CN115518197B - 用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨缺损修复的聚氨基酸多功能纳米纤维微载体及其制备方法。采用自组装、乳液法以及热诱导相分离相结合的方法制备了具有不对称结构的聚氨基酸基开口中空纳米纤维微载体，微载体表面羧基化改性后接枝了蓝铜胜肽(GHK‑Cu)。本发明制备的聚氨基酸基微载体不仅具有仿生细胞外基质纳米纤维结构的物理特征，而且表面接枝了蓝铜胜肽后的微载体具有抗菌、促血管化和促成骨分化的多种生物活性作用，因此可以用于骨修复等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种微载体及其制备方法，特别是涉及一种聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体及其制备方法，应用于组织工程技术领域。
背景技术
由感染、肿瘤、意外创伤等因素造成的不规则骨缺损疾病已经成为一个社会普遍问题，如何有效地治疗不规则骨缺损是临床医学中的一个难题。常见治疗骨缺损的手段有自体骨移植和同种异体骨移植。然而自体骨移植材料来源有限，且会对患者造成二次伤害，异体骨移植存在免疫排斥和感染的风险。临床现有治疗骨缺损的方法存在不足，随着组织工程技术的发展，基于微载体的骨组织工程技术为修复不规则的骨缺损提供了一种有效的方法，通过注射植入微载体可以减少手术创伤并可以填充各种不规则形状的骨缺损。
微载体由于具有高比表面积、能够维持细胞分化表型以及可以微创注射到组织缺损部位进行再生等优势在骨组织工程领域具有极大的应用潜力。特别是，具有开口中空结构的微载体，具有开口中空结构的微载体支持细胞在微载体的表面和内部黏附，其开口中空的结构有利于细胞迁移进入微载体增殖分化，且能够装载更多的细胞，促进组织整合，开口中空微载体为细胞的附着、增殖、迁移、营养交换和代谢废物的排泄提供高表面积和受保护的环境，在骨缺损修复领域具有极大的应用前景。
以纳米纤维为主导的拓扑环境是纳米尺度的重要物理特征。这些纤维在形态和大小上都类似于胶原蛋白的纤维结构。在微载体中构建纳米纤维结构可以增强细胞与基质的相互作用，提高微载体的比表面积，从而改善细胞的粘附、增殖和分化。如，Ma的小组设计并合成了可生物降解的星形聚L-乳酸(SS-PLLA)，将热诱导相分离技术和自组装结合在一起制备了纳米纤维空心微球，纳米纤维空心微球模拟了细胞外基质(ECM)的结构，可有效容纳细胞并增强软骨再生(Liu,X.,X.Jin,and P.X.Ma,Nanofibrous hollow microspheresself-assembled from star-shapedpolymers as injectable cell carriers forkneerepair.NatureMaterials,2011.10(5):p.398-406.)。此外，现有的专利技术也报道了纳米纤维微载体对细胞行为的调控，如，专利CN113336977A公开了一种壳聚糖纳米纤维微载体的制备方法，体外细胞实验结果表明，壳聚糖纳米纤维微载体支持细胞黏附和增殖，具有良好的生物医用前景。专利CN112316914A公开了一种丝素纳米纤维微载体的制备方法，该微载体由于具有纳米纤维的结构，增加了微载体的比表面积，有利于细胞在微载体表面的黏附和增殖。此外，研究指出具有纳米纤维结构的微载体除了能够在体外促进细胞黏附和增殖外，在体内能够促进组织缺损部位的ECM重建，从而加速骨组织再生，因此，在开口中空微载体中构建纳米纤维结构对于骨缺损修复具有重要意义。
应用于组织工程领域的微载体应当具有良好的生物相容性以及生物可降解性等性能。高分子材料包括天然高分子材料和合成高分子材料满足上述要求，是制备微载体的理想材料。其中，合成高分子材料因其可调的机械性能、生物降解性能以及无免疫原性等优点在组织工程领域具有更广泛的应用前景。在诸多的合成高分子材料之中，聚氨基酸材料(如聚L-谷氨酸苄酯)降解产物无酸性副产物，不会引起炎症反应，且具有与胶原蛋白相似的二级结构是制备组织工程微载体材料的理想选择。
