WO2011132842A2 - 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재 - Google Patents

표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재 Download PDF

Info

Publication number
WO2011132842A2
WO2011132842A2 PCT/KR2010/009602 KR2010009602W WO2011132842A2 WO 2011132842 A2 WO2011132842 A2 WO 2011132842A2 KR 2010009602 W KR2010009602 W KR 2010009602W WO 2011132842 A2 WO2011132842 A2 WO 2011132842A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
calcium phosphate
bone
producing
bonded
Prior art date
Application number
PCT/KR2010/009602
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011132842A3 (ko
Inventor
김석영
박광범
류경호
최석규
양동준
안현욱
이상민
Original Assignee
주식회사 메가젠임플란트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 메가젠임플란트 filed Critical 주식회사 메가젠임플란트
Publication of WO2011132842A2 publication Critical patent/WO2011132842A2/ko
Publication of WO2011132842A3 publication Critical patent/WO2011132842A3/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/46—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with phosphorus-containing inorganic fillers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a bone material and a bone material produced by the method, more specifically, hydroxyapatite (Hydroxyapatite) and calcium triphosphate ( ⁇ -tricalcium phosphate) chemically bonded to the ideal calcium phosphate (Biphasic calcium phosphate, BCP) and the collagen is a porous bone material chemically bonded.
  • hydroxyapatite Hydroxyapatite
  • ⁇ -tricalcium phosphate calcium triphosphate
  • BCP Biphasic calcium phosphate
  • Hydroxyapatite as a bone substitute, has a low dissolution rate in vivo, which acts as a foreign substance with no immune response in host connective tissue, and thus does not function as a support for the formation of new bone, and calcium triphosphate ( ⁇ -tricalcium phosphate) It is easily absorbed and cannot provide a predictive framework for bone growth. As such, pure hydroxyapatite and calcium triphosphate have limitations as bone substitutes. Therefore, bicalcium phosphate with the proper ratio of hydroxyapatite and calcium triphosphate adjusted is currently used clinically in dentistry and orthopedics.
  • biphasic calcium phosphate is a mineral-only material, lack of elasticity, there is a risk of being broken by the force applied from the outside, the initial bone fixation strength is somewhat lacking may be a long treatment period for alveolar bone regeneration. Accordingly, attempts have been made to physically coat or mix the collagen necessary for the initial attachment or proliferation of cells as an important component of bone tissue to the surface of the bone substitute material.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, by applying collagen which is a bioactive substance to the abnormal calcium phosphate combined in a suitable ratio of hydroxyapatite and calcium phosphate, initial bone fixation, cell growth, biocompatibility, etc. It is an object of the present invention to provide a method for producing a skeleton material and a skeleton material produced by the method.
  • the method for producing a bicalcium phosphate bone substitute in which the collagen is bonded to the surface of the present invention, and the bone substitute prepared by the method adjusts the absorbency of the material while maintaining bone conductivity, and facilitates the proliferation of bone cells, thereby increasing the initial osteostatic force And has the effect of improving biocompatibility.
  • FIG. 1 is a flow chart showing a method for producing an abnormal calcium phosphate bone substitute material in which collagen is bonded to the surface according to an embodiment of the present invention in order.
  • FIG. 3 is an X-ray diffraction graph of pure bicalcium phosphate as a control of Experimental Example 1.
  • Figure 4 is a scanning electron microscope image of the surface of the bone material prepared by the manufacturing method according to the embodiment of the present invention, the experimental group of Experimental Example 2.
  • FIG. 5 is a scanning electron microscope image of the surface of the pure bicalcium phosphate bone aggregate material, which is a comparative group of Experimental Example 2.
  • FIG. 5 is a scanning electron microscope image of the surface of the pure bicalcium phosphate bone aggregate material, which is a comparative group of Experimental Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the photoelectron spectrum by X-ray spectroscopy of the bone aggregate material prepared by the manufacturing method according to the embodiment of the present invention which is the experimental group of Experimental Example 3.
  • FIG. 7 is a graph showing photoelectron spectra obtained by X-ray spectroscopy of pure bicalcium phosphate bone aggregates, a comparative group of Experimental Example 3.
