CN112759774B - 一种力学增强明胶冷冻水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种力学增强明胶冷冻水凝胶及其制备方法与应用。该方法包括：将甲基丙烯酰化明胶与丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白溶液复合，加入过硫酸铵/四甲基乙二胺引发剂溶液在低温下实现自由基交联，利用甲醇溶液后处理诱导SF‑GMA分子链形成疏水性结晶(β‑sheet结构)，得到该冷冻水凝胶。该冷冻水凝胶在溶胀平衡条件下有近200μm贯通大孔结构，其压缩模量可从0.057Mpa增强至0.523Mpa，在含有II型胶原酶的环境中降解周期从7天完全降解延长为28天降解剩余60％，具有良好的生物相容性。本发明提供的方法制备过程简单，有效增强了冻胶的性能，在药物递送以及组织修复等领域有良好应用前景。

Description

一种力学增强明胶冷冻水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及复合水凝胶材料制造的技术领域，尤其涉及一种力学增强明胶冷冻水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
大孔水凝胶具有高比表面积和内部贯通孔洞结构等特点而具有支持物质快速交换以及细胞迁入能力，从而在药物缓释、细胞载体以及组织工程支架等生物医用领域具有广阔应有前景。因目前致孔剂法制备的大孔凝胶常存在致孔剂残留以及易出现闭孔现象等不足，由冷冻凝胶化法制备的冷冻水凝胶(以下简称冻胶)在近年来越发受到关注。
若水凝胶在低于体系凝固点交联而制备则被称为冻胶，其成型机理为：低温条件下，冰晶逐渐形成并生长且最终相互接连，同时高分子链或单体与交联剂等作为“杂质”被推入未冻结液微相中得以冷冻浓缩而引发交联，冰晶在冻胶结构中充当了致孔剂的作用，其消融后赋予了冻胶高度贯通的大孔结构。由于冷冻浓缩效应，冻胶的交联比较均匀且交联密度较高，从而具有相对较强的韧性，承受应力时不易产生裂纹。此外，其还具有无需致孔剂以及孔结构性能可调等优势。
明胶、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖以及海藻酸盐等天然高分子聚合物材料具有出色的生物相容性与可降解性，基于此类材料的冻胶在药物载体、敷料等研究领域已有较多应用。不足的是，力学性能较差、降解周期太短等因素极大地限制了这些天然高分子冻胶在组织工程领域中的进一步推广。采用小分子单体(如丙烯酰胺等)参与交联或采用纳米颗粒(如羟基磷灰石(HA)及生物玻璃(BG)等)掺杂的方式是提升冻凝胶机械强度的常见手段，但会存在单体残留、增幅有限等问题：如Song等使用BG掺入至GelMA冻胶从而使其杨氏模量计算值由约80kpa增幅至约170kpa(Song K,Seunghun L,Sivashanmugam A,et al.Bioglass-Incorporated Methacrylated Gelatin Cryogel for Regeneration of Bone Defects[J].Polymers,2018,10(8):914.)；Gu等使用HA纳米线对GelMA冻胶进行增强，其杨氏模量从约35Kpa增幅至55Kpa(20％应变)(Gu L,Zhang J,Li L,et al.Hydroxyapatitenanowire composited gelatin cryogel with improved mechanical properties andcell migration for bone regeneration[J].Biomedical Materials,2019.)。此外，由于HA与BG等颗粒的诱成骨效应或促成血管性，此类复合冻胶仅适用于骨修复或敷料等，不利于拓宽冻胶的实际应用范围。丝素蛋白分子链中具有许多GAGAGS六肽片段，故丝素蛋白凝胶可经合适条件诱导β-sheet构象转变进而形成疏水结晶微区，这种疏水性结构会提升丝素蛋白凝胶的力学性能与延长降解周期。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种力学增强明胶冷冻水凝胶及其制备方法与应用。该制备方法通过将双键化改性丝素蛋白(SF-GMA)掺入至双键化改性明胶(GelMA)材料中构建复合冻凝胶，经溶剂后处理诱导SF-GMA结晶，从而使GelMA基冻胶力学性能不足与降解过快的缺点得到大幅度改善。本发明提供的力学增强明胶冷冻水凝胶能够满足骨/软骨组织工程支架对于孔隙、降解以及力学性能的需求，特别适用于骨/软骨缺损修复。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
