基团、优选末端半胱氨酸基团(即，侧面连接硫醇的氨基酸序列)的含双硫醇短链肽。适宜的侧面连接有两个半胱氨酸氨基酸基团的含双硫醇短链肽包括但不限于惰性短链肽序列、酶反应性短链肽(例如，MMP响应性、丝氨酸反应性、半胱氨酸反应性、天冬氨酸反应性、谷氨酸反应性、半胱氨酸反应性或胰蛋白酶反应性肽序列)，或其任意组合。
在一个实施方案中，含双硫醇交联剂是含双硫醇生物活性分子。例如，含双硫醇短链肽可以是MMP响应性双半胱氨酸肽。例如，MMP响应性双半胱氨酸肽可以是MMP-2响应性双半胱氨酸肽(例如，GCIPVSLRSGCG)、MMP-1、-2、-3、-7、8和-9响应性双半胱氨酸肽(例如，GCRDGPQGIWGQDRCG)、MMP-15响应性硫醇化肽(例如，GCRDEAPLKQDRCG)或MMP-1、-2、3、7、-8、-9、-12、13和-14响应性双半胱氨酸肽(例如，GCRDPLGLDRCG)。
激活剂可包括任意比例的两种或多种类型的含双硫醇交联剂的组合。例如，激活剂可包括两种类型的含双硫醇交联剂的组合，其比例为大约10:1～大约1:10，例如大约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10.
在一个实施方案中，激活剂可以是包含含双硫醇交联剂的水溶液的形式。水溶液可以是细胞培养基。在一些实施方案中，激活剂可包含两种或以上含硫醇交联剂的混合物。激活剂可含有任意适宜浓度的含双硫醇交联剂。激活剂在溶液中可含有任意适宜浓度的含硫醇交联剂。在优选的实施方案中，激活剂中含双硫醇交联剂的浓度等于或小于补充聚合物生物墨水中含马来酰亚胺聚合物的浓度。含马来酰亚胺聚合物与含双硫醇交联剂之比的范围为大约10:1～1:1、大约9:1～1:1、大约8:1～1:1、大约7:1～1:1、大约6:1～1:1、大约5:1～1:1、大约4:1～1:1、大约3:1～1:1或者大约2:1～1:1。含双硫醇交联剂可包含生物活性分子，或者它可包含与其共价结合的一种或多种生物活性分子。此外或可选择地，激活剂在溶液中可包含一种或多种游离生物活性分子。激活剂中生物活性分子的浓度的范围可以为大约0.1mM～10mM、大约0.5mM～10mM、大约1mM～10mM、大约1mM～5mM、大约2mM～5mM或者大约2mM～3mM。
在一个实施方案中，激活剂是无菌溶液。制备无菌溶液的适宜方法或者对激活剂溶液进行灭菌的方法对本领域人员来说是公知的。
激活剂的配方可以与聚合物生物墨水的配方相同，或者不相同。在优选的实施方案中，用于聚合物生物墨水和激活剂的配方是相同的。
在一个实施方案中，激活剂具有生物相容性。
3D打印水凝胶
本技术的3D打印水凝胶包含使用含双硫醇交联剂交联的含马来酰亚胺聚合物。在一个实施方案中，3D打印水凝胶含有细胞。
在一个实施方案中，3D打印水凝胶是通过对包含含马来酰亚胺聚合物的聚合物生物墨水和包含含双硫醇交联剂的激活剂进行3D打印而制备得到的。
为了适用于3D打印，应快速形成水凝胶。但是，现有技术中使用的水凝胶的快速形成通常会导致不规则水凝胶的形成。目前控制交联剂的速率和在3D打印中产生UV辐射的方法包括利用外部驱动力，如UV辐射和共反应物或催化剂。这些外部驱动不参与水凝胶的形成，但可以辅助形成水凝胶，并且对包封在水凝胶中的细胞的细胞与生物特征有影响。特别地，涉及使用UV辐照的光化学交联反应可包括自由基来源的使用，该自由基来源必须要从产物中去除，以使得其不与水凝胶中的细胞相互作用。
令人惊讶的是，本发明人已发现能够支持高密度、高活力细胞的均匀水凝胶的形成可通过使含马来酰亚胺聚合物与含双硫醇交联剂反应来实现。在生理条件下，马来酰亚胺基团与硫醇快速同时反应。由于该反应不需要任何外部驱动力，因此特别适合用于体外分析的3D生物打印，因为它消除了对潜在细胞毒性共反应物、自由基引发剂或UV辐照的需要。此外，不产生有害的或细胞毒性的副产物，从而允许原位打印细胞但不产生有害的副产物。
在聚合物生物墨水与激活剂接触时，含马来酰亚胺聚合物之间可使用含双硫醇交联剂快速发生交联反应，从而允许3D打印水凝胶的快速形成。因此，在一些实施方案中，水凝胶在从打印聚合物生物墨水和激活剂开始30分钟或更短时间内形成。例如，水凝胶可在从打印聚合物生物墨水和激活剂30分钟或更短或者20分钟或更短或者10分钟或更短或者1分钟或更短或者30秒或更短或者10秒或更短或者1秒或更短的时间内形成。尺寸、形状、组成等各种因素都可影响3D打印水凝胶的形成速率。
以下反应式1中示出了含马来酰亚胺聚合物与含双硫醇交联剂之间的示例性反应。该反应包括对含双硫醇交联剂(1)上的硫醇基团与含马来酰亚胺聚合物(2)上的马来酰亚胺部分的烯烃功能基团进行亲核(Machael)加成，以在水性条件(例如，在细胞培养基中)下产生3-取代琥珀酰亚胺基团。该反应特别用于体外分析的3D生物打印，因为它不需要潜在的细胞毒性共反应物、自由基引发剂或UV照射。进一步，在生理条件下(例如，pH大约6.5～7.5的pH，优选pH 7.4)混合含马来酰亚胺聚合物和双硫醇交联剂时快速且同时发生共价交联，产生交联聚合物(3)。
Figure BDA0002978135910000121
反应式1
在一个实施方案中，在3D打印之前，先使用适宜的碱将聚合物生物墨水、激活剂或二者的pH调节至生理性pH(例如，大约6.5～7.5，优选大约pH 7.4)。适宜的碱对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
在一个实施方案中，碱为NaOH。
本发明人已发现，使用NaOH调节聚合物生物墨水的pH，在3D打印期间激活剂可加速凝胶化，从而允许3D打印水凝胶的快速形成(例如，低于大约1秒)。进一步，发明人已发现，NaOH的存在可减少细胞在聚合物生物墨水、激活剂或二者中的团聚，从而允许高浓度细胞分散在溶液中以通过小的喷嘴口进行3D打印。
在一个实施方案中，含马来酰亚胺聚合物的摩尔浓度大于含生物硫醇交联剂的摩尔浓度，从而消耗含双硫醇交联剂。所得到的水凝胶可包含交联产物和过量的含马来酰亚胺聚合物(如果有的话)，但不含任意额外的不想要的副产物。例如，含马来酰亚胺聚合物与含双硫醇交联剂的摩尔比范围可以为大约10:1～2:1、大约9:1～2:1、大约8:1～2:1、大约7:1～2:1、大约6:1～2:1、大约5:1～2:1、大约4:1～2:1、大约3:1～2:1。
优选地，对于水凝胶的形成，含双硫醇交联剂中硫醇基团的数目大于含马来酰亚胺聚合物中马来酰亚胺基团的数目约60％。例如，含双硫醇交联剂中硫醇基团的数目大于含马来酰亚胺聚合物中马来酰亚胺基团的数目的约60％。相对于含马来酰亚胺聚合物中马来酰亚胺基团中数目，含双硫醇交联剂中硫醇基团的数目可以为大约60％或70％或80％或90％或100％或200％或更高。在一些实施方案中，含双硫醇交联剂中硫醇基团的数目与含马来酰亚胺聚合物中马来酰亚胺基团的数目相同(即，100％)。
由于本文所公开的聚合物生物墨水与激活剂可用于进行大量测定，用于制备聚合物生物墨水和激活剂的材料优选为现成的散装市售材料，或者易于由此类市售材料制备。
一种制备本技术的3D打印技术的典型方法可包括以下步骤：
提供聚合物生物墨水，所述聚合物生物墨水包括含马来酰亚胺聚合物；
提供激活剂，所述激活剂包括含双硫醇交联剂；以及
3D打印聚合物生物墨水和激活剂，形成3D打印水凝胶。
在一个实施方案中，进一步包括提供给细胞，使得以3D打印生物墨水、激活剂和细胞的方法形成了含细胞的3D打印水凝胶。
在一个实施方案中，细胞悬浮在水凝胶中。在聚合物生物墨水、激活剂、或二者中、或另一培养基中可提供有细胞。细胞可悬浮于一部分(或多个部分)水凝胶中，或者它们可大体上均匀地悬浮在整个水凝胶上。