  • FIG. 7 is a graph showing photoelectron spectra obtained by X-ray spectroscopy of pure bicalcium phosphate bone aggregates, a comparative group of Experimental Example 3.
  • MTT assay 10 is a graph showing the results of MTT assay (MTT assay) comparing the cell proliferation of the experimental group, comparative group, control group according to Experimental Example 5.
  • FIG. 11 is a photograph showing the degree of ALP staining of the control group (a), the comparative group (b) and the experimental group (c) according to Experimental Example 6.
  • the method for producing a bicalcium phosphate bone aggregate in which collagen is bonded to the surface of the present invention includes an amino group (Biphasic calcium phosphate (BCP)) containing a hydroxyapatite (Hydroxyapatite) and calcium triphosphate ( ⁇ -tricalcium phosphate).
  • BCP Biphasic calcium phosphate
  • Hydroxyapatite hydroxyapatite
  • ⁇ -tricalcium phosphate calcium triphosphate
  • the fourth step of activating the carboxyl group (-COOH) of the collagen by mixing and reacting the WSC solution prepared in the third step and the abnormal calcium phosphate with the amino group (-NH 2 ) is produced on the surface prepared in the first step
  • a fifth step of amide-bonding the collagen activated with the carboxyl group (-COOH) prepared in the fourth step is produced on the surface prepared in the first step.
  • the first step by stirring the solution of the mixed calcium phosphate and hexane (Hexane) and 3-APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) amino group (amino group, -NH 2 on the surface ) Can be created.
  • the generation of amino groups on the surface of the abnormal calcium phosphate may further include a step of washing with a mixed solution of hexane (Hexane) and 3-APTES (3-aminopropyltriethoxysilane), washing with hexane, and drying. .
  • the mixed solution of the hexane (Hexane) and 3-APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) and stirring may be carried out at room temperature.
  • the collagen and acetic acid aqueous solution may be stirred to dissolve the collagen.
  • the acetic acid aqueous solution 0.01wt% to 0.1wt% of acetic acid, the collagen, so as to occupy 0.01wt% to 1.0wt% in the weight of the acetic acid solution, the temperature range of 0 °C to 8 °C
  • the mixture can be stirred to dissolve the collagen.
  • ESC N- (3-dimethylaminopropyl) -N ⁇ -ethylcarbodiamide hydrochloride
  • NHS N-hydroxy succinimied
  • WSC Water-Soluble Carbodiimide
  • the EDC and NHS can be dissolved in a ratio of 0.01wt% to 1.0wt% with respect to the weight of the distilled water, respectively.
  • the mixing reaction may be performed in a temperature range of 0 ° C to 8 ° C.
  • the amide coupling reaction may be performed in a temperature range of 0 ° C to 8 ° C.
  • the fifth step may further include a step of washing the unreacted collagen by washing the distilled water once or several times with the amide bond reaction, freezing at an ultra low temperature, and freeze drying.
  • the above-mentioned calcium phosphate bone aggregate material, in which collagen is bonded to the surface of the present invention for achieving the above another object, can be prepared by the above method.
  • FIG. 1 is a flow chart sequentially showing a method for producing an abnormal calcium phosphate bone substitute material with collagen bonded to the surface according to an embodiment of the present invention.
  • the first step of the method for producing a bicalcium phosphate bone substitute in which collagen is bonded to the surface of the present invention by reacting the bicalcium phosphate with 3-APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) solution an amino group ( -NH 2 ) step (S1).
  • 3-APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • BCP biphasic calcium phosphate
  • the second step is dissolving collagen in an aqueous acetic acid solution (S2).
  • Collagen is a light protein that exists as a fibrous solid. Bone proteins, including collagen, are constituents of the extracellular matrix in bone and can provide a place for bone cells to attach and produce bone. In addition, it has a property of giving high toughness to bone and inducing selective attachment of bone cells.
  • an acetic acid solution containing 0.01 wt% to 0.1 wt% of acetic acid was added to 20 ml of distilled water, and then collagen corresponding to 0.01 wt% to 1.0 wt% of the acetic acid solution. It is stirred within 10 hours in an ice bath (ice-bath) to maintain a temperature of 8 °C or less, preferably 0 °C to 8 °C.
