CN110639058A - 用于骨组织工程针状ha/pblg多孔复合微载体材料及其制备方法 - Google Patents

用于骨组织工程针状ha/pblg多孔复合微载体材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料及其制备方法，先采用双乳液法制备了PBLG多孔微载体，并对其进行表面羧基化改性，以改性后的PBLG多孔微载体为基体，结合原位沉淀法，进而构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。细胞实验以及动物实验证明，本发明中针状HA的引入，有利于脂肪干细胞早期黏附，并促进脂肪干细胞的成骨向分化。本发明制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损的修复，并具有良好的骨再生效果。

Description

用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种微载体材料及其制备方法，特别是涉及一种多孔有机无机复合微载体材料及其制备方法，应用于组织工程技术领域。
背景技术
由创伤、感染、肿瘤、骨坏死等原因造成的不规则骨缺损疾病已经成为一个社会普遍问题，如何有效地治疗不规则骨缺损是当代医学中的一个难题。
常见治疗骨缺损的手段有自体骨移植和同种异体骨移植。其中自体骨移植材料来源有限，且会对病人造成二次伤害，而异体骨移植则存在免疫排斥和感染的风险。组织工程材料来源丰富、形式多样，同时可以降低手术感染和免疫反应的风险，因此在骨缺损治疗方面具有巨大潜力。
微载体由于具有高比表面积为细胞的生长和增殖提供更加充足的空间；此外，微载体的三维结构在一定程度上模拟了细胞在体内的生存环境，有助于维持细胞表型，防止细胞退分化；一定尺寸的微载体又具有可注射的优势，因而在微创技术领域得到极大应用。这些优势使得微载体成为目前最常用的细胞培养载体之一。基于微载体的组织工程技术在修复不规则骨缺损方面具有巨大潜力，通过合理选取微载体材料和设计微载体结构来改善其成骨性能是微载体研究中的一个重要内容。
羟基磷灰石(HA)由于具有优良的骨整合和骨传导性能，因而在骨修复领域得到普遍认可。随着研究的深入，研究者们发现HA的形貌与细胞成骨分化的效果形貌密切相关。然而同大多数无机材料一样，HA的脆性问题限制了它的应用，通过有机无机复合的方法能够有效解决这一问题，故使制备得到的复合微载体中依旧保留HA原本的结构特性是研究的难点。
如Ma等制备得到不同长度的一维线状HA，通过大量细胞实验证明，在无生长因子作用下，直径为纳米级别，长度为5μm左右的线状HA具有诱导细胞成骨分化的能力。(Ma B,Zhang S,Liu F,et al.One dimension hydroxyapatite nanostructures with tunablelength for efficient stem cell differentiation regulation[J].ACS AppliedMaterials&Interfaces,2017:acsami.7b13313)。与此类似，Lin等通过热液处理的方法得到三种支架，其表面分别是片状HA、棒状HA和微纳米混合HA，其中微纳米混合HA由长度为10～20μm，直径分别为80～120nm和1～4μm的HA组成，实验表明这种微纳米混合的HA表面具有更优的蛋白吸附和成骨分化能力。(Tailoring the Nanostructured Surfaces ofHydroxyapatite Bioceramics to promote protein adsorption osteoblast growth,and osteogenic differentiation[J].ACS Applied Materials&Interfaces,2013,5(16):8008-8017)。除了尺寸以外，HA的形貌对细胞的黏附、增殖也存在差异。实验结果表面，由于针状HA能够更好模拟天然骨组织中HA的晶体结构，因而能够促进细胞的黏附、增殖和成骨向分化。
现有的构建微载体的材料主要包括两种：无机材料和高分子材料。其中无机材料由于其机械性能较脆，因而高分子材料在组织工程中成为热点。目前用于组织工程的高分子材料主要以聚酯类为主，这类材料的不足之处在于材料在体内的降解过程中降解产物会引起炎症反应。而聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)由于具有良好的生物相容性和组织相容性，且其降解产物不会引起炎症反应，因而是一种优良的组织工程原料。