虽然在微载体中构建纳米纤维结构能够促进干细胞向成骨分化，但是，对于感染性骨再生，微载体还需要具有抗菌和促进血管化的功能。蓝铜胜肽(GHK-Cu)是人体天然存在的铜络合物，GHK-Cu是Cu2+的优良载体，将GHK-Cu与支架结合体内移植后能够稳定释放Cu2+，众所周知，Cu2+具有抗菌、促进血管化以及促进成骨分化的多种生物活性，因此，在微载体表面接枝GHK-Cu是治疗感染性骨缺损的理想选择。然而，现有的临床产品以及研究报道中未见在微载体中构建纳米纤维结构和开口中空的结构并接枝GHK-Cu从而实现多种生物活性功能于一体的微载体系统。因此，使用聚氨基酸材料构建开口中空纳米纤维微载体并赋予其多种功能对骨缺损修复具有重大意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体、其制备方法及其应用，用于骨组织工程，本发明具有仿生细胞外基质纳米纤维结构且表面接枝蓝铜胜肽(GHK-Cu)开口中空的微载体，以PBLG为原料，采用自组装、热诱导相分离技术和乳液法制备了纳米纤维开口中空微载体，通过对微载体表面进行改性，利用化学接枝法在其表面接枝了GHK-Cu，所制备的微载体具有良好的生物相容性，且GHK-Cu接枝的纳米纤维微载体能够抗菌、促进血管生成、促进成骨分化，体内注射后，加速不规则骨缺损部位的修复。在组织工程领域具有广阔应用前景。
为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体，具有中空大孔的结构，且内表面和外表面具有不同的结构；其中，微载体内表面具有仿生细胞外基质(ECM)纳米纤维的结构，且微载体表面羧基化改性后接枝蓝铜胜肽，形成具有不对称结构的聚氨基酸基开口中空纳米纤维微载体。
本发明针对临床现有骨修复材料难降解、结构单一、功能单一以及不可定向控制生物活性等问题，本发明用于骨缺损修复的聚氨基酸微载体不仅具有中空大孔的结构且内表面和外表面具有不同的结构，其中内表面具有仿生细胞外基质(ECM)纳米纤维的结构。
优选地，微载体的平均长度尺寸范围为50-1000μm，平均孔径和纳米纤维的粒径的范围分别为不大于206.3μm和不大于482.9nm。
优选地，微载体的平均长度尺寸范围为336.4-1000μm。
优选地，形成了球型的微载体。
优选地，聚氨基酸为聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)、聚L-谷氨酸甲酯(PMLG)或聚L-谷氨酸乙酯(PELG)。
本发明通过结合自组装、热诱导相分离技术和乳液法制备了PBLG纳米纤维开口中空微载体，其中，微载体内部具有仿生ECM纳米纤维的结构。将预先制备好的微载体在0.1-0.5mol/LNaOH乙醇溶液改性10-40min，得到表面羧基化改性的微载体。在室温下，将羧基化改性的微载体浸没在GHK-Cu水溶液中反应12-24h，得到表面接枝GHK-Cu的微载体。
一种本发明所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体的制备方法，其步骤如下：
a.将0.1-1g聚氨基酸(PBLG)在70-80℃下搅拌溶解于1-10mL甲苯中，制备质量百分比为1-10wt.％的聚氨基酸的甲苯溶液，备用；
b.取0.5-1.5mL吐温20，在40-60℃下搅拌溶解于10-30mL去离子水中，制备质量百分比为1-10wt.％的吐温20水溶液，备用；
c.将在所述步骤a中所得的聚氨基酸的甲苯溶液加入在所述步骤b中所得的吐温20水溶液中，搅拌乳化均匀，得到混合物；
d.将在所述步骤c中所得的混合物倒入无水乙醇中，去除有机溶剂甲苯，从而得到聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体。
一种本发明所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体的应用，将微载体通过设定尺寸的筛子过筛，得到微载体，冷冻干燥后，得到所需尺寸的微载体。
一种本发明所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体的应用，将微载体加入浓度为0.1-0.5mol/L的NaOH乙醇溶液中搅拌10-40min，用去离子水洗涤微载体，冷冻干燥，得到羧基化改性的微载体。
