CN113663116A - 具有止血和抗粘连的离子基水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有止血和抗粘连的离子基水凝胶及其制备方法和应用，其制备方法是将双键化氨基己酸和双键化甘氨酸的复合溶液制备的水凝胶前体溶液，氯化钙水溶液制备的钙离子溶液，交联剂在室温下混合反应200～500s，得到具有良好止血和抗粘连性能的可注射水凝胶，所述交联剂为N,N'－亚甲基双丙烯酰胺(Bis)。本发明选择甘氨酸及氨基己酸作为水凝胶的主要成分，进一步引入具有良好止血性能的钙离子，通过自由基聚合反应，金属‑羧基配位作用，制备具有良好黏附以及强大机械性能的水凝胶敷料，本发明的制备方法操作简单，使用的原材料易于获取且价格低廉，同时制得的水凝胶敷料具有良好的粘合性、止血性能、抗粘连能够有效地用于肾脏肿瘤行保留肾单位手术后。

Description

具有止血和抗粘连的离子基水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于可降解生物医药材料技术领域，具有止血和抗粘连的离子基水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
肾癌是全球常见的肿瘤之一。尽管肾癌的手术治疗及药物治疗取得了进展，但肾癌患者的总体预后仍较差。手术治疗是肾癌患者的首选治疗手段。随着术前检查的完善及手术方式的改进，保留肾单位手术作为T1a期肾肿瘤的首选术式被广泛应用。
无论选择开放或腹腔镜下手术操作，术后组织粘连的形成成为一个无法避免的问题。手术后组织粘连伴随多种并发症，如慢性腹腔疼痛、肠梗阻等。这些并发症在全球范围内对数十万患者产生了负面影响。尽管许多研究集中在减轻术后炎症反应，溶解纤维蛋白，物理阻挡不同脏器表面接触上，以减少或延缓组织粘连的发生。但在实际应用中存在防粘连效果差、操作性差、湿表面粘附性差等问题。
另外，在保留肾单位手术中，为了降低缺血再灌注损伤对术后正常肾组织功能产生的负面影响，需要术者缩短术中热缺血时间。因此具有止血效果的材料对于肾癌手术预后具有积极的意义。但是目前关于同时满足抗粘连和止血的新型材料用于开放或腹腔镜下保留肾单位手术的报道仍然十分罕见。
原位可注射水凝胶在预凝胶状态下，表现出良好的可注射性，可以通过注射或喷雾方式，可在不引起凝胶碎裂的情况下被注射到伤口部位直接施用于创面部位，在短时间内经历转变或响应pH和温度的变化，原位形成水凝胶，并迅速与组织交联。然后原位形成的水凝胶作为抗粘连屏障(Yang,Y.；Liu,X.；Li,Y.；Wang, Y.；Bao,C.；Chen,Y.；Lin,Q.；Zhu,L.,Acta Biomaterialia 2017,62,199-209)。
考虑到水凝胶在模拟肾肿瘤保留肾单位手术后止血和抗粘连的应用，能够在开腹及腹腔镜操作下应用于肿瘤床创面防粘连的水凝胶止血材料应具备的基本要求是：第一，可通过腹腔镜Trocar喷洒于肿瘤床及周围脏器表面；第二，快速高效的止血性能，缩短缝合止血过程的时间；第三，在干燥或湿润表面均可快速与组织黏附，无需对待作用创面进行预处理；第四，稳定且长期的粘合性能，以防止其从创面脱落。然而，现有的水凝胶防粘连材料无法同时满足上述要求，因此，迫切需要开发新型的防粘连材料，用于肾脏肿瘤行保留肾单位手术后的止血和抗粘连的应用。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺点，本发明提供一种具有止血和抗粘连的离子基水凝胶及其制备方法和应用，具有良好的粘附性、止血性、机械性能、生物相容性，抗粘连性能。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：具有止血和抗粘连的离子基水凝胶的制备方法，是通过将水凝胶前体溶液，钙离子溶液，交联剂等在室温下混合反应200～500s，得到具有良好止血机械性能和抗粘连的离子基水凝胶；所述的水凝胶前体溶液是双键化氨基己酸和双键化甘氨酸的复合溶液，所述的钙离子溶液是氯化钙水溶液；所述交联剂为N,N'－亚甲基双丙烯酰胺(Bis)；