目前构建有机无机复合微载体的常见方法有共混法、接枝法等，其中用共混法制备复合微载体的缺点为制备得到复合微载体中无机物分散不均，有机与无机组分间结合力较弱。而接枝法所得复合微载体的缺点为制备工艺要求较高，无机粒子的生物特性会由于改性或接枝而受到部分屏蔽。利用原位沉淀对微载体材料进行生物矿化的方法，使得复合微载体中无机物分布均匀且可以提高有机、无机组分间结合能力，在临床上具有广阔前景，也成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料及其制备方法，以PBLG为原料，利用乳液法和原位沉淀法构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。通过对PBLG多孔微载体表面进行改性，并利用原位沉淀的方法制备得到的针状HA/PBLG多孔复合微载体具有良好的生物相容性。且针状HA/PBLG多孔复合微载体能够促进脂肪干细胞在其上黏附和增殖，以及促进脂肪干细胞的成骨向分化并加速不规则骨缺损部位的修复。本发明针状HA/PBLG多孔复合微载体材料用于骨组织工程中不规则骨缺损修复，在临床上具有广阔前景。
为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，在添加致孔剂的条件下，通过双乳液法，预先制备PBLG多孔微载体；再利用氢氧化钠溶液对PBLG多孔微载体表面进行羧基化改性，得到羧基化改性PBLG多孔微载体；于70～80℃反应条件下，通过三羟甲基氨基甲烷溶液，通过原位沉淀法调节钙、磷前驱体溶液在羧基化改性PBLG多孔微载体上缓慢沉积，从而制备得到针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，作为骨组织细胞培养载体材料；其中针状HA/PBLG多孔复合微载体中的HA的直径为200nm～2μm，长度为5～15μm，HA中的钙磷比为(1.31～1.41):1；针状HA/PBLG多孔复合微载体中HA的质量百分比含量为38.8～49.0％，保水率为657～715％。
优选上述针状HA/PBLG多孔复合微载体的孔径与孔隙率的范围在30～50μm和88.2±4.8％。
一种PBLG多孔微载体的制备方法，所制备的PBLG多孔微载体用于制备本发明用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，包括如下步骤：
a.聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)的合成：在N2气氛下，以三乙胺为引发剂引发BLG-NCA开环聚合，并通过无水乙醇沉降得到PBLG；
b.配制聚乙烯醇(PVA)水溶液：将PVA固体溶于去离子水中，得到质量百分比浓度为0.8～1.0％的PVA溶液；
c.配制明胶溶液：采用明胶作为致孔剂，将4～6g明胶溶于50～60mL去离子水中，于37℃下搅拌至溶液透明澄清，得到明胶溶液；
d.配制W/O乳化液：取3～6mL在所述步骤c中制备的明胶溶液加入到20～40mL在所述步骤a中制备的PBLG的溶液中，在室温下，用乳化机乳化，得到白色W/O乳化液Ⅰ；
e.PBLG多孔微载体制备：取500～600mL在所述步骤b中制备的PVA溶液，在冰浴中进行机械搅拌，再取其中的80～100mLPVA溶液，在搅拌下，将在所述步骤d中制备的W/O乳化液Ⅰ加入到PVA溶液中，在2～4min后将得到的W/O/W体系溶液倒入烧杯中，保持搅拌直至二氯甲烷完全挥发；然后将烧杯置于37℃恒温摇床中，每隔1～2h进行一次换水，重复多次直至明胶去除干净后，筛选得到所需粒径的PBLG多孔微载体，并保存于去离子水中。
一种羧基化改性PBLG多孔微载体的制备方法，包括如下步骤：量取1～2mL体积的本发明PBLG多孔微载体的制备方法制备的PBLG多孔微载体，将PBLG多孔微载体加入烧杯中，再加入20～30mL的1.25～1.5mol/L的氢氧化钠溶液，然后将其放在恒温摇床中，处理1.5～3.5h，用去离子水洗涤多次直至洗涤液为中性为止，将得到的PBLG多孔微载体冻干后保存。
一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向500mL烧杯中加入100～200mL的0.025～0.4mol/L的CaCl2溶液，然后加入1mL体积的表面羧基化改性后的PBLG多孔微载体，得到第一混合液体系；
(2)升温至70～80℃，并始终维持150r/min的速度，对在所述步骤(1)中制备的第一混合液体系进行机械搅拌30～40min；
