CN113416326B - 一种可注射水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可注射水凝胶及其制备方法和应用，所述可注射水凝胶以明胶和单宁酸为原料，通过转谷氨酰胺酶的催化发生化学交联获得。该可注射水凝胶中明胶分子链之间以酰胺键作用形成网络结构，单宁酸的多酚羟基和明胶链上的氨基之间具有氢键作用，单宁酸的多酚羟基在碱性条件下能够自发络合，最终赋予可注射水凝胶优异的粘附性能，实现材料和组织之间的粘固，促进材料性能的发挥，同时提高材料的可注射性，缩短成胶时间，易于临床操作，并且改善机械性能。该水凝胶材料能够实现对缺损组织的粘附和高效保留，适用于各种不规则形状的缺损填充，可高效促进材料性能的发挥，实现对缺损组织的修复。

Description

一种可注射水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种可注射水凝胶及其制备方法和应用，尤其涉及一种粘附性能和机械性能优秀的可注射水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是一类具有三维网状结构、高含水量的材料，其与细胞外基质结构类似，可模拟微环境促进细胞组织的生长。近年来，天然高分子来源的可注射水凝胶由于良好的生物相容性和生物可降解性在生物组织工程中更具有吸引力。可注射水凝胶实现流动性的生物材料在任意形状缺损处的原位固化，通过在缺损中填充粘附进一步发挥其特定作用。因此可注射水凝胶易于临床操作，同时可作为药物及基因载体，实现微创疗法。
例如CN111171339A公开了一种可注射水凝胶前驱液的制备方法、制备得到可注射水凝胶，以及可注射水凝胶的使用方法。其制备方法是以PEG2000氰乙酸酯和水溶性聚醛为原料，是通过PEG2000氰乙酸酯所提供的活性亚甲基与水溶性聚醛所提供的醛基在PBS催化下，通过Knoevenagel反应原位形成可注射水凝胶，具有优异的生物相容性和生物可降解性，可作为3D细胞培养的载体材料。
例如CN111961225A公开了一种自组装可注射水凝胶及其制备方法和应用，所述自组装可注射水凝胶以甲基丙烯酸羟乙酯HEMA和甲基丙烯酸二甲氨基乙酯DMAEMA的共聚物为基体，以聚谷氨酸PGA修饰的钙磷盐纳米颗粒PGA-CaP NPs为填充相，是原位纳米钙磷盐调控的自组装可注射水凝胶。其可注射性、力学性质、细胞行为以及生物相容性可通过PGA、钙盐和磷盐含量进行调控和优化。利用微创注射的方法，能够成功将这种水凝胶植入到骨缺损部位，加快了骨修复过程，缩短骨缺损愈合时间。
目前大多数可注射水凝胶的关注点在于易于注射、成胶时间可控等特性，良好的生物相容性、生物降解性以及适宜的机械性能也是可注射水凝胶的研究重点。此外，可注射水凝胶应具有一定的粘附性，可以确保在机体缺损处的固定，避免因机体运动导致材料的滑落而影响作用的发挥。但是目前对于如何兼顾可注射水凝胶和机体之间的粘附性能以及机械性能方面的研究较少。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可注射水凝胶及其制备方法和应用，尤其提供一种粘附性能和机械性能优秀的可注射水凝胶及其制备方法和应用
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种可注射水凝胶，所述可注射水凝胶以明胶和单宁酸为原料，通过转谷氨酰胺酶的催化发生化学交联获得。
本发明所涉及的可注射水凝胶以明胶为原料，通过转谷氨酰胺酶的催化发生化学交联，使得明胶分子链之间以酰胺键作用形成网络结构，单宁酸的加入进一步促进了这种网络结构的形成，一方面，单宁酸的多酚羟基和明胶链上的氨基之间具有氢键作用，另一方面，单宁酸的多酚羟基在碱性条件下能够自发络合。最终赋予可注射水凝胶优异的粘附性能，实现材料和组织之间的粘固，促进材料性能的发挥；同时提高材料的可注射性，缩短成胶时间，可在30s-5min之内迅速固化，易于临床操作；并且改善机械性能；该可注射水凝胶材料具有可控的三维网状结构，其孔洞更加致密、均匀，可广泛应用于细胞、药物和生长因子释放载体；进一步地，可通过调节明胶、单宁酸、转谷氨酰胺酶的比例来控制最终水凝胶的成胶时间、粘附性、力学强度、降解性等。该水凝胶材料能够实现对缺损组织的粘附和高效保留，适用于各种不规则形状的缺损填充，可高效促进材料性能的发挥，实现对缺损组织的修复。
优选地，所述明胶与单宁酸的质量比为5:2-40:1，例如5:2、40:15、40:14、40:12、40:10、40:8、40:7、40:6、40:5、40:3或40:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述明胶与单宁酸的质量比特定选择在5:2-40:1的范围内，若单宁酸的相对质量进一步减少会显著延长水凝胶的成胶时间、显著削弱水凝胶的机械性能和粘附性能，且孔洞的致密性和均匀性下降。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的可注射水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将明胶与水混合后制得明胶溶液，调节pH，然后与单宁酸混合，制得单宁酸掺杂的明胶溶液；