一种甲基丙烯酰化明胶(GelMA)/甲基丙烯酸缩水甘油基改性丝素蛋白(SF-GMA)复合冻胶及其制备方法，将GelMA与SF-GMA溶液复合得到混合溶液，随后适当添加过硫酸铵(APS)以及四甲基乙二胺(TEMED)，最后将体系置于低温环境中，待冻凝胶形成之后消融冰晶并经甲醇溶液处理诱导SF-GMA产生构象转变，最终获得力学性能有效增强的GelMA/SF-GMA冻凝胶。
本发明提供的力学增强明胶冷冻水凝胶(GelMA/SF-GMA复合冻胶)的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备GelMA溶液：将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶于去离子水中，得到GelMA溶液；
制备自由基引发剂溶液：将过硫酸铵(APS)溶于冰水中，得到APS溶液，往所述APS溶液中加入四甲基乙二胺(TEMED)，混合均匀(优选振荡均匀)，得到自由基引发剂溶液，冰浴待用；
制备SF-GMA溶液：量取高浓度SF-GMA储液，加入去离子水稀释至指定浓度，得到SF-GMA溶液(所述SF-GMA溶液的浓度为6％wt-10％wt，具体视需求而定)；
(2)制备冻胶：将GelMA溶液(甲基丙烯酰化明胶溶液)与SF-GMA溶液混合，然后在冰浴条件下加入自由基引发剂溶液，混合均匀得到冻胶前驱液，将所述冻胶前驱液转移至模具(孔板或聚四氟乙烯模具)中，随后立即转移到-15℃至-30℃环境中诱导自由基交联(低温下经自由基引发双键交联进而形成冻胶)，取出，得到冷冻水凝胶；
(3)冻胶后处理：将步骤(2)所述冷冻水凝胶置于室温，待冷冻水凝胶上的冰融化后浸泡在甲醇溶液中进行构象转变诱导处理(SF-GMA分子链发生β-sheet构象转变)，取出后浸泡在去离子水中置换去除甲醇溶液，最后得到所述力学增强明胶冷冻水凝胶。
进一步地，步骤(1)所述甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的取代度不低于60％。
优选地，步骤(1)配制GelMA溶液的过程中，溶解甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的温度为35℃-55℃，在搅拌促进溶解的过程中，搅拌速率为100-250rpm。
进一步地，步骤(2)所述SF-GMA溶液为双键化改性丝素蛋白的溶液；本发明中，双键化改性丝素蛋白(SF-GMA)的取代度不低于30％。所述SF-GMA的制备方法可参照文献(KimSH,et al.Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink fordigital light processing 3D printing[J].Nat Commun,2018,9(1):1620.)。
优选地，步骤(2)所述SF-GMA溶液的制备，包括：将丝素蛋白(脱胶蚕丝)溶于饱和溴化锂溶液中，在水浴和搅拌的状态下添加甲基丙烯酸缩水甘油酯进行反应，将反应产物透析，将透析液置于大表面皿中挥发水分以浓缩，然后离心取上清液，得到所述SF-GMA溶液。
优选地，在所述SF-GMA溶液(双键化改性丝素蛋白溶液)的制备过程中，所述丝素蛋白与饱和溴化锂溶液的质量体积比为1:5-8(g/mL)；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯与饱和溴化锂溶液的体积比为0.2-0.7：5-8；所述搅拌反应的温度为50-70℃，搅拌反应的时间为2-5h，搅拌的速率为100-250rpm；所述透析处理采用的透析袋截留分子量为8-12kDA，其中透析处理的时间为不短于4天，但透析时间更长对产物无明显影响，透析处理的温度为25℃。