(3)以2～4mL/min的速率，向在所述步骤(2)中完成搅拌处理的第一混合液体系中滴加100～200mL的0.015～0.24mol/L的NaH2PO4溶液，滴加完毕后，维持体系稳定30～40min，得到第二混合液体系；
(4)以1～2mL/min的速率，向在所述步骤(3)制备的第二混合液体系中滴加10～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)，形成反应物溶液体系，并使反应物溶液体系达到pH＝9并维持pH值恒定，进行反应3～4h后停止加热，陈化至少24h，得到产物溶液；
(5)将产物溶液在振荡器上进行多次振荡后，用标准筛筛除游离的HA粒子，得到针状HA/PBLG多孔复合微载体，冻干后保存。
作为本发明优选的技术方案，用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，在所述步骤(1)中，采用100mL的0.025～0.4mol/L的CaCl2溶液；在所述步骤(3)中，采用100mL的0.015～0.24mol/L的NaH2PO4溶液。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明用于骨组织工程中不规则骨缺损修复的针状HA/PBLG多孔复合微载体，该针状HA/PBLG多孔复合微载体可通过注射的方式用于骨组织再生和重建；
2.本发明针状HA的引入，有利于脂肪干细胞早期黏附，并促进脂肪干细胞的成骨向分化；
3.本发明针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损的修复，并具有良好的骨再生效果。
附图说明
图1为本发明实施例一针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的扫描电子显微镜照片。
图2为本发明实施例一PBLG多孔微载体和羧基化改性后的PBLG多孔微载体的扫描电子显微镜照片，其中，图2A为PBLG多孔微载体的电镜图；图2B为羧基化改性2.5h后的PBLG多孔微载体电镜图。
图3为本发明实施例一通过原位沉淀法所制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体的不同放大倍数下的扫描电子显微镜照片，其中，图3A为针状HA/PBLG多孔复合微载体的低倍电镜图，图3B为针状HA/PBLG多孔复合微载体的高倍电镜图。
图4为本发明实施例一兔子ADSCs在PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体上分别培养1天，4天和7天的增殖统计图(*p＜0.05)。
图5为本发明实施例一兔子脂肪干细胞分别在针状HA/PBLG多孔复合微载体和PBLG多孔微载体上培养7天和14天后细胞中碱性磷酸酶(ALP)基因表达统计图(*p＜0.05)。
图6为本发明分别用PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体对兔子骨缺损修复后的组织切片图。其中图6A为对照组(ADSCs-PBLG多孔微载体)手术6周后的骨再生H&E染色图和Masson染色图，图6B为实施例一实验组(ADSCs-针状HA/PBLG复合微载体)手术6周后的骨再生H&E染色图和Masson染色图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施例中，一种PBLG多孔微载体的制备方法，包括如下步骤：
a.聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)溶液制备：在N2气氛下，以三乙胺为引发剂引发BLG-NCA开环聚合，并通过无水乙醇沉降得到PBLG；称取0.1～0.2g PBLG加入25mL烧杯中，再用量筒量取10～25mL二氯甲烷加入烧杯中，搅拌直至PBLG完全溶解，得到透明溶液，即为聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)溶液；
b.配制聚乙烯醇(PVA)水溶液：将PVA固体溶于去离子水中，得到质量百分比浓度为0.8～1.0％的PVA溶液；
c.配制明胶溶液：采用明胶作为致孔剂，将4～6g明胶溶于50～60mL去离子水中，于37℃下搅拌至溶液透明澄清，得到明胶溶液；
d.配制W/O乳化液：取3～6mL在所述步骤c中制备的明胶溶液加入到20～40mL在所述步骤a中制备的PBLG溶液中，在室温下，用乳化机乳化，得到白色W/O乳化液Ⅰ；