其中双键化氨基己酸和双键化甘氨酸的质量比为(80～100)：(0～20)；所述钙离子与水凝胶前体溶液，交联剂的质量比为(0～10)：(100～120)：(0～1)。
优选的，所述水凝胶前体溶液的制备方法是将双键化氨基酸与双键化氨基酸衍生物溶解于去离子水中，获得水凝胶前体溶液。
优选的，所述钙离子溶液的制备方法是将氯化钙溶解到去离子水中，制备含有钙离子的氯化钙溶液。
优选的，所述双键化氨基己酸和双键化甘氨酸的浓度分别为120～180mg/mL 和0～200mg/mL。
优选的，所述的水凝胶前体溶液的浓度为140～200mg/mL，所述的氯化钙溶液浓度为0～200mg/mL，所述的交联剂Bis的浓度为0～10mg/mL。
优选地，所述水凝胶的制备还需要添加引发剂和催化剂，引发剂为过硫酸铵(APS)，催化剂为四甲基乙二胺(TEMED)，水凝胶前体物质与引发剂、催化剂的质量比为(100～120)：(3～5)：(0～3)，其中，引发剂的浓度为80～120mg/mL，催化剂的浓度为0～50μL/mL。
利用如上制备方法制得的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶，对于处理直径×深度为6×6mm的肾脏创面，将水凝胶前体溶液直接注射到伤口区域时，水凝胶止血效果明显优于传统的缝合处理；对于处理直径×深度为6×6mm的肾脏创面，将水凝胶附着在肾脏创面，水凝胶具有良好的抗粘连效果。
具有良好黏附止血机械性能的水凝胶在肾脏肿瘤行保留肾单位手术后止血和抗粘连应用。
本发明的优点是：本发明公开了一种具有止血和抗粘连的离子水凝胶制备方法，选择甘氨酸及氨基己酸作为水凝胶的主要成分，所制备的水凝胶表现出良好的生物相容性；水凝胶前体溶液，钙离子溶液，交联剂通过自由基聚合反应，氨基酸及其衍生物的所及与钙离子之间的金属-羧基配位作用，制备具有良好黏附以及强大机械性能的水凝胶敷料；将双键化的甘氨酸和双键化的氨基己酸溶解到去离子水中，制备了氨基酸及其衍生物的水凝胶的前体复合溶液，甘氨酸以及氨基己酸分子结构中的羧基可在酸性环境下被质子化，然后在界面上的其他末端羧基或酰胺基之间形成氢键，赋予水凝胶良好的黏附性能；引入的钙离子能够与水凝胶骨架中来源于甘氨酸和氨基己酸末端的羧基发生金属-羧基配位作用，提升水凝胶的内聚力，以显著提高水凝胶的黏附以及机械性能，因而能够处理肾脏肿瘤保留肾单位手术后创面处早期大量出血；钙离子作为凝血机制中多种因子的辅因子，参与到内外源性凝血途径中的多个环节，进一步提高了水凝胶止血性能；负载钙离子的水凝胶敷料增强的粘合强度，以防止敷料从伤口部位脱落，进而可以为伤口提供更好，更长的保护；本发明的制备方法操作简单，使用的原材料易于获取且价格低廉，同时制得的水凝胶敷料具有良好的粘合性、止血性能、抗粘连能够有效地用于肾脏肿瘤行保留肾单位手术后。
进一步地，本发明的制备方法中，以双键化甘氨酸和双键化氨基己酸为主要原料，按照一定的配比将其溶解到去离子水中，得到水凝胶前体溶液；通过将氯化钙溶解到去离子水中，制备含有钙离子的氯化钙溶液；得到的水凝胶前体溶液与钙离子溶液生理环境下进行交联反应(Bis作为交联剂)，得到具有止血和抗粘连的水凝胶敷料(AA/Gly/Ca，其中，AA表示双键化氨基己酸，Gly表示双键化甘氨酸，Ca表示钙离子)。AA/Gly/Ca水凝胶敷料中的主体成分6-氨基己酸作为一种抗纤溶剂，已被证实可以用于促进创面愈合；进一步地，钙离子作为凝血因子Ⅳ，钙离子辅助其他凝血因子的激活，并且与激活的凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅴ在血小板磷脂膜上结合成为凝血酶原激活物，进一步激活凝血酶原和纤维蛋白原，最终形成不溶性的纤维蛋白网，完成血液凝固的最后阶段，有助于提升水凝胶的止血性能。