(2)将单宁酸掺杂的明胶溶液与转谷氨酰胺酶混合后孵育，得到所述可注射水凝胶。
本发明所涉及的可注射水凝胶的制备方法采用TG酶交联，无需引入任何其他化学交联剂，制备工艺简单，具有良好的生物安全性；通过化学和物理交联的结合，可在生理条件下操作即可实现凝胶化，凝胶时间短，易于临床操作。
优选地，步骤(1)所述明胶为猪皮来源的A型明胶。
优选地，步骤(1)所述明胶溶液的质量分数为10-20wt％，例如10wt％、12wt％、14wt％、15wt％、16wt％、18wt％或20wt％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述调节pH至7.5-8.5，例如pH＝7.5、pH＝7.6、pH＝7.7、pH＝7.8、pH＝8.0、pH＝8.2、pH＝8.4或pH＝8.5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述pH值调节至弱碱性是因为若pH值进一步升高会使得体系中单宁酸的多酚羟基官能团之间作用加强，会对体系的机械性能和粘附性能造成降低；若pH值进一步降低虽然可以提高明胶的溶解性，增强明胶和单宁酸之间的作用，但是最终体系的酸性太强会导致所负载的蛋白发生变性，同时也不利于细胞的粘附和增殖的进行。
优选地，步骤(1)所述调节pH用Tris缓冲液。
优选地，步骤(1)所述单宁酸在所述明胶溶液中的质量分数为0.5-4wt％，例如0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％或4wt％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(1)所述与单宁酸混合后在水浴条件下进行搅拌，所述搅拌的温度为45-55℃，例如45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、53℃、55℃等，搅拌的时间为4-10h，例如4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
若上述温度进一步提高会容易使得明胶分子链断裂，导致明胶的分解变性，若温度进一步降低会导致明胶不能溶解。
优选地，步骤(2)所述转谷氨酰胺酶溶解于中性缓冲液或水中以转谷氨酰胺酶溶液形式与单宁酸掺杂的明胶溶液混合。
优选地，步骤(2)所述转谷氨酰胺酶溶液的浓度为0.5-1mg/mL，例如0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL或1mg/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述单宁酸掺杂的明胶溶液与转谷氨酰胺酶溶液的体积比为5:1-8:1，例如5:1、6:1、7:1或8:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
相对于明胶的质量，若转谷氨酰胺酶的使用量过高会加快明胶分子间的反应，降低成胶时间，若转谷氨酰胺酶的使用量过低会显著增大水凝胶的成胶时间，同时也会影响水凝胶的机械性能。
优选地，步骤(2)所述孵育的温度为35-60℃，例如35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等，时间为30s-5min，例如0.5min、1min、2min、3min、4min、5min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述孵育的温度若进一步提高会导致水凝胶失水严重，若温度进一步降低会不符合可注射水凝胶应用的温度范围。
作为本发明的优选技术方案，所述可注射水凝胶的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将明胶与水混合后制得质量分数为10-20wt％的明胶溶液，调节pH至7.5-8.5，然后与单宁酸混合，使单宁酸的质量分数为0.5-4wt％，在45-55℃水浴中搅拌4-10h，制得单宁酸掺杂的明胶溶液；
(2)将体积比(5-8):1的单宁酸掺杂明胶溶液与浓度为0.5-1mg/mL转谷氨酰胺酶溶液混合后，在35-60℃下孵育30s-5min，得到所述可注射水凝胶。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的可注射水凝胶在制备组织工程材料中的应用。
优选地，所述组织工程材料包括皮肤伤口粘合剂、组织粘合剂或骨缺损中空洞局部填充支架材料。
本发明所涉及的可注射水凝胶的制备原料均为天然材料，具有良好的生物相容性和降解性，具有可控的三维网状结构，其孔洞致密、均匀，可作为载体负载药物或生长因子等，还具有良好的粘附性能和较强的力学强度，能够实现对缺损组织的粘附和高效保留，适用于各种不规则形状的缺损填充，可高效促进材料性能的发挥，可广泛应用于制备各类组织工程材料。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的可注射水凝胶以明胶为原料，通过转谷氨酰胺酶的催化发生化学交联，使得明胶分子链之间以酰胺键作用形成网络结构，单宁酸的加入进一步促进了这种网络结构的形成，一方面，单宁酸的多酚羟基和明胶链上的氨基之间具有氢键作用，另一方面，单宁酸的多酚羟基在碱性条件下能够自发络合。最终赋予可注射水凝胶优异的粘附性能，实现材料和组织之间的粘固，促进材料性能的发挥；同时提高材料的可注射性，缩短成胶时间，可在30s-5min之内迅速固化，易于临床操作；并且改善机械性能；该可注射水凝胶材料具有可控的三维网状结构，其孔洞更加致密、均匀，可广泛应用于细胞、药物和生长因子释放载体；进一步地，可通过调节明胶、单宁酸、转谷氨酰胺酶的比例来控制最终水凝胶的成胶时间、粘附性、力学强度、降解性等。该水凝胶材料能够实现对缺损组织的粘附和高效保留，适用于各种不规则形状的缺损填充，可高效促进材料性能的发挥，实现对缺损组织的修复。