在一个实施方案中，在细胞培养基中提供细胞。细胞培养基可以被包括在聚合物生物墨水、激活剂中，或者可以与聚合物生物墨水和激活剂分开提供。例如，细胞培养基可悬浮在由聚合物生物墨水和激活剂形成的3D打印水凝胶层之间，或者它可沉积在水凝胶的表面。
在一个实施方案中，3D打印水凝胶进一步含有生物活性分子。生物活性分子可提供在聚合物生物墨水或激活剂或二者中。生物活性分子可游离地悬浮在聚合物生物墨水或激活剂或二者中，或者它可与含马来酰亚胺聚合物和/或含双硫醇交联剂结合。
在一个实施方案中，在大体上无菌的环境中进行3D打印过程。
生物活性分子
本技术的3D打印水凝胶可通过一个或多个生物活性分子来修饰以引入某些生物特征。例如，可通过加入蛋白质、肽(如MMP响应性肽)、化学引诱剂、生长因子、有机染料、荧光染料、药物、治疗剂、抗体、小分子抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、抗原、病原体、血小板、细胞因子、营养素(如单糖和多糖)、条件培养基、抗生素、抗病毒药物、RNA和相关变体(如siRNA、mRNA)等来修饰3D打印水凝胶的生物特征。一种或多种生物活性分子可通过与含马来酰亚胺聚合物、含双硫醇交联剂或其任意组合而加入至3D打印水凝胶中。也可将纳米颗粒加入到3D打印水凝胶中。
在一个实施方案中，生物活性分子是短链肽(例如，在N或C末端上的含Arg-Gly-Asp(RGD)的半胱氨酸(C)氨基酸)、生长因子(例如，VEGF)、蛋白质(例如，层粘连蛋白、胶原)或化学引诱剂(例如基质细胞衍生因子-1(CXCL12))，或其任意组合。其他适宜的生物活性分子对本领域技术人员来说是公知的。
在一些实施方案中，可通过将游离的生物活性分子加入到聚合物生物墨水、激活剂或二者中而将一种或多种生物活性分子加入到3D打印水凝胶中。聚合物生物墨水、激活剂或二者都可包括细胞培养基。
在一个实施方案中，生物活性分子可与含马来酰亚胺聚合物结合。可通过使马来酰亚胺基团与生物活性分子反应而将生物活性分子引入到含马来酰亚胺聚合物中以形成共价键。例如，通过硫醇与含乙烯基生物活性分子之间的Machael加成反应(例如，在水性介质中)、氨基与乙醛基团之间的Schiff碱基反应、Diels-Alder反应、点击化学，氨解反应到活性酯基或酶交联可形成共价键。在许多生物活性分子中都含有丰富的硫醇基团，因此，可通过硫醇基团与马来酰亚胺基团的烯烃基团的亲和(Machael)加成将生物活性分子加入到含马来酰亚胺聚合物中，产生3-取代的琥珀酰亚胺基团。根据所用反应物的条件和摩尔比，所得的化合物将具有至少一个马来酰亚胺基团，该马来酰亚胺基团可修饰为含3取代琥珀酰亚胺基团的生物活性分子，从而使至少一个、优选至少两个马来酰亚胺基团完好无损。本领域技术人员能够确定适宜的条件(例如，反应物的摩尔比)以控制反应，进而确保至少一个、优选至少两个马来酰亚胺基团仍完好无损。
在将含硫醇生物活性分子加入到含马来酰亚胺聚合物中的典型方法中，对生物活性分子和含马来酰亚胺聚合物在室温下在水溶液(例如，缓冲液或细胞培养基)中以马来酰亚胺聚合物超过生物活性分子的摩尔比(例如，3:1、4:1或5:1)进行混合。例如，通过Ellman测定监控反应的完成，以确认无游离硫醇基团存在。通常的反应时间为大约30分钟。反应完成后，如果需要，可添加适宜的碱(例如，NaOH)来将溶液的pH调节至生理pH(大约7.4)。用于将pH调节至生理pH的适宜碱对领域技术人员来说将是显而易见的。可使用所得到的经修饰的含马来酰亚胺聚合物溶液，无需要分离或纯化。
在一个实施方案中，使用NaOH将含生物分子的聚合物生物墨水或激活剂溶液的pH调节至生理pH(例如，大约6.5～7.5，优选pH 7.4)。使用NaOH调节聚合物生物墨水或激活剂溶液的pH可在随后的3D打印期间进行快速聚合，从而加速了水凝胶的形成(例如，不到1秒)。进一步，NaOH的使用可降低细胞在聚合物生物墨水、激活剂或二者中的团聚，从而允许高浓度的细胞分散在溶液中以通过小的喷嘴口进行3D打印。
用RGD部分修饰的4臂PEG马来酰亚胺(4-arm PEG-maleimide-RGD)的示例具有以下结构(n＝28-2,841)，通过4臂PEG马来酰亚胺与CRGDS以4:1摩尔比反应制备得到：
Figure BDA0002978135910000141
用VEGF部分修饰的4臂PEG马来酰亚胺(4-arm PEG-maleimide-VEGF)的示例具有以下结构(n＝28-2,841)，通过4臂PEG马来酰亚胺与VEGF以4:1摩尔比反应制备得到：
Figure BDA0002978135910000151
在一些实施方案中，一种生物活性分子，如CRGDS、CIKVAV、VEGF和C末端未配对的半胱氨酸和/或MMP响应性肽(例如，GCIPVSLRSGCG、GCRDGPQGIWGQDRCG、GCRDPLGLDRCG或GCRDEAPLKQDRCG)加入到3D打印水凝胶中以引入生物功能。例如，可通过加入CRGDS或CIKVAV细胞粘附基序来引入细胞附着性能，可通过加入VEGF来促进血管生成，可通过加入MMP反应性肽交联剂来促进细胞运动。GCIPVSLRSGCG特别适合用作交联剂中的含双硫醇交联剂，但此外或可选择地与含马来酰亚胺聚合物、含双硫醇交联剂或两者共价联接，或作为游离生物活性分子添加到聚合物生物墨水、激活剂或两者中。
生物活性分子可以任意适宜的浓度存在于3D打印水凝胶中，以实现所需的生物特征。例如，生物活性分子可以大约1nM至100μM、大约1nM至50μM、大约5nM至50μM、大10nM至50μM、大约50nM至50μM、大约100nM至50μM、大约100nM至1μM或大约500nM至1μM的浓度存在于3D打印水凝胶中。
细胞
可将细胞加入到本技术的3D打印水凝胶中。还可将细胞培养基加入到水凝胶中以保持细胞活力或促进生长和细胞分裂。可通过将细胞和/或细胞培养基加入到聚合物生物墨水或激活剂或两者中而加入到水凝胶中。
在一个实施方案中，在聚合物生物墨水、激活剂、聚合物生物墨水活激活剂中或在单独的介质中提供细胞。
聚合物生物墨水和/或激活剂可包括细胞培养基。细胞培养基可选自与细胞相容并且在3D打印过程中保持细胞活力的任意适宜的培养基。例如，细胞培养基可以是包含水(例如，灭菌的MilliQ水)、缓冲液和细胞培养基的溶液。适宜的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲盐(PBS)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)和2-(环己胺基)乙磺酸(CHES)，或以上任意组合。适宜的细胞培养基的非限制性示例包括Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、Iscove的改良Dulbecco培养基(IMDM)、培养基199、Ham'sF10、Ham's F12、McCoy's 5A和Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基。
在一些实施方案中，细胞培养基中可进一步包含还原剂(例如，2-硫醇乙醇或三(2-羧乙基)膦(TCEP))、稳定剂(例如，
Figure BDA0002978135910000161