进一步优选地，在所述SF-GMA溶液的制备过程中，所述搅拌反应的温度为60℃，搅拌反应的时间为3h；所述透析处理的时间为4天。
进一步地，步骤(2)所述冻胶前驱液中，过硫酸铵(APS)的浓度为0.3wt％-1.5wt％，四甲基乙二胺(TEMED)的浓度为2-10μL/ml，甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的浓度为3％wt-10％wt，双键化改性丝素蛋白(SF-GMA)的浓度为1％wt-10％wt，余者为水或PBS溶液。
进一步地，步骤(2)所述诱导自由基交联的时间不低于6h，但更长交联时间不影响冻胶性能。
优选地，步骤(2)所述诱导自由基交联的温度为-20℃。成胶时间(诱导自由基交联的时间)为不短于6h。
进一步地，步骤(2)所述混合均匀的方式为搅拌混合，所述搅拌混合的时间为5-30秒，所述搅拌混合在冰浴条件下进行。
进一步地，步骤(3)所述甲醇溶液的体积百分比浓度不低于70％，所述构象转变处理的时间不低于3h。但构象转变处理时间更长无明显影响。
优选地，步骤(3)所述甲醇溶液的体积百分比浓度为75％。
进一步地，步骤(3)所述冷冻水凝胶浸泡在水中的时间为不短于6h，但处理时间更长无明显影响。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的力学增强明胶冷冻水凝胶(GelMA/SF-GMA冻胶)。
本发明提供的力学增强明胶冷冻水凝胶可用为生长因子、小分子药物等递送载体，修复领域中的皮肤敷料或骨、软骨等组织工程支架。
本发明提供的力学增强GelMA冷冻水凝胶的制备方法是从丝素蛋白经构象转变形成疏水性结晶从而提升凝胶强度与延长降解时间的机制出发，在GelMA溶液中掺入含有功能化双键的丝素蛋白(SF-GMA，即丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白)，使用APS/TEMED引发体系在低温下实现自由基交联，最后通过甲醇溶液后处理诱导SF-GMA分子链形成疏水性结晶(β-sheet结构)，从而在维持生物相容性与大贯通孔优势的前提下对纯GelMA冻胶性能进行有效提升(包括力学强度与降解适配性等)。所述GelMA/SF-GMA复合冷冻水凝胶具有近200μm贯通大孔结构，其压缩模量可从0.057Mpa增强至0.523Mpa，在含有II型胶原酶的环境中降解周期从7天完全降解延长为28天降解剩余60％，此外，所述复合冻凝胶具有良好的生物相容性，可较好地促进细胞黏附与增殖等，综合而言，所述冻胶具有作为骨/软骨等组织工程支架的潜能。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法中，首次通过自由基引发交联成功制备了纯SF-GMA冻胶，经甲醇溶液处理后其压缩模量可达0.170±0.020MPa，且其压缩形变可达75％而基本不产生裂纹，可作为其他天然高分子冻胶的增强成分(参照实例5，图3a和图3b)。
(2)本发明提供的制备方法，首次成功制备了GelMA/SF-GMA复合冻胶，证明在GelMA冻胶中加入SF-GMA并诱导构象转变是一种简单有效的力学增强手段：复合冻胶在5％应变处的压缩模量可由0.057MPa增强至0.523MPa，同等制备方法与浓度条件下杨氏模量增幅近900％且可通过改变投料比例实现调控(参照实例5，图3)；SF-GMA的引入还较大程度延长了GelMA冻胶的降解周期，在含有II型胶原酶(20μg/ml)的环境中，纯GelMA冻胶7天内完全降解，而掺入33％SF-GMA的复合冻胶降解28天后仍残留60％(参照实例6，图4)。
(3)本发明所制备的力学增强明胶冷冻水凝胶(GelMA/SF-GMA冻胶)具有贯通孔结构且孔径大小约为200μm(参照实例3，图1；实例4，图2)，适合物质快速运输以及细胞生长迁移；由于该冻胶由天然高分子材料制备且不含小分子交联剂，因此其具有良好的生物相容性，能为细胞的生长提供良好环境，较好地促进细胞黏附增殖等(参照实例7，图5)；此外，经投料比或总固含量优化的冻胶具有较强力学性质以及较长降解周期，表明这种力学增强的冻胶具有作为骨/软骨组织工程支架的潜能。