e.PBLG多孔微载体制备：取500～600mL在所述步骤b中制备的PVA溶液，在冰浴中进行机械搅拌，再取其中的80～100mLPVA溶液，在搅拌下，将在所述步骤d中制备的W/O乳化液Ⅰ加入到PVA溶液中，在2～4min后将得到的W/O/W体系溶液倒入烧杯中，保持搅拌直至二氯甲烷完全挥发；然后将烧杯置于37℃恒温摇床中，每隔1～2h进行一次换水，重复多次直至明胶去除干净后，筛选得到所需粒径的PBLG多孔微载体，并保存于去离子水中。
在本实施例中，一种羧基化改性PBLG多孔微载体的制备方法，包括如下步骤：量取1～2mL体积的PBLG多孔微载体的制备方法制备的PBLG多孔微载体，将PBLG多孔微载体加入烧杯中，再加入20～30mL的1.25～1.5mol/L的氢氧化钠溶液，然后将其放在恒温摇床中，处理1.5～3.5h，用去离子水洗涤多次直至洗涤液为中性为止，将得到的PBLG多孔微载体冻干后保存。
在本实施例中，参见图1，一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)向500mL烧杯中加入100mL的0.1mol/L的CaCl2溶液，然后加入1mL体积的表面羧基化改性后的PBLG多孔微载体，得到第一混合液体系；
(2)升温至70～80℃，并始终维持150r/min的速度，对在所述步骤(1)中制备的第一混合液体系进行机械搅拌30～40min；
(3)以2～4mL/min的速率，向在所述步骤(2)中完成搅拌处理的第一混合液体系中滴加100mL的0.06mol/L的NaH2PO4溶液，滴加完毕后，维持体系稳定30～40min，得到第二混合液体系；
(4)以1～2mL/min的速率，向在所述步骤(3)制备的第二混合液体系中滴加10～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)，形成反应物溶液体系，并使反应物溶液体系达到pH＝9并维持pH值恒定，进行反应3～4h后停止加热，陈化24h，得到产物溶液；
(5)将产物溶液在振荡器上进行多次振荡后，用标准筛筛除游离的HA粒子，得到针状HA/PBLG多孔复合微载体，冻干后保存。
实验测试分析：
对本实施例制备的PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体的细胞实验：将兔子ADSCs分别接种到PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体上，培养7天后，对细胞进行死活染色，通过共聚焦显微镜观察细胞在两种微载体上的增殖情况。结果表明，针状HA/PBLG多孔复合微载体能够促进兔子脂肪干细胞的黏附和增殖，同时能够促进细胞的成骨向分化。
对本实施例制备的PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体的动物实验：将载有兔子ADSCs的PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体分别注射到兔子的骨缺损部位进行填充修复。术后饲养6周后，取出手术部位的股骨进行切片处理。结果表明，针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损部位的修复，具有良好的骨再生能力。
图2为本实施例用到的PBLG多孔微载体和羧基化改性后的PBLG多孔微载体的扫描电子显微镜照片。图2A为PBLG多孔微载体的电镜图；图2B为羧基化改性2.5h后的PBLG多孔微载体电镜图。由此可见，改性前后PBLG多孔微载体的尺寸以及形貌并没无明显差别。
图3为本实施例通过原位沉淀法所制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体的扫描电子显微镜照片。图3A为针状HA/PBLG多孔复合微载体的低倍电镜图，如图所示多孔微载体具有良好球形结构；图3B为针状HA/PBLG多孔复合微载体的高倍电镜图，如图所示，针状HA/PBLG多孔复合微载体具有不同直径的孔结构，其中较大的孔径达到30～50μm。直观来看，复合微载体表面存在各相异性分布的针状HA，其直径为亚微米级别，长度主要分布在5～15μm左右，复合微载体中没有出现明显的堵孔现象。多孔复合微载体具有疏松多孔结构，孔洞连续贯通，孔径与孔隙率的范围也在30～50μm和88.2±4.8％。
图4为本实施例分别用PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体培养ADSCs1天，4天和7天，通过MTT比色法检测细胞在PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体上的增殖情况，结果如图4所示。从图中可以看出，随这培养时间延长，细胞在针状HA/PBLG多孔复合微载体上出现明显的增殖(p＜0.05)，而在同一天内，细胞在针状HA/PBLG多孔复合微载体上的增殖情况与正常对照组无明显差异(p＞0.05)，这表明细胞在针状HA/PBLG多孔微载体上能够正常生长和增殖。