或PVP)和/或生长补充剂(例如，L-谷氨酰胺或氢化可的松)。适宜的生长补充剂的非限制性示例包括胎牛血清(FCS)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FBF)、成纤维细胞生长因子(FBF)、内皮细胞生长因子(ECGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和血小板衍生生长因子(PDGF)。例如，还原剂可防止在交联剂中的游离硫醇基团之间形成二硫键。例如，稳定剂可用于防止细胞从细胞培养基中沉淀出来。如有必要，可使用适宜的碱将细胞培养基的pH调节至大约7.4的生理pH。在一个实施方案中，氢氧化钠(NaOH)用作中和或控制细胞培养基pH的碱，因为它不促进细胞团聚。
收获的细胞可以所选的细胞浓度重悬浮在聚合物生物墨水或激活剂中或两者中。聚合物生物墨水和/或激活剂中细胞的浓度范围为大约1×105至大约5×108个细胞/mL，或大约1×105至大约1×108个细胞/mL，或大约1×105至大约1×107个细胞/mL、5×105至大约1×107个细胞/mL，或大约5×105至大约5×106个细胞/mL，或大约1×106至大约5×106个细胞/mL。在一个实施方案中，细胞以聚合物生物墨水或激活剂的大约4×106至大约5×106个细胞/mL的浓度悬浮在聚合物生物墨水和/或激活剂或细胞培养基中。
任意适宜的细胞都可与本技术的聚合物生物墨水和激活剂一起使用。例如，适宜的细胞可包括但不限于粘附细胞，如哺乳动物肝细胞、胃肠细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、乳腺细胞细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、雪旺细胞、脂肪细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、周细胞、间皮细胞、内分泌组织衍生细胞、基质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、内胚层衍生细胞，外胚层来源细胞、中胚层来源细胞，或其任意组合。
其他适宜的细胞类型可包括其他真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢)、细菌(例如，幽门螺杆菌)、真菌(例如，产黄青霉)和酵母(例如，酿酒酵母)。
3D打印水凝胶可含有至少大约100或大约1000或大约5000或大约10000或大约50,000或大约100,000或大约150,000或大约200,000或大约250,000或大约300,000或大约350,000或大约400,000或大约450,000或大约500,000或更多个细胞。本领域技术人员将理解的是可以使用其他数量的细胞。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在允许细胞生长或维持的条件下培育悬浮在水凝胶中的细胞。在一些实施方案中，细胞可在允许干细胞分化的条件下悬浮在水凝胶中。培育可以在任意适宜的温度和条件下进行。例如，适合于细胞生长、维持或分化的培育可在大约37℃和大约5％CO2的条件下进行至少24小时。应理解，可在允许水凝胶中细胞类型的细胞生长、维持或分化的任意温度和持续时间下进行培育。
在其他实施方案中，该方法进一步包括在不适合细胞生长的条件下培育悬浮在水凝胶中的细胞。例如，可在缺氧的条件下、在使细胞饥饿的无血清环境中，在酸性或碱性环境中、在施加的外部压力下、在电场存在下、在持续振荡下、或其任意组合下进行培育。用于模拟某些生物条件的其他适宜条件对本领域人员来说是公知的。
3D生物打印
本技术的聚合物生物墨水和激活剂适用于按需滴墨(DOD)生物打印，其中生物打印基于聚合物生物墨水和激活剂的离散液滴的产生，并且可包括热喷墨、压电喷墨和基于微阀的生物打印等。与其他任意按需滴定打印技术一样，聚合物生物墨水和激活剂在生物打印机墨盒内必须是液体。此外，聚合物生物墨水和激活剂应由生物相容性材料制成，以在生物打印墨盒中存储时保持高的细胞活力。
用于3D测定的DOD生物打印包括在基底上重复沉积一滴聚合物生物墨水和激活剂，其大小和位置由生物打印软件确定。因此，在一个实施方案中，使用能够形成和沉积液滴的3D生物打印机来进行3D生物打印。生物打印机可具有至少用于聚合物生物墨水、激活剂和清洁溶液的流体贮存器、3轴运动控制台、按需滴定液滴分配系统和用于控制流体贮存器中的压力的压力调节器。液滴分配系统和3轴控制台可置于层流柜等无菌室内。打印平台可包括适用于打印到微孔板和培养皿等多种基底上的适配器。打印平台可加热至大约37℃以辅助细胞增殖。
3D生物打印机可由具有限定打印格式的软件的计算机来控制。
3D生物打印机可配置为以允许细胞完整性、活力或功能性的方式打印(沉积)聚合物生物墨水和激活剂的液滴。应理解，聚合物生物墨水及激活剂的沉积可按任意顺序进行。可将一滴聚合物生物墨水施加到基底上，接着再施加一滴激活剂，形成水凝胶液滴，或者将一滴激活剂施加到基底上，接着再施加一滴聚合物生物墨水，形成水凝胶液滴。
通过本技术工艺形成的水凝胶包含大体上均匀的3D结构。当水凝胶包含细胞时，细胞可大体上均匀地分布在整个水凝胶中，或者它们可悬浮在水凝胶的水凝胶部分内。细胞可沉积在水凝胶中的一个或多个选定位置。
打印基底是用于封闭和培养打印水凝胶结构的生物相容性耗材。所述基底可选自用于容纳、保持或生长细胞的任意适宜的容器。示例包括不同孔结构(6、24、48和96孔)的微滴定板、具有不同孔结构(6、24、48和96孔)的盖玻片底部的微滴定板、各种尺寸的荧光培养皿、不同孔结构(1、2、4、8和16)的室载玻片、盖玻片或显微镜载玻片或培养皿。在一些实施方案中，进行3D生物打印过程以在基质上形成多个3D组织培养模型。例如，96孔微量滴定板是适宜的基底，可用于多细胞分析。其他适宜的容器对本领域技术人员来说是公知的。
可使用生物打印机软件设计分析的3D结构。适宜的生物打印机和生物打印机软件对本领域技术人员来说是公知的。例如，对于96孔板中的生物打印，可将生物打印软件配置为在选定直径的层中的孔中重复沉积液滴。
聚合物生物墨水和激活剂在打印时迅速发生反应，形成水凝胶，从而允许3D结构和分析的快速、高通量生产。在一个实施方案中，本技术的聚合物生物墨水和激活剂在混合(即在打印时)数秒内形成水凝胶。例如，水凝胶可在混合5秒、优选混合4、3、2或1秒内形成。
本技术的聚合物生物墨水和激活剂可与任意适宜的DOD生物打印系统一起使用。本发明者最近开发了一种DOD生物打印系统，该系统专门用于3D体外分析的生物打印。更具体地说，生物打印机能够以高达200cP的速度打印聚合物生物墨水和激活剂，并且能够以高达5亿个细胞/mL的速度打印细胞，细胞存活率大于95％。该研发的系统已成功地用于以高通量的方式生物打印3D球体分析。因此，本技术的生物墨水对于使用由本发明者开发的3D生物打印系统进行3D细胞打印来说特别有用。
本技术水凝胶的快速凝胶特性，结合开发的生物打印机的新颖打印逻辑，使得生物打印机能够以96孔格式快速打印复杂的3D分析。例如，在96孔板中的3D分析的生物打印可在小于约1小时、优选小于约30分钟(例如，约25分钟或大约20分钟或大约15分钟或更少)内实现。
聚合物生物墨水和激活剂可在打印前立即装入单独的灭菌墨盒中，或储存在墨盒内。如果细胞生物墨水储存在墨盒中，墨盒最好储存在4℃，以备用。本技术的聚合物生物墨水和激活剂可在打印前长时间支持细胞活力。例如，在打印之前，细胞可在聚合物生物墨水和激活剂中保持活力至少大约2小时。在一些实施方案中，本技术的聚合物生物墨水和激活剂可在-20℃下储存至少6个月而基本上不影响细胞活力。类似地，本技术的3D打印水凝胶可在打印后支持细胞活力较长时间。例如，细胞可在3D打印水凝胶中保持活力至少大约21天。