以APS/TEMED作为催化体系，N,N'－亚甲基双丙烯酰胺(Bis)作为交联剂，通过调整催化剂TEMED在水凝胶敷料中的含量，使得水凝胶显示出可控的胶凝时间以及良好的可注射性，以实现更方便、更简化的条件下应用于肾脏肿瘤行保留肾单位手术后的创面止血和抗粘连应用。
本发明公开了一种具有止血和抗粘连的离子基水凝胶敷料，是基于上述制备方法得到的，该水凝胶敷料具有如下优点：
(1)有效和稳定的粘附性能，通过双键化甘氨酸和双键化氨基己酸为主要原料构筑的水凝胶网络中含有大量的羧基，可以在水凝胶敷料和组织之间形成氢键来产生黏附，赋予水凝胶敷料有效和稳定的粘附性能。
(2)具有快速的止血性能，水凝胶的良好粘附性可以粘附在伤口部位并在短时间内凝胶化，从而提供稳定的凝胶网络作为物理屏障，可防止血液从伤口部位流出；钙离子作为凝血机制中多种因子的辅因子，参与到内外源性凝血途径中的多个环节，进一步提升了敷料的止血性能；带负电荷的羧基可以激活凝血过程的内在途径，并最终导致形成稳定的血纤蛋白，从而在止血早期强化血小板栓塞促进凝血；
(3)具有良好的机械性能，钙离子与羧基之间的金属-离子配位作用显著增强水凝胶的应力及模量，使其在处理肾脏肿瘤行保留肾单位手术后的止血时，能够承受早期的大量出血且保证自身结构不被破坏。因此，可以作为有效的密封剂以提供急性止血，并且手术后期，用作形成抗粘连的屏障。
本发明制备的水凝胶含有大量的羧基，可以与周围组织的酰胺基之间形成氢键来产生黏附，因而该水凝胶敷料具有高效且稳定的粘附性能；水凝胶敷料具有良好的止血和抗粘连性能，可以牢固地粘附在伤口部位，作为屏障来保护伤口，并为伤口提供合适的微环境以加速内肾脏肿瘤行保留肾单位手术后伤口的止血和抗粘连；水凝胶具有良好的机械性能，能够在SD大鼠的肾脏肿瘤行保留肾单位手术后，处理伤口区域的出血。
所以本发明制备的水凝胶敷料，可以通过注射器在不引起凝胶碎裂的情况注射到肾脏伤口区域，原位形成水凝胶敷料，并迅速与组织交联，并稳定且长期粘合于肾脏伤口区域，且该水凝胶敷料结构稳定，粘合性能优异，成凝胶时间较短，因此该水凝胶敷料表现出良好的止血性能。同时，该水凝胶敷料能够承受具有良好的机械性能，进而可以为伤口提供更好，更长的保护，并作为抗粘连屏障以避免肾脏肿瘤行保留肾单位手术后的术后粘连产生。此外，本发明的制备方法操作简单，使用的原材料易于获取且价格低廉。因此，具有止血和抗粘连的离子基水凝胶敷料在肾脏肿瘤行保留肾单位手术后止血和抗粘连领域具有巨大的应用价值。
附图说明
图1是AA/Gly水凝胶的相角；
图2是AA/Gly/Ca水凝胶的相角；
图3是本发明制得AA/Gly水凝胶在流变仪测定的存储模量-时间曲线；
图4是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶在流变仪测定的存储模量-时间曲线；
图5是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶在磷酸盐缓冲液中的溶胀曲线；
图6是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶的应力测试；
图7是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶的应变测试；
