CN113248732B - 可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法，首先通过酰胺化反应将羧基苯硼酸和明胶合成明胶‑苯硼酸，或将氨基苯硼酸和天然多糖合成多糖‑苯硼酸；并且通过酰胺化反应将多巴胺和明胶或天然多糖合成明胶‑多巴胺或多糖‑多巴胺；然后将明胶‑苯硼酸/多糖‑苯硼酸溶解于磷酸盐缓冲溶液中，明胶‑多巴胺/多糖‑多巴胺溶解于含有天然多酚物质的磷酸盐缓冲溶液中，将二者混匀发生即可发生自发的苯硼酸与多酚的酯化反应，生成可逆的硼酸酯键，最终制备得到可注射自适应天然水凝胶粘合剂；本发明的水凝胶粘合剂,具有很好的生物粘附性与抑菌抗炎作用，贴附于组织表面并发挥修复作用；具有良好的力学自适应性能，可匹配不同的动态组织的形变与频率。

Description

可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法

技术领域

本发明涉及高分子材料技术领域，特别涉及一种用于修复肺损伤的可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法。

背景技术

气胸(pneumothorax)是指气体进入胸膜腔，造成积气状态，称为气胸。多因肺部疾病或外力影响使肺组织和脏层胸膜破裂，或靠近肺表面的细微气肿泡破裂，肺和支气管内空气逸入胸膜腔。通常来说，因胸壁或肺部创伤引起者称为创伤性气胸；因疾病致肺组织自行破裂引起者称“自发性气胸”。创伤性气胸发生率在钝性伤中占15％～50％，在穿透性伤中占30％～87.6％。多由于肺被肋骨骨折断端刺破，亦可由于暴力作用引起的支气管或肺组织挫裂伤，或因气道内压力急剧升高而引起的支气管或肺破裂。创伤性气胸如果不得到及时治疗，极易引起呼吸衰竭甚至死亡。

创伤性气胸的治疗主要分为两个方面，胸腔排气解压和肺组织破损修补。一般而言，小的肺实质破损有自愈性，组织的漏气和出血很快会停止，大创面的肺损伤必须进行补漏。临床上尚未有有效的方法进行破损肺组织修补，主要原因有以下几个方面：(1)肺组织无法进行外科针线缝合，因为会造成新的漏气点；(2)肺组织是柔软的动态收缩-膨胀的实体，现有的医用粘合剂的力学硬度过大，粘附在肺组织表面无法适应肺表面形变的动态变化，从而导致局部变形不协调，应变过大等问题，有可能引起额外的肺功能损伤；(3)开胸手术成本高，对病人损伤大，手术难度大，即使是微创手术，创面依然较针刺或导管大的多。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于修复肺损伤的可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法，首先通过酰胺化反应将羧基苯硼酸和明胶合成明胶-苯硼酸，或将氨基苯硼酸和天然多糖(如透明质酸)合成多糖-苯硼酸；并且通过酰胺化反应将多巴胺和明胶或天然多糖合成明胶-多巴胺或多糖-多巴胺；然后将明胶-苯硼酸/多糖-苯硼酸溶解于37℃的磷酸盐缓冲溶液中，明胶-多巴胺/多糖-多巴胺溶解于含有天然多酚物质(如茶多酚、丹参多酚等)的37℃的磷酸盐缓冲溶液中，将二者混匀发生即可发生自发的苯硼酸与多酚的酯化反应，生成可逆的硼酸酯键，最终制备得到可注射自适应天然水凝胶粘合剂，由此制备方法制备出来的水凝胶粘合剂,具有很好的生物粘附性与抑菌抗炎作用，可以使材料很好的贴附于组织表面并发挥修复作用；具有良好的力学自适应性能，可匹配不同的动态组织的形变与频率，不会约束肺的自主呼吸行为；同时该水凝胶粘合剂可通过简单注射递送至患处并快速粘附成胶。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一:向质量分数1％～3％的天然大分子溶液中加入4-羧基苯硼酸或3-氨基苯硼酸，控制大分子溶液中的大分子单体与苯硼酸的摩尔比，并加入与苯硼酸等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，用0.5-1.5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至4-6，在30-50℃下搅拌反应1-2天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换不少于三次水，透析5-6天后冷冻干燥，可得到不同取代度的明胶/多糖-苯硼酸；

步骤二：向质量分数为1％～3％的天然大分子溶液中加入多巴胺，控制大分子溶液中的大分子单体与多巴胺的摩尔比，并加入与多巴胺等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，用0.5-1.5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至5，在30-50℃下搅拌反应1-2天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换不少于三次水，透析5-6天后冷冻干燥，可得到不同取代度的明胶/多糖-多巴胺；

