CN112007204B - 一种抗感染促愈合止血防粘连膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗感染促愈合止血防粘连膜及其制备方法。止血防粘连膜由N‑马来酰化壳聚糖与透明质酸钠‑琥珀酰亚胺酯反应制得的下层，N‑马来酰化明胶、聚乙烯亚胺、外泌体、丙烯酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯、马来酸酐、N,N'‑亚甲基双丙烯酰胺经亲核取代反应后自由基聚合制得的中层，丙烯酸酯PEG‑N羟基琥珀酰亚胺酯、钙盐、凝血酶、丙烯酰胺经亲核取代反应后自由基聚合制得的上层组成。本发明制备的止血防粘连膜下层接触伤口后迅速将水分转移到中层，快速粘附，在内源性止血和机械压迫双重作用下高效止血；中层可缓慢释放明胶与外泌体促进伤口愈合，上层可抗感染、预防伤口粘连。故本止血防粘连膜有快速止血、促愈合、抗感染和防粘连功效。

Description

一种抗感染促愈合止血防粘连膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种抗感染促愈合止血防粘连膜及其制备方法。本申请的医用止血膜具有快速止血、防止位移、促愈合、抗感染、防粘连的功效。
背景技术
在突发性事故的急救、手术以及在战争中，50%的死亡是因大量出血导致。一些传统的止血材料，例如止血纱布、止血绷带、止血棉纱等，他们的止血能力有限，止血效果并不十分理想。因此，开发出高效而且快速可吸收的止血材料及产品，在出血发生后的1-2分钟，甚至更短的时间内，有效地快速止血，这成为止血材料研发的主要目标之一。止血膜是一种用于在进行外科手术时对伤口进行止血的材料，当将止血膜贴敷到血管破损处时，其中亲水性高分子材料会与血小板发生粘着和凝聚作用，然后形成血小板血栓，继而凝成纤维蛋白栓塞来堵住血管破损处，从而达到止血作用。
在伤口愈合过程，防止愈合过程中感染、粘连及加速伤口愈合已经成为很重要的方面。壳聚糖能够增加细菌细胞外膜和内膜的渗透性，且其质子化的氨基可破坏细菌细胞膜的结构和功能，进而使细胞膜的完整性遭到破坏，从而抑制细菌活性。明胶是一种广泛应用于生物医学领域的天然可吸收材料，生物相容性好，无毒无刺激，分子结构上有大量的羟基、氨基和羧基，是一种两性物质，具有极强的亲水性；置于出血部位、迅速吸收血液，引起血小板破裂，促进凝血，达到止血的目的，同时具有促进新细胞形成功能和细胞粘附性。透明质酸是一种酸性粘多糖。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如抑制组织迁移、减少血纤维蛋白原沉积、阻隔和润滑作用、抗炎和促进组织愈合作用等。因此透明质酸常被制成止血膜，从而起到抑制过量纤维组织形成，防止粘连的发生，减少手术并发症，促进伤口愈合等作用。故壳聚糖、明胶和透明质酸已经被广泛应用于止血膜的制备。
例如在申请号为201711316988.2的发明专利中，公开了一种壳聚糖基复合止血膜的制备方法。此发明首先将壳聚糖液和明胶液混合，并加入聚乙二醇和交联剂，搅拌反应，制得成膜液，再经流延成膜，得壳聚糖基薄膜，再将无机粉料分散液喷洒于壳聚糖基薄膜表面，自然晾干后冷压，得冷压膜，再于冷压膜表面涂覆营养匀浆后，喷洒木醋杆菌菌液，经恒温恒湿培养后，灭菌、洗涤和干燥，即得壳聚糖基复合止血膜。此发明所得壳聚糖基复合止血膜止血效果得到了有效提高，而且伤口愈合后，便于从伤口剥离，有利于避免清除止血膜时产生疼痛和二次受伤的情况。但该止血膜对伤口的粘附性能不强，在遇到出血较大或伤口血压较大时，易脱落，起不到很好的机械止血作用。且该止血膜无防粘连和促进伤口愈合的功效。
申请号为201410748532.3的发明专利中，公开了一种复合止血膜材料，包括壳聚糖膜层和淀粉/明胶膜层，所述壳聚糖膜层和淀粉/明胶膜层的质量比为(1:1)～(1:20)；此发明还公开了一种复合止血膜材料的制备方法，将配制的壳聚糖溶液置于模具中干燥成型，制得壳聚糖膜层；将淀粉溶液与明胶溶液按质量为(1:1)～(5:1)共混配制共混液，将共混液加入所述的壳聚糖膜上，固化成型，得到复合止血膜。此发明中的复合止血膜可同时启动几种止血机制，高效止血，同时与创面有较佳的粘附性；另外，此发明制备的复合止血膜材料具有良好的生物相容性、可吸收降解，有效止血的同时具有一定的抑菌性、促愈合作用。但该止血膜粘附作用有限，在遇到出血较大或伤口血压较大时，仍易脱落，抑菌和促愈合效率低，且无防粘连功效。
市场上常见的大清可吸收止血膜是由透明质酸钠和羧甲基壳聚糖经共混、分装、冷冻干燥、裁剪、包装和辐照等工序制得。该止血膜与伤口接触后，短时间内可编程凝胶，吸附于创面上，大大节约手术时间，提高手术效率，降低手术风险。该止血膜由一定的防粘连功效，但其机械性能差、粘附性能不佳，无法起到机械压迫止血的作用，且促愈合功效较低。
综上所述，临床上急需一种生物相容性好、不易位移、机械强度高、可快速止血、抗感染、防粘连和长效高效促愈合功能的止血防粘连膜。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性好、不易位移、机械强度高、可快速止血、防粘连和长效高效促愈合功能的止血防粘连膜。
一种抗感染促愈合止血防粘连膜，所述止血防粘连膜由下层、中层和上层组成：下层由N-马来酰化壳聚糖与透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯充分混匀后，加入0.006-0.020的光引发剂，充分混匀后，在紫外灯下聚合而成；中层由N-马来酰化明胶、聚乙烯亚胺、外泌体、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯充分混匀后，再加入马来酸酐、0.2-0.5%的光引发剂和0.01-0.02%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺充分混匀，将混合液加入到以下层为底的容器中，在紫外灯下聚合而成；上层由丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯、钙盐、凝血酶、丙烯酰胺、0.05-0.10%光引发剂充分混匀后喷涂到中层表面，在紫外灯下聚合而成。止血防粘连膜下层、中层和上层聚合后，经程序式真空干燥、灭菌制得成品。