附图说明
图1为实施例3中力学增强明胶冷冻水凝胶断面喷金后的扫描电镜图；
图2为实施例4中力学增强明胶冷冻水凝胶的3D显微表征图；
图3a和图3b为实施例5中力学增强明胶冷冻水凝胶的力学压缩测试结果图；
图4为实施例6中力学增强明胶冷冻水凝胶在含有20μg/ml II型胶原酶PBS溶液中降解行为的结果图；
图5为实施例6中力学增强明胶冷冻水凝胶的生物相容性测试结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1：低固含量冻胶制备(兼承重试验)
(1)GelMA与SF-GMA的制备
50℃条件下将1g明胶溶解于10ml 1×PBS缓冲液中，搅拌30分钟至明胶完全溶解，利用微量注射泵将0.6ml甲基丙烯酸酐在30分钟内持续注入，随后持续反应3小时，将产物转移至8-12kDA透析袋中，40℃条件下进行透析，每天换水两次，持续7天，将透析产物冻干，得到的白色海绵状甲基丙烯酰化明胶(GelMA)，将GelMA低温保存。
在60℃条件下将1g丝素蛋白加入到7ml饱和溴化锂溶液中搅拌40分钟使之溶解，得到丝素蛋白溶液，注入0.3ml甲基丙烯酸缩水甘油酯至丝素蛋白溶液中，搅拌反应3小时，搅拌的速率为100-250rpm，将产物转移至8-12kDA透析袋中并在4℃条件下透析，每天换水2次，持续3天，将透析产物置于通风橱内蒸发水分以浓缩，最后将浓缩液离心5分钟，上清液即为SF-GMA溶液，量取2ml SF-GMA烘干称重以计算其具体固含量。经测定，本实例中使用的SF-GMA浓缩溶液的浓度为8.8％wt。将SF-GMA溶液置于4℃条件下，并在3周内使用。
(2)冷冻水凝胶的制备
称取80mg的GelMA加入2.545ml去离子水并搅拌直至GelMA完全溶解，随后加入20μl TEMED并搅匀后再加入455μl的SF-GMA溶液。与此同时称取0.60g过硫酸铵(APS)加入至15ml超纯水中搅拌均匀。在GelMA/SF-GMA混合溶液中加入1ml APS溶液并立即搅拌10秒以混匀冻胶前驱液，随后立即将之分装转移至模具中并存放于-15℃冰箱中诱导交联，交联处理的时间为6h，诱导冻胶成胶。
(3)冷冻水凝胶的后处理
将冻胶转移至室温条件下，并加入75％v/v的甲醇溶液淹没之以诱导SF产生β-sheet构象转变，4小时后取出冻胶并使用去离子水浸泡处理，浸泡时间为5h，期间换水2次，最终即得到固含量为6％的GelMA/SF-GMA冻胶(投料比为2/1)，即所述力学增强明胶冷冻水凝胶，标记为Gel2SF1。
(4)承重试验分析
将高度8mm，直径10mm的上述冻胶(Gel2SF1)与纯GelMA冻胶(Gel3SF0)(纯GelMA冻胶制备方法与本案例中制备方法的唯一区别在于步骤(2)中选用同质量分数且同体积的GelMA溶液代替SF-GMA溶液)分别施加8N的压力并静置用于模拟冻胶作为植入物在体内的受力行为，同时为了直观表现出SF-GMA掺入对GelMA冻凝胶的性能增强，将三块Gel2SF1冻胶置于3个1kg砝码(总共3kg)下进行承重试验。纯GelMA冻凝胶在承受8N的压力前早已破裂，而Gel2SF1冻凝胶则可以承受更强的压力，承重试验更是直观地反映了此性质，可以看出即使平均承受10N的压力，Gel2SF1冻凝胶在抗压10min后依然保持原来的形状，体现了出色的抗压缩能力与强度。这对于拓宽GelMA基冻凝胶在骨或软骨组织工程中的应用至关重要。
实施例2：较高固含量冻胶制备
(1)GelMA与SF-GMA以及APS溶液的制备
按照实例1的方法制备GelMA，SF-GMA溶液等，称量0.45g APS并加入到15ml超纯水中，搅拌至APS完全溶解，将APS溶液置于4℃冰箱中待用。
(2)较高固含量(15％)GelMA/SF-GMA复合冷冻水凝胶的制备
将1.2g GelMA溶于2.182ml去离子水，随后加入6.818ml质量分数为8.8％的浓缩SF-GMA溶液，40℃条件下静置5min后搅拌均匀，随后加入60μl的TEMED并混合均匀，最后加入3ml APS溶液并搅拌10s秒以混匀物料，随即将之分装转移至模具中并存放于-30℃条件下进行交联处理(诱导自由基交联)，交联处理的时间为24h，诱导冷冻水凝胶成型。