一种本发明所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体的应用，取50-1000mg微载体，加入到质量百分比浓度为0.5-1.5wt.％的蓝铜胜肽(GHK-Cu)去离子水中，在室温下反应12-36h，得到蓝铜胜肽接枝的微载体。
本发明的微载体实现了在微载体内腔和外壁构建不同的结构，使其具有仿生ECM纳米纤维的结构，并接枝了小分子GHK-Cu，使微载体具有了促成骨、促血管化和抗菌的多种功能。针对骨缺损特定的环境进行修复。其中聚氨基酸基材料作为一种主链由肽键相连接的高分子材料，具有独特的二级结构、良好的生物可降解性和生物相容性而被广泛应用于组织工程领域。甘氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酸(GHK)是在人血浆，唾液和尿液中发现的天然存在的三肽。它对铜具有很强的亲和力，并容易在溶液中形成高度稳定的单体铜络合物。GHK-Cu复合物以其生长调节功能、促进组织修复以及用作抗炎和抗氧化剂而广为人知。最近的研究表明，它具有成骨活性，而Cu2+具有广谱的抗菌性能和促进血管生长的能力。实验发现，本发明所制备的聚氨基酸微载体具有良好的促成骨、促血管以及抗菌作用，可加速骨缺损的修复。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明用于骨缺损修复的聚氨基酸多功能微载体，该微载体具有可注射的优势，用于骨的再生与重建；
2.本发明制备的聚氨基酸微载体内腔具有仿生ECM纳米纤维的独特结构，且微载体的内外表面结构具有不对称性，这种独特的结构未曾有人报道过；
3.本发明的聚氨基酸多功能微载体具有促成骨、促血管化以及抗菌多种功能于一体，符合感染性骨缺损修复的特定微环境。
附图说明
图1(a-d)为本发明实施例一纳米纤维微载体的扫描电子显微镜照片；图(e-g)分别为纳米微载体的粒径分布、纳米微载体的孔径分布和纳米纤维微载体内部纳米纤维的粒径分布图。
图2(a-i)为本发明实施例一不同聚合物浓度对纳米纤维微载体结构影响的扫描电子显微镜照片。
图3(a-i)为本发明实施例一不同聚合物分子量对纳米纤维微载体结构影响的扫描电子显微镜照片。
图4(a-f)为本发明实施例一不同浓度下油凝胶的偏光显微镜照片。
图5(a-d)为本发明实施例一不同浓度下聚合物的溶液和油凝胶的照片；(e-g)为不同聚合物浓度的溶液以及油凝胶的透射电子显微镜照片。
具体实施方式：
在下述实施例中，BLG NCA合成过程中使用的有机溶剂均为超干溶剂，以下实施例合成过程若无特殊说明，亦均使用超干溶剂。
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施中，一种聚氨基酸(PBLG)的制备方法，包括如下步骤：
a.γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)的合成：
取500mL带磁子的三口圆底烧瓶，加入250mL四氢呋喃，在氮气氛围中，搅拌状态下依次加入30gγ-苄基-L-谷氨酸和16.5g三光气，55℃下搅拌反应30min，反应澄清后，继续反应约10min；反应完毕后，将反应液用1L冰的石油醚沉降，沉降完毕后抽滤，所得沉淀用约350mL乙酸乙酯溶解，转入分液漏斗中，依次用125mL冰去离子水、100mL饱和NaHCO3和125mL饱和NaCL洗涤，将上清液转移到锥形瓶中，加入100g无水MgSO4干燥，干燥完毕后抽滤，将所得溶液用油泵抽干，加入60mL四氢呋喃于40℃下溶解，然后加入55mL正己烷，升温至60℃溶解，最后冷却至室温后置入-25℃冰箱中重结晶8h，将溶剂用油泵抽干后得到24gγ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐；
b.PBLG的合成
PBLG是通过γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)在1,4-二氧六环中开环聚合制备的，三乙胺作为引发剂；