图8是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶的应力-应变曲线；
图9是本发明制得的AA/Gly(图9(a))和AA/Gly/Ca(图9(b))水凝胶在猪皮肤基质上的黏附强度；
图10是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶对于小鼠血细胞水凝胶的凝血指数测试；
图11是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶对于小鼠血细胞的溶血率测试；
图12是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶对于小鼠成纤维细胞(L929)的细胞存活率测试，图12(a)为水凝胶萃取液浓度为5mg/mL时，成纤维细胞相容性；图12(b)为AA/Gly/Ca5水凝胶萃取液浓度为0-15mg/mL时成纤维细胞相容性；
图13是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶的在模拟肾脏肿瘤行保留肾单位手术的止血效果；
图14是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶的体内抗粘连实验结果；
图15是本发明制得的AA/Gly/Ca水凝胶的组织化学染色；
具体实施方式
下面结合附图对本发明做清楚完整的描述，以使本领域的技术人员在不需要作出创造性劳动的条件下，能够充分实施本发明。
实施例1
具止血和抗粘连的离子基质水凝胶敷料的制备：
(1)将100mg的双键化氨基己酸，0mg的双键化甘氨酸，21.6mg的氢氧化钠溶解到700μL去离子水中，制备水凝胶前体溶液；
(2)100μLBis(N,N'－亚甲基双丙烯酰胺)用去离子水配制成5mg/mL溶液；
(3)50μLAPS(过硫酸铵)用去离子水配制成100mg/mL溶液，50μL TEMED(四甲基乙二胺)用去离子水配制成40μL/mL溶液，在25℃条件下和水凝胶前体溶液、Bis相互交联200～500秒，得到具有止血和抗粘连的离子基质水凝胶水凝胶敷料AA/Gly0。
实施例2
将实施例1中的双键化甘氨酸浓度提升至5mg，其它条件同实施例1，得到 AA/Gly5水凝胶。
实施例3
将实施例1中的双键化甘氨酸浓度提升至10mg，其它条件同实施例1，得到AA/Gly10水凝胶。
实施例4
将实施例1中的双键化甘氨酸浓度提升至15mg其它条件同实施例1，得到 AA/Gly15水凝胶。
实施例5
将实施例1中的双键化甘氨酸浓度提升至20mg，其它条件同实施例1，得到AA/Gly20水凝胶。
实施例6
(1)将100mg的双键化氨基己酸，5mg的双键化甘氨酸，21.6mg的氢氧化钠溶解到700μL去离子水中，制备水凝胶前体溶液；
(2)100μL氯化钙用去离子水配制成0mg/mL溶液；
(3)100μL Bis(N,N'－亚甲基双丙烯酰胺)用去离子水配制成5mg/mL 溶液；
(4)50μLAPS(过硫酸铵)用去离子水配制成100mg/mL溶液，50μL TEMED(四甲基乙二胺)用去离子水配制成40μL/mL溶液，在25℃条件下和水凝胶前体溶液、钙离子溶液、Bis相互交联200～500秒，得到具有止血和抗粘连的离子基质水凝胶水凝胶敷料AA/Gly/Ca0。
实施例7
将实施例6中的氯化钙浓度提升至50mg/mL，其它条件同实施例6，得到 AA/Gly/Ca5水凝胶敷料。
实施例8
将实施例6中的氯化钙浓度提升至100mg/mL，其它条件同实施例6，得到 AA/Gly/Ca10水凝胶敷料。
实施例9
将实施例1中的氯化钙浓度提升至150mg/mL，其它条件同实施例6，得到 AA/Gly/Ca15水凝胶敷料。
