CN113444264B - 用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法，属于生物医用材料领域，首先合成由Sortase A酶特异性底物短肽接枝的甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)共轭物(HAMA‑P)，该底物与一定浓度的Sortase A酶促交联，即可获得可注射的透明质酸单网络水凝胶。该方法具有原料易得、反应条件温和、反应时间短、等优点。然后制备了酶、光双交联的透明质酸‑明胶双网络水凝胶，酶促交联的透明质酸水凝胶作为第一网络快速成胶，紫外光交联的甲基丙烯酸化明胶(GelMA)水凝胶作为第二增强网络。本发明所制备的双网络水凝胶为细胞粘附生长提供了适宜的支架和三维微环境，在可注射组织工程、3D打印和细胞三维培养等方面都有着良好的应用前景。

Description

用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法。
背景技术
水凝胶是被广泛用于支持组织再生、作为细胞或药物的输送载体，或用于细胞三维培养应用的基质材料。透明质酸水凝胶(HA)具有生物相容性良好、不易降解、溶胀比高以及结构高度类似于细胞外基质等特点，是很有发展潜力的细胞三维培养支架材料。
目前，HA水凝胶主要通过化学官能团修饰，加入交联剂交联形成具有特定形状、机械硬度和生物活性的水凝胶。例如，通过与硫酸二肼反应将-SH共价交联到HA骨架上，并通过聚乙二醇二丙烯酸酯交联，以构建生物相容性的HA水凝胶。然而，这些活性试剂很容易发生副反应(与细胞表面的蛋白质反应等)，同时反应特异性较差。酶促交联反应因其温和的反应条件和特异性反应引起研究者广泛的兴趣。广泛存在于细菌细胞膜中的半胱氨酸转肽酶A(Sortase A)以其优异的反应动力学和高度特异性已经被应用于酶诱导的成键反应。Sortase A可以催化其中一个短肽底物中的C端序列LPXTG和另外一个短肽底物中的N端寡甘氨酸序列(Gn)之间形成新的酰胺键。特别地，Sortase A的浓度越高，酶促交联反应速率越快，因此可作为注射水凝胶的潜在交联体系。
值得注意的是，单一的HA水凝胶由于差的细胞粘附性使得三维培养时细胞形态始终为球状，不能促进细胞铺展。
而GelMA由于与明胶类似的优异的细胞粘附性和细胞相容性，有利于细胞生长增殖，但是其最大缺点是降解速率较快。因此单网络的水凝胶难以同时兼顾细胞相容性、机械强度和长时间稳定培养的要求。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，提供用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，为细胞的粘附、铺展和增殖提供良好的三维仿生环境，同时改善了支架材料降解过快等问题；本发明还提供用于细胞三维培养的双网络水凝胶的应用方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法，双网络水凝胶由Sortase A酶交联的透明质酸水凝胶网络和光交联的明胶水凝胶网络两部分组成，其制备方法包括如下步骤：
(1)Sortase A酶促交联底物甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA-P)的制备
酶底物短肽P通过迈克尔加成反应，即利用半胱氨酸侧链上的-SH官能团，直接共轭到甲基丙烯酸化透明质酸HAMA的双键上；
(2)HAMA-P/GelMA经酶、光双交联制备透明质酸-明胶双网络水凝胶(HAMA-P-GelMA)
将酶促交联底物HAMA-P以及水溶性光引发剂溶于DPBS缓冲液中，得到HAMA-P溶液，然后加入甲基丙烯酸化明胶GelMA溶解完全，混合均匀后加入Sortase A酶溶液并经紫外光照射，即得到HAMA-P-GelMA双网络水凝胶。
进一步地，所述的酶底物短肽P为P1(GGGG)和P2(LPETG)；酶促交联底物HAMA-P的组成为HAMA-P1和HAMA-P2。
进一步地，所述的HAMA的反应浓度为3～10μM；加入的TEOA缓冲液的浓度为100～500mM，pH为8.0，体积占总体积比的1/3～1；酶底物短肽P与HAMA的摩尔比为1:1～1:2。
进一步地，所述的HAMA-P的纯化步骤为加入无水乙醇将反应产物析出沉淀、离心，再次溶解于超纯水中；重复2～4次。
进一步地，所述的酶促交联底物HAMA-P中HAMA-P1和HAMA-P2是等质量浓度的，两者总质量体积浓度为0.25～1％；GelMA的质量体积浓度为5～10％。