进一步的，所述N-马来酰化壳聚糖重量百分比为2-4，优选为2.5-3.5%；所述透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯重量百分比为2.4-6.5%，优选为3.1-5.7%；N-马来酰化明胶重量百分比为20-30，优选为22.5-27.5；聚乙烯亚胺重量百分比为0.01-0.03%，优选为0.015-0.025%；外泌体重量百分比为0.5-1.0%，优选为0.07-0.08%；N-羟基琥珀酰亚胺酯重量百分比为4-8%，优选为5-7%；马来酸酐重量百分比为5-10%，优选为7-8%；丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯重量百分比为4-6%，优选为4.5-5.5%；钙盐重量百分比为0.2-0.4%，优选为0.25-0.35%；凝血酶重量百分比为0.1-0.3%，优选为0.15-0.25%；丙烯酰胺重量百分比为1-2%，优选为1.25-1.75%；
所述N-马来酰化壳聚糖的分子量为20-200KDa，马来酰化取代度为20-40%；
所述透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯的分子量为1500-2200KDa ，琥珀酰亚胺酯接枝率为90-95%；所述N-马来酰化壳聚糖中的氨基与透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯中的琥珀酰亚胺酯，摩尔比为1.25:1。
所述N-马来酰化明胶的分子量为50-100KDa，马来酰化取代度为85-95%；
所述聚乙烯亚胺的分子量为1800Da；
所述外泌体为脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞中的一种或多种间充质干细胞分泌的外泌体；
所述丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯分子量为1-10KDa；
所述钙盐为氯化钙、硫酸钙、碳酸钙中的一种或多种；
所述凝血酶为固体粉末，酶活为40-300U/mg；
所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。
所述聚合第下层所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为20-30min；
所述中层聚合所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为20-40min；
所述上层聚合所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为10-20min；
本发明还提供了抗感染促愈合止血防粘连膜的制备方法包括以下步骤：
（1）下层聚合反应：将N-马来酰化壳聚糖与透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入光引发剂，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于紫外灯下聚合，得止血防粘连膜下层。
（2）中层聚合反应：将N-马来酰化明胶、聚乙烯亚胺、外泌体、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入马来酸酐、N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和光引发剂在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在紫外灯下聚合，得止血防粘连膜中层。
（3）上层聚合反应：将丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯、钙盐、凝血酶、丙烯酰胺、光引发剂在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在紫外灯下聚合，得止血防粘连膜上层。
（4）程序式真空干燥：将经以上步骤得到的止血防粘连膜置于模具中，置入程序真空干燥机中，经程序真空干燥后得到未灭菌止血防粘连膜。
（5）灭菌：将步骤（4）中得到的未灭菌止血防粘连膜，经包装、15-25K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
所述一种抗感染促愈合止血防粘连膜的制备方法步骤（3）中所述喷涂方法为雾化喷涂。
所述一种抗感染促愈合止血防粘连膜的制备方法步骤（4）中所述止血防粘连膜置于模具中时，下层面接触模具，上层面朝上；所述程序真空干燥的方法为：首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.5-1h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2-3h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1-2h。
本发明所使用的组分均可以是商购产品，其结构和组成也是本领域技术人员所知晓的。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
1.本发明所述止血防粘连膜中层内的N-马来酰化明胶、聚乙烯亚胺、外泌体中的氨基可与丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯发生亲核取代反应，而N-马来酰化明胶、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酸酐、N, N'-亚甲基双丙烯酰胺在光引发剂下发生自由基聚合反应，从而形成多维度和高混度的化学交联方式，保证了止血防粘连膜的机械强度。
2. 本发明止血防粘连膜上层含有酰胺键，中层含有酰胺键和羧基，中层和上层通过吸水动力学，可快速清除止血防粘连膜与伤口组织界面中的水分，使止血防粘连膜上层中的聚丙烯酰胺链段和N-羟基琥珀酰亚胺酯基团与组织产生强共价键和分子间作用力，再加上止血膜具有高机械强度，从而使止血膜可通过机械压迫，高效止血，且不受血液与组织液影响。而上层中的钙盐和凝血酶则可加速伤口处的凝血，从而使止血效率更高。
3.本发明止血防粘连膜的下层为N-马来酰化壳聚糖与透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯通过亲核取代和自由基双重交联而得，其中壳聚糖成分可有效抑菌，防止伤口感染，而透明质酸成分可有效防止伤口粘连。