步骤三：将带有苯硼酸的步骤一产物明胶/多糖-苯硼溶解在0.01M酸磷酸盐缓冲溶液中，总质量分数为5％～20％；将带有邻苯二酚基团的步骤二产物明胶/多糖-多巴胺溶解在含有天然多酚物质的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，总质量分数为5％～20％，35℃-40℃下将两者涡旋震荡均匀，即可得到质量分数为5％～20％的水凝胶。

所述的天然大分子溶液，其大分子单体即溶质为明胶或透明质酸，任意选择或组合；溶剂为去离子水与二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺的混合物，去离子水与二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1-2:1。

所述的控制大分子溶液中的大分子单体与苯硼酸的摩尔比，具体为，当天然大分子溶液中大分子单体为明胶时，摩尔比为1:(2～4)；天然大分子溶液中大分子单体为透明质酸时，摩尔比为1:(0.5～2)。

所述的控制大分子溶液中的大分子单体与多巴胺的摩尔比，具体为，当天然大分子溶液中大分子单体为明胶时，摩尔比为1:(3～6)；天然大分子溶液中大分子单体为透明质酸时，摩尔比为1:(0.5～2)。

所述的含有天然多酚物质的酸磷酸盐缓冲溶液，天然多酚物质包括表没食子儿茶素没食子酸酯、丹酚酸-B、茶多酚。

本发明的优点：

应用接枝苯硼酸的天然大分子(明胶、透明质酸)和接枝多巴胺的天然大分子交联，并混入天然多酚类物质，形成硼酸酯键可注射凝胶。动态可逆的硼酸酯键赋予水凝胶良好的力学自适应性能，可用于动态组织的损伤修复；多酚类物质具有很好的生物粘附性与抑菌抗炎作用，可以使材料很好的贴附于组织表面并发挥修复作用。

本发明的原理:

通过利用苯硼酸和邻苯多酚类物质生成的可逆化学键交联制备具有可注射、自适应等性能的天然水凝胶。其中苯硼酸和邻苯多酚类物质形成的硼酸酯键，具有动态可逆的反应特征，即键的断裂和新键生成存在动态平衡。由于硼酸酯键的解离速率相对于其他的动态共价键(如酰腙键)较快，其形成的水凝胶具有与生理频率相适应的特征松弛时间(10^-1～10¹秒)，且该特征时间可以简单的通过改变苯硼酸的种类来改变(如4-羧基苯硼酸，4-羧基-2-氟苯硼酸等)，因此可以自适应于肺在呼吸时的动态舒张与收缩。此外，天然的多酚类(如茶多酚等)物质，一方面可作为与邻苯多酚与硼酸形成硼酸酯键，另一方面，这些多酚基团已被证明具有良好的生物粘附性，可帮助有效水凝胶有效粘合在组织表面，其粘附强度可达30kPa以上。此外，茶多酚等也被证明具有良好的抗炎促伤口愈合等功能，在本发明中的水凝胶体系里掺入的天然的多酚类物质，可以通过硼酸酯键结合在材料体系中，并通过硼酸酯键的动态解离释放，起到药物缓释的作用。最后，本发明采用具有良好生物相容性的明胶和天然多糖材料作为水凝胶骨架，合成过程简单绿色，反应条件温和，在药物缓释，细胞释放，组织修复等生物医学领域均具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更详细的说明。

实施例一

本实施例，包括以下步骤：

步骤一：配置去离子水与二甲基亚砜体积比1:1的溶剂，将1.0g明胶在40℃下溶解到40mL溶剂中，配成2.5％的明胶溶液；将2mM，3mM或4mM 4-羧基苯硼酸或4-羧基-2-氟苯硼酸溶解在20mL溶剂中，再向其中加入等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，混匀后静置30分钟，然后将两种溶液混合，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至5，在40℃下搅拌反应1天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换三次水，透析5天后冷冻干燥，可得到取代度分别为12％，26％和40％的明胶-苯硼酸或明胶-氟代苯硼酸；

步骤二：配置去离子水与二甲基亚砜体积比1:1的溶剂，将1.0g明胶在40℃下溶解到40mL溶剂中，配成2.5％的明胶溶液，向其中加入3mM，4.5mM或6mM的多巴胺、再向其中加入等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至5，在40℃下搅拌反应1天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换三次水，透析5天后冷冻干燥，可得到取代度21％，33％或47％的明胶多巴胺；