进一步地，所述的Sortase A酶的交联浓度为2～100μM。
进一步地，所述的水溶性光引发剂为Iragure2959或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)，对应的紫外光源波长分别为365nm和405nm；使用的质量体积浓度为0.05～1％；紫外光照射时间为10～120s。
所述的HAMA-P-GelMA双网络水凝胶在体外细胞三维培养中的应用。
所述的制备的HAMA-P-GelMA双网络水凝胶应用于体外细胞三维培养，应用方法如下：首先，配置含有0.5～1％质量体积浓度的HAMA-P、5～7.5％质量体积浓度的GelMA以及0.25～0.5％质量体积浓度的光引发剂的水凝胶预溶液，完全溶解后，用0.22μm滤膜过滤除菌；消化培养的贴壁细胞，计数并离心，加入水凝胶预溶液，吹打均匀，使得细胞密度为2000～10000/mL；加入50～80μMSortase A酶溶液后快速滴加到PDMS薄膜上，并用圆形玻片覆盖，紫外光固化时间为10-30s，用DPBS淋洗负载细胞的水凝胶三次，加入新鲜DMEM培养液浸没培养；培养液每2天更换一次。
有益效果：与现有技术相比，本发明以功能化的透明质酸HAMA-P和GelMA为主要单体材料，制备出一种酶、光双交联的双网络水凝胶，它由酶交联的透明质酸水凝胶网络和紫外光交联的明胶水凝胶网络两部分组成。本发明中HAMA-P在Sortase A酶交联作用下形成的单网络透明质酸水凝胶具有可注射性和高细胞相容性的优点。GelMA在光引发剂和紫外光照射交联形成的单网络水凝胶，具有可促进细胞粘附增殖的优点。因此本发明制备的HAMA-P-GelMA双网络水凝胶，同时具有上述两种单一网络水凝胶的优点，即可注射性和可促进细胞生长，并且双交联形成的双网络水凝胶具有高机械强度和改善的降解速率，因而为细胞粘附、铺展和增殖提供了适宜的支架和理想的三维微环境。该双网络水凝胶的机械性能、降解性能等可灵活调控，且具有可注射性，光固化等特点，可满足细胞递送、组织工程和细胞三维培养等生物医用领域对水凝胶性能的要求，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的Soratase A酶促交联底物HAMA-P的制备示意图及相应的1H NMR图谱；
图2为本发明实施例1制备的Sortase A酶促交联的HAMA-P水凝胶可注射性试验。标尺：1cm；
图3为本发明实施例1制备的GelMA水凝胶和双网络水凝胶的压缩应力-应变曲线；
图4为本发明实施例1制备的GelMA水凝胶和双网络水凝胶的降解性能；
图5是本发明实施例1制备的GelMA水凝胶和双网络水凝胶三维培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在第3，7和14天的二维和三维以及截面活死染色荧光共聚焦显微图像，标尺：2D：200μm；3D：50μm。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例所用主要原材料：
甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)和甲基丙烯酸化明胶(GelMA)，购自苏州永沁泉智能设备有限公司；
短肽P1(GGGG)和P2(LPETG)，购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
Sortase A购自上海同科生物科技有限公司。
实施例1
(1)Sortase A酶促交联底物甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA-P)的制备
称取23.55mg HAMA(n(-C＝C-)＝50μmol，1equiv)完全溶解于8mL超纯水中，加入16mL 300mM三乙醇胺(TEOA)缓冲液(pH 8.0)混合均匀，通入N2 15min以除去溶液中的氧气。随后，称取65mg P1(75μmol，1.5equiv)或76mg P2(75μmol，1.5equiv)加入到上述混合物中，在室温，N2气氛中连续搅拌反应24h。反应结束后加入大量无水乙醇沉淀反应产物，以5000rpm/min转速离心15min，得到的沉淀再次溶解于超纯水中。以上纯化步骤重复两次。最后，产物在室温下用超纯水(Mw 3500Da)透析4天，冷冻干燥3天，-80℃储存。