具体地，取带有磁子的、干燥的安瓶，加入24g干燥的BLG NCA，加入360mL1,4-二氧六环溶解BLG NCA，按分子量150000g/mol投料加入三乙胺，30℃下反应三天，反应完毕后将反应液用2L无水乙醇沉降，所得产物进一步用乙醚洗涤两次，并在室温下真空干燥24h，即得产物PBLG，产率为70％。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
a.取0.25g的PBLG，在80℃下搅拌溶解于5mL甲苯中，制备质量百分比浓度为5wt.％的PBLG甲苯溶液
b.取1mL吐温20 50℃下搅拌溶解于20mL去离子水中，制备质量百分比浓度为5wt.％吐温20水溶液；
c.将步骤a所得的PBLG甲苯溶液缓慢滴入50℃的在步骤b所得的吐温20水溶液中，搅拌乳化均匀；
d.将步骤c所得的混合物立即倒入200ml常温无水乙醇中，温和搅拌72小时，其中换乙醇多次，得到微载体。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体的药物接枝方法，包括如下步骤：
a.纳米纤维微载体的表面改性：
称取1g纳米纤维微载体分散在0.5mol/L的NaOH乙醇溶液中；室温下搅拌反应30min，反应结束后，使用大量去离子水洗涤，冷冻干燥备用；
b.纳米纤维微载体表面接枝GHK-Cu：
将1g改性好的微载体分散在20mL去离子水中，分别加入NHS、EDC·HCl和GHK-Cu，-COOH、NHS、EDC·HCl和GHK-Cu的摩尔比分别为1：1：2：2，常温下反应24h，反应结束后用大量去离子水洗涤微载体，除去NHS、EDC·HCl和未反应的GHK-Cu，冷冻干燥即得到表面接枝GHK-Cu的微载体。
实验测试分析：
图1(a-d)为本实施实例中制备得到的纳米纤维微载体的扫描电子显微镜照片。如图所示，使用乳液法和热诱导相分离技术制备了两面结构不同的聚氨基酸纳米纤维微载体，图c展示了纳米纤维微载体的外表面是光滑没有纳米纤维的。图d展示了纳米纤维微载体内部结构是具有仿生细胞外基质纳米纤维的结构。图1(e-g)展示了纳米纤维微载体的粒径分布、孔径分布以及纳米纤维的粒径分布统计结果。其中纳米纤维微载体的平均尺寸为336.4μm，平均孔径和纳米纤维的粒径的范围分别为206.3μm和482.9nm。
图2为本实施例不同聚合物浓度下制备的纳米纤维微载体的扫描电子显微镜照片。(a-c)为1％聚合物浓度下制备的纳米纤维微载体，如图所示，在此浓度下，由于聚合物浓度太低，形成的微载体较少，存在聚合物未成球型，但是，在已成球型的微载体内部可以明显看到纳米纤维的存在。(d-f)为5％聚合物浓度下制备的纳米纤维微载体，如图所示，在此浓度下，所有的聚合物都已形成球型的微载体且内部的纳米纤维结构可以明显的看到，微载体的开口情况保持良好。(g-i)为10％聚合物浓度下制备的纳米纤维微载体，如图所示，虽然几乎所有的聚合物都形成了球型的微载体，内部的纳米纤维结构亦明显可见，但是由于聚合物浓度较高，导致微载体的开口受到限制，微载体的开口较小。因此，优选5％的聚合物浓度去制备纳米纤维微载体。
图3为本实施例不同聚合物分子量下制备的纳米纤维微载体的扫描电子显微镜照片。(a-c)为10w聚合物分子量下制备的纳米纤维微载体，如图所示，虽然此分子量下可以作成微载体，但是可能由于聚合物分子量过低，在透析之后，微载体发生了塌陷，未保持原来的状态。(d-f)为17w聚合物分子量下制备的纳米纤维微载体，如图所示，所有的微载体在透析完成以后都能保持球型且内部纳米纤维结构明显可见。(g-i)为50w聚合物分子量下制备的纳米纤维微载体，如图所示，在此分子量下制备的纳米纤维微载体，虽然透析完成后，能够保持完整的球型，内部纳米纤维结构也可以保持，但是微球的开口较小。因此，我们选择17w分子量的聚合物制备纳米纤维微载体。
图4为本实施例不同聚合物浓度下油凝胶的偏光显微镜照片。如图所示，PBLG甲苯油凝胶的结晶性能不会受到聚合物浓度的影响。因此，PBLG在甲苯中低温下形成凝胶的一种机理是PBLG和甲苯形成了共晶。我们正是利用了PBLG在甲苯中可以发生自组装和形成油凝胶的性质制备了具有纳米纤维结构的微载体。