实施例10
将实施例6中的氯化钙浓度提升至200mg/mL，其它条件同实施例6，得到 AA/Gly/Ca20水凝胶敷料。
实施例1～10制备的水凝胶敷料的原料组成如表1所示：
表1
Figure RE-GDA0003287096530000071
图1，图2利用TA流变仪(DHR-2)测定实施例1～5以及6～10制得水凝胶AA/Gly和AA/Gly/Ca的相角(tan(δ)＝损失模量/存储模量)，相角越大，水凝胶润湿性和顺应性越低。实验步骤为，在37℃下，以1％恒定应变，10rad/s恒定频率，将300μL水凝胶聚合物溶液置于20mm平行板之间，间隙为1000μm，通过时间扫描测试测定，进行评估。结果如图1，图2所示。在图1中，随着双键化甘氨酸在水凝胶中的含量升高，水凝胶的相角越来越小，甚至降至tan(δ)<1，意味着水凝胶溶液向着弹性占主导的状态转变；在图2中，随着钙离子在水凝胶中的含量升高，水凝胶的相角越来越小，意味着水凝胶溶液向着弹性占主导的状态转变。
图3，图4是利用TA流变仪(DHR-2)测定实施例1～5以及6～10制得水凝胶AA/Gly和AA/Gly/Ca的存储模量-时间曲线。实验步骤为，在37℃下，以1％恒定应变，10rad/s恒定频率，将300μL水凝胶聚合物溶液置于20mm平行板之间，间隙为1000μm，通过时间扫描测试测定，评估AA/Gly和AA/Gly/Ca的存储模量。结果如图3和图4所示，由图3可知，随着Gly在水凝胶中的含量升高，水凝胶样品的存储模量不断增高；由图4可知AA/Gly/Ca0，AA/Gly/Ca5，AA/Gly/Ca10，AA/Gly/Ca15，AA/Gly/Ca20随着Ca在水凝胶中含量升高在完全成胶后，存储模量分别为154.82Pa，233.59Pa，247.53Pa，278.01Pa和396.08Pa，也是增高的趋势。
图5是实施例6～10制得水凝胶敷料在37℃下，PBS(pH＝7.4)溶液中的溶胀曲线，结果如图5所示，在pH值为7.4时，所有水凝胶敷料均可急剧溶胀，由图5可知AA/Gly/Ca0，AA/Gly/Ca5，AA/Gly/Ca10，AA/Gly/Ca15，AA/Gly/Ca20 的平衡溶胀率分别为1243.15±60.55％，815.29±21.20％，739±14.82％, 709.60±9.26％，657.774.93％，水凝胶的溶胀率随着钙离子浓度升高为降低，这主要是因为随着钙离子浓度的升高，金属-离子配位作用增强，水凝胶的网络强度进一步升高所导致的。
图6，图7，图8是对实施例6～10制得水凝胶敷料进行的应力测试，应变测试，以及应力应变曲线。具体实验步骤为，制备直径为6mm，长度为8mm的柱状水凝胶，在配备有50N称重传感器的Instron材料测试系统(MTS Criterion 43， MTS Criterion)上以10mm/min的速度进行拉伸测试。由图6可知，实施例6～10 所制备的水凝胶AA/Gly/Ca0，AA/Gly/Ca5，AA/Gly/Ca10，AA/Gly/Ca15，AA/Gly/Ca20的峰值应力分别为60.62±8.60，82.30±10.17，103.98± 14.62，116.37±22.08，121.68±29.98Pa，随着钙离子浓度越大，应力增加；由图7可知，实施例6～10所制备的水凝胶AA/Gly/Ca0，AA/Gly/Ca5， AA/Gly/Ca10，AA/Gly/Ca15，AA/Gly/Ca20的峰值应变分别为419.96±52.97， 210.08±42.44，175.98±18.29，174.12±21.25，168.74±26.37；图8为水凝胶的应力-应变曲线，由图8可知，实施例6～10制得水凝胶杨氏模量随着钙离浓度增加而增加。