图5为本实施例中分别将兔子脂肪干细胞接种到PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体上并培养7天、14天后检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)基因的表达。由图4可以发现，相较于PBLG多孔微载体，细胞在针状HA/PBLG多孔复合微载体上成骨分化的过程中表现出更高的ALP活性，这一优势在第7天时尤为明显(p＜0.05)。这表明针状HA/PBLG多孔复合微载体在促进细胞成骨分化方面更具有优势。
图6为本实施例分别用PBLG多孔微载体和针状HA/PBLG多孔复合微载体对兔子骨缺损修复后的组织切片图。图6A为对比例用PBLG多孔微载体对兔子骨缺损部位修复后的H&E染色和Masson染色图；图6B为本实施例用针状HA/PBLG多孔复合微载体对兔子骨缺损部位修复后的H&E染色和Masson染色图。手术6周后，实验组和对照组均出现似骨小梁结构的新生骨样组织，相比较而言，实验组中新生骨小梁面积和成熟度更高，这表明针状HA/PBLG复合微载体具有更好的骨缺损修复性能。
本实施例用于骨组织工程的针状羟基磷灰石(HA)/聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)多孔复合微载体材料及其制备方法。该方法中先采用双乳液法制备了PBLG多孔微载体，并对其进行表面羧基化改性，以改性后的PBLG多孔微载体为基体，结合原位沉淀法，进而构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。细胞实验以及动物实验证明，本实施例中针状HA的引入，有利于脂肪干细胞早期黏附，并促进脂肪干细胞的成骨向分化。本实施例制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损的修复，并具有良好的骨再生效果。
实施例二：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，PBLG多孔微载体的制备方法和羧基化改性PBLG多孔微载体的制备方法皆与实施例一相同。
在本实施例中，一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)向500mL烧杯中加入100mL的0.25mol/L的CaCl2溶液，然后加入1mL体积的表面羧基化改性后的PBLG多孔微载体，得到第一混合液体系；
(2)升温至70～80℃，并始终维持150r/min的速度，对在所述步骤(1)中制备的第一混合液体系进行机械搅拌30～40min；
(3)以2～4mL/min的速率，向在所述步骤(2)中完成搅拌处理的第一混合液体系中滴加100mL的0.015mol/L的NaH2PO4溶液，滴加完毕后，维持体系稳定30～40min，得到第二混合液体系；
(4)以1～2mL/min的速率，向在所述步骤(3)制备的第二混合液体系中滴加10～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)，形成反应物溶液体系，并使反应物溶液体系达到pH＝9并维持pH值恒定，进行反应3～4h后停止加热，陈化24h，得到产物溶液；
(5)将产物溶液在振荡器上进行多次振荡后，用标准筛筛除游离的HA粒子，得到针状HA/PBLG多孔复合微载体，冻干后保存。
实验测试分析：
对本实施例方法制备的针状羟基磷灰石(HA)/聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)多孔复合微载体的多孔复合微载体具有疏松多孔结构，孔洞连续贯通，孔径与孔隙率的范围也在30～50μm和88.2±4.8％。该方法中先采用双乳液法制备了PBLG多孔微载体，并对其进行表面羧基化改性，以改性后的PBLG多孔微载体为基体，结合原位沉淀法，进而构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。细胞实验以及动物实验证明，本实施例中针状HA的引入，有利于脂肪干细胞早期黏附，并促进脂肪干细胞的成骨向分化。本实施例制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损的修复，并具有良好的骨再生效果。