步骤三：将带有苯硼酸的步骤一产物明胶-苯硼溶解在pH＝7.0的0.01M酸磷酸盐缓冲溶液中，质量分数为10％；将带有邻苯二酚基团的步骤二产物明胶-多巴胺溶解在含有10mM表没食子儿茶素没食子酸酯的pH＝7.0的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，质量分数为10％，将上述两种溶液等体积混合，37℃下将其涡旋震荡均匀，静置20秒后得到质量分数为10％的水凝胶。

对体重200g左右大鼠实施开胸手术并进行机械通气，用19G针头(外径约1.08mm)在肺表面扎出伤口产生漏气。使用取代度为12％的明胶苯硼酸和取代度为21％的明胶多巴胺混合成的凝胶。通过注射器将上述水凝胶直接均匀注射在破损漏气的大鼠肺部缺损处，形成一定大小的贴敷区域，伤口处即不再漏气，即可证实该种水凝胶具有良好的肺组织破损修补能力。也可通过外科手术方法摘除完整大鼠肺部并进行机械通气，用19G针头(外径约1.08mm)在肺表面扎出伤口产生漏气，然后将完整的肺叶浸入水中，缺口处产生气泡。使用注射器将上述制得的水凝胶直接均匀注射在破损漏气的大鼠肺部缺损处，形成一定大小的贴敷区域，再将完整的肺叶浸入水中，缺口处不再产生气泡，即可证实该种水凝胶具有良好的肺组织破损修补能力。使用取代度为26％的明胶苯硼酸和取代度33％的明胶多巴胺混合成的凝胶，以及取代度为40％的明胶苯硼酸和取代度为47％的明胶多巴胺混合成的凝胶也可取得类似的效果，且粘附强度随取代度的升高有所增强。

实施例二

本实施例，包括以下步骤：

步骤一：配置去离子水与N,N-二甲基甲酰胺体积比1:1的溶剂，将1.0g分子量为90kDa的透明质酸钠溶解到100mL溶剂中，配成1％的透明质酸溶液；向其中加入1.25mM，3mM或5mM 3-氨基苯硼酸，和等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至6，在室温下搅拌反应1天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换四次水，透析6天后冷冻干燥，可得到取代度15％，27％或41％的透明质酸-苯硼酸；

步骤二：配置去离子水与N,N-二甲基甲酰胺体积比2:1的溶剂，将1.0g分子量为90kDa的透明质酸钠溶解到50mL溶剂中，配成2％的透明质酸溶液；向其中分别加入1.25mM，3mM或5mM多巴胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至5，在室温下搅拌反应1天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换四次水，透析6天后冷冻干燥，可得到取代度14％,24％或36％的透明质酸多巴胺；

步骤三：将带有苯硼酸的步骤一产物透明质酸-苯硼溶解在pH＝7.0的0.01M酸磷酸盐缓冲溶液中，质量分数为20％、将带有邻苯二酚基团的步骤二产物透明质酸-多巴胺溶解在含有10mM表没食子儿茶素没食子酸酯的pH＝7.0的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，质量分数为20％，将上述两种溶液等体积混合，40℃下将其涡旋震荡均匀，静置20秒后得到质量分数为5％的水凝胶。

对体重200g左右大鼠实施开胸手术并进行机械通气，用19G针头(外径约1.08mm)在肺表面扎出伤口产生漏气。使用取代度为15％的透明质酸苯硼酸和取代度为14％的透明质酸多巴胺混合成的凝胶。通过注射器将上述水凝胶直接均匀注射在破损漏气的大鼠肺部缺损处，形成一定大小的贴敷区域，伤口处即不再漏气，即可证实该种水凝胶具有良好的肺组织破损修补能力。也可通过外科手术方法摘除完整大鼠肺部并进行机械通气，用19G针头(外径约1.08mm)在肺表面扎出伤口产生漏气，然后将完整的肺叶浸入水中，缺口处产生气泡。使用注射器将上述制得的水凝胶直接均匀注射在破损漏气的大鼠肺部缺损处，形成一定大小的贴敷区域，再将完整的肺叶浸入水中，缺口处不再产生气泡，即可证实该种水凝胶具有良好的肺组织破损修补能力。使用取代度为27％的透明质酸苯硼酸和取代度24％的透明质酸多巴胺混合成的凝胶，以及取代度为41％的透明质酸苯硼酸和取代度为36％的透明质酸多巴胺混合成的凝胶也可取得类似的效果，且粘附强度随取代度的升高有所增强。

实施例三

本实施例，包括以下步骤：

步骤一：配置去离子水与N,N-二甲基甲酰胺体积比3:2的溶剂，将1.0g分子量为90kDa的透明质酸钠溶解到100mL溶剂中，配成3％的透明质酸溶液；向其中加入1.25mM，3mM或5mM的3-氨基苯硼酸，和等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至5，在室温下搅拌反应1天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换三次水，透析5天后冷冻干燥，可得到取代度15％，27％或41％的透明质酸-苯硼酸；