(2)透明质酸-明胶双网络水凝胶(HAMA-P-GelMA)的制备
称取1％(w/v)的HAMA-P和5％(w/v)的GelMA完全溶解于含0.5％LAP的DPBS缓冲液中，加入2μM Sortase A酶，约17min左右成胶，然后再紫外光交联10s，制备得到了双网络水凝胶。
图1为实施例1制备的Sortase A酶促交联底物甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA-P)的合成和酶促交联示意图以及相应的酶促交联底物氢核磁共振图谱。酶底物短肽P首先通过迈克尔加成反应，即利用半胱氨酸侧链上的-SH官能团，共轭到HAMA的双键上，然后在酶催化作用下，酶促交联底物HAMA-P之间形成酰胺键而交联成胶(图1A)。由图1B和1C分别可以看出，HAMA-P1和HAMA-P2的1H NMR光谱中位于5.6ppm和6.1ppm处的质子峰(MA的-C＝C-)几乎消失，表明MA双键上的氢完全被P1和P2取代，说明酶底物短肽P成功地共轭到HAMA骨架上。另外短肽中各个氨基酸上的氢化学环境与HA骨架上的氢化学环境不同。
图2为实施例1制备的Sortase A酶交联的HA水凝胶的凝胶前后和可注射试验。如图2A所示，加入Sortase A酶后，溶液在一定时间内成胶。图2B所示的为不同的Sortase A交联浓度对水凝胶成胶时间的线性关系曲线。当使用的SA浓度大于80μM时，即凝胶时间小于1min，就可以进行可注射实验。水凝胶可以注射形成我们想要的任何形状。这有利于用于体内缺损组织的填补修复以及细胞递送治疗心肌梗死等疾病。
图3为实施例1制备的双网络水凝胶和单纯GelMA水凝胶的压缩应力-应变曲线。可以看出，GelMA水凝胶的杨氏模量为2000±100Pa，双网络水凝胶的杨氏模量为3750±250Pa，因此双网络水凝胶的机械性能得到了提高。
图4为实施例1制备的双网络水凝胶和单纯GelMA水凝胶的降解性能。单纯GelMA水凝胶显示快速的降解行为，在一个月内约有20％的质量损失。双网络水凝胶则没有发生明显的降解。说明双网络水凝胶支持细胞的长时间二维或三维培养。
图5为实施例1制备的双网络水凝胶和单纯GelMA水凝胶三维培养HUVECs在第3，7和14天的二维和三维以及截面活死染色荧光共聚焦显微图像。如图5A所示，GelMA中的HUVECs显示出良好的细胞活力；同时，培养第3天就发现大量细胞突起，说明HUVECs在GelMA水凝胶内具有良好的铺展能力。与GelMA不同，双网络水凝胶中的HUVECs在培养第3天也开始部分铺展但仍存在未铺展的大的球状细胞(图5B)。当培养到第7天和第14天，几乎没有球状细胞，细胞显示出类似于在GelMA水凝胶中的生长行为，并且未见明显的水凝胶支架降解，因此双网络水凝胶为细胞生长提供了一个合适的三维微环境。
实施例2
本实施例与实施例1中(1)不同的是：称取32.5mg P1(37.5μmol，0.75equiv)或38mg P2(3.75μmol，0.75equiv)加入到上述含有HAMA的TEOA混合溶液中，在室温N2气氛中反应24h。得到的HAMA-P1/P2中双键未被完全取代，可以进一步被紫外光交联生成单一成分的透明质酸双网络水凝胶，在此发明中不再赘述。其他与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1中(2)不同的是：称取1％(w/v)的HAMA-P和5％(w/v)的GelMA完全溶解于含0.5％LAP的DPBS缓冲液中，加入80μM Sortase A酶，约1min左右成胶，然后再紫外光交联10s，制备得到了双网络水凝胶。
其他与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1中(2)不同的是：称取0.5％(w/v)的HAMA-P和5％(w/v)的GelMA完全溶解于含0.5％LAP的DPBS缓冲液中，加入40μM Sortase A酶，约1min左右成胶，然后再紫外光交联10s，制备得到了双网络水凝胶。
其他与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1中(2)不同的是：称取0.5％(w/v)的HAMA-P和5％(w/v)的GelMA完全溶解于含0.5％LAP的DPBS缓冲液中，加入40μM Sortase A酶，约1min左右成胶，然后再紫外光交联30s，制备得到了双网络水凝胶。
其他与实施例1相同。
实施例6