图5为本实施例不同聚合物浓度的溶液和油凝胶的光学照片和透射电子显微镜照片。(a-d)分别为聚合物浓度为0.2％的溶液光学照片和1％、5％以及10％油凝胶的光学照片，如图所示，PBLG在甲苯中形成油凝胶的临界浓度为1％。(e-h)为不同聚合物浓度下溶液和油凝胶的透射电子显微镜照片，如图所示，PBLG可以在甲苯中形成纳米纤维。
实施例二：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，PBLG的制备方法与实施例一相同。
在本实施例中，聚氨基酸纳米纤维微载体的制备方法，包括如下步骤：
a.γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)的合成
取500mL带磁子的三口圆底烧瓶，加入250mL四氢呋喃，在氮气氛围中，搅拌状态下依次加入30gγ-苄基-L-谷氨酸和16.5g三光气，55℃下搅拌反应30min，反应澄清后，继续反应约10min；反应完毕后，将反应液用1L冰的石油醚沉降，沉降完毕后抽滤，所得沉淀用约350mL乙酸乙酯溶解，转入分液漏斗中，依次用125mL冰去离子水、100mL饱和NaHCO3和125mL饱和NaCl洗涤，将上清液转移到锥形瓶中，加入100g无水MgSO4干燥，干燥完毕后抽滤，将所得溶液用油泵抽干，加入60mL四氢呋喃于40℃下溶解，然后加入55mL正己烷，升温至60℃溶解，最后冷却至室温后置入-25℃冰箱中重结晶8h，将溶剂用油泵抽干后得到24gγ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐；
b.PBLG的合成
PBLG是通过γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)在1,4-二氧六环中开环聚合制备的，三乙胺作为引发剂。具体地，取一带有磁子的、干燥的安瓶，加入24g干燥的BLGNCA，加入360mL1,4-二氧六环溶解BLG NCA，按分子量100000g/mol投料加入三乙胺，30℃下反应三天，反应完毕后将反应液用2L无水乙醇沉降，所得产物进一步用乙醚洗涤两次，并在室温下真空干燥24h，即得产物PBLG，产率为70％。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
a.取0.25g的PBLG，在80℃下搅拌溶解于5mL甲苯中，制备质量百分比浓度为5wt.％的PBLG甲苯溶液
b.取1mL吐温20 50℃下搅拌溶解于20mL去离子水中，制备质量百分比浓度为5wt.％吐温20水溶液；
c.将步骤a所得的PBLG甲苯溶液缓慢滴入50℃的在步骤b所得的吐温20水溶液中，搅拌乳化均匀；
d.将步骤c所得的混合物立即倒入200ml常温无水乙醇中，温和搅拌72小时，其中换乙醇多次，得到微载体。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体的药物接枝方法，包括如下步骤：
a.纳米纤维微载体的表面改性：
称取1g纳米纤维微载体分散在0.5mol/L的NaOH乙醇溶液中；室温下搅拌反应30min，反应结束后，使用大量去离子水洗涤，冷冻干燥备用；
b.纳米纤维微载体表面接枝GHK-Cu：
将1g改性好的微载体分散在20mL去离子水中，分别加入NHS、EDC·HCl和GHK-Cu，-COOH、NHS、EDC·HCl和GHK-Cu的摩尔比分别为1：1：2：2，常温下反应24h，反应结束后用大量去离子水洗涤微载体，除去NHS、EDC·HCl和未反应的GHK-Cu，冷冻干燥即得到表面接枝GHK-Cu的微载体。
实验测试分析：
对本实施例用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维微载体材料及其制备方法。该方法中，通过加入不同量的三乙胺控制PBLG的分子量。使用乳液法和热诱导相分离技术制备具有纳米纤维结构的微载体。研究发现，微载体具有仿生细胞外基质纳米纤维的结构。在微载体表面接枝了能够抗菌、促进血管生长以及能够促进成骨分化的药物三肽铜。研究发现，微载体能够释放铜离子。