准备使用时，墨盒可连接到清洁的生物打印机上。可通过本领域已知的任意适宜方法，例如，通过乙醇(水中70v/v％)擦拭、空气干燥和放置在生物安全柜内，来实现墨盒和/或生物打印机(包括流体管路、阀门和喷嘴)的清洁。优选地，在清洁之后和打印之前使用组织培养基清洗生物打印机。
应用
本技术的3D打印水凝胶可具有各种体外应用。在一个示例中，本技术的3D打印水凝胶可用于制备用于检查生物表型的分析，包括但不限于细胞运动、细胞迁移、细胞侵袭、经内皮迁移、上皮-间充质转变、间充质-上皮转变、球体形成及生长、细胞侵袭分化(例如，干细胞分化、细胞分化标志物监测)、细胞死亡(例如，细胞凋亡；细胞坏死)、细胞自噬、细胞增殖、细胞代谢、蛋白质周转、蛋白质分布和定位、细胞信号传导和下游事件、药物疗效、药物药效学、药物作用机制、药物受体介导的转运、药物内化机制、生物标志物评价、细胞-细胞连接、细胞-细胞信号传达和下游事件、细胞形态、细胞粘附、基因表达、蛋白质表达、细胞归巢、细胞周期调控、细胞因子释放、胰岛素产生、蛋白质分泌和细胞内教义和运输，受体-配体结合，抗体结合，抗体特异性，蛋白质磷酸化，蛋白质体功能，酶功能(例如，酶抑制)，免疫调节，克隆原性，氧化应激，蛋白质折叠，细胞骨架，细胞器形态和功能(例如，线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、分泌小泡、液泡、核糖体、细胞核、溶酶体、纤毛、内质网、高尔基体)、膜转运、缺氧、血管生成、伤口愈合、神经突起(生长或形成)、激酶功能、磷酸酶功能、板层足形成和动力学、局灶性接触/粘附形成、动力学信号，细胞感应和机械力传导。
本技术的3D打印水凝胶也可适用于体内应用(例如，动物研究)。例如，本技术的3D打印水凝胶可用于原位和皮下模型，包括或不包括细胞。
实施例
以下实施例说明了本技术和使用本技术的3D打印水凝胶实现的有益效果，不应被认为是限制性的。
材料
4臂PEG马来酰亚胺(PEG-Mal，MW 5、10和20kDa，JenKem)，PEG双硫醇(MW 1kDa，Sigma Aldrich)，明胶(来自牛、鱼或猪、Sigma-Aldrich)，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC，Sigma-Aldrich)，N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基NHS，Sigma Aldrich)，氢氧化钠(NaOH)、CRGDS、CIKVAV、CYIGSR、GCRDGPQGIWGQDRCG、GCRDPLGLDRCG和不含氯化钙(PBS，Gibco)的GCIPVSLRSGCG(>90％，Genscript)磷酸盐缓冲溶液、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco)、无钙DMEM(Gibco)、丙酮酸钠(Gibco)、L-谷氨酰胺(Gibco)、胰蛋白酶(SigmaAldrich)、0.22μm注射器过滤器(聚醚砜膜，Merck Millipore，T75和T150烧瓶(康宁)，15毫升离心管(康宁)，乙醇(Merck Millipore)按原样使用。
实施例1–PEG-Mal聚合物生物墨水的制备
实施例1a-PBS中聚合物生物墨水的制备
在PBS缓冲液中制备了三种PEG-Mal聚合物生物墨水。
·PEG-Mal聚合物生物墨水
将PEG-Mal聚合物(7.5wt％)与PBS缓冲溶液在室温下混合，制备了PEG-Mal聚合物生物墨水。完全溶解后，通过0.22μm注射器过滤器对溶液进行无菌过滤。
·PEG-RGD聚合物生物墨水
在室温下于PBS缓冲液中将CRGDS与PEG-Mal(10wt％)混合，制备得到含RGD的PEG-Mal(PEG-RGD)聚合物生物墨水，RGD的总浓度为5mM。当没有记录到游离硫醇时，通过Ellman分析确认反应完成。反应产物中含有10wt％和5mM RGD浓度的PEG-RGD，溶解于PBS中。完全溶解后，将与RGD浓度等摩尔浓度的NaOH添加到溶液中，使溶液的pH值达到7.4。用0.22μm注射器过滤器过滤对溶液进行无菌过滤灭菌。
·PEG-三肽聚合物生物墨水
在室温下于PBS缓冲液中将CRGDS、CIKVAV和CYIGSR(以所需摩尔浓度)与PEG-Mal(15wt％)混合30分钟，获得15wt％的PEG-Mal和0.67mM的RGD、IKVAV和YIGSR，从而制备得到含PEG-Mal的RGD、IKVAV和YIGSR(PEG三肽)聚合物生物墨水。完全溶解后，通过逐滴添加1MNaOH将溶液的pH提高到7.4。然后通过0.22μm注射器过滤器对所得溶液进行无菌过滤。
图2示出了使用CRGDS对4臂PEG-Mal进行修饰的分析。UV分析显示，在反应开始时，在412nm处有一个明显的峰(图2(a))。这表示存在TNB2-(2-硝基-5-硫代苯甲酸酯)离子，该离子是在Ellman试剂的二硫键被硫醇基团(在该情况下为CRGDS)切割并电离时产生的。相比之下，在不含CRGDS的4臂PEG-Mal溶液上没有这样的峰，并且反应允许进行20分钟后，表明4臂PEG-Mal未与Ellman试剂反应，并且CRGDS在30分钟后分别完全反应。通过比较酰胺和马来酰亚胺质子峰(图2(b))，使用1H NMR确认对CRGDS共轭的定量。
实施例1b–在细胞培养基中制备聚合物生物墨水
使用用于待打印细胞的适宜细胞培养溶液替代PBS溶液，按照实施例1的程序，制备细胞培养基中含RGD的PEG-Mal聚合物生物墨水。对所得到的聚合物生物墨水经过滤(0.22μm过滤器)进行无菌灭菌。
将根据实施例1制备的聚合物生物墨水储存在-20℃下以备用。聚合物生物墨水可在-20℃下储存至少6个月，不影响功能性。
实施例2–PEG双硫醇和GCIPVSLRSGCG激活剂的制备
实施例2a-PBS中激活剂的制备
通过在PBS中混合二硫苏糖醇(DTT)、PEG双硫醇、GCIPVSLRSGCG和GCRDPLGLDRCG、或其各种组合制备激活剂，总硫醇浓度与互补聚合物生物墨水的马来酰亚胺浓度为相等摩尔浓度。所得到的溶液通过0.22μm注射器过滤器进行无菌过滤灭菌。
实施例2b–细胞培养基中激活剂的制备
通过将二硫苏糖醇(DTT)、PEG双硫醇、GCIPVSLRSGCG和GCRDPLGLDRCG混合在用于待打印细胞的适当细胞培养液中制备激活剂，总硫醇浓度与补充生物墨水的马来酰亚胺浓度为相等摩尔浓度。所得溶液通过过滤(0.22μm过滤器)无菌灭菌。
将根据实施例2制备的激活剂储存在-20℃下以备用。激活剂可在-20℃下储存至少6个月，不影响功能性。
实施例3-细胞培养
在37℃/5％CO2条件下，将SK-N-BE(2)(人神经母细胞瘤)、KrasG12D和p53R172H(胰腺导管腺癌)、MCF(人乳腺癌)和U87vIII(人胶质母细胞瘤)细胞分别地保存在10％胎牛血清(FCS)/DMEM中。在37℃/5％CO2条件下，在Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基和10％FCS(37℃/5％CO2)中培养人非小细胞肺癌H460细胞。对细胞系进行常规筛选，并且无支原体污染。
实施例4-Trypan蓝排除
使用胰蛋白酶/PBS从T75烧瓶中收获根据实施例3培养的SK-N-BE(2)、KrasG12D和p53R172H、H460和U87vIII细胞，并使用离心法进行粒化。将细胞重新悬浮在聚合物生物墨水中，该墨水含PEG-Mal和PEG-RGD，浓度为10wt％，RGD浓度为5mM，细胞浓度为2×106细胞/mL。将样本分为两组：打印的样本组和非打印对照组。打印的样本组通过3D生物打印机，在室温下无菌保存30分钟。用0.4％Trypan蓝着色剂(Invitrogen)鉴定死细胞。通过计算每个样本中活细胞和死细胞的数量来获得细胞计数。用活细胞总数除以总细胞数(活+死)确定细胞存活率。