图9对实施例1～5和6～10制得水凝胶进行粘合强度的测试，具体实验步骤为，选择新鲜的猪皮肤作为被粘物，将新鲜的皮肤制成大小为1x 3cm的矩形块，将100μLAA/Gly或者AA/Gly/Ca水凝胶聚合物溶液注入猪皮肤的表面，然后将另一块猪皮肤置于水凝胶溶液上，粘合面积为10×10mm将猪皮肤在室温下放置3小时，使用搭接剪切试验，在配备有50N称重传感器的Instron材料测试系统(MTS Criterion 43，MTS Criterion)上以5mm/min的速度进行搭接剪切测试。
由图9(a)可知，实施例1～5所制备的水凝胶AA/Gly0，AA/Gly5，AA/Gly10， AA/Gly15，AA/Gly20的黏附强度分别为1.35±0.32，2.84±0.37，3.06± 0.36，3.39±0.21，1.13±0.4kPa；图9(b)可知，实施例6～10所制备的水凝胶AA/Gly/Ca0，AA/Gly/Ca5，AA/Gly/Ca10，AA/Gly/Ca15，AA/Gly/Ca20的黏附强度分别为3.23±0.35，6.33±1.07，8.83±0.75，7.00±1.54，7.67± 1.00kPa。对实施例1～5而言，当双键化甘氨酸浓度在5，10，15mg/mL时，水凝胶表现出最高的粘合强度，对实施例6～10而言，当添加氯化钙后，水凝胶粘合强度显著提高。
对实施例6～10所制备的水凝胶的动态全血凝血性能测试，纱布和明胶止血海绵作为对照组，凝血指数越高表示水凝胶凝血性能越差。参考图10，空白组，纱布组和明胶止血海绵组在900秒后依然呈现出较高的凝血指数，分别为79.44 ±4.41，36.71±8.92，36.21±4.98。在水凝组，AA/Gly/Ca0，AA/Gly/Ca5， AA/Gly/Ca10组在相同的时间点呈现出低于纱布，止血海绵的凝血指数。因此，说明AA/Gly/Ca0，AA/Gly/Ca5，AA/Gly/Ca10水凝胶具有有效的凝血性能。
对实施例6～10制得水凝胶的血液相容性进行评估，具体实验步骤为，通过将昆明小鼠血液离心(1000rpm)10分钟获得红细胞，使用PBS稀释至最终浓度为5％(v/v)待用，在24孔培养板中将500μL红细胞悬液与500μL水凝胶混合。以100rpm的振荡速度，在37℃下放置1h后之后，将500μL新鲜PBS添加到每个装有水凝胶的微孔板孔中，将所有微孔板内容物以1000rpm离心10分钟，以去除无溶血性红细胞，将100μL上清液小心地转移到新的96孔透明板上。使用酶标仪(Molecular Devices)读取540nm处溶液的吸光度，0.1％Triton X-100用作阳性对照，DPBS用作阴性对照。参考图11，水凝胶AA/Gly/Ca的溶血率均在3％以下，结果表明，实施例6～10制得水凝胶表现出良好的血液相容性。
对实施例6～10制得水凝胶的细胞相容性测试，图12(a)为水凝胶萃取液浓度为5mg/mL时，成纤维细胞相容性；图12(b)为AA/Gly/Ca5水凝胶萃取液浓度为0-15mg/mL时成纤维细胞相容性。实验步骤为：实验步骤为，将冻干的 AA/Gly/Ca水凝胶样品在37℃的细胞培养基中浸泡48h，制备一系列固定浓度的无菌AA/Gly/Ca水凝胶萃取液。将悬浮在100μL完全生长培养基中的L929细胞接种到96孔板的每个孔中，培养24小时后，将培养基换成100μL样品的水凝胶萃取液，共孵育24小时后，除去培养基，并将100μL完全生长培养基中的
Figure RE-GDA0003287096530000101
试剂添加到平板中的每个孔中，使用微孔板读取器读取每个孔的荧光，以评估细胞活力，结果参考图12。