附图说明
图1是本发明所涉及的可注射水凝胶表面的SEM观察图；
图2是本发明所涉及的可注射水凝胶的储能模量G’、损耗模量G”随温度变化曲线图；
图3是本发明所涉及的可注射水凝胶的储能模量G’、损耗模量G”随时间变化曲线图；
图4是本发明所涉及的可注射水凝胶的压缩模量值；
图5是本发明所涉及的可注射水凝胶在循环应力下的应力-应变变化曲线；
图6是本发明所涉及的注射水凝胶在湿态下的搭接-剪切拉伸承载强度图；
图7是搭接-剪切拉伸承载强度的装置图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例和对比例中涉及的A型猪皮明胶购自于sigma试剂官网，牌号为1288485。
实施例1
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为20wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将单宁酸加入到(1)明胶溶液中，单宁酸在明胶溶液中的质量分数为2wt％，在55℃水浴中搅拌6h，制备单宁酸掺杂的明胶溶液。
(3)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于PBS缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为0.5mg/mL。
(4)将体积比为5:1的步骤(2)单宁酸掺杂的明胶溶液和步骤(3)TG酶溶液混合均匀，孵育得到所述的粘附性可注射水凝胶，孵育时间为1min，孵育温度为37℃，使其凝胶化，得到所述可注射水凝胶。
实施例2
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为20wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将单宁酸加入到(1)明胶溶液中，单宁酸在明胶溶液中的质量分数为4wt％，在55℃水浴中搅拌6h，制备单宁酸掺杂的明胶溶液。
(3)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于PBS缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为0.5mg/mL。
(4)将体积比为5:1的步骤(2)单宁酸掺杂的明胶溶液和步骤(3)TG酶溶液混合均匀，孵育得到所述的粘附性可注射水凝胶，孵育时间为40s，孵育温度为37℃，使其凝胶化，得到所述可注射水凝胶。
实施例3
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为10wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至7.5。
(2)将单宁酸加入到(1)明胶溶液中，单宁酸在明胶溶液中的质量分数为1wt％，在45℃水浴中搅拌10h，制备单宁酸掺杂的明胶溶液。
(3)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于PBS缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为1mg/mL。
(4)将体积比为8:1的步骤(2)单宁酸掺杂的明胶溶液和步骤(3)TG酶溶液混合均匀，孵育得到所述的粘附性可注射水凝胶，孵育时间为40s，孵育温度为45℃，使其凝胶化，得到所述可注射水凝胶。
实施例4
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(1)中使用Tri缓冲液将pH调至9.0，其他条件均保持不变。
实施例5
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(1)中使用Tri缓冲液将pH调至7.2，其他条件均保持不变。
实施例6
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中在65℃水浴中搅拌4h，其他条件均保持不变。
实施例7
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中在35℃水浴中搅拌8h，其他条件均保持不变。
实施例8
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(4)中孵育时间为1min，孵育温度为70℃，其他条件均保持不变。
实施例9
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(4)中孵育时间为1min，孵育温度为25℃，其他条件均保持不变。
