CN111303459B - 一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，首先，将透明质酸分别进行改性，获得呋喃和多巴胺改性透明质酸与呋喃和苯硼酸改性透明质酸，然后再将该两种改性透明质酸与马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇共混，发生双交联；苯硼酸和多巴胺的邻二醇结构能够在pH为7.4的条件下自发形成苯硼酸酯，赋予水凝胶可注射性和粘附性，产生单交联水凝胶，而在后续的时间中，呋喃基团和马来酰亚胺会发生Diels‑Alder反应，形成第二重交联，增强水凝胶的力学性能，获得双交联水凝胶。本发明采用点击化学和苯硼酸酯的双交联方式，所得产物具有良好的力学性能、可注射性以及抗透明质酸酶降解性，具备优良的生物相容性，两种交联方式温和快速，可包载细胞进行注射。

Description

一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料的技术领域，尤其是指一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶是一种含水量高，由亲水性聚合物与水结合形成的三维网络构成的体系，同时它们具有与天然ECM相似的独特性质，如高含水量，生物降解性，孔隙率和生物相容性，是用于组织工程和细胞治疗应用的多功能和吸引人的生物材料，水凝胶的组成、结构、机械性能和生物化学性质可方便地调节，以适应各种所需的生物医学应用。得益于以上优势，水凝胶作为组织工程修复材料被广泛研究，其应用领域包括神经、骨软骨、皮肤、肌肉以及血管等软组织修复。
透明质酸是软骨细胞外基质中的重要组成物质，并且是将软骨ECM组织成弹性结构的重要聚集蛋白聚糖组分，是应用与软骨组织工程水凝胶支架的优良材料。透明质酸参与软骨细胞的一些关键细胞活动，如形态发生、增殖和炎症，透明质酸对体外软骨细胞代谢具有刺激作用。透明质酸还可以显著增加硫酸软骨素、II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖等关节软骨外基质的合成。但目前组织工程中的透明质酸基材料存在力学性能差、易降解等问题，抑或是非可注射性的，临床操作性差，组织粘附性差，易脱落等等。
得益于透明质酸上羧基的易修饰性，近年来有许多研究使用了多种点击化学方法来制备透明质酸基水凝胶支架，包括Diels-Alder反应(Park et al.,2019)、Michael加成反应(Jin et al.,2010)、无铜叠氮-炔烃反应(Wang et al.,2018)等。其中Diels-Alder反应由于高选择性、无毒、无副产物等优秀，被广泛应用于组织工程支架的制备中。
可注射水凝胶可以用微创注射方法取代植入手术可以形成任何所需的形状，以匹配不规则的缺陷，相比于植入材料更简单便利。而可注射水凝胶常存在力学性能不足、与组织粘附性差、易脱落等不足，限制了其在组织工程的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种可用于软骨组织工程的透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，采用点击化学和苯硼酸酯的双交联方式，所得产物具有良好的力学性能、可注射性以及抗透明质酸酶降解性，具备优良的生物相容性，两种交联方式温和快速，可包载细胞进行注射，在软骨组织工程领域具有广泛的应用前景。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，首先，将透明质酸分别进行改性，获得呋喃基团和多巴胺基团修饰的透明质酸及呋喃基团和苯硼酸基团修饰的透明质酸，即获得两种改性透明质酸：呋喃和多巴胺改性透明质酸与呋喃和苯硼酸改性透明质酸，然后再将该两种改性透明质酸与马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇(PEG-4Mal)共混，发生双交联；其中，苯硼酸和多巴胺的邻二醇结构能够在pH为7.4的条件下自发形成苯硼酸酯，赋予水凝胶可注射性和粘附性，产生单交联水凝胶，而在后续的时间中，呋喃基团和马来酰亚胺会发生Diels-Alder反应，形成第二重交联，增强水凝胶的力学性能，获得双交联水凝胶。
所述透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将透明质酸溶于吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，利用羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化透明质酸分子链上的羧基，加入糠胺反应12～24h后，用羧基活化剂进行活化，加入盐酸多巴胺反应12～24h，而后经透析冻干获得呋喃和多巴胺改性透明质酸；将透明质酸溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，利用羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化透明质酸分子链上的羧基，加入3-氨基苯硼酸反应12～24h后，再加入羧基活化剂进行活化，加入糠胺反应12～24h，反应结束后经透析冻干获得呋喃和苯硼酸改性透明质酸；
2)将步骤1)得到的两种改性透明质酸分别溶解于磷酸缓冲液后，两者混合均匀，即得到单交联透明质酸基水凝胶，在单交联透明质酸基水凝胶中加入马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇(PEG-4Mal)，搅拌充分溶解，混合均匀，在37℃下反应进一步交联得到透明质酸基双交联水凝胶。
在步骤1)中，所述透明质酸、羧基活化剂、糠胺和盐酸多巴胺的摩尔比为1:1～2:1:3。