  • the third step is to prepare a WSC (Water-Soluble Carbodiimide) solution (S3).
  • WSC Water-Soluble Carbodiimide
  • the WSC solution serves to activate the carboxyl group of collagen dissolved in the second step.
  • EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiamide hydrochloride
  • NHS N-hydroxy succinimied
  • the fourth step is a step (S4) of activating the carboxyl group of collagen by mixing and reacting the collagen dissolved in the second step and the WSC solution prepared in the third step.
  • the mixing reaction is reacted for about 24 hours at a temperature of 8 °C or less, preferably 0 °C to 8 °C.
  • the fifth step is a step (S5) of reacting amide (Ca) by reacting the calcium phosphate having the amino group bonded to the surface prepared in the first step and the carboxyl group activated collagen prepared in the fourth step.
  • BCP bicalcium phosphate
  • the above-described calcium phosphate bone aggregate material is completed the collagen is bonded to the surface of the present invention.
  • Experimental Example 1 is to confirm the presence or absence of crystal phase change and secondary phase generation by X-ray diffraction analysis of the abnormal calcium phosphate bonded collagen to the surface prepared by the production method of the present invention.
  • the comparison group was made of pure bicalcium phosphate.
  • the X-ray diffractometer (DMAX-2500, Rigaku Co. Ltd., Japan), using a CuK ⁇ ray having a wavelength of 1.5418 kHz, at a rate of 5 ° / min, the range of 10 ° to 60 ° Measured.
  • FIG. 2 is an X-ray diffraction analysis graph of the bone substitute material prepared by the manufacturing method according to the embodiment of the present invention
  • Experimental Example 1 Experimental Example 1
  • Figure 2b is an X-ray diffraction analysis graph of pure bismuth calcium phosphate of Comparative Example 1 to be.
  • the numerical value indicated at each point of the peak is the X-ray diffraction peak intensity value (CPS).
  • the ratio of the calcium phosphate bone substitutes and pure bicalcium phosphate bone substitutes with collagen on the surface ratio of hydroxyapatite (Hydroxyapatite) and calcium triphosphate ( ⁇ -TCP) is 6: 4 to 7 It was confirmed that: 3 was properly made. Accordingly, it was confirmed that there is no change in crystal phase in the process of binding collagen to abnormal calcium phosphate.
  • the method for producing a biphasic calcium phosphate bone substitute in which the collagen is bonded to the surface does not cause any modification to the abnormal calcium phosphate itself in the process of attaching the collagen to the bicalcium phosphate surface. It shows that the calcium phosphate can have the same advantages as the bone substitute material.
  • Experimental Example 2 is to observe the microstructure of the surface of the calcium phosphate bone aggregates in which the collagen is bonded to the surface prepared by the manufacturing method according to the embodiment of the present invention by a scanning electron microscope (SEM). At this time, the comparison group was a pure bicalcium phosphate bone substitute material.
  • porous biomaterials it is reported that fibrous tissues, vascular tissues, and bone tissues can grow in the pores only when the pore size is at least 100 ⁇ m. Therefore, the bone material of the present invention needs to have a porous structure because various nutrients can be smoothly supplied into the structure.
  • Figure 4 is a scanning electron microscope image of the surface of the bone material prepared by the manufacturing method according to the embodiment of the present invention, the experimental group of Experimental Example 2. At this time, (a) is observed at x10,000 magnification, and (b) is observed at x20,000 magnification. 5 is a scanning electron microscope image of the surface of the pure bicalcium phosphate bone aggregate material, which is a comparative group of Experimental Example 2. FIG. At this time, (a) is observed at x10,000 magnification, and (b) is observed at x20,000 magnification.
  • the bone aggregate material of the experimental group is made of porous porous macro-pores having a diameter of 400 to 500 ⁇ m and micropores of 10 to 50 ⁇ m are connected.
  • the porous structure observable in the experimental group was hardly found a difference from the porous structure in the comparative group.
  • collagen was successfully bonded to the surface of the abnormal calcium phosphate by the production method of the present invention, and the overall porous structure is also well maintained, which shows that the product having an optimal state as a bone substitute material can be produced.
  • Experimental Example 3 is to perform the elemental analysis of the abnormal calcium phosphate bone aggregate material in which collagen is bonded to the surface of the present invention.