4.本发明止血防粘连中层将明胶和外泌体通过化学键交联到止血防粘连中层整个网络体系中，随着止血防粘连膜在伤口处的降解，可缓慢释放明胶和外泌体，不但起到了长效促愈合的作用，而且可避免单纯明胶促愈合成分单一，促愈合效果差的问题。
5.本发明利用特定的程序真空干燥、灭菌和保存工艺，在保证止血防粘连膜无菌提供的同时，还可保证血防粘连膜长效促愈合和高效粘附功能。
附图说明
附图1是实施例1所述血防粘连膜随时间降解曲线图。
附图2是血防粘连膜结构图。
具体实施方式
以下结合实施例和比较例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不受这些具体实施例的限制。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明中对止血防粘连膜的检测采用以下检测方法：
（1）表面粘附力测试
将大鼠背部皮肤切开一个1cm×1cm的创面，然后将试验材料贴附于创面区域，按压10min后，从材料侧面进行剥离，测定拉力值，即为创面表面粘附力强度，每个样品测试6次取平均值。
（2）破裂强度试验
按照ASTM F2392-04的方法测定可粘附促愈合止血膜的破裂强度，重复5次取平均值。
（3）体积溶胀率试验
体积的测试方法选用排液法，将止血防粘连膜材料置于装有一定体积液体的量筒中，读取液面升高数值，分别测得止血防粘连膜材料吸水溶胀前的体积V0及充分吸水溶胀后的体积V1。体积溶胀率计算方法为：饱和溶胀后的体积V1与初始体积V0的差值占初始体积V0的百分比，每个样品测试6次取平均值。
（4）吸水倍率试验
将0.025g止血防粘连膜置于2ml水中进行静置10min，然后在500rpm转速下进行离心10分钟后取出，称重计算残液量，每个样品测试6次取平均值。
（5）吸水速率试验
将1cm×1cm，厚度为1mm的止血膜，用移液枪滴加20μl纯化水，记录水滴被吸收时间，即为止血膜的吸水速率，每个样品测试5次取平均值。
（6）体外细胞毒性试验
按照医疗器械生物学评价第5部分：细胞毒性试验GB/T16886.5-2017进行。
（7）皮肤刺激和致敏试验
按照医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验GB/T16886.10-2017进行。
实施例1将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例2将4%的N-马来酰化壳聚糖（100-200KDa，取代度20%）与6.5%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.011%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合20min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（70-100KDa，取代度85-95%）、0.01%的聚乙烯亚胺、1.0%的外泌体、4%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入10%的马来酸酐、0.020%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.50%%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合40min，得止血防粘连膜中层。将4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（10KDa）、0.4%的碳酸钙、0.3%的凝血酶、2%的丙烯酰胺、0.09%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合20min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.5h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥3h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、15K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例3将2%的N-马来酰化壳聚糖（20-80KDa，取代度40%）与2.4%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.011%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合20min，得止血防粘连膜下层。将20%的N-马来酰化明胶（50-80KDa，取代度85-95%）、0.03%的聚乙烯亚胺、0.5%的外泌体、8%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入5%的马来酸酐、0.02%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.20%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合20min，得止血防粘连膜中层。将6%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（1KDa）、0.2%的硫酸钙、0.1%的凝血酶、2%的丙烯酰胺、0.10%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合10min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥1h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥2h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、25K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例4将4%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度40%）与4.9%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.020%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例5将2%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度20%）与3.