实施例5-细胞聚合物生物墨水的制备
按照实施例4的程序收获融合一定程度的培养的感兴趣细胞。为了制备细胞聚合物生物墨水，将收获的细胞以适当的细胞浓度重新悬浮在根据实施例1(a)或1(b)制备的灭菌的聚合物生物墨水中，1mL灭菌的聚合物生物墨水中得到2×106细胞/mL。
实施例6-细胞激活剂的制备
按照实施例4中的程序收获融合一定程度的培养的感兴趣细胞。为了制备细胞激活剂，将收获的细胞以适当的细胞浓度重新悬浮在根据实施例2(a)或2(b)制备的灭菌的激活剂中。
实施例7-3D细胞活力测定
活/死染色用于监测水凝胶包裹细胞的活力。用DMEM中的钙黄绿素AM(1μL mL-1)和同二聚体乙锭I(4μL mL-1)对分别活细胞和死细胞进行染色。使用根据实施例5制备的细胞聚合物生物墨水用于以封装细胞来3D生物打印水凝胶。在所需培育期之后，在共焦荧光显微镜分析之前，将生物打印水凝胶与活/死染色剂在37℃/5％CO2下培育至少2小时。
实施例8-流变特性
研究了由具有5mM RGD(10wt％)(根据实施例1(a)制备)的4臂PEG-Mal水凝胶制备并用PEG双硫醇和MMP-2响应性双半胱氨酸肽GCIPVSLRSGCG交联(以50:50硫醇摩尔浓度混合)(根据实施例2(a)制备)交联的水凝胶的机械性能。
使用Anton-Paar模块化紧凑型流变仪(MCR)302测量水凝胶流变性，该流变仪配备有同心圆柱形主轴和杯系统。在1～1000s-1的剪切速率值下进行粘度测量。使用同一台配备有平行板几何结构(直径25毫米)系统和溶剂收集器的机器测量水凝胶的流变特性，以尽量减少液体蒸发。在预热板上进行流变测量，并将其保持在37℃的恒定温度下。进行振幅应变扫描实验(γ：1100％)，以在固定频率为10Hz下确定线性粘弹性区(LVR)。一旦确定了每个样本的LVR，在水凝胶的线性粘弹性区域的固定应变下进行动态频率扫描(ω：0.1～10Hz)。时间扫描测量通常在固定频率(10Hz)和应变幅度(LVR内)下进行。
如图3所示，频率(图3(a))和应变(图3(b))扫描研究证实了凝胶的机械性能与这两个参数无关。
随后在水凝胶粘弹性区域内以恒定频率和应变值测定刚度(图3(c))。在水凝胶浇铸后1分钟内进行测量。图3(c)示出了在整个测量期间，存储模量(G’)值始终高于损耗模量(G”)值。在大约1.1kPa下的恒定存储模量值表明凝胶化过程在1min内完成。对聚合物生物墨水和激活剂的粘度研究表明，粘度值小于10cP，使得聚合物生物墨水和激活剂都非常适合按需滴定生物打印工艺(图3(d))。
还研究了由4臂PEG Mal空白聚合物生物墨水(根据实施例1(a)制备)制备并与PEG双硫醇(根据实施例2(a)制备)交联的水凝胶和由PEG三肽(根据实施例1(a)制备)并与MMP敏感激活剂交联的水凝胶的机械性能(GCIPVSLRSGCG)(根据实施例2(a)制备)。在PEG-Mal水凝胶(图4(a))和PEG-三肽水凝胶(图4(b))的粘弹性区域内以恒定频率和应变值测定刚度。在水凝胶浇铸后1分钟内进行测量。图4(a)和4(b)示出了在整个测量期间，存储模量(G’)值始终高于损耗模量(G”)值。这一观察证实了当生物墨水和激活剂混合时存在水凝胶。定量地，由PEG-Mal空白聚合物生物墨水和PEG-双硫醇激活剂形成的水凝胶的硬度值约为0.2kPa，PEG-三肽/MMP敏感水凝胶的硬度值约为1.6kPa。
实施例9-3D生物打印平台
本实施例中使用的3D生物打印机的部件包括3轴运动控制台、按需滴定液滴分配系统和控制储液罐中压力的压力调节器。液滴分配系统和3轴运动控制台可置于层流柜等无菌室内。打印平台包括适配器，可以打印到多种基底上，如微孔板和培养皿。打印平台可加热至37℃，以辅助细胞增殖。
三轴运动控制台(MX80S，Parker)能够以10μm的分辨率在所有三个维度(X、Y和Z)上精确定位液滴分配系统。十个液滴分配系统由电磁阀(VHS系列电磁阀，Lee公司)和由微控制器(Arduino Mega 2560，Arduino)控制的宝石孔分配喷嘴(MINSTAC喷嘴，Lee公司)组成。根据流体粘度和所需液滴体积，宝石喷孔喷嘴的内径可为127～254μm。每个液滴分配系统都连接到静压储存器上以用于通过软管待分配聚合物生物墨水和激活剂溶液。还可以使用储液罐中的背压和电磁阀打开时间来调整所需的液滴体积。通常，背压设置为1至300kPa之间的压力，电磁阀打开时间为0.3ms或更长，液滴体积为1～500nL。连接聚合物生物墨水和激活剂容器的挠性管应保持尽可能短，以最大程度地减少启动系统和在打印例程结束时清除系统所需的时间。
实施例10-控制软件
通过为打印生物分析测定而开发的定制软件来控制3D生物打印机。该软件包括图形用户界面(GUI)，并用Python编程语言编写。通过GUI，终端用户可选择不同的测定打印程序，并更改分析参数，如液滴间距和液滴体积。用户还可以手动控制液滴分配系统的空间位置，并创建自定义的液滴图案。该软件的附加功能包括启动和清洗液滴分配系统的程序。
实施例11-3D生物打印
在打印之前先将无菌聚合物生物墨水和激活剂加热至室温。以所需的细胞浓度将感兴趣细胞与聚合物生物墨水和/或激活剂混合。然后将所有溶液装入生物打印机样本托盘中。使用RastrumTM模块化3D生物打印机(Inventia Life Science(ILS))进行生物打印。该结构是用RastrumTM软件(ILS)设计的；打印两种不同的生物打印样本：直径约为6.35cm、厚度为400μm的圆柱形结构和直径为100μm的半球形结构位于直径为6.35cm、厚度为100μm的惰性凝胶层的顶部。聚合物生物墨水和激活剂溶液均在20-100kPa的打印压力下打印。在生物打印过程之前，生物打印机先进行自动灭菌和启动步骤。
3D物体的生成是通过沉积聚合物生物墨水液滴来实现的，然后立即在软件确定的位置在其顶部沉积激活剂液滴。所有打印均在96孔板(康宁)中进行。完成后，添加用于细胞的相关细胞培养基(150μL)，并将平板转移到培养箱中。
图1是3D生物打印过程的代表性示意图。所用聚合物生物墨水包含4臂PEG马来酰亚胺(PEG-Mal)、CRGDS和所需癌细胞(根据实施例1(a)和5制备)。激活剂包含PEG双硫醇和双硫醇MMP响应性肽GCIPVSLRSGCG(根据实施例2(a)制备)的混合物。根据实施例9，将两种溶液装入ILS 3D生物打印机系统中，该系统以空间控制的方式沉积聚合物生物墨水和激活剂的组合。两种溶液混合后立即发生凝胶化，从而在96孔板内在水凝胶内部产生三维包封细胞。
实施例12–胰腺导管腺癌细胞(KrasG12D和p53R172H)的3D生物打印
使用ILS 3D生物打印机对硫醇马来酰亚胺交联PEG水凝胶内的多个三维包封癌细胞样本进行生物打印。具体来说，使用生物打印机同时递送癌细胞、聚合物生物墨水和激活剂，以在生物打印水凝胶内快速形成细胞原位包封。
细胞培养
在T150烧瓶中80％融合的胰腺导管腺癌细胞KrasG12D和p53R172H用3mL PBS洗涤。吸入过量PBS后，添加3mL胰蛋白酶，并将烧瓶在37℃下培育，以使细胞从烧瓶表面分离5分钟。随后，添加7mL由DMEM与FCS以10v/v％混合制备的组织培养基，并将分离的细胞转移到15mL管中。将细胞分散液在400g下离心3分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在5mL培养基中。然后通过将等体积的细胞悬浮液和trypan蓝着色剂混合来细胞计数，确定细胞浓度。