实施例6～10中的AA/Gly/Ca的细胞数据统计结果如12(a)所示，从图中可以看出，L929在与AA/Gly/Ca水凝胶萃取液共同培养细胞的24小时，72小时之后，Alamar-Blue测定的细胞数目显示出增长的趋势，这表明整个实验过程中细胞的良好生长，共同培养24h后，水凝胶组与对照组之间细胞活力的定量数据没有明显差异，共同培养72小时后，与对照组组相比，所有水凝胶组均显示出较低的细胞增殖，但对照组和水凝胶组之间的细胞活力没有差异(存活率均大于85％)，说明水凝胶提取物没有细胞毒性浸出物，显示出良好的体外细胞相容性，可以作为良好的生物医疗材料。
实施例7所制备的AA/Gly/Ca5的细胞数据统计结果如12(b)所示，从图中可以看出，L929在与AA/Gly/Ca水凝胶萃取液(0-15mg/mL)共同培养细胞的24小时，共同培养24h后，即使萃取液的浓度上升至15mg/mL，水凝胶组与对照组之间细胞活力的定量数据没有明显差异，进一步说明水凝胶提取物没有细胞毒性浸出物，显示出良好的体外细胞相容性，可以作为良好的生物医疗材料。
图13是对实施例7制得AA/Gly/Ca5水凝胶的止血性能进行评估测试，实验步骤为：对于大鼠肾脏止血模型，简要的，对大鼠进行麻醉，右侧卧位固定在操作台上，手术区域备皮消毒，做左旁正中切口，见左肾，轻柔剥除肾周脂肪及浆膜，暴露肾动静脉及输尿管，将预先称重的滤纸置于肾脏下方以收集造模过程中的出血，2-0丝线(Mersilk，ETHICON)活结暂时关闭肾动静脉，用直径6mm 打孔器在肾表面制造6mm的圆柱状创面，待创面血液流速减缓后，水凝胶组用注射器将1mLAA/Gly/Ca5水凝胶溶液施加到出血部位，实验组组选用4-0带针可吸收线褥式缝合创面，空白组无处理，3组处理结束后观察5分钟，打开线结，用预先称重的纱布沾取渗出的血液并记录，出血时间结果如图14的第二幅图所示，在大鼠肾脏止血模型中，空白对照组大鼠出血319.475±134.15mg，缝合组大鼠出血112.8±102.12mg，水凝胶组大鼠出血47.13±41.83mg；图14的第三幅图为大鼠的止血时间，空白对照组，缝合组，水凝胶组大鼠的止血时间分别为 1.68±0.32min，1±0.71min，0.69±0.80min。
对实施例7制得水凝胶的抗粘连性能进行评估测试，简要的，大鼠麻醉后，手术区域备皮消毒，做左旁正中切口，见左肾，轻柔剥离肾周脂肪和浆膜，显露肾动静脉和输尿管，2-0丝线(Mersilk，ETHICON)活结暂时关闭肾动静脉，用直径6mm打孔器在肾表面制造直径×深度(6×6)mm的圆柱状创面，水凝胶组待创面渗血减缓后，将直径为7mm的水凝胶切片贴附于伤口部位，缝合组选用4-0带针可吸收线褥式缝合肾脏创面，阴性对照组对创面无处理，观察5分钟后，开放线结，待渗血停止后将肾脏归位，分层缝合腹壁并包扎，每组进行3次重复实验，在第7天腹腔注射过量水合氯醛进行安乐死，观察粘连情况，结果如图15所示。大鼠肾脏大体标本可见水凝胶组创面残留水凝胶，表面光滑，无纤维结缔组织粘连，缝合组可见缝合创面与周围结缔组织、肠管、脾或腹壁等之间出现纤维结缔组织，阴性对照组创面与肾周结缔组织、肠管及腹壁间出现组织粘连，粘连情况严重者，锐性剥离粘连组织，可见小部分组织遗留肾创面上。
表2是对实施例7制得水凝胶的粘连指数的评估，通过粘连指数对组织粘连程度进行评分：0分＝无粘连，1分＝组织粘连可在重力牵引下分离，2分＝组织粘连需钝性分离，3分＝组织粘连需锐性分离。结果如表2所示，在大鼠肾部分切除模型中，术后7天取材可见，水凝胶组均未出现组织粘连，平均粘连指数为0 分；缝合组出现1例无粘连，2例需钝性分离粘连，平均粘连指数为1.33分；空白组为3例需钝性分离粘连，平均粘连指数为2分。
表2
Figure RE-GDA0003287096530000121