实施例三：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，PBLG多孔微载体的制备方法和羧基化改性PBLG多孔微载体的制备方法皆与实施例一相同。
在本实施例中，一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)向500mL烧杯中加入100mL的0.05mol/L的CaCl2溶液，然后加入1mL体积的表面羧基化改性后的PBLG多孔微载体，得到第一混合液体系；
(2)升温至70～80℃，并始终维持150r/min的速度，对在所述步骤(1)中制备的第一混合液体系进行机械搅拌30～40min；
(3)以2～4mL/min的速率，向在所述步骤(2)中完成搅拌处理的第一混合液体系中滴加100mL的0.03mol/L的NaH2PO4溶液，滴加完毕后，维持体系稳定30～40min，得到第二混合液体系；
(4)以1～2mL/min的速率，向在所述步骤(3)制备的第二混合液体系中滴加10～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)，形成反应物溶液体系，并使反应物溶液体系达到pH＝9并维持pH值恒定，进行反应3～4h后停止加热，陈化24h，得到产物溶液；
(5)将产物溶液在振荡器上进行多次振荡后，用标准筛筛除游离的HA粒子，得到针状HA/PBLG多孔复合微载体，冻干后保存。
实验测试分析：
对本实施例方法制备的针状羟基磷灰石(HA)/聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)多孔复合微载体的多孔复合微载体具有疏松多孔结构，孔洞连续贯通，孔径与孔隙率的范围也在30～50μm和88.2±4.8％。该方法中先采用双乳液法制备了PBLG多孔微载体，并对其进行表面羧基化改性，以改性后的PBLG多孔微载体为基体，结合原位沉淀法，进而构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。细胞实验以及动物实验证明，本实施例中针状HA的引入，有利于脂肪干细胞早期黏附，并促进脂肪干细胞的成骨向分化。本实施例制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损的修复，并具有良好的骨再生效果。
实施例四：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，PBLG多孔微载体的制备方法和羧基化改性PBLG多孔微载体的制备方法皆与实施例一相同。
在本实施例中，一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)向500mL烧杯中加入100mL的0.02mol/L的CaCl2溶液，然后加入1mL体积的表面羧基化改性后的PBLG多孔微载体，得到第一混合液体系；
(2)升温至70～80℃，并始终维持150r/min的速度，对在所述步骤(1)中制备的第一混合液体系进行机械搅拌30～40min；
(3)以2～4mL/min的速率，向在所述步骤(2)中完成搅拌处理的第一混合液体系中滴加100mL的0.12mol/L的NaH2PO4溶液，滴加完毕后，维持体系稳定30～40min，得到第二混合液体系；
(4)以1～2mL/min的速率，向在所述步骤(3)制备的第二混合液体系中滴加10～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)，形成反应物溶液体系，并使反应物溶液体系达到pH＝9并维持pH值恒定，进行反应3～4h后停止加热，陈化24h，得到产物溶液；
(5)将产物溶液在振荡器上进行多次振荡后，用标准筛筛除游离的HA粒子，得到针状HA/PBLG多孔复合微载体，冻干后保存。
实验测试分析：
对本实施例方法制备的针状羟基磷灰石(HA)/聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)多孔复合微载体的多孔复合微载体具有疏松多孔结构，孔洞连续贯通，孔径与孔隙率的范围也在30～50μm和88.2±4.8％。该方法中先采用双乳液法制备了PBLG多孔微载体，并对其进行表面羧基化改性，以改性后的PBLG多孔微载体为基体，结合原位沉淀法，进而构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。细胞实验以及动物实验证明，本实施例中针状HA的引入，有利于脂肪干细胞早期黏附，并促进脂肪干细胞的成骨向分化。本实施例制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损的修复，并具有良好的骨再生效果。