实施例三：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，PBLG的制备方法与实施例一相同。
在本实施例中，聚氨基酸纳米纤维微载体的制备方法，包括如下步骤：
a.γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)的合成
取500mL带磁子的三口圆底烧瓶，加入250mL四氢呋喃，在氮气氛围中，搅拌状态下依次加入30gγ-苄基-L-谷氨酸和16.5g三光气，55℃下搅拌反应30min，反应澄清后，继续反应约10min；反应完毕后，将反应液用1L冰的石油醚沉降，沉降完毕后抽滤，所得沉淀用约350mL乙酸乙酯溶解，转入分液漏斗中，依次用125mL冰去离子水、100mL饱和NaHCO3和125mL饱和NaCL洗涤，将上清液转移到锥形瓶中，加入100g无水MgSO4干燥，干燥完毕后抽滤，将所得溶液用油泵抽干，加入60mL四氢呋喃于40℃下溶解，然后加入55mL正己烷，升温至60℃溶解，最后冷却至室温后置入-25℃冰箱中重结晶8h，将溶剂用油泵抽干后得到24gγ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐；
b.PBLG的合成
PBLG是通过γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)在1,4-二氧六环中开环聚合制备的，三乙胺作为引发剂；
具体地，取带有磁子的、干燥的安瓶，加入24g干燥的BLG NCA，加入360mL1,4-二氧六环溶解BLG NCA，按分子量500000g/mol投料加入三乙胺，30℃下反应三天，反应完毕后将反应液用2L无水乙醇沉降，所得产物进一步用乙醚洗涤两次，并在室温下真空干燥24h，即得产物PBLG，产率为70％。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
a.取0.25g的PBLG，在80℃下搅拌溶解于5mL甲苯中，制备质量百分比浓度为5wt.％的PBLG甲苯溶液
b.取1mL吐温20 50℃下搅拌溶解于20mL去离子水中，制备质量百分比浓度为5wt.％吐温20水溶液；
c.将步骤a所得的PBLG甲苯溶液缓慢滴入50℃的在步骤b所得的吐温20 水溶液中，搅拌乳化均匀；
d.将步骤c所得的混合物立即倒入200mL常温无水乙醇中，温和搅拌72小时，其中换乙醇多次，得到微载体。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体的药物接枝方法，包括如下步骤：
a.纳米纤维微载体的表面改性：
称取1g纳米纤维微载体分散在0.5mol/L的NaOH乙醇溶液中。室温下搅拌反应30min，反应结束后，使用大量去离子水洗涤，冷冻干燥备用。
b.纳米纤维微载体表面接枝GHK-Cu：
将1g改性好的微载体分散在20mL去离子水中，分别加入NHS、EDC·HCl和GHK-Cu，-COOH、NHS、EDC·HCl和GHK-Cu的摩尔比分别为1：1：2：2，常温下反应24h，反应结束后用大量去离子水洗涤微载体，除去NHS、EDC·HCl和未反应的GHK-Cu，冷冻干燥即得到表面接枝GHK-Cu的微载体。
实验测试分析：
对本实施例用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维微载体材料及其制备方法。该方法中，通过加入不同量的三乙胺控制PBLG的分子量。使用乳液法和热诱导相分离技术制备具有纳米纤维结构的微载体。研究发现，微载体具有仿生细胞外基质纳米纤维的结构。在微载体表面接枝了能够抗菌、促进血管生长以及能够促进成骨分化的药物三肽铜。研究发现，微载体能够释放铜离子。
实施例四：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，PBLG的制备方法与实施例一相同。
在本实施例中，聚氨基酸纳米纤维微载体的制备方法，包括如下步骤：