步骤二：配置去离子水与二甲基亚砜体积比2:1的溶剂，将1.0g明胶在40℃下溶解到40mL溶剂中，配成3％的明胶溶液，向其中加入3mM，4.5mM或6mM的多巴胺、再向其中加入等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至5，在35℃下搅拌反应2天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换三次水，透析5天后冷冻干燥，可得到取代度21％，33％或47％的明胶多巴胺；

步骤三：将带有苯硼酸的步骤一产物透明质酸-苯硼溶解在pH＝7.0的0.01M酸磷酸盐缓冲溶液中，质量分数为5％、将带有邻苯二酚基团的步骤二产物明胶-多巴胺溶解在含有10mM丹酚酸-B的pH＝7.0的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，质量分数为5％，将上述两种溶液等体积混合，37℃下将其涡旋震荡均匀，静置20秒后得到透明质酸-明胶水凝胶。

对体重200g左右大鼠实施开胸手术并进行机械通气，用19G针头(外径约1.08mm)在肺表面扎出伤口产生漏气。使用取代度为15％的透明质酸苯硼酸和取代度为21％的明胶多巴胺混合成的凝胶。通过注射器将上述水凝胶直接均匀注射在破损漏气的大鼠肺部缺损处，形成一定大小的贴敷区域，伤口处即不再漏气，即可证实该种水凝胶具有良好的肺组织破损修补能力。也可通过外科手术方法摘除完整大鼠肺部并进行机械通气，用19G针头(外径约1.08mm)在肺表面扎出伤口产生漏气，然后将完整的肺叶浸入水中，缺口处产生气泡。使用注射器将上述制得的水凝胶直接均匀注射在破损漏气的大鼠肺部缺损处，形成一定大小的贴敷区域，再将完整的肺叶浸入水中，缺口处不再产生气泡，即可证实该种水凝胶具有良好的肺组织破损修补能力。使用取代度为27％的透明质酸苯硼酸和取代度33％的透明质酸多巴胺混合成的凝胶，以及取代度为41％的透明质酸苯硼酸和取代度为47％的透明质酸多巴胺混合成的凝胶也可取得类似的效果，且粘附强度随取代度的升高有所增强。

Claims (1)

1.可注射自适应天然水凝胶粘合剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一: 向质量分数1%~3%的天然大分子溶液中加入4-羧基苯硼酸或3-氨基苯硼酸，控制大分子溶液中的大分子单体与苯硼酸的摩尔比，并加入与苯硼酸等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和N-羟基琥珀酰亚胺，用0.5-1.5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至4-6，在30-50°C下搅拌反应1-2天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换不少于三次水，透析5-6天后冷冻干燥，可得到不同取代度的明胶/多糖-苯硼酸；

步骤二：向质量分数为1%~3%的天然大分子溶液中加入多巴胺，控制大分子溶液中的大分子单体与多巴胺的摩尔比，并加入与多巴胺等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和N-羟基琥珀酰亚胺，用0.5-1.5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至5，在30-50°C下搅拌反应1-2天后，再用透析袋将该溶液在去离子水中透析，一天换不少于三次水，透析5-6天后冷冻干燥，可得到不同取代度的明胶/多糖-多巴胺；

步骤三：将带有苯硼酸的步骤一产物明胶/多糖-苯硼溶解在0.01M酸磷酸盐缓冲溶液中，总质量分数为5%~20%；将带有邻苯二酚基团的步骤二产物明胶/多糖-多巴胺溶解在含有天然多酚物质的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，总质量分数为5%~20%，35^。C-40^。C下将两者涡旋震荡均匀，即可得到质量分数为5%~20%的水凝胶;

所述的天然大分子溶液，其大分子单体即溶质为明胶或透明质酸，任意选择或组合；溶剂为去离子水与二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺的混合物，去离子水与二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1-2:1;

所述的控制大分子溶液中的大分子单体与苯硼酸的摩尔比，具体为，当天然大分子溶液中大分子单体为明胶时，摩尔比为1:（2~4）；天然大分子溶液中大分子单体为透明质酸时，摩尔比为1:（0.5~2）;

所述的控制大分子溶液中的大分子单体与多巴胺的摩尔比，具体为，当天然大分子溶液中大分子单体为明胶时，摩尔比为1:（3~6）；天然大分子溶液中大分子单体为透明质酸时，摩尔比为1:（0.5~2）;

所述的含有天然多酚物质的酸磷酸盐缓冲溶液，天然多酚物质包括表没食子儿茶素没食子酸酯、丹酚酸-B、茶多酚。