实施例五：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，PBLG多孔微载体的制备方法和羧基化改性PBLG多孔微载体的制备方法皆与实施例一相同。
在本实施例中，一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)向500mL烧杯中加入100mL的0.4mol/L的CaCl2溶液，然后加入1mL体积的表面羧基化改性后的PBLG多孔微载体，得到第一混合液体系；
(2)升温至70～80℃，并始终维持150r/min的速度，对在所述步骤(1)中制备的第一混合液体系进行机械搅拌30～40min；
(3)以2～4mL/min的速率，向在所述步骤(2)中完成搅拌处理的第一混合液体系中滴加100mL的0.24mol/L的NaH2PO4溶液，滴加完毕后，维持体系稳定30～40min，得到第二混合液体系；
(4)以1～2mL/min的速率，向在所述步骤(3)制备的第二混合液体系中滴加10～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)，形成反应物溶液体系，并使反应物溶液体系达到pH＝9并维持pH值恒定，进行反应3～4h后停止加热，陈化24h，得到产物溶液；
(5)将产物溶液在振荡器上进行多次振荡后，用标准筛筛除游离的HA粒子，得到针状HA/PBLG多孔复合微载体，冻干后保存。
实验测试分析：
对本实施例方法制备的针状羟基磷灰石(HA)/聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)多孔复合微载体的多孔复合微载体具有疏松多孔结构，孔洞连续贯通，孔径与孔隙率的范围也在30～50μm和88.2±4.8％。该方法中先采用双乳液法制备了PBLG多孔微载体，并对其进行表面羧基化改性，以改性后的PBLG多孔微载体为基体，结合原位沉淀法，进而构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。细胞实验以及动物实验证明，本实施例中针状HA的引入，有利于脂肪干细胞早期黏附，并促进脂肪干细胞的成骨向分化。本实施例制备的针状HA/PBLG多孔复合微载体能够加速不规则骨缺损的修复，并具有良好的骨再生效果。
综上所述，其中用实施例一所获得的针状HA/PBLG多孔复合微载体进行了细胞实验以及动物实验，验证了其能够促进兔子脂肪干细胞的黏附和增殖，同时促进了脂肪干细胞的成骨向分化，加速了兔子不规则骨缺损部位的骨修复，具有良好的骨再生能力。本发明上述实施例用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，在添加致孔剂的条件下，通过双乳液法，预先制备PBLG多孔微载体；再利用氢氧化钠溶液对PBLG多孔微载体表面进行羧基化改性，得到羧基化改性PBLG多孔微载体；于70～80℃反应条件下，通过三羟甲基氨基甲烷溶液，通过原位沉淀法调节钙、磷前驱体溶液在羧基化改性PBLG多孔微载体上缓慢沉积，从而制备得到针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，作为骨组织细胞培养载体材料；其中针状HA/PBLG多孔复合微载体中的HA的直径为200nm～2μm，长度为5～15μm，HA中的钙磷比为(1.31～1.41):1；针状HA/PBLG多孔复合微载体中HA的质量百分比含量为38.8～49.0％，保水率为657～715％。针状HA/PBLG多孔复合微载体的孔径与孔隙率的范围在30～50μm和88.2±4.8％。上述实施例以PBLG为原料，利用乳液法和原位沉淀法构建针状HA/PBLG多孔复合微载体。通过对PBLG多孔微载体表面进行改性，并利用原位沉淀的方法制备得到的针状HA/PBLG多孔复合微载体具有良好的生物相容性。且针状HA/PBLG多孔复合微载体能够促进脂肪干细胞在其上黏附和增殖，以及促进脂肪干细胞的成骨向分化并加速不规则骨缺损部位的修复。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料及其制备方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，其特征在于：在添加致孔剂的条件下，通过双乳液法，预先制备PBLG多孔微载体；再利用氢氧化钠溶液对PBLG多孔微载体表面进行羧基化改性，得到羧基化改性PBLG多孔微载体；于70～80℃反应条件下，通过三羟甲基氨基甲烷溶液，通过原位沉淀法调节钙、磷前驱体溶液在羧基化改性PBLG多孔微载体上缓慢沉积，从而制备得到针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，作为骨组织细胞培养载体材料；其中针状HA/PBLG多孔复合微载体中的HA的直径为200nm～2μm，长度为5～15μm，HA中的钙磷比为(1.31～1.41):1；针状HA/PBLG多孔复合微载体中HA的质量百分比含量为38.8～49.0％，保水率为657～715％。