本实施例与实施例1中(2)不同的是：称取1％(w/v)的HAMA-P和10％(w/v)的GelMA完全溶解于含0.5％LAP的DPBS缓冲液中，加入80μM Sortase A酶，约1min左右成胶，然后再紫外光交联30s，制备得到了双网络水凝胶。
其他与实施例1相同。
实施例7
本实施例与实施例1中(2)不同的是：称取1％(w/v)的HAMA-P和5％(w/v)的GelMA完全溶解于含0.25％LAP的DPBS缓冲液中，加入80μM Sortase A酶，约1min左右成胶，然后再紫外光交联10s，制备得到了双网络水凝胶。
其他与实施例1相同。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）Sortase A酶促交联底物甲基丙烯酸化透明质酸（HAMA-P）的制备
酶底物短肽P通过迈克尔加成反应，利用半胱氨酸侧链上的-SH官能团，直接共轭到甲基丙烯酸化透明质酸HAMA的双键上；
（2）HAMA-P/GelMA经酶、光双交联制备透明质酸-明胶双网络水凝胶（HAMA-P-GelMA）
将酶促交联底物HAMA-P以及水溶性光引发剂溶于DPBS或TEOA缓冲液中，得到HAMA-P溶液，然后加入甲基丙烯酸化明胶GelMA溶解，混合均匀后加入Sortase A酶溶液并经紫外光照射，即得到HAMA-P-GelMA双网络水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的酶底物短肽P选自P1和P2；对应的，酶促交联底物HAMA-P的组成为HAMA-P1和HAMA-P2。
3.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的HAMA的反应浓度为3~10μM；加入的TEOA缓冲液的浓度为100~500mM，pH为8.0，体积占总体积比的1/3~1；酶底物短肽P与HAMA的摩尔比为1:1~1:2。
4.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的HAMA-P的纯化步骤为加入无水乙醇将反应产物析出沉淀、离心，再次溶解于超纯水中。
5.根据权利要求2所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的酶促交联底物HAMA-P中HAMA-P1和HAMA-P2是等质量浓度的，两者总质量体积浓度为0.25~1%；GelMA的质量体积浓度为5~10%。
6.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的Sortase A酶的交联浓度为2~100μM。
7.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的水溶性光引发剂为Iragure2959或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂LAP，对应的紫外光源波长分别为365nm和405nm；使用的质量体积浓度为0.05~1%；紫外光照射时间为10~120s。
8.权利要求1-7中任意一项所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法制备得到的用于细胞三维培养的可注射双网络水凝胶在体外细胞三维培养中的应用。
9.权利要求8所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶在体外细胞三维培养中的应用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
配置含有0.5~1%质量体积浓度的HAMA-P、5~7.5%质量体积浓度的GelMA以及0.25~0.5%质量体积浓度的光引发剂的水凝胶预溶液，完全溶解后除菌；消化培养的贴壁细胞，计数并离心，加入水凝胶预溶液，吹打均匀，使得细胞密度为2000~10000/mL；
加入50~80μM Sortase A酶溶液后快速滴加到PDMS薄膜上，并用玻片覆盖，紫外光固化，用DPBS淋洗负载细胞的水凝胶若干次，加入DMEM培养液浸没培养。
10.权利要求9所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶在体外细胞三维培养中的应用的方法，其特征在于，所述的除菌是用0.22μm滤膜过滤，所述的紫外光固化时间为10-30s。
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