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.006%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合20min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例6将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将30%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.03%的聚乙烯亚胺、1.0%的外泌体、8%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入10%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.50%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合40min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例7将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将20%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.01%的聚乙烯亚胺、0.5%的外泌体、4%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.20%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例8将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.23%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将6%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（2KDa）、0.4%的氯化钙、0.3%的凝血酶、2%的丙烯酰胺、0.10%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合20min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例9将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.23%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将4%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（5KDa）、0.2%的氯化钙、0.1%的凝血酶、1%的丙烯酰胺、0.05%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例1将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例2将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例3将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例4将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例5将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例6将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例7将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合10min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合5min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合5min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.75h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2.5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
比较例8将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥3h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥1h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥3h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
实施例9将3%的N-马来酰化壳聚糖（90-120KDa，取代度30%）与4.3%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯（1500-2200KDa，取代度90-95%）在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入0.013%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合25min，得止血防粘连膜下层。将25%的N-马来酰化明胶（60-90KDa，取代度85-95%）、0.02%的聚乙烯亚胺、0.75%的外泌体、6%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入7.5%的马来酸酐、0.015%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.35%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合30min，得止血防粘连膜中层。将5%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯（3.4KDa）、0.3%的氯化钙、0.2%的凝血酶、1.5%的丙烯酰胺、0.07%的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在功率为150W，波长为365nm的紫外灯下聚合15min，得止血防粘连膜上层。将经以上步骤得到的止血防粘连膜以下层面接触模具底部的形式置于模具中，实施例1置入程序真空干燥机中，首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.1h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥5h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥0.5h，得到未灭菌止血防粘连膜。未灭菌止血防粘连膜，经包装、20K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
分别按照表面粘附力测试方法、破裂强度试验方法、体积溶胀率试验方法、吸水倍率试验方法、吸水速率试验方法、体外细胞毒性试验方法、皮肤刺激和致敏试验方法对止血防粘连膜的理化性能和生物学进行了检测，结果如表1和表2所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
通过表1中实施例1-3和表2中比较例6可知，止血防粘连膜的粘附力与止血防粘连膜上层的N羟基琥珀酰亚胺和丙烯酰胺含量有关，随着N羟基琥珀酰亚胺和丙烯酰胺含量的升高，止血防粘连膜的粘附力逐渐提高，当止血防粘连膜的粘附力提高到一定强度，N羟基琥珀酰亚胺和丙烯酰胺的含量再增加，止血防粘连膜的粘附力提高不大。
通过表1中实施例1-9和表2中比较例1-6、比较例7、比较例8可知，止血防粘连膜的破裂强度与膜表面粘附力及膜内交联密度有关。止血膜的表面粘附力越强、膜内交联密度越大，止血膜的破裂强度越高。
通过表1中实施例1-9和表2中比较例1-6、比较例7、比较例8可知，止血防粘连膜的体积溶胀率、吸水倍率与膜中的交联密度有关，当膜中氨基含量、N-羟基琥珀酰亚胺酯含量及交联剂含量越高时，膜的交联密度越高，膜的体积溶胀率和吸水倍率越低。另外，通过表1中实施例1和表2中比较例2-3可知，体积溶胀率和吸水倍率与膜中羧基和酰胺基含量有关，羧基和酰胺基含量越高，膜体积溶胀率和吸水倍率越高。
通过表1实施例1-9可知，止血防粘连膜的生物相容性较好，止血防粘连膜的细胞毒性试验、皮肤刺激和致敏试验均符合医用止血防粘连膜的生物相容性要求。
通过表1实施例1和表2中比较例6可知，止血防粘连膜在特定的聚合条件下才能得到生物相容性较好的产品。
通过表1实施例1和表2中比较例7-8可知，止血防粘连膜在特定的真空干燥程序下才能得到粘附性强、机械强度高的产品。
取实施例1所述样品，按以下试验方案，做了体外降解试验，结果如附图1所示，止血膜可在96天内完全降解。。
体外降解时间的检测：
1.待测样品的制备：将样品切成1cm*1cm*1cm的正方体止血防粘连膜备用。
2.配制pH值为7.4的PBS缓冲溶液。
3.体外降解时间的检测：将1制备好的样品放入装有PBS缓冲溶液的密闭容器中，并转移到37±1℃培养箱内，每隔72h称量一次重量，观察样品在缓冲液中的变化情况，直至肉眼看不见为止，即为样品体外降解时间。
止血试验：
取实施例1所述样品（试验组）和比较例5所述样品（对照组），按以下试验方案，做了相关止血试验，结果如表3所示。
（1）股动脉止血试验
以SD大鼠的股动脉损伤出血为模型，麻醉后剃掉腿部毛，露出腹股沟与后肢，横切大腿皮肤和肌肉，露出动脉，手术针刺穿动脉制造大出血。将0.5g样品立即覆盖在伤口处，并用纱布按压操作，每隔5s抬起纱布观察，直到止血结束。统计止血时间和出血量。
（2）肝创伤止血试验
以SD大鼠的肝脏损伤出血为模型，通过水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉及腹毛而剃掉，在腹部被打开，露出肝脏。用手术刀开一个长度1cm，深度1cm的伤口。用0.1g材料直接洒在出血肝脏的顶部，盖上纱布垫，同时实施常规的按压操作。每隔5s抬起纱布，观察出血情况直到止血，统计出血时间和出血量。
伤口愈合试验：
小鼠皮肤伤口模型的建立：
小鼠经乙醚麻醉，背部剪毛，用剃毛刀将背侧毛剃干净，70%乙醇清洗皮肤消毒。在脊柱左右两侧相同位置各做一个稍大于直径1cm的圆形记号，无菌条件下用直径1cm的皮肤活检打孔器在圆形记号内制造一个全层皮肤伤口。造模后伤口暴露，单笼饲养。将致伤当天记为第0天。
试验动物分组
36只SPF级18-22g雄性昆明种小白鼠，适应性喂养1周后，随机分为2组，每组18只，包括对照组和试验组。试验组采用实施例1中的配方，对小鼠皮肤伤口进行治疗；对照组采用比较例1所述样品，对小鼠皮肤伤口进行治疗。在14天内观察伤口愈合情况，记录感染率。
小鼠皮肤伤口愈合率的测定
致伤后每两天给小鼠伤口拍照，采用Image-Pro Plus Version 6 .0 图像分析软件计算小鼠的伤口面积，直至伤口愈合。
愈合率=（原始伤口面积-未愈合伤口面积）/原始伤口面积×100%
伤口愈合（创面完全上皮化）标准：愈合面积大于原始伤口面积的95%或者伤口面积小于原始伤口面积的5%即为完全愈合。
肝创伤止血后粘连试验
分别取实施例1（试验组）和比较例1（对照组）所述样品，做以下肝脏止血试验，术后120天观察肝脏伤口粘连情况。每种样品做5组试验。
以SD大鼠的肝脏损伤出血为模型，通过水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉及腹毛而剃掉，在腹部被打开，露出肝脏。用手术刀开一个长度1cm，深度1cm的伤口。用0.1g材料直接洒在出血肝脏的顶部，盖上纱布垫，同时实施常规的按压操作。每隔5s抬起纱布，观察出血情况直到止血，止血后取走纱布垫，将皮肤缝合、消炎处理后正常饲养。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