基底
按原样使用康宁公司提供的96孔板。在无菌环境中打开无菌包装，以保持内容物无菌。
聚合物生物墨水
为了制备聚合物生物墨水，在1.5mL PBS中溶解PEG-Mal(0.150g)，产生10wt％的聚合物生物墨水。如果要加入PEG-RGD，则将CRGDS(1.34mg)添加到溶液中并搅拌30分钟，产生10wt％PEG-Mal/PEG-RGD聚合物生物墨水，其中含有5mM RGD。向溶液中添加2.5μL 1MNaOH，将溶液的pH值提高至7.4。然后在无菌环境下通过0.22μm注射器过滤器过滤溶液。
将以2×106细胞/mL浓度分散在1mL DMEM中的KrasG12D和p53R172H离心，得到500,000个细胞的细胞颗粒。然后将所得颗粒重新分散在聚合物生物墨水(1mL)中，得到细胞聚合物生物墨水溶液，其中含有分散的KrasG12D和p53R172H细胞，浓度2×106细胞/mL。
激活剂
为了制备非MMP和MMP响应性水凝胶，制备了两种不同的激活剂。这两种激活剂由单独的PEG双硫醇(0.01975g)或PEG双硫醇(0.0096g)和GCIPVSLRSGCG(0.0111g)的组合制备得到，每种激活剂溶解在1mL PBS中，产生其中硫醇浓度与生物墨水中的马来酰亚胺浓度为相等摩尔浓度的激活剂。然后在无菌环境下通过0.22μm注射器过滤器过滤每种溶液。
细胞打印条件
将细胞聚合物生物墨水和激活剂装入相关墨盒中，连接至生物打印机。细胞聚合物生物墨水和激活剂均连接到一个0.007英寸的喷嘴上，工作压力为10Psi。
最初通过乙醇(70v/v％水溶液)擦拭清洁打印机并风干。流体管道、阀门和喷嘴也按顺序经乙醇、水和组织培养基清洗进行消毒。然后将细胞聚合物生物墨水和激活剂装入各自的小瓶中。然后在开始打印程序之前，使打印头填充准备(primed)。
使用ILS定制软件设计分析的3D结构。3D分析由3层圆形凝胶组成，总直径为6.35mm。通过软件在确定的位置重复沉积一滴聚合物生物墨水和激活剂对进行3D分析的生物打印。
细胞浓度
本实验使用浓度为2×106细胞/mL的细胞聚合物生物墨水。
细胞活力
获得大于或等于95％的细胞活力。
实施例13-人乳腺癌细胞(MCF7)的3D生物打印
细胞培养
在T75烧瓶中80％融合的MCF7细胞用3mL PBS洗涤。吸入过量PBS后，添加1mL胰蛋白酶，并将烧瓶在37℃下培育，以使细胞从烧瓶表面分离3分钟。随后，添加7mL由DMEM与FCS以10v/v％混合制备的组织培养基，并将分离的细胞转移到15mL管中。将细胞分散液在400g下离心3分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在5mL培养基中。然后通过将等体积细胞悬液与trypan蓝着色剂混合来进行细胞计数以确定细胞浓度。
基底
按原样使用康宁公司提供的96孔板。在无菌环境中打开无菌包装，以保持内容物无菌。
聚合物生物墨水
为了制备空白聚合物生物墨水，在1.5毫升PBS中溶解PEG-Mal(0.1125克)，得到7.5wt％的聚合物生物墨水。将CRGDS(0.54mg)、CIKVAV(0.64mg)、CYIGSR(0.70mg)和PEG-Mal(0.225g)混合于1.5mL PBS中30分钟，得到15wt％的PEG三肽，其中RGD、IKVAV和YIGSR各0.67mM。通过滴加1M NaOH，将溶液pH值提高到7.4。两种溶液均通过0.22μm注射器过滤器进行无菌过滤。
激活剂
为了制备非MMP和MMP响应性水凝胶，制备了两种不同的激活剂。这两种激活剂由PEG-双硫醇(0.015g)或GCRDPLGRDRCG(0.019g)制备得到，每种溶解在1mL PBS中，分别得到激活剂，激活剂中硫醇浓度与空白生物墨水和PEG-三肽中的马来酰亚胺浓度等摩尔。随后，通过滴加1M NaOH将MMP反应激活剂溶液调节至pH 7.4。然后通过0.22μm注射器过滤器对每种溶液进行无菌过滤。
将分散在1mL DMEM中的收获的MCF7离心，得到10000,000个细胞的细胞颗粒。然后将所得颗粒重新分散在激活剂(1mL)中，得到细胞MMP激活剂溶液，其中含有分散的MCF7，浓度为1×107细胞/mL。
细胞打印条件
将聚合物生物墨水、PEG双硫醇激活剂和MMP响应性细胞激活剂装入相关墨盒中，连接到生物打印机上。聚合物生物墨水、PEG双硫醇激活剂和MMP响应性细胞激活剂分别连接到一个0.007英寸的喷嘴上，工作压力在25到30kPa之间。
最初通过乙醇(70v/v％水溶液)擦拭清洁打印机并风干。流体管线、阀门和喷嘴也按顺序通过乙醇和无菌水清洗进行消毒。然后将聚合物生物墨水、PEG双硫醇激活剂和MMP响应性细胞激活剂装入各自的小瓶中。然后在开始打印程序之前，使打印头中填充准备(primed)。
使用ILS定制软件设计分析的3D结构。3D分析包括直径为6.35cm、厚度为100μm的底部凝胶层和直径为1mm、厚度为200μm的充满细胞的圆顶状凝胶。
细胞浓度
本实验使用浓度为1×107细胞/mL的细胞激活剂。
细胞活力
获得大于或等于95％的细胞活力。
实施例14–细胞排列比较
利用本技术的聚合物生物墨水和激活剂测试了对水凝胶微环境对胰腺癌细胞排列的影响。选择胰腺癌细胞是因为其生物学特性高度依赖于细胞培养环境。通过在96孔板上生物打印直径6mm、高度0.4mm的水凝胶样本来测试两种不同的细胞排列。第一种，在水凝胶的顶部3D生物打印细胞，第二种，在水凝胶内部(即，包封在水凝胶中)打印细胞。在两种细胞排列测试中，观察到了活细胞。此外，细胞-凝胶相互作用是可见的，以细胞向水凝胶中形成突起的能力表示。总的来说，用基于PEG的聚合物生物墨水成功地进行了生物相容性和生物相关的3D分析的生物打印。
接种在水凝胶顶部的胰腺癌细胞
由收获的胰腺导管腺癌细胞(KrasG12D和p53R172H)和4臂PEG-Mal(10kDa)制备细胞聚合物生物墨水，其中5mM RGD聚合物生物墨水用于3D生物打印。将胰腺癌细胞分散以适宜于接种约5,000个细胞/孔的浓度分散在细胞聚合物生物墨水中。
无细胞水凝胶最初是由4臂PEG-Mal(10kDa)，用5mM RGD聚合物生物墨水与PEG双硫醇和MMP-2(GCIPVSLRSGCG)激活剂(硫醇浓度比为50:50)在96孔板上进行3D生物打印形成的。然后将细胞聚合物生物墨水与PEG双硫醇和MMP-2激活剂(硫醇浓度比为50:50)一起打印在水凝胶顶部，以接种约5,000个细胞/孔。
对接种在水凝胶顶部的胰腺癌细胞进行显微镜观察。培育3天后，观察当相同细胞接种在组织培养材料顶部时的形态差异。当接种在水凝胶顶部时，细胞-凝胶和细胞-细胞相互作用都被促进，从而导致在所有三维空间中形成具有广泛细胞突起的扩展细胞网络。培育3天后，通过活/死染色试验证实了培养的细胞具有活力。证实，细胞活力>98％，在较大的活细胞群中清晰可见小的单个死亡细胞。
胰腺癌细胞也可接种在各种基底上以进行比较。显微图像显示，接种在组织培养孔板上的胰腺癌细胞非常个性(individualistic)。相反，当接种在水凝胶顶部时，胰腺癌细胞在多个细胞之间形成了一个扩张的网络。当接种在水凝胶顶部时，细胞能够侵入到水凝胶中并形成3D细胞网络。显微镜扫描z轴上的凝胶表明，水凝胶内存在3D细胞网络。
包封在生物惰性水凝胶中的胰腺癌细胞
将胰腺导管腺癌细胞(KrasG12D和p53R172H)以2×106细胞/mL的浓度分散于不含PEG-RGD的聚合物生物墨水中，以产生细胞聚合物生物墨水，细胞聚合物生物墨水与不含MMP-2响应肽的激活剂一起打印。通过在96孔板上用PEG双硫醇激活剂直接3D生物打印细胞生物墨水来实现原位包封。