在步骤1)中，所述透明质酸、羧基活化剂、糠胺和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1:1～2:0.5:3。
在步骤1)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
在步骤2)中，所述两种改性透明质酸溶液的质量浓度为2～3w/v％。
在步骤2)中，所述马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇(PEG-4Mal)的分子量为10000。
本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
1、本发明所用材料为透明质酸为天然可再生高分子，其来源广泛易获取，并且其为天然软骨细胞外基质的重要组成，为软骨细胞的生长和代谢提供了更为相似的环境。
2、本发明的制备过程简单易操作，制备条件温和。
3、本发明赋予水凝胶可注射性，弥补了可注射透明质酸基水凝胶存在的缺陷。
4、本发明所采用的双交联方式反应条件均温和，无需加入任何交联剂和引发剂，保证了后续水凝胶仿生支架的无毒性和细胞相容性。
附图说明
图1为实施例1中制备呋喃、多巴胺改性的透明质酸的核磁氢谱图；图中ChemistryShift表示化学位移。
图2为实施例1中制备呋喃、苯硼酸改性的透明质酸的核磁氢谱图；图中ChemistryShift表示化学位移。
图3为实施例2中单交联水凝胶和双交联水凝胶实物图。
图4为实施例2中水凝胶的粘附性能宏观表征图；图中，Acrylate glue表示丙烯酸酯胶，Porcine skin表示猪表皮，Hydrogel表示水凝胶，Glass slide表示玻璃片，Metal表示金属基底。
图5为实施例3中不同pH下双交联水凝胶的应力应变曲线图；图中，stress表示应力，strain表示应变。
图6为实施例4中不同pH下双交联水凝胶的SEM照片。
图7为实施例5中ATDC-5细胞在双交联水凝胶中培养1、7天的共聚焦照片。
具体实施方式
下面结合多个具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将0.5g透明质酸在常温下完全溶于100mM吗啉乙磺酸缓冲液中，加入0.7g羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入110μL糠胺，室温避光下搅拌反应24h，再加入0.7g 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入0.7112g盐酸多巴胺，搅拌反应24h，反应结束后经截留分子量8000～14000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得呋喃和多巴胺改性透明质酸。
将0.5g透明质酸在常温下完全溶于100mM吗啉乙磺酸缓冲液中，加入0.7g羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入0.067g 3-氨基苯硼酸，室温下搅拌反应24h，再加入0.7g 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入704μL糠胺，避光搅拌反应24h，反应结束后经截留分子量8000～14000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得呋喃和苯硼酸改性透明质酸。
对上述两种改性透明质酸进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其分子结构，两种分子的1H NMR谱见图1、2。根据不同基团的特征峰，对化学位移为1.9的透明质酸特征峰进行积分计算得不同基团的取代度分别是：呋喃基团45％，苯硼酸基团22.5％，多巴胺基团28％。
将两种改性透明质酸分别溶于磷酸缓冲液中，配成质量分数为2％的溶液。通过pH计用0.05M NaOH溶液将溶液滴定至pH为7.4，再分别加入马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇，达到最终质量分数为6.25％。取等量溶液混合均匀，在30内得到单交联水凝胶。
将获得的单交联水凝胶注射入直径10mm，厚度5mm的圆柱状模具中，放入37℃反应2h，获得透明质酸基双交联水凝胶。
单交联水凝胶和双交联水凝胶实物参见图3所示，图4为水凝胶的粘附性能宏观表征图，可以从图中发现，单交联水凝胶力学不足以支撑其维持形状，而双交联水凝胶力学性能提高后可以维持圆柱体状。粘附性能上水凝胶既可以将玻璃片和200g的金属砝码良好的粘合在一起，也可以将两金属夹粘合在一起，并承受70g的重量。按照示意图进行搭接剪切测试，用拉力机夹住玻璃片两段进行剪切拉伸，测得水凝胶对于不同基质的粘附力，具体地说水凝胶对于猪皮的剪切模量为5.8kPa，对于金属的为2.1kPa，对于玻璃片的为3kPa。
实施例2
将0.5g透明质酸在常温下完全溶于100mM吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1.4g羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入110μL糠胺，室温避光下搅拌反应24h，再加入1.4g 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入0.7112g盐酸多巴胺，搅拌反应24h，反应结束后经截留分子量8000～14000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得呋喃和多巴胺改性透明质酸。
