CN114773549B - 一种甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法，本发明将丝素蛋白纤维用LiBr溶解后成为丝素蛋白溶液，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯进行接枝改性，随后进行透析、用液氮低温处理、冷冻干燥，得到液氮‑甲基丙烯酰化丝素蛋白N2‑SilMA；将N2‑SilMA溶于光引发剂溶液中，溶解完全后得到水凝胶前驱液；最后用紫外灯进行水凝胶固化，得到甲基丙烯酸酐改性丝素。本发明可在短时间内形成改性丝素水凝胶凝胶，时间可以短至几秒钟，大大增加了制备丝素蛋白水凝胶的工作效率。本发明制备的甲基丙烯酰化丝素蛋白具有更好的力学强度，可以作为细胞支架等更好的在组织工程被应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种高分子生物源性凝胶及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料改性的液氮-丝素蛋白/明胶复合水凝胶，利用光交联技术，制备具有生物相容性高、力学性能好的可注射性新型甲基丙烯酸酐改性丝素的制备技术。
背景技术
组织工程为各类组织修复、再生领域不断提供新方向，天然高分子生物材料在组织工程中表现出的巨大应用潜力而被国内外大量研究。丝素蛋白是一种蛋白质聚合物，在形成不同的材料时具有良好的力学性能、生物相容性和生物降解性、低免疫原性等固有优点。同时丝素蛋白具有较强的自组装性能，无需化学交联即可在水溶液中加工成薄膜、水凝胶、颗粒、电纺纤维、非织造纳米纤维网、多孔海绵、三维多孔支架等多种形式的自主装材料，通过改性可以形成生物支架、高强度水凝胶、药物缓释传递载体等多种形式的复合材料，因此丝素蛋白能适合多种组织工程应用场景。
由于丝素蛋白溶液存在自组装行为，随着时间推移丝素蛋白分子会从Silk I向Silk II转变(β-折叠构象转变)，变成难溶于水的固态凝胶状态。丝素蛋白在液氮中进行超低温处理后会减少丝素蛋白中无规则卷曲结构向β-折叠结构转变，更多的保留Silk I结构，从而降低丝素蛋白的结晶度，增加丝素蛋白的水溶性。利用液氮对甲基丙烯酸酐改性丝素进行进一步处理后，新型的改性丝素水凝胶具有更高强度和高压缩性对优异力学性能以及更好的生物相容性。
当前，甲基丙烯酸酐改性丝素的制备已有报道：
公开号为CN110330797A的中国发明专利“一种光交联双改性的丝素蛋白-明胶复合生物墨水及其制备方法和应用”中，通过将丝素蛋白与明胶分别进行甲基丙烯酰化改性，再经过光交联制备而得，其力学性能测试显示机械强度不高，生物相容性未知。
公开号为CN114075339A的中国发明专利“一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法”中，需要经过甲醇溶液或乙醇溶液处理后改变其降解性，使水凝胶具有良好的生物相容性以及可调节的降解性。但甲醇和乙醇残留会对有损水凝胶的生物相容性。
制备条件温和，生物相容性良好，力学性能较好的甲基丙烯酸酐改性丝素水凝胶的制备仍需进一步探索。
发明内容
本发明鉴于现有技术存在的不足，本发明提供一种操作简单，制备效率高、力学强度高、生物相容性高的新型丝素蛋白水凝胶的制备方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案步骤如下：
步骤(1)将丝素蛋白纤维用LiBr溶解后成为丝素蛋白溶液，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯进行接枝改性，随后进行透析、用液氮低温处理、冷冻干燥，得到液氮-甲基丙烯酰化丝素蛋白N2-SilMA；
步骤(2)将N2-SilMA溶于光引发剂溶液中，溶解完全后得到水凝胶前驱液；
步骤(3)用紫外灯进行水凝胶固化，得到甲基丙烯酸酐改性丝素。
作为优选，步骤(1)中制备丝素蛋白纤维的具体方法为：将剪碎的蚕丝在浓度为0.05～0.06M的碳酸钠溶液中微沸煮25～30min，其中蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为1:100～1:1000，用去离子水洗净蚕丝表面的丝胶，重复煮沸清洗3～4次，将脱胶后的蚕丝于25～37℃条件下烘干。
作为优选，所述的将丝素蛋白纤维用LiBr溶解后成为丝素蛋白溶液，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯进行接枝改性；具体为：将丝素蛋白纤维在50～60℃温度下溶解于溴化锂溶液中，浴比25:100～30:100，溶解后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，浓度为140～800mM，反应温度为50～60℃，反应3～4小时。
作为优选，所述的进行透析、低温处理，具体为：采用去离子水透析3d以上，得到的甲基丙烯酰化丝素蛋白溶液，将甲基丙烯酰化丝素蛋白溶液滴入液氮中，并在液氮中反应2～3小时。