对实施例7制得水凝胶治疗7天后，肾脏组织的组织化学HE染色切片。结果如图15所示，HE染色实验组轻微降解的水凝胶材料覆盖在创面上，其下可见大量红细胞，新生肉芽组织出现，与正常肾组织分界明显，部分可见正常肾皮质处的肾小管长入创面修复组织，新生肾脏小管结构紊乱；缝合组可见缝线截面，创面对合良好，创面出现肉芽组织，可见炎细胞浸润，与正常肾组织区分明显，部分可见粘连的其他组织位于肾轮廓外；阴性对照组可见新生肉芽组织及紊乱的新生小管结构出现。
综上所述，本发明所制备的水凝胶敷料具有有效和稳定的粘附性能，稳定的流变学特性、可调节的胶凝时间，良好的机械性能，良好的止血性能和抗粘连性，可以通过注射器在不引起凝胶碎裂的情况下注射到肾脏伤口区域，原位形成水凝胶敷料，并迅速与组织交联，并稳定且长期粘合于肾脏伤口区域，为伤口提供更好，更长的保护，并作为抗粘连屏障以避免肾脏肿瘤行保留肾单位手术后的术后粘连产生。因此，具有止血和抗粘连的离子基水凝胶敷料在肾脏肿瘤行保留肾单位手术后止血和抗粘连领域具有巨大的应用价值。
以上对本发明的较佳实施例进行了描述，需要指出的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (8)

1.具有止血和抗粘连的离子基水凝胶的制备方法，其特征在于，将水凝胶前体溶液，钙离子溶液，交联剂在室温下混合反应200～500s，得到具有良好止血机械性能和抗粘连的离子基水凝胶；
所述的水凝胶前体溶液是双键化氨基己酸和双键化甘氨酸的复合溶液，将双键化氨基己酸和双键化甘氨酸溶解于去离子水中，获得水凝胶前体溶液；
所述的钙离子溶液是氯化钙水溶液，将氯化钙溶解到去离子水中，制备含有钙离子的氯化钙溶液；所述交联剂为N,N'－亚甲基双丙烯酰胺。
2.根据权利要求1所述的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的水凝胶前体溶液的浓度为140～200mg/mL，所述的氯化钙溶液浓度为0～200mg/mL，所述的交联剂N,N'－亚甲基双丙烯酰胺的浓度为0～10mg/mL。
3.根据权利要求2所述的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述双键化氨基己酸和双键化甘氨酸的质量比为(80～100)：(0～20)；所述钙离子与水凝胶前体溶液，交联剂的质量比为(0～10)：(100～120)：(0～1)。
4.根据权利要求3所述的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述双键化氨基己酸和双键化甘氨酸的浓度分别为120～180mg/mL和0～200mg/mL。
5.根据权利要求4所述的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水凝胶的制备还需要添加引发剂和催化剂，所述引发剂为过硫酸铵，所述催化剂为四甲基乙二胺，所述水凝胶前体溶液与引发剂、催化剂的质量比为(100～120)：(3～5)：(0～3)。
6.根据权利要求5所述的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述引发剂的浓度为0～50mg/mL，所述催化剂的浓度为0～30μL/mL。
7.利用权利要求1-6任一制备方法制得的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶，其特征在于，水凝胶可直接注射在肾脏创面或者直接附着在肾脏创面上。
8.权利要求7所述的具有止血和抗粘连的离子基水凝胶在肾脏肿瘤行保留肾单位手术后止血和抗粘连应用。
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