(3)冻胶后处理
将成胶后的冻胶转移至室温并浸泡在85％v/v的甲醇溶液中以诱导SF产生β-sheet构象转变，12h后吸弃甲醇并使用大量去离子水浸泡冻胶，冻胶浸泡在水中的时间为24h，期间换水3次以去除乙醇，得到所述力学增强明胶冷冻水凝胶。
实施例3：不同固含量冻胶制备(兼SEM形貌表征)
(1)GelMA与SF-GMA以及APS溶液的制备：
按照实例1的方法制备GelMA与SF-GMA溶液等，称量0.45g APS并加入到15ml超纯水中，溶解后置于4℃冰箱中待用。
(2)不同固含量GelMA/SF-GMA复合冻胶的制备：
在一系列西林瓶中分别按照表1参数依次加入水凝胶前驱液的各组分并充分混合，最终加入过硫酸铵溶液后立即搅拌10秒以混匀前驱液，随后立即将之转移至模具中并存放于-20℃条件下12h诱导冷冻水凝胶成型。
表1：不同固含量冷冻水凝胶的组分配比
Figure BDA0002865502390000091
(3)冷冻水凝胶的后处理以及表征
将成胶后的冻胶转移至室温并浸泡在75％v/v的甲醇溶液中以诱导SF产生β-sheet构象转变，8h后取出冻胶并使用去离子水浸泡处理，冻胶浸泡在水中的时间为18h，最终得到固含量分别为4％/6％/8％/10％的GelMA/SF-GMA冻胶(投料比为2/1)，即固含量分别为4％/6％/8％/10％的力学增强明胶冷冻水凝胶。
(4)扫描电镜表征
将溶胀平衡的不同固含量冻胶(力学增强明胶冷冻水凝胶)在-80℃条件下冷冻12h，随后经冷冻干燥后使用液氮淬断，将冻胶的断面朝上粘附在导电胶带上，喷金60s后使用钨丝灯扫面电镜观察，如图1所示，图1中的SF1Gel2(4％)表示固含量为4％的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF1Gel2(6％)表示固含量为6％的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF1Gel2(8％)表示固含量为8％的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF1Gel2(10％)表示固含量为10％的力学增强明胶冷冻水凝胶，冻干条件下，冻胶内部由许多相互接连的大孔结构组成(孔径约为200μm)，其孔壁虽薄但少有缺陷。此外可以看出提高固含量不仅会使孔径稍微变小，还导致冻凝胶的孔连通程度变低，其原因在于增加固含量会提升冻胶强度，从而在冷冻浓缩程度较低时即可平衡冰晶生长的压力，可以合理猜测当固含量上升到某一阈值时，冻胶内部将出现闭孔。
实施例4：不同GelMA与SF-GMA的比例冻胶制备(兼3D显微镜表征)
(1)GelMA与SF-GMA以及APS溶液的制备
按照实例1的方法制备GelMA，SF-GMA溶液等，称量0.70g APS并加入到15ml超纯水中，溶解后置于4℃冰箱中待用。
(2)不同比例GelMA/SF-GMA复合冷冻水凝胶的制备
在一系列西林瓶中分别按照表2参数依次加入水凝胶前驱液的各组分并充分混合，最终加入过硫酸铵溶液后立即搅拌10秒以混匀前驱液，随后立即将之转移至模具中并存放于-20℃条件下16h诱导冷冻水凝胶成型。
表2：不同比例冷冻水凝胶的组分配比
Figure BDA0002865502390000101
Figure BDA0002865502390000111
(3)冷冻水凝胶的后处理
将成胶后的冻胶转移至室温并浸泡于75％v/v的甲醇溶液以诱导SF产生β-sheet构象转变，24h后取出冻胶并使用去离子水浸泡处理，冻胶浸泡在水中的时间为18h，最终即得不同投料比的GelMA/SF-GMA冻胶(固含量均为6％wt)。
(4)3D显微镜表征