将0.5g透明质酸在常温下完全溶于100mM吗啉乙磺酸缓冲液中，加入1.4g羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入0.067g 3-氨基苯硼酸，室温下搅拌反应24h，再加入1.4g 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化羧基30min后，加入704μL糠胺，避光搅拌反应24h，反应结束后经截留分子量8000～14000透析袋透析4天，-50℃冷冻干燥获得呋喃和苯硼酸改性透明质酸。
将上述两种改性透明质酸分别溶于磷酸缓冲液中，配成质量分数为3％的溶液。通过pH计用0.05M NaOH溶液将溶液滴定至pH为7.4，再分别加入马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇，达到最终质量分数为9.375％。取等量溶液混合均匀，在30内得到单交联水凝胶。
将获得的单交联水凝胶注射入直径10mm，厚度5mm的圆柱状模具中，放入37℃反应2h，获得透明质酸基双交联水凝胶。
实施例3(不同pH下的双交联水凝胶的压缩性能测试)
将2％双交联水凝胶分别浸泡于pH为6、7.4和9的磷酸缓冲液中24h，使其溶胀完全。使用动态力学分析仪对在不同pH磷酸缓冲液下溶胀完全的水凝胶进行压缩性能测试，所得到的压缩曲线如图5所示。结果表示，随着pH提升，水凝胶的力学性能提高。这是因为随着pH的提升，苯硼酸酯形成的越多，对于该水凝胶的力学性能有一定的提升。
实施例4(不同pH下的双交联水凝胶的微观形貌表征)
将2％双交联水凝胶分别浸泡于pH为6、7.4和9的磷酸缓冲液中24h，使其交联网络反应完全，再于-20℃条件下冰冻，使用冻干机冻干水凝胶。将冻干的支架用液氮淬锻后掰开，用导电胶固定在电镜台上，喷金60s，用扫描电子显微镜观察各组水凝胶支架的截面，以观察水凝胶支架的内部形貌与孔径规律。不同pH下的双交联水凝胶的SEM照片如图6所示。结果表示，随着pH的上升，孔径增大，具体地说，pH＝6的水凝胶孔径为120um，pH＝7.4的水凝胶孔径为60um，pH＝9的水凝胶孔径为90um。
实施例5(双交联水凝胶的细胞相容性实验)
将实施例1的两种改性的透明质酸在紫外灯下灭菌12h后，分别溶于磷酸缓冲液中，配成质量分数为2％的溶液。通过pH计用0.05M NaOH溶液将溶液滴定至pH为7.4，再分别加入马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇，达到最终质量分数为6.25％。取等量溶液混合均匀，再加入ATDC-5细胞悬液，使细胞的最终浓度达到50万/mL。将水凝胶注射到48孔板中，置于37℃培养箱2h，加入完全培养基，并每两天换一次液。
对于培养到1、7天的支架进行共聚焦观察，共聚焦照片如图7所示。结果表示，各组水凝胶在培养了7天后，细胞都有一定数量的增殖，说明各组水凝胶都具备支持细胞增殖的能力，表明了水凝胶的生物相容性。
以上所述实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：首先，将透明质酸分别进行改性，获得呋喃基团和多巴胺基团修饰的透明质酸及呋喃基团和苯硼酸基团修饰的透明质酸，即获得两种改性透明质酸：呋喃和多巴胺改性透明质酸与呋喃和苯硼酸改性透明质酸，然后再将该两种改性透明质酸与马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇共混，发生双交联；其中，苯硼酸和多巴胺的邻二醇结构能够在pH为7.4的条件下自发形成苯硼酸酯，赋予水凝胶可注射性和粘附性，产生单交联水凝胶，而在后续的时间中，呋喃基团和马来酰亚胺会发生Diels-Alder反应，形成第二重交联，增强水凝胶的力学性能，获得双交联水凝胶；其包括以下步骤：
1)将透明质酸溶于吗啉乙磺酸缓冲液，利用羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化透明质酸分子链上的羧基，加入糠胺反应12～24h后，用羧基活化剂进行活化，加入盐酸多巴胺反应12～24h，而后经透析冻干获得呋喃和多巴胺改性透明质酸；将透明质酸溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，利用羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化透明质酸分子链上的羧基，加入3-氨基苯硼酸反应12～24h后，再加入羧基活化剂进行活化，加入糠胺反应12～24h，反应结束后经透析冻干获得呋喃和苯硼酸改性透明质酸；
2)将步骤1)得到的两种改性透明质酸分别溶解于磷酸缓冲液后，配成两种溶液，通过pH计用0.05M NaOH溶液将两种溶液滴定至pH为7.4后，两者混合均匀，即得到单交联透明质酸基水凝胶，在单交联透明质酸基水凝胶中加入马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇，搅拌充分溶解，混合均匀，在37℃下反应进一步交联得到透明质酸基双交联水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述透明质酸、羧基活化剂、糠胺和盐酸多巴胺的摩尔比为1:1～2:1:3。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述透明质酸、羧基活化剂、糠胺和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1:1～2:0.5:3。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述两种改性透明质酸溶液的质量浓度为2～3w/v％。
6.根据权利要求1所述的一种透明质酸基双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，所述马来酰亚胺封端的四臂聚乙二醇的分子量为10000。
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