  • the method used X-ray photoelectron spectroscopy (X-Say).
  • the comparative group was pure bicalcium phosphate as in Experimental Examples 1 and 2.
  • Figure 6 is a graph showing the photoelectron spectrum by the X-ray spectroscopy of the bone aggregate material prepared by the manufacturing method according to the embodiment of the present invention
  • Experimental Example 3 is a pure bicalcium phosphate skeleton of the comparative group of Experimental Example 3 It is a graph which shows the photoelectron spectrum by X-ray spectroscopy of a format.
  • Tables 1 and 2 below show the element ratios of the main elements showing peaks in the optoelectronic spectra of FIGS. 6 and 7.
  • the surface of the bone skeleton material by the method of manufacturing the bone skeleton material of the present invention compared with the pure bicarbonate calcium phosphate bone material.
  • Nitrogen (N) component was significantly increased, while silicon (Si) component was found to decrease.
  • Nitrogen is a major element constituting amino acids and a large amount contained in collagen, a biological protein.
  • silicon is an element contained in large quantities in the abnormal calcium phosphate which is inorganic.
  • the result of the component analysis of the surface of the bone substitute means that the binding of collagen to the abnormal calcium phosphate surface by the manufacturing method according to the embodiment of the present invention was successfully achieved.
  • Experimental Example 4 is an experiment on the initial cell adhesion capacity of the collagen-bonded bone substitute on the surface of the present invention. At this time, the comparison group was a pure bicalcium phosphate bone substitute material.
  • Collagen-coupled bone aggregate (experimental group) and pure bicalcium phosphate bone aggregate (comparative group) on the surface of the present invention are mixed with MC3T3-E1 cells, which are osteoblasts, respectively, and rotated in the rotator for about 3 hours. An experiment was performed to attach the stay to the cells. Thereafter, the surface was dehydrated and the surface was observed by scanning electron microscopy (SEM).
  • SEM scanning electron microscopy
  • FIG. 8 is a scanning electron microscope image showing the cell adhesion of the bone substitute material prepared by the production method according to the embodiment of the present invention, the experimental group of Experimental Example 4,
  • Figure 9 is a pure bicalcium phosphate of the comparative group of Experimental Example 4 Scanning electron microscope image showing cell adhesion. At this time, magnification was observed as x1000 and x3000, respectively.
  • the cells penetrated to the inside of the bone material and attached to the front surface of the abnormal calcium phosphate, whereas in the comparison group, the cells did not penetrate into the bone material and attached only to the surface. I could see it.
  • the collagen-coupled bone substitute on the surface of the present invention is superior to the initial adhesion ability of cells as compared to the pure bicalcium phosphate bone substitute.
  • Experimental Example 5 is an experiment on the cell proliferation of the abnormal calcium phosphate bone substitute with collagen bonded to the surface of the present invention.
  • MTT assay 10 is a graph showing the results of the MTT assay (MTT assay) comparing the cell proliferation of the experimental group, comparative group, control group according to Experimental Example 2.
  • the absorbance in the abnormal calcium phosphate bone aggregate (experimental group) with collagen bonded to the surface of the present invention was higher than that in pure calcium phosphate bone aggregate (comparative group).
  • the cell proliferation in the abnormal calcium phosphate bone substitute in which the collagen is bonded to the surface of the present invention is superior to the cell proliferation in the pure calcium phosphate bone substitute.
  • Experimental Example 6 is an experiment relating to the cell differentiation of the abnormal calcium phosphate bone substitute in which collagen is bound to the surface of the present invention.
  • Experimental method is to put 2 ⁇ 10 4 MC3T3-E1 cells per well of 24 well culture plate and 20 mg of calcium phosphate bone substitute with collagen on the surface of the present invention, 10% bovine serum In a ⁇ -MEM medium containing a culture for one day, under a carbon dioxide concentration of 5%, temperature of 37 °C.
  • osteoblast differentiation medium (10% FBS, 50 ⁇ g / ⁇ l ⁇ - ascorbic acid, 10mM ⁇ -glycerophosphate and antibiotics added ⁇ -MEM) was added and cultured for 7 days.