作为优选，步骤(2)中所述的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐LAP固体，在50～60℃温度下溶解于1xPBS溶液中，加入量为0.5w/v％。
作为优选，步骤(3)中紫外灯强度为3W，光源波长为405nm。
本发明具有以下明显优点：
(1)可在短时间内形成改性丝素水凝胶凝胶，时间可以短至几秒钟，大大增加了制备丝素蛋白水凝胶的工作效率。
(2)由于本发明在制备过程是利用光引发剂，可以控制水凝胶成胶时间。
(3)本发明制备的甲基丙烯酰化丝素蛋白具有更好的力学强度，可以作为细胞支架等更好的在组织工程被应用。
(4)本发明中制备的水凝胶，具有良好的生物相容性，无细胞毒性，对细胞生长具有一定促进作用，且具有三维立体结构能为细胞提供良好的生长环境。
(5)本发明中制备的水凝胶可以与甲基丙烯酰化明胶GelMA一起交联，形成双交联复合水凝胶，可以作为生物墨水用于3D打印技术，用于制备各种生物模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本实施例一所述发明所提供的一种新型甲基丙烯酰化丝素蛋白制备方法的流程图。
图2是实施例二所述的15％N2-SilMA/10％GelMA复合水凝胶的应力-应变曲线。
图3是实施例二所述的5％、10％、15％N2-SilMA/10％GelMA复合水凝胶的红外光谱图。
图4是实施例二所述的N2-SilMA/GelMA复合水凝胶与普通的SilMA/GelMA细胞毒性对比图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述：
实施例一：
将剪碎的蚕丝在浓度为0.05M的碳酸钠溶液中微沸煮25min，其中蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为1:100，用去离子水洗净蚕丝表面的丝胶，重复煮沸清洗3次，将脱胶后的蚕丝于25℃条件下烘干备用。
用600mL超纯水溶解807.7g无水溴化锂(LiBr),然后用磁力搅拌器搅拌24h，完全冷却后加入超纯水至1 000mL，最后使用真空抽滤机抽滤至澄清，得到浓度为9.3mol/L的LiBr溶液。将制得的LiBr溶液放入60℃的烘箱中预热30min，然后将丝素蛋白纤维按照1:4的溶质比溶解在LiBr溶液中，然后再放入60℃烘箱中溶解2h，期间每隔15min拿出来搅拌1次，丝素蛋白完全溶解后缓慢加入60g/L的甲基丙烯酸缩水甘油酯，60℃下持续搅拌4h，制得SilMA-LiBr溶液。将制得的SilMA-LiBr溶液在透析袋(分子量12k)中透析3d，除去溶液中的LiBr，用纱布过滤，最后再用低温高速离心机上以7000r/min离心20min，保留上清液，进行液氮稳定丝素蛋白2h，随后进行冷冻干燥处理，冻干后在-20℃密封保存。
在避光条件下称取光引发剂LAP以0.5g/L的质量浓度溶于1xPBS中，在60℃水浴中加热溶解，期间避光并震荡数次至完全溶解。称取N2-SilMA以50g/L、100g/L、150g/L的质量浓度溶于上述制备的光引发剂中，在37℃水浴中加热溶解，震荡数次至完全溶解，得到5％、10％、15％的N2-SilMA水凝胶前驱液，用405nm紫外线固化后形成水凝胶。
请参见图1，图1是本发明中新型甲基丙烯酰化丝素蛋白制备方法的流程图。
实施例二：
将剪碎的蚕丝在浓度为0.06M的碳酸钠溶液中微沸煮28min，其中蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为1:600，用去离子水洗净蚕丝表面的丝胶，重复煮沸清洗4次，将脱胶后的蚕丝于30℃条件下烘干备用。
用600mL超纯水溶解807.7g无水溴化锂(LiBr),然后用磁力搅拌器搅拌24h，完全冷却后加入超纯水至1 000mL，最后使用真空抽滤机抽滤至澄清，得到浓度为9.3mol/L的LiBr溶液。将制得的LiBr溶液放入60℃的烘箱中预热30min，然后将丝素蛋白纤维按照7:25的溶质比溶解在LiBr溶液中，然后再放入50℃烘箱中溶解2h，期间每隔15min拿出来搅拌1次，丝素蛋白完全溶解后缓慢加入20g/L的甲基丙烯酸缩水甘油酯，50℃下持续搅拌3h，制得SilMA-LiBr溶液。将制得的SilMA-LiBr溶液在透析袋(分子量13k)中透析3d，除去溶液中的LiBr，用纱布过滤，最后再用低温高速离心机上以7000r/min离心20min，保留上清液，进行液氮稳定丝素蛋白2.5h，随后进行冷冻干燥处理，冻干后在-20℃密封保存。
实施例三：
将剪碎的蚕丝在浓度为0.055M的碳酸钠溶液中微沸煮30min，其中蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为1:1000，用去离子水洗净蚕丝表面的丝胶，重复煮沸清洗4次，将脱胶后的蚕丝于37℃条件下烘干备用。