2.根据权利要求1所述用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，其特征在于：针状HA/PBLG多孔复合微载体的孔径与孔隙率的范围在30～50μm和88.2±4.8％。
3.一种PBLG多孔微载体的制备方法，所制备的PBLG多孔微载体用于制备权利要求1所述用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料，其特征在于，包括如下步骤：
a.聚L-谷氨酸苄酯(PBLG)的合成：在N2气氛下，以三乙胺为引发剂引发BLG-NCA开环聚合，并通过无水乙醇沉降得到PBLG；
b.配制聚乙烯醇(PVA)水溶液：将PVA固体溶于去离子水中，得到质量百分比浓度为0.8～1.0％的PVA溶液；
c.配制明胶溶液：采用明胶作为致孔剂，将4～6g明胶溶于50～60mL去离子水中，于37℃下搅拌至溶液透明澄清，得到明胶溶液；
d.配制W/O乳化液：取3～6mL在所述步骤c中制备的明胶溶液加入到20～40mL在所述步骤a中制备的PBLG的溶液中，在室温下，用乳化机乳化，得到白色W/O乳化液Ⅰ；
e.PBLG多孔微载体制备：取500～600mL在所述步骤b中制备的PVA溶液，在冰浴中进行机械搅拌，再取其中的80～100mL PVA溶液，在搅拌下，将在所述步骤d中制备的W/O乳化液Ⅰ加入到PVA溶液中，在2～4min后将得到的W/O/W体系溶液倒入烧杯中，保持搅拌直至二氯甲烷完全挥发；然后将烧杯置于37℃恒温摇床中，每隔1～2h进行一次换水，重复多次直至明胶去除干净后，筛选得到所需粒径的PBLG多孔微载体，并保存于去离子水中。
4.一种羧基化改性PBLG多孔微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：量取1～2mL体积的权利要求3所述PBLG多孔微载体的制备方法制备的PBLG多孔微载体，将PBLG多孔微载体加入烧杯中，再加入20～30mL的1.25～1.5mol/L的氢氧化钠溶液，然后将其放在恒温摇床中，处理1.5～3.5h，用去离子水洗涤多次直至洗涤液为中性为止，将得到的PBLG多孔微载体冻干后保存。
5.一种权利要求1所述用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，其特征在于，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向500mL烧杯中加入100～200mL的0.025～0.4mol/L的CaCl2溶液，然后加入1mL体积的表面羧基化改性后的PBLG多孔微载体，得到第一混合液体系；
(2)升温至70～80℃，并始终维持150r/min的速度，对在所述步骤(1)中制备的第一混合液体系进行机械搅拌30～40min；
(3)以2～4mL/min的速率，向在所述步骤(2)中完成搅拌处理的第一混合液体系中滴加100～200mL的0.015～0.24mol/L的NaH2PO4溶液，滴加完毕后，维持体系稳定30～40min，得到第二混合液体系；
(4)以1～2mL/min的速率，向在所述步骤(3)制备的第二混合液体系中滴加10～20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)，形成反应物溶液体系，并使反应物溶液体系达到pH＝9并维持pH值恒定，进行反应3～4h后停止加热，陈化至少24h，得到产物溶液；
(5)将产物溶液在振荡器上进行多次振荡后，用标准筛筛除游离的HA粒子，得到针状HA/PBLG多孔复合微载体，冻干后保存。
6.根据权利要求5所述用于骨组织工程针状HA/PBLG多孔复合微载体材料的制备方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，采用100mL的0.025～0.4mol/L的CaCl2溶液；在所述步骤(3)中，采用100mL的0.015～0.24mol/L的NaH2PO4溶液。
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