用手术刀将已在去离子水中溶胀平衡的冻胶沿中心轴切开，使用3D显微镜观察其形貌结构，结果如图2所示，其中SF0Gel3表示不加入SF-GMA的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF1Gel2表示GelMA/SF-GMA为2/1的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF2Gel1表示GelMA/SF-GMA为1/2的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF3Gel0表示纯SF-GMA冷冻水凝胶，在溶胀条件下冻胶内部仍维持贯通大孔结果，投料比不会彻底改变冻胶内部具体形貌，但对孔径大小有一定影响，具体而言，GelMA的投料比例越高则冻胶的孔径越小，这是由于GelMA在低温因氢键作用而发生物理交联，物理交联与自由基引发的化学交联耦合赋予混合冻胶更高的强度，进而导致冰晶生长形成的压力被过早平衡，最终导致孔径偏小。
实施例5：力学压缩测试
参考实施例4制备得到固含量为6％而投料比例不同的冻胶，溶胀平衡后使用手术刀进行修整得到高度约8mm而直径10mm的柱体，利用万能力学测试机进行力学压缩测试，在压缩曲线的不同应变点(5％；15％；25％；35％)进行线性拟合而计算其压缩模量。结果如图3a所示，其中Gel3SF0表示纯GelMA冻胶且未经甲醇溶液处理，Gel3SF0 treated with CH3OH表示纯GelMA冻胶且经甲醇溶液处理,Gel2SF1则表示GelMA/SF-GMA为2/1的冷冻水凝胶，Gel2SF1treated with CH3OH表示GelMA/SF-GMA为2/1且经历了甲醇处理的力学增强明胶冷冻水凝胶,Gel1SF2表示GelMA/SF-GMA为1/2的冷冻水凝胶，Gel1SF2treated with CH3OH表示GelMA/SF-GMA为1/2且经历了甲醇处理的力学增强明胶冷冻水凝胶，Gel0SF3表示纯SF-GMA冷冻水凝胶，Gel0SF3 treated with CH3OH表示纯SF-GMA冷冻水凝胶经历了甲醇处理。不同投料比以及是否经甲醇处理的冻凝胶表现出较大的差异性，具体表现为：在未经甲醇处理的前提下，GelMA与SF-GMA在适中的比例条件下具有较好的压缩性能，其中纯SF-GMA虽压缩模量低但具有较好的耐压缩能力；SF-GMA经β-sheet构象转变之后极大地提升了冻凝胶的杨氏模量，分别在不同的应变点进行线性拟合并计算，结果如图3b所示，同固含量条件下，在5％的应变处GelMA冻凝胶的压缩模量为0.057Mpa而引入约33％含量的SF-GMA时其压缩模量增幅至0.182MPa，超过GelMA冻凝胶的三倍，而随着SF-GMA的比例增加到66％时，其压缩模量增幅至0.523Mpa,极大地改善了GelMA冻凝胶的机械强度。上述结果证明掺入SF-GMA并诱导其构象转变能有效提升复合冻胶强度。
实施例6：降解试验
参考实施例4制备得到固含量为6％而投料比例不同的冻胶，冻干之后进行称重，使用II型胶原酶(20μg/ml)溶液模拟体内降解微环境，将载有冻胶的所述溶液置于恒温摇床中孵化(37℃，100rpm)，每2天换一次降解液，按预定时间(第1/3/5/7/11/14/21/28天，每个时间节点5个平行样)取出样品，去离子水清洗后冻干并称重，通过比对重量减轻程度分析其降解行为。结果如图4所示，其中SF0Gel3表示不加入SF-GMA的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF1Gel2表示GelMA/SF-GMA为2/1的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF2Gel1表示GelMA/SF-GMA为1/2的力学增强明胶冷冻水凝胶、SF3Gel0表示纯SF-GMA冷冻水凝胶。SF-GMA的掺入可大幅度延长复合冻胶的降解速率，具体而言：由于胶原酶浓度较高且冻胶的多孔性质，纯GelMA冻胶在近11天内完全降解，而SF-GMA的引入并诱导构象转变导致冻胶二次交联，其孔壁更紧实，同时SF-GMA分子链本身无胶原酶作用靶点以及其形成的疏水性微区阻碍了胶原酶进入，从而有效降低了GelMA降解速率，因此即便掺入33％SF-GMA表示，复合冻胶的降解行为被延长为28天残留60％。
实施例7：细胞活死染色