  • FIG. 11 is a photograph showing the degree of ALP staining of the control group (a), the comparative group (b), the experimental group (c) according to Experimental Example 6.
  • ALP (Alkaline Phosphate) staining was used as a method for verifying cell differentiation ability.
  • the ALP staining method uses the principle that the expression level of enzyme ALP increases during bone cell differentiation, and it is possible to determine the degree of bone cell differentiation by observing purple precipitation after the precipitation reaction with BCIP and NPT.
  • Experimental Example 7 relates to an experiment of implanting the bone substitute of the present invention into a rabbit skull defect as an animal test of an abnormal calcium phosphate bone substitute in which collagen is bound to the surface of the present invention.
  • the comparison group was a pure bicalcium phosphate bone substitute material.
  • ketamine Ketara, Yuhan
  • zillazine Rompun, Yuhan
  • the formed bone defects on both sides were implanted with an abnormal calcium phosphate bone substitute with pure collagen on its surface and a pure calcium phosphate bone substitute with a suture.
  • antibiotics 0.2 ml / kg
  • 0.44 ml / kg stabilizer Nobin, Bayer Korea
  • Tissue specimens were prepared by Masson's trichrome staining, and histological evaluation was performed.
  • FIG. 12 is a tissue specimen (comparative group, a) transplanted with a pure bicalcium phosphate bone substitute according to Experimental Example 4 and a tissue specimen implanted with a bicalcium phosphate bone substitute with collagen bonded to the surface of the present invention (experimental group, b) Photograph showing the microscopic image of the. 13 is a graph showing the histometric evaluation of the comparison group and the experimental group.
  • the bicalcium phosphate bone substitute in which collagen is bound to the surface of the present invention can be used to treat alveolar bone prior to implantation.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)의 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 제1 단계, 콜라겐을 용해하여 준비하는 제2 단계, WSC(Water-Soluble Carbodiimide)용액을 제조하는 제3 단계, 용해된 콜라겐과 WSC용액을 혼합 반응시켜 콜라겐의 카복실기(-COOH)를 활성화하는 제4 단계 및 표면에 아미노기(-NH2)가 생성된 이상인산칼슘과 카복실기(-COOH)가 활성화된 콜라겐을 아미드(amide) 결합시키는 제5 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재가 개시된다. 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재는 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절하고, 골세포의 증식을 용이하게 하여 초기 골고정력과 생체 친화성을 향상시키는 효과를 갖는다.

Description

표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재
본 발명은 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosphate) 이 적절한 비율로 화학결합된 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)과 콜라겐을 화학적으로 결합시킨 다공성 골대체재에 관한 것이다.
노화, 질병, 사고. 선천적인 요인 등 각종 원인에 의한 기능치의 상실에 대한 대안으로 임플란트 시술이 보편화되고 있다. 이와 같은 임플란트의 시술을 위해서는 먼저 치조골을 재생하는 치료가 우선되어야 하는데, 여기에 필요한 골대체재로서 골전도성, 생체활성, 초기 골재생 등에 효과가 좋은 재료가 요구되고 있다.
골대체재로서 수산화인회석(Hydroxyapatite)은 생체 내 용해율이 낮아 숙주 결합조직 내에서 면역반응이 없는 이물질로 작용하여 신생골 형성을 위한 지지체로서의 기능을 충분히 하지 못하고, 삼인산칼슘(β-tricalcium phosphate)은 조직에 쉽게 흡수되어 골성장을 위한 골격을 예견성있게 제공할 수 없다. 이와 같이, 순수한 수산화인회석이나 삼인산칼슘은 골대체재로서 한계가 있다. 따라서 수산화인회석과 삼인산칼슘을 적절한 비율로 조절한 이상인산칼슘이 현재 치과나 정형외과 등에서 임상적으로 이용되고 있다.
그러나 이상인산칼슘은 무기질만의 재료로서 탄력이 부족하여, 외부에서 가해지는 힘에 의해 깨질 염려가 있으며, 초기 골고정력이 다소 부족하여 치조골 재생을 위한 치료기간이 길어질 수 있다. 이에 따라 골조직의 중요한 성분의 단백질로서 세포의 초기부착이나 증식에 필요한 콜라겐을 단순히 골대체재의 표면에 물리적으로 코팅하거나 골대체재에 섞는 등의 시도가 이루어지고 있다.