共聚焦图像显示了包封在水凝胶内部的胰腺癌细胞。确认了细胞在培育期的形态。由于缺少RGD和MMP-2交联剂，细胞的形态在凝胶内是圆形。这种形态表明，细胞不能与水凝胶相互作用产生粘着斑，也不能在凝胶内移动。培育3天后对包封细胞进行活/死测定。荧光图像显示了培育3天后的活细胞(>95％存活率)。
包封在生物活性水凝胶中的胰腺癌细胞
将胰腺导管腺癌细胞(KrasG12D和p53R172H)以2x106细胞/mL的浓度分散在细胞聚合物生物墨水中，并与MMP-2响应性肽激活剂(硫醇浓度比为50:50)一起打印。通过在96孔板上用PEG双硫醇和MMP-2激活剂直接3D生物打印细胞聚合物生物墨水来实现原位包封。用MMP-2激活剂以允许细胞侵入。
共聚焦图像显示了包封在水凝胶内的胰腺癌细胞。确认了细胞在培育期的形态。在凝胶内部，细胞与细胞的相互作用由细胞簇的形成来表示，而细胞与凝胶的相互作用和细胞侵入则由细胞膜突起的存在来确认。在3天和6天的培育期后，对包封的细胞进行活/死试验。在培养3天后，亮场和荧光图像显示，在培育3天后，活细胞(>98％存活率)，并确认了存在细胞-细胞和细胞-凝胶相互作用。细胞侵入在培育6天时更明显，这表明了细胞-凝胶相互作用强烈。同时，在凝胶内培育6天后，仍保持了98％以上的细胞活力。
接种在水凝胶中的MCF7乳腺癌细胞
培育3天后，在明场显微镜下，通过观察细胞形态来确认细胞活性。在培育期后，单个MCF7细胞的团聚可见，从而在预先定义的凝胶区域形成多个球体，这表明了单个MCF7细胞在水凝胶内相互移动的能力。
实施例15-用马来酰亚胺基团修饰冷鱼皮明胶
在40℃下将鱼皮明胶(1g)溶解在20mL 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液中。在一单独的容器中，将6-马来酰亚胺基己酸(MHA；0.211g)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC，EDC:MHA摩尔比1：:20)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，1:2NHS:EDC摩尔比1:2)溶于1mLMES缓冲液中，保持搅拌20分钟，从而激活羧酸(COOH)基团。然后，将激活的COOH基团溶液转移到明胶溶液中，反应24小时。通过用10mM盐酸(HCl)和1wt％氯化钠(NaCl)渗析2天来纯化所得的溶液，然后再针对10mM HCl渗析1天。然后将纯化的明胶溶液冷冻干燥，得到马来酰亚胺修饰的鱼明胶。
实施例16-用马来酰亚胺基团修饰猪皮明胶
在40℃下将猪皮明胶(凝胶强度300，A型，1g)溶解在20mL MES缓冲液中。在一单独的容器中，将MHA(0.139g)，EDC(EDC:MHA摩尔比1:20)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，NHS:EDC摩尔比1:2)溶解在1mL MES缓冲液中，保持搅拌20分钟，从而激活COOH基团。然后将激活的COOH基团溶液转移到明胶溶液中，反应24小时。通过用10mM HCl和1wt％NaCl渗析2天来纯化所得的溶液，然后再用10mM HCl渗析1天。然后将纯化的明胶溶液冷冻干燥，得到马来酰亚胺修饰的猪皮明胶。
实施例17-马来酰亚胺修饰明胶的凝胶化
将实施例15和16中合成的来自猪和冷鱼皮的马来酰亚胺修饰明胶各自以20wt％溶解在PBS中，产生聚合物生物墨水。用1M NaOH将每种溶液的pH中和至pH 7.4。为了制备激活剂，将SH摩尔浓度与马来酰亚胺摩尔浓度相等的PEG-双硫醇溶解在PBS中。将等体积的各个聚合物生物墨水和激活剂混合，实现凝胶化。
实施例18-含胶原蛋白的PEG水凝胶的3D生物打印
基底
Thermofisher提供的细胞培养皿用模拟96孔板尺寸的目标网格蚀刻。
聚合物生物墨水
为了制备聚合物生物墨水，将PEG-Mal(0.15g)溶解在1.5mL PBS中，得到10wt％的聚合物生物墨水。通过0.22μm注射器过滤器对溶液进行无菌过滤。
激活剂
将GCRDPLGLDRCG(0.01g)混合在0.5mL PBS中制备得到含有胶原蛋白的激活剂。随后，将0.5mL I型牛胶原蛋白(3.1mg)混合至激活剂溶液中，产生含有胶原蛋白的MMP激活剂。随后，通过逐滴添加1M NaOH将溶液的pH调节至pH 7.4。然后通过0.22μm注射器过滤器对溶液进行无菌过滤。
打印条件
将含聚合物生物墨水和胶原蛋白的MMP激活剂装入相关墨盒中，连接到生物打印机上。聚合物生物墨水和激活剂均连接到0.007英寸的喷嘴上，工作压力在25至30kPa之间。
使用ILS定制软件设计分析的3D结构。3D矩形棱镜结构由长度和宽度约为4.5cm、厚度为150μm的底部凝胶层构成。
结构验证
使用USB数字显微镜对所得水凝胶结构进行成像。
实施例19-含有PEG水凝胶的胶原内的成纤维细胞培养
通过以1:1v/v比在PBS中将I型牛胶原蛋白与10wt％PEG-Mal混合来制备具有胶原蛋白的聚合物生物墨水。通过滴加1M NaOH溶液，使溶液的pH值提高到7.4。在PBS中制备含与马来酰亚胺浓度等摩尔的硫醇的PEG双硫醇激活剂。将收获的人肺成纤维细胞(MRC-5)颗粒化并重新悬浮在含胶原蛋白的聚合物生物墨水中。首先将聚合物生物墨水转移到孔板中，然后将等体积的含细胞激活剂转移到同一孔中，进而制备得到PEG水凝胶。然后将100μLDMEM+10v/v％FBS添加到每个孔中，培养样本6天，并在第0天、第3天和第6天拍摄亮场图像以监测细胞活动。
通过观察成纤维细胞形态从圆形形态到梭形形态的变化来评估用于成纤维细胞培养的凝胶的生物相容性。
本领域技术人员将认识到，本发明易受不同于具体描述的变化和修改的影响。应理解，本发明在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下包括所有这样的变化和修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。
本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤、特征、组合物和化合物中任意两个或更多个的任意和所有组合。
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Claims (34)

1.一种由使用具有至少两个巯基官能团的含双硫醇交联剂交联的含马来酰亚胺聚合物形成的3D打印水凝胶。
2.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶，其中，所述含马来酰亚胺聚合物选自含马来酰亚胺的多糖，包括含有果糖、蔗糖或葡萄糖单体的聚合物；合成聚合物，包括聚(乙二醇)(PEG)马来酰亚胺、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)马来酰亚胺、聚(ε-己内酯)(PCL)马来酰亚胺，聚(乙烯醇)(PVA)马来酰亚胺、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)马来酰亚胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAAM)马来酰亚胺、聚(富马酸丙烯酯)(PPF)马来酰亚胺、聚(亚乙基亚胺)(PEI)马来酰亚胺、聚(3-甲基丙烯酰胺丙基)三甲基铵(PMAETMA)马来酰亚胺、聚(L-赖氨酸)(PLL)马来酰亚胺、聚(丙烯酸)(PAA)马来酰亚胺、聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)马来酰亚胺、聚(丙烯酸-stat-二甲氨基乙基甲基丙烯酰胺)(P(AA-stat-DMAEMA))马来酰亚胺，和聚(甲基丙烯酸精氨酸)马来酰亚胺，或其衍生物；含马来酰亚胺的生物聚合物，包括明胶马来酰亚胺、纤维素马来酰亚胺、透明质酸马来酰亚胺和海藻酸盐马来酰亚胺；含马来酰亚胺的核碱基聚合物，包括含马来酰亚胺的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和/或胞嘧啶重复单元聚合物；及其任意组合。