实施例10
本实施例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中单宁酸在明胶溶液中的质量分数为6wt％，其他条件均保持不变。
对比例1
本对比例提供一种可注射水凝胶，其制备方法与实施例1的区别仅在于制备原料中不含有单宁酸，具体如下：
(1)将A型猪皮明胶溶于去离子水中制备质量分数为20wt％的明胶溶液，使用Tri缓冲液将pH调至8.0。
(2)将纯化的转谷氨酰胺酶(TG酶)稀释于PBS缓冲液中，制备TG酶溶液，TG酶的浓度为0.5mg/mL。
(3)将体积比为5:1的步骤(1)的明胶溶液和步骤(2)TG酶溶液混合均匀，孵育得到所述的粘附性可注射水凝胶，孵育时间为1min，孵育温度为37℃，使其凝胶化，得到所述可注射水凝胶。
评价试验：
(1)将实施例1制得的水凝胶产品进行冷冻干燥处理，利用SEM扫描电子显微镜拍摄水凝胶微观孔洞结构，如图1所示，由图1可知：所制备的水凝胶三维微观上呈现致密的孔洞结构，且孔洞分布均匀，其孔径约为30μm左右。
(2)量取实施例1制得的水凝胶预聚液1.2mL，利用流变仪(型号为TAInstruments,Discovery,DHR-2,USA)检测其储能模量G’、损耗模量G”随温度变化曲线，如图2所示，由图2可知：在温度变化下(25℃～60℃)，体系的储能模量G’高于损耗模量G”，表明凝胶化过程。体系中单宁酸含量为2wt％时，其储能模量能达到1200Pa，且在凝胶化后，模量都比较稳定。
(3)量取实施例2制得的水凝胶预聚液1.2mL，利用流变仪(型号为TAInstruments,Discovery,DHR-2,USA)检测其储能模量G’、损耗模量G”随时间变化曲线，如图3所示，由图3可知：水凝胶的储能模量G’高于损耗模量G”表明凝胶化的完成，此外随着时间的增长，储能模量G’和损耗模量G”都比较稳定。
(4)将实施例1、2、3制得的三种水凝胶产品做成实心圆柱体(高度：10mm，直径7.5mm)，利用力学试验机(型号为PDDW-2)测试其应力-应变变化曲线，计算出弹性模量值，如图4所示。由图4可知：随着单宁酸含量的提高，其弹性模量增大。并测试实施例1中粘附性水凝胶在循环应力下的应力-应变变化曲线，如图5所示，由图5可知：在循环应力下，水凝胶的力学性能可以恢复至90％以上，具有稳定的力学性能。
(5)量取实施例1、2、3制得的水凝胶预聚液0.5mL，根据组织粘合剂粘合性能试验方法第三部分：搭接-剪切拉伸承载强度(YY/T 0729.1)进行测试，该粘附性可注射水凝胶在湿态下对猪皮的搭接-剪切拉伸承载强度如图6所示，图7为搭接-剪切拉伸承载强度的装置图。由图6可知：所制备的水凝胶具有一定的粘附性，可黏附猪皮组织，其黏附强度随着单宁酸含量的增大而增大。
(6)将实施例1-10和对比例1制得的可注射水凝胶的各项性能测试结果汇总于表1-表2中，测试方法同上：
表1
Figure GDA0003223926290000111
Figure GDA0003223926290000121
表2
Figure GDA0003223926290000122
Figure GDA0003223926290000131
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种可注射水凝胶及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (6)

1.一种可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将明胶与水混合后制得质量分数为10-20wt％明胶溶液，调节pH至7.5-8.0，然后与单宁酸混合，在水浴条件下进行搅拌，所述搅拌的温度为45-55℃，搅拌的时间为4-10h，制得单宁酸掺杂的明胶溶液，所述单宁酸在所述明胶溶液中的质量分数为0.5-4wt％；
(2)将体积比为5:1-8:1的单宁酸掺杂的明胶溶液与浓度为0.5-1mg/mL转谷氨酰胺酶溶液混合后孵育，所述孵育的温度为35-60℃，时间为30s-5min，得到所述可注射水凝胶；
所述明胶与单宁酸的质量比为5:2-40:1。
2.如权利要求1所述的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述明胶为猪皮来源的A型明胶。
3.如权利要求1所述的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述调节pH用Tris缓冲液。
4.如权利要求1所述的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述转谷氨酰胺酶溶解于中性缓冲液或水中以转谷氨酰胺酶溶液形式与单宁酸掺杂的明胶溶液混合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的可注射水凝胶的制备方法在制备组织工程材料中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述组织工程材料包括皮肤伤口粘合剂、组织粘合剂或骨缺损中空洞局部填充支架材料。
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