본 발명의 목적은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 수산화인회석과 산인산칼슘이 적절한 비율로 결합된 이상인산칼슘에 생체활성물질인 콜라겐을 적용함으로써 초기 골고정력, 세포증식력, 생체친화성 등을 향상시킬 수 있는 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재를 제공하려는 것이다.
본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재는 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절하고, 골세포의 증식을 용이하게 하여 초기 골고정력과 생체 친화성을 향상시키는 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법을 순서대로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 실험예 1의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 회절 분석 그래프이다.
도 3은 실험예 1의 대조군인 순수한 이상인산칼슘의 X선 회절 분석 그래프이다.
도 4는 실험예 2의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재 표면의 주사전자현미경 상 이미지이다.
도 5는 실험예 2의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재 표면의 주사전자현미경상 이미지이다.
도 6은 실험예 3의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험예 3의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼(Photoelectron Spectrum)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 4의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이다.
도 9는 실험예 4의 비교군인 순수한 이상인산칼슘의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이다.
도 10은 실험예 5에 의한 실험군, 비교군, 대조군의 세포증식력을 비교한 MTT분석(MTT assay) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 실험예 6에 의한 대조군(a), 비교군(b) 및 실험군(c)의 ALP 염색정도를 나타낸 사진이다.
도 12는 실험예 7에 의한 비교군(a) 및 실험군(b)의 광학현미경 상 이미지를 나타낸 사진이다.
도 13은 실험예 7에 의한 비교군 및 실험군의 조직계측학적 평가를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법은 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosph)을 포함하는 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)의 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 제1 단계, 콜라겐을 용해하여 준비하는 제2 단계, WSC(Water-Soluble Carbodiimide)용액을 제조하는 제3 단계, 상기 제2 단계에서의 용해된 콜라겐과 상기 제3 단계에서 제조된 WSC용액을 혼합 반응시켜 상기 콜라겐의 카복실기(-COOH)를 활성화하는 제4 단계 및 상기 제1 단계에서 준비된 표면에 아미노기(-NH2)가 생성된 이상인산칼슘과 상기 제4 단계에서 준비된 카복실기(-COOH)가 활성화된 콜라겐을 아미드(amide) 결합시키는 제5 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 제1 단계는, 상기 이상인산칼슘 및 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)를 혼합한 용액을 교반시켜 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성할 수 있다.
상기 이상인산칼슘의 표면에 아미노기의 생성은, 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합 용액과 교반시킨 후, 헥산(Hexane)으로 세척하고, 건조하는 과정을 더 포함할 수 있다.
한편, 상기 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)를 혼합한 용액과 교반은, 상온에서 수행할 수 있다.
상기 제2 단계는, 상기 콜라겐과 아세트산(acetic acid) 수용액을 교반하여 상기 콜라겐의 용해가 이루어지도록 할 수 있다.
또한, 상기 아세트산 수용액은, 0.01wt% 내지 0.1wt%의 아세트산을 포함하고, 상기 콜라겐은, 상기 아세트산 용액의 중량 중에 0.01wt% 내지 1.0wt%를 차지하도록 하여, 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 교반하여 콜라겐을 용해할 수 있다.
상기 제3 단계는, EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiamide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxy succinimied)를 증류수에 용해시켜 WSC(Water-Soluble Carbodiimide) 용액을 제조할 수 있다.
한편, 상기 EDC 및 NHS는, 상기 증류수의 중량에 대하여 각기 0.01wt% 내지 1.0wt%의 비율로 용해시킬 수 있다.
상기 제4 단계는, 상기 혼합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 할 수 있다.
상기 제5 단계는, 상기 아미드 결합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 할 수 있다.
또한, 상기 제5 단계는, 상기 아미드 결합 반응을 한 다음, 증류수로 1회 내지 복수 회 세척하여 반응하지 않은 콜라겐을 씻어내고, 초저온에서 동결시킨 후, 동결 건조하는 과정을 더 포함할 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재는 상기 제조방법으로 제조될 수 있다.
이하에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이다. 다음에서 설명되는 실시예들은 여러 가지 다양한 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 완전한 설명을 하기 위하여 제공되는 것이다.