a.γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)的合成
取500mL带磁子的三口圆底烧瓶，加入250mL四氢呋喃，在氮气氛围中，搅拌状态下依次加入30gγ-苄基-L-谷氨酸和16.5g三光气，55℃下搅拌反应30min，反应澄清后，继续反应约10min；反应完毕后，将反应液用1L冰的石油醚沉降，沉降完毕后抽滤，所得沉淀用约350mL乙酸乙酯溶解，转入分液漏斗中，依次用125mL冰去离子水、100mL饱和NaHCO3和125mL饱和NaCL洗涤，将上清液转移到锥形瓶中，加入100g无水MgSO4干燥，干燥完毕后抽滤，将所得溶液用油泵抽干，加入60mL四氢呋喃于40℃下溶解，然后加入55mL正己烷，升温至60℃溶解，最后冷却至室温后置入-25℃冰箱中重结晶8h，将溶剂用油泵抽干后得到24gγ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐；
b.PBLG的合成
PBLG是通过γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG NCA)在1,4-二氧六环中开环聚合制备的，三乙胺作为引发剂；
具体地，取一带有磁子的、干燥的安瓶，加入24g干燥的BLG NCA，加入360mL1,4-二氧六环溶解BLG NCA，按分子量170000g/mol投料加入三乙胺，30℃下反应三天，反应完毕后将反应液用2L无水乙醇沉降，所得产物进一步用乙醚洗涤两次，并在室温下真空干燥24h，即得产物PBLG，产率为70％。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
a.取0.25g的PBLG，在80℃下搅拌溶解于5mL甲苯中，制备质量百分比浓度为5wt.％的PBLG甲苯溶液
b.取1mL吐温20 50℃下搅拌溶解于20mL去离子水中，制备质量百分比浓度为5wt.％吐温20水溶液；
c.将步骤a所得的PBLG甲苯溶液缓慢滴入50℃的在步骤b所得的吐温20水溶液中，搅拌乳化均匀；
d.将步骤c所得的混合物立即倒入200mL常温无水乙醇中，温和搅拌72小时，其中换乙醇多次，得到微载体。
在本实施例中，一种聚氨基酸多功能纳米纤维微载体的药物接枝方法，包括如下步骤：
a.纳米纤维微载体的表面改性：
称取1g纳米纤维微载体分散在0.5mol/L的NaOH乙醇溶液中；室温下搅拌反应30min，反应结束后，使用大量去离子水洗涤，冷冻干燥备用；
b.纳米纤维微载体表面接枝GHK-Cu：
将1g改性好的微载体分散在20mL去离子水中，分别加入NHS、EDC·HCl和GHK-Cu，-COOH、NHS、EDC·HCl和GHK-Cu的摩尔比分别为1：1：2：2，常温下反应24h，反应结束后用大量去离子水洗涤微载体，除去NHS、EDC·HCl和未反应的GHK-Cu，冷冻干燥即得到表面接枝GHK-Cu的微载体。
实验测试分析：
对本实施例用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维微载体材料及其制备方法。该方法中，通过加入不同量的三乙胺控制PBLG的分子量。使用乳液法和热诱导相分离技术制备具有纳米纤维结构的微载体。研究发现，微载体具有仿生细胞外基质纳米纤维的结构。在微载体表面接枝了能够抗菌、促进血管生长以及能够促进成骨分化的药物三肽铜。研究发现，微载体能够释放铜离子。
综上所述，其中用实施例一所获得的聚氨基酸纳米纤维微载体进行了体外研究，研究发现，聚氨基酸基微载体具有仿生细胞外基质的纳米纤维结构，并对其自组装机理进行了进一步分析。本发明上述实施例用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维微载体材料，通过改变引发剂三乙胺的用量，制备了不同分子量的原料PBLG，然后结合了乳液法和热诱导相分离技术制备了具有仿生纳米纤维结构的微载体。并对其进行了表面改性，表面接枝了能够抗菌、促进血管生成以及能够促进成骨分化的药物GHK-Cu。研究发现，该微载体可以稳定释放铜离子。已知铜离子对骨缺损的修复有明显的促进作用。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维微载体材料及其制备方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体，其特征在于：具有中空大孔的结构，且内表面和外表面具有不同的结构；其中，微载体内表面具有仿生细胞外基质纳米纤维的结构，且微载体表面羧基化改性后接枝蓝铜胜肽，形成具有不对称结构的聚氨基酸基开口中空纳米纤维微载体；