用600mL超纯水溶解807.7g无水溴化锂(LiBr),然后用磁力搅拌器搅拌24h，完全冷却后加入超纯水至1 000mL，最后使用真空抽滤机抽滤至澄清，得到浓度为9.3mol/L的LiBr溶液。将制得的LiBr溶液放入60℃的烘箱中预热30min，然后将丝素蛋白纤维按照3:10的溶质比溶解在LiBr溶液中，然后再放入60℃烘箱中溶解2h，期间每隔15min拿出来搅拌1次，丝素蛋白完全溶解后缓慢加入100g/L的甲基丙烯酸缩水甘油酯，55℃下持续搅拌3.5h，制得SilMA-LiBr溶液。将制得的SilMA-LiBr溶液在透析袋(分子量14k)中透析3d，除去溶液中的LiBr，用纱布过滤，最后再用低温高速离心机上以7000r/min离心20min，保留上清液，进行液氮稳定丝素蛋白3h，随后进行冷冻干燥处理，冻干后在-20℃密封保存。
实施例四：
采用与实施例一相同的方法制备新型甲基丙烯酰化丝素蛋白，并加入甲基丙烯酰化明胶进行复合。
将生物明胶以100g/L的质量浓度溶解于超纯水中，50℃下搅拌至明胶完全溶解，缓慢加入甲基丙烯酸酐使其加入量为所溶解明胶质量的0.6倍，在50℃下持续搅拌2h，充分交联后用30℃的超纯水稀释4倍后转移至12-14KDa透析袋中，在50℃超纯水中透析6d，每天更换3次水。透析结束后将透析袋中溶液冻干制得GelMA大分子固体。称取GelMA以100g/L的质量浓度溶于的光引发剂中，在60℃水浴中加热溶解，震荡数次至完全溶解。将制备好的N2-SilMA溶液与GelMA溶液以1:1的比例混合均匀，在50℃水浴中加热使其交联，震荡数次至完全融合，得到复合水凝胶前驱液，用405nm紫外线固化后形成水凝胶。
由图2可知，15％N2-SilMA/10％GelMA复合水凝胶在拉伸和压缩试验中具有较好的力学表现。
由图3可知，在N2-SilMA的FTIR光谱中，在液氮改性后不同含量的材料的大部分的官能团振动信号相似但是部分的官能团仍然存在着差异，这说明了材料的一些官能团结构发生了变化，但是整体的框架依然保持不变，由于SilMA和SF均有酰胺I、酰胺II和酰胺III带，951cm-1处显示为RR'C＝CH2特征峰，峰的增强说明的丝素蛋白与甲基丙烯基团的成功接枝。
由图4可知，15％N2-SilMA/10％GelMA比15％SilMA/10％GelMA复合水凝胶具有更好的生物相容性，无细胞毒性且能促进细胞生长。
综上所述，本发明利用液氮的超低温改变丝素蛋白的二级结构及蛋白形态，得到生物相容性更好、力学性能更好的甲基丙烯酰化丝素蛋白水凝胶。本发明在制备过程不需要醇类等有机试剂，不会引起丝素蛋白水凝胶生物相容性降低。并且所制备的水凝胶具有较高的抗拉伸、抗压缩能力，能够在较大程度上维持水凝胶的形态，能满足组织工程中细胞支架的需要。
Claims (6)
1.一种甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤(1)将丝素蛋白纤维用LiBr溶解后成为丝素蛋白溶液，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯进行接枝改性，随后进行透析、用液氮低温处理、冷冻干燥，得到液氮-甲基丙烯酰化丝素蛋白N2-SilMA；
步骤(2)将N2-SilMA溶于光引发剂溶液中，溶解完全后得到水凝胶前驱液；
步骤(3)用紫外灯进行水凝胶固化，得到甲基丙烯酸酐改性丝素。
2.根据权利要求1所述的一种甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法，其特征在于：步骤(1)中制备丝素蛋白纤维的具体方法为：将剪碎的蚕丝在浓度为0.05～0.06M的碳酸钠溶液中微沸煮25～30min，其中蚕丝与碳酸钠溶液的浴比为1:100～1:1000，用去离子水洗净蚕丝表面的丝胶，重复煮沸清洗3～4次，将脱胶后的蚕丝于25～37℃条件下烘干。
3.根据权利要求1所述的一种甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法，其特征在于：所述的将丝素蛋白纤维用LiBr溶解后成为丝素蛋白溶液，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯进行接枝改性；具体为：将丝素蛋白纤维在50～60℃温度下溶解于溴化锂溶液中，浴比25:100～30:100，溶解后加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，浓度为140～800mM，反应温度为50～60℃，反应3～4小时。
4.根据权利要求1所述的一种甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法，其特征在于：所述的进行透析、低温处理，具体为：采用去离子水透析3d以上，得到的甲基丙烯酰化丝素蛋白溶液，将甲基丙烯酰化丝素蛋白溶液滴入液氮中，并在液氮中反应2～3小时。
5.根据权利要求1所述的一种甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的光引发剂为(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂)LAP固体，在50～60℃温度下溶解于1xPBS溶液中，加入量为0.5w/v％。
6.根据权利要求1所述的一种甲基丙烯酸酐改性丝素的制备方法，其特征在于：步骤(3)中紫外灯强度为3W，光源波长为405nm。
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