由表3可知，在用抗感染促愈合止血防粘连膜进行的肝脏止血和股动脉止血试验效果明显好于对照组，其肝脏止血时间较对照组下降53%，肝脏出血量下降52%，股动脉止血时间较对照组下降42%，股动脉出血量下降38%。可见，钙盐和凝血酶的加入可使止血作用效果有较大提升。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
由表4可知，在用可粘附促愈合止血防粘连膜进行的对小鼠皮肤伤口愈合试验效果明显好于对照组，试验组在10天便可促进伤口愈合，而对照组促进伤口愈合的时间为14天。可见，在止血防粘连膜中引入抗菌和防粘连的组分，并经过特定的冻干工序后的可粘附促愈合止血防粘连膜具有良好的促愈合功能。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
由表5可知，试验组伤口感染率和粘连率明显少于对照组。可见，抗菌和防粘连的组分的引入使粘连情况明显好转，并明显降低了伤口的感染率。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种抗感染促愈合止血防粘连膜，其特征在于，止血防粘连膜由下层、中层和上层组成：下层由2-4%的N-马来酰化壳聚糖与2.4-6.5%的透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯充分混匀后，加入0.006-0.020%的光引发剂，充分混匀后，在紫外灯下聚合而成；中层由20-30%的N-马来酰化明胶、0.01-0.03%的聚乙烯亚胺、0.5-1.0%的外泌体、4-8%的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯充分混匀后，再加入5-10%的马来酸酐、0.2-0.5%的光引发剂和0.01-0.02%的N, N'-亚甲基双丙烯酰胺充分混匀，将混合液加入到以下层为底的容器中，在紫外灯下聚合而成；上层由4-6%的丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯、0.2-0.4%钙盐、0.1-0.3%凝血酶、1-2%丙烯酰胺、0.05-0.10%光引发剂充分混匀后喷涂到中层表面，在紫外灯下聚合而成；止血防粘连膜下层、中层和上层聚合后，经程序式真空干燥、灭菌制得成品；
所述下层聚合所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为20-30min；所述中层聚合所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为20-40min；所述上层聚合所用紫外灯功率为150W，波长为365nm，照射时间为10-20min；
所述程序真空干燥的方法为：首先在真空度为80Pa、温度为4℃下干燥0.5-1h，然后在真空度为30Pa、温度为10℃下干燥2-3h，最后在真空度为15Pa、温度为15℃下干燥1-2h。
2.根据权利要求1所述的一种抗感染促愈合止血防粘连膜，其特征在于，所述N-马来酰化壳聚糖的分子量为20-200kDa，马来酰化取代度为20-40%；所述透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯的分子量为1500-2200kDa，琥珀酰亚胺酯接枝率为90-95%；其中N-马来酰化壳聚糖中的氨基与透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯中的琥珀酰亚胺酯，摩尔比为1.25:1。
3.根据权利要求1所述的一种抗感染促愈合止血防粘连膜，其特征在于，所述N-马来酰化明胶的分子量为50-100kDa，马来酰化取代度为85-95%。
4.根据权利要求1所述的一种抗感染促愈合止血防粘连膜，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量为1800Da；所述外泌体为脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞中的一种或多种间充质干细胞分泌的外泌体；所述丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯分子量为1-10kDa；所述钙盐为氯化钙、硫酸钙、碳酸钙中的一种或多种；所述凝血酶为固体粉末，酶活为40-300U/mg。
5.根据权利要求1所述的一种抗感染促愈合止血防粘连膜，其特征在于，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。
6.根据权利要求1所述的一种抗感染促愈合止血防粘连膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）下层聚合反应：将N-马来酰化壳聚糖与透明质酸钠-琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，继续搅拌20min，加入光引发剂，在100-200rpm下搅拌至完全溶解，置于紫外灯下聚合，得止血防粘连膜下层；
（2）中层聚合反应：将N-马来酰化明胶、聚乙烯亚胺、外泌体、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，再加入马来酸酐、N, N'-亚甲基双丙烯酰胺和光引发剂在100-200rpm下搅拌至完全溶解，继续搅拌20min，加入到以下层为底的容器中，在紫外灯下聚合，得止血防粘连膜中层；
（3）上层聚合反应：将丙烯酸酯PEG-N羟基琥珀酰亚胺酯、钙盐、凝血酶、丙烯酰胺、光引发剂在100-200rpm下搅拌至完全溶解后，喷涂到中层表面，在紫外灯下聚合，得止血防粘连膜上层；
（4）程序式真空干燥：将经以上步骤得到的止血防粘连膜置于模具中，置入程序真空干燥机中，经程序真空干燥后得到未灭菌止血防粘连膜；
（5）灭菌：将步骤（4）中得到的未灭菌止血防粘连膜，经包装、15-25K电子束辐照灭菌，得止血防粘连膜成品，置于-20℃下保存备用。
7.根据权利要求6所述的一种抗感染促愈合止血防粘连膜的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述喷涂方法为雾化喷涂。
8.根据权利要求6所述的一种抗感染促愈合止血防粘连膜的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述止血防粘连膜置于模具中时，下层面接触模具，上层面朝上。
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