3.根据权利要求2所述的3D打印水凝胶，其中，所述含马来酰亚胺聚合物包括PEG马来酰亚胺。
4.根据权利要求2所述的3D打印水凝胶，其中，所述含马来酰亚胺聚合物包括明胶马来酰亚胺。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的3D打印水凝胶，其中，所述含双硫醇交联剂选自合成聚合物、生物聚合物、小分子、生物活性分子，及其任意组合。
6.根据权利要求5所述的3D打印水凝胶，其中，所述合成聚合物选自PEG-双硫醇、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-双硫醇(NIPAAM-双硫醇)、聚(丙烯酸)-双硫醇、聚(甲基丙烯酸)-双硫醇、聚(苯乙烯磺酸盐)-双硫醇、聚(酰胺)-双硫醇，及其任意组合。
7.根据权利要求6所述的3D打印水凝胶，其中，所述含双硫醇交联剂为PEG-双硫醇。
8.根据权利要求5所述的3D打印水凝胶，其中，所述生物聚合物选自硫醇-明胶、硫醇-纤维素、硫醇-壳聚糖、硫醇-透明质酸，及其任意组合。
9.根据权利要求5所述的3D打印水凝胶，其中，所述小分子为二硫苏糖醇(DTT)。
10.根据权利要求5所述的3D打印水凝胶，其中，所述生物活性分子选自具有至少两个半胱氨酸氨基酸基团的短链肽、惰性短链肽、酶响应性短链肽、基质金属蛋白酶(MMP)响应性肽，及其任意组合。
11.根据权利要求10所述的3D打印水凝胶，其中，所述生物活性分子为MMP响应性双半胱氨酸肽。
12.根据权利要求11所述的3D打印水凝胶，其中，所述MMP响应性肽选自GCIPVSLRSGCG、GCRDGPQGIWGQDRCG、GCRDPLGLDRCG、GCRDEAPLKQDRCG，及其任意组合。
13.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶，其中，所述含马来酰亚胺聚合物为PEG-马来酰亚胺，所述含双硫醇交联剂选自PEG-双硫醇、MMP响应性肽，或其组合。
14.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶，其中，所述含马来酰亚胺聚合物为被至少一个选自RGD、YIGSR和IKVAV中的生物活性分子取代的PEG-马来酰亚胺，所述含双硫醇交联剂选自PEG-双硫醇、MMP响应性肽，或其组合。
15.根据权利要求13或14所述的3D打印水凝胶，其中，所述MMP响应性肽为GCIPVSLRSGCG、GCRDPLGLDRCG，或其组合。
16.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶，其中，所述含马来酰亚胺聚合物为明胶马来酰亚胺，所述含双硫醇交联剂为PEG-双硫醇。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的3D打印水凝胶，其中，含马来酰亚胺聚合物与含双硫醇交联剂的摩尔比在10:1～1:10的范围内。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的3D打印水凝胶，包含细胞。
19.根据权利要求18所述的3D打印水凝胶，其中，所述细胞悬浮在一部分水凝胶内或者所述水凝胶大体上均匀地悬浮在整个所述水凝胶中。
20.根据权利要求18或19所述的3D打印水凝胶，其中，打印细胞的浓度范围为1×105至5×108个细胞/mL。
21.根据权利要求18～20中任一项所述的3D打印水凝胶，其中，所述细胞选自肝细胞、胃肠道细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、气管细胞、血管细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、皮肤细胞、平滑肌细胞、结缔组织细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、乳腺细胞、生殖细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、雪旺细胞、脂肪细胞、骨细胞、骨髓细胞、软骨细胞、周细胞、间皮细胞、内分泌组织衍生细胞、基质细胞、干细胞、祖细胞、淋巴细胞、血细胞、内胚层衍生细胞、外胚层衍生细胞或中胚层衍生细胞，及其任意组合。
22.根据权利要求1～21中任一项所述的3D打印水凝胶，进一步包含生物活性分子。
23.根据权利要求22所述的3D打印水凝胶，其中，所述生物分子为游离的生物活性分子，或者与含马来酰亚胺聚合物或含双硫醇交联剂结合，或者既与含马来酰亚胺聚合物结合又与含双硫醇交联剂结合。
24.根据权利要求22或23所述的3D打印水凝胶，其中，所述生物活性分子选自肽、MMP响应性肽、蛋白质、多糖、药物、治疗剂、抗体、小分子抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、抗原、病原体、血小板、生长因子、细胞因子、氨基酸、营养素、条件培养基、抗生素、抗病毒药物、RNA，及其任意组合。
25.根据权利要求24所述的3D打印水凝胶，其中，所述生物活性分子为胶原蛋白。
26.根据权利要求1～24中任意一项所述的3D打印水凝胶，进一步包含细胞培养基。
27.一种制备3D打印水凝胶的方法，所述方法包括以下步骤：
提供聚合物生物墨水，所述聚合物生物墨水包括含马来酰亚胺聚合物；
提供激活剂，所述激活剂包括含双硫醇交联剂，具有至少两个巯基官能团；以及
打印所述聚合物生物墨水和所述激活剂，形成3D打印水凝胶。
28.根据权利要求27所述的方法，进一步包括提供细胞，形成含细胞的3D打印水凝胶。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，在3D打印之前，所述细胞存在于聚合物生物墨水中、存在于所述激活剂中、既存在于所述聚合物生物墨水又存在于所述激活剂中、或者存在于单独的介质中。
30.根据权利要求27～29中任意一项所述的方法，其中，聚合物生物墨水和激活剂在从打印开始的30分钟或更短、或者10分钟或更短、或者1分钟或更短、或30秒或更短、或者10秒或更短、或者1秒或更短时间内形成。
31.根据权利要求27～30中任意一项所述的方法，其中，在打印前将所述聚合物墨水、所述激活剂或二者均调节至大约pH 7.4。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，使用NaOH调节所述pH。
33.一种细胞分析法，包括根据权利要求18～21中任意一项所述的含细胞的3D打印水凝胶。
34.根据权利要求18～21中任意一项所述的含细胞的3D打印水凝胶用于细胞分析的用途。
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