参考实施例4制备得到固含量为6％而投料比例不同的冻胶，将冻胶整理为厚约3mm薄片并充分溶胀，采用75％(v/v)乙醇溶液与紫外照射灭菌之后使用完全培养基浸泡除去酒精，48孔板中每孔种入第五代小鼠BMSCs(5×104个，300μl)，每2天更换一次培养基，分别在第1/3/7天进行活死细胞染色，随后使用共聚焦显微镜进行观察。如图5所示，各组分冻胶均具有良好的生物相容性，均能支持细胞黏附和增殖，其中纯GelMA组在第三天的细胞密度已明显高于其他组，表明SF-GMA的促增殖能力低于GelMA，这是因为GelMA保留了明胶上RGD等细胞识别序列短肽，能更好地促进细胞增殖。但结果证明利用SF-GMA对GelMA进行增强得到复合冻胶的行为并不影响所述材料的生物相容性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将甲基丙烯酰化明胶溶于水中，得到GelMA溶液；将过硫酸铵溶于水中，得到APS溶液，往所述APS溶液中加入四甲基乙二胺，混合均匀，得到自由基引发剂溶液；
(2)将GelMA溶液与SF-GMA溶液混合，然后在冰浴条件下加入自由基引发剂溶液，混合均匀得到冻胶前驱液，将所述冻胶前驱液转移至模具中，随后立即转移到-15℃至-30℃环境中诱导自由基交联，得到冷冻水凝胶；所述SF-GMA为甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的丝素蛋白；
(3)将步骤(2)所述冷冻水凝胶浸泡在甲醇溶液中进行构象转变处理，取出后使用水浸泡以除去甲醇，得到所述力学增强明胶冷冻水凝胶。
2.根据权利要求1所述的力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述甲基丙烯酰化明胶的取代度不低于60％。
3.根据权利要求1所述的力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述SF-GMA溶液的制备，包括：将丝素蛋白溶于饱和溴化锂溶液中，添加甲基丙烯酸缩水甘油酯进行搅拌反应，室温下将反应产物透析处理，透析液离心后的上清液即SF-GMA溶液；所述双键化改性丝素蛋白的取代度不低于30％。
4.根据权利要求3所述的力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白与饱和溴化锂溶液的质量体积比为1:5-8 g/mL；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯与饱和溴化锂溶液的体积比为0.2-0.7：5-8；所述搅拌反应的温度为50-70℃，搅拌反应的时间为2-5h，搅拌的速率为100-250rpm；所述透析处理采用的透析袋截留分子量为8-12kDA，透析处理的时间为4天以上。
5.根据权利要求1所述的力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述冻胶前驱液中，过硫酸铵的浓度为0.3wt％-1.5wt％，四甲基乙二胺的浓度为2-10μL/ml，甲基丙烯酰化明胶的浓度为3％wt-10％wt，所述SF-GMA的浓度为1％wt-10％wt。
6.根据权利要求1所述的力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导自由基交联的时间不低于6h；步骤(2)所述混合均匀的方式为搅拌混合，所述搅拌混合的时间为5-30s。
7.根据权利要求1所述的力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述甲醇溶液的体积百分比浓度不低于70％，所述构象转变处理的时间不低于3h。
8.根据权利要求1所述的力学增强明胶冷冻水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述水浸泡的时间为不短于6h。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的力学增强明胶冷冻水凝胶。
10.权利要求9所述的力学增强明胶冷冻水凝胶在制备生长因子、小分子药物的载体，皮肤修复敷料或骨、软骨组织工程支架中的应用。
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