所述用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体采用如下方法制备而成，其步骤如下：
a. 将0.1-1g聚氨基酸在70-80℃下搅拌溶解于1-10 mL甲苯中，制备质量百分比为1-10wt.%的聚氨基酸的甲苯溶液，备用；所述聚氨基酸为聚L-谷氨酸苄酯、聚L-谷氨酸甲酯或聚L-谷氨酸乙酯；
b. 取0.5-1.5 mL吐温20，在40-60℃下搅拌溶解于10-30 mL去离子水中，制备质量百分比为1-10wt.%的吐温20水溶液，备用；
c. 将在所述步骤a中所得的聚氨基酸的甲苯溶液加入在所述步骤b中所得的吐温20水溶液中，搅拌乳化均匀，得到混合物；
d.将在所述步骤c中所得的混合物倒入无水乙醇中，去除有机溶剂甲苯，从而得到聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体；
e. 将微载体加入浓度为0.1-0.5 mol/L的NaOH乙醇溶液中搅拌10-40 min，用去离子水洗涤微载体，冷冻干燥，得到羧基化改性的微载体；
f. 取50-1000mg微载体，加入到质量百分比浓度为0.5-1.5wt.%的蓝铜胜肽去离子水中，在室温下反应12-36 h，得到蓝铜胜肽接枝的微载体。
2.根据权利要求1所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体，其特征在于：微载体的平均长度尺寸范围为50-1000μm，平均孔径和纳米纤维的粒径的范围分别为不大于206.3μm和不大于482.9nm。
3.根据权利要求2所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体，其特征在于：微载体的平均长度尺寸范围为336.4-1000μm。
4.根据权利要求1所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体，其特征在于：形成了球型的微载体。
5.一种权利要求1所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体的制备方法，其特征在于：其步骤如下：
a. 将0.1-1g聚氨基酸在70-80℃下搅拌溶解于1-10 mL甲苯中，制备质量百分比为1-10wt.%的聚氨基酸的甲苯溶液，备用；
b. 取0.5-1.5 mL吐温20，在40-60℃下搅拌溶解于10-30 mL去离子水中，制备质量百分比为1-10wt.%的吐温20水溶液，备用；
c. 将在所述步骤a中所得的聚氨基酸的甲苯溶液加入在所述步骤b中所得的吐温20水溶液中，搅拌乳化均匀，得到混合物；
d. 将在所述步骤c中所得的混合物倒入无水乙醇中，去除有机溶剂甲苯，从而得到聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体；
e. 将微载体加入浓度为0.1-0.5 mol/L的NaOH乙醇溶液中搅拌10-40 min，用去离子水洗涤微载体，冷冻干燥，得到羧基化改性的微载体；
f. 取50-1000mg微载体，加入到质量百分比浓度为0.5-1.5wt.%的蓝铜胜肽去离子水中，在室温下反应12-36 h，得到蓝铜胜肽接枝的微载体。
6.根据权利要求5所述的用于骨缺损修复的聚氨基酸纳米纤维开口中空微载体的制备方法，其特征在于：将微载体通过设定尺寸的筛子过筛，得到微载体，冷冻干燥后，得到所需尺寸的微载体。
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