먼저, 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법에 관하여 설명하고, 다음으로 그 방법에 의해 제조된 골대체재의 품질 및 제조상태에 관하여 알아본 후, 마지막으로 몇 가지 실험예들을 들어 골대체재로서 적용시 효과를 살펴보도록 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법을 순차적으로 나타낸 흐름도이다.
도 1에 의하면, 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법의 제1 단계는 이상인산칼슘을 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane) 용액과 반응시켜 이상인산칼슘 표면에 아미노기(-NH2)를 생성시키는 단계(S1)이다.
이에 대한 화학 반응식은 아래 화학식 1과 같다.
화학식 1
Figure PCTKR2010009602-appb-C000001
이상인산칼슘의 표면에 아미노기를 생성함으로써 아래에서 설명할 콜라겐(Collagen)의 카복실기(Carboxyl group, -COOH)와 결합할 수 있게 된다.
상세하게는, 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP) 1.0g을 준비하여, 헥산(Hexane) 50㎖와 3-APTES 2.5㎖를 혼합한 용액과 함께 상온에서 1시간 이상 교반 시킨다. 이후, 헥산으로 3회에 걸쳐 세척하고, 약 60℃의 온도에서 완전히 건조시킨다.
제2 단계는 콜라겐(Collagen)을 아세트산(acetic acid) 수용액에 용해시키는 단계(S2)이다.
콜라겐은 경단백질로 섬유 상 고체로 존재하는데, 콜라겐을 포함하는 골 단백질들은 뼈에서 세포 외 기질(extracellular matrix)의 구성물질이며, 골세포가 부착하여 뼈를 생산하는 장소를 제공할 수 있다. 또한, 뼈에 높은 인성을 부여하고 골세포의 선택적 부착을 유도하는 성질이 있다.
상세하게는, 증류수(Distilled water) 20㎖에 0.01wt% 내지 0.1wt%에 해당하는 아세트산(Acetic acid)을 넣은 아세트산 수용액을 만든 후, 그 아세트산 수용액의 0.01wt% 내지 1.0wt%에 해당하는 콜라겐을 8℃ 이하, 바람직하게는 0℃ 내지 8℃의 온도를 유지하는 아이스 배스(ice-bath)에서 10시간 이내에서 교반 시킨다.
제3 단계는 WSC(Water-Soluble Carbodiimide) 용액을 제조하는 단계(S3)이다.
이때, WSC 용액은 상기 제2 단계에서 용해된 콜라겐의 카복실기를 활성화하는 역할을 한다. 상세하게는, 증류수 20㎖에 0.01wt% 내지 1.0wt%의 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiamide hydrochloride)와 0.01wt% 내지 1.0wt%의 NHS(N-hydroxy succinimied)를 용해시켜 WSC 용액을 만든다.
제4 단계는 상기 제2 단계에서 용해된 콜라겐과 상기 제3 단계에서 준비된 WSC 용액을 혼합 반응시켜 콜라겐의 카복실기를 활성화하는 단계(S4)이다.
이때, 상기 혼합 반응은 8℃ 이하, 바람직하게는 0℃ 내지 8℃의 온도에서 약 24시간 동안 반응시킨다.
제5 단계는 상기 제1 단계에서 준비된 표면에 아미노기가 결합된 이상인산칼슘과 상기 제4 단계에서 준비된 카복실기가 활성화된 콜라겐을 반응시켜 아미드(amide) 결합시키는 단계(S5)이다.
이에 대한 화학 반응식은 아래 화학식 2와 같다.
화학식 2
Figure PCTKR2010009602-appb-C000002
상세하게는, 카복실기가 활성화된 콜라겐 용액과 3-APTES 처리한 이상인산칼슘(BCP)을 8℃ 이하, 바람직하게는 0℃ 내지 8℃의 온도를 유지하는 아이스 배스ce-bath)에서 약 2시간 동안 반응시킨 후, 반응하지 않은 콜라겐은 3회에 걸쳐 증류수로 씻어낸다. 다음으로, 초저온 냉동고에서 동결시키고, 동결건조기(Freeze drier)를 이용하여 동결건조 시킨다.
상기 다섯 단계의 제조공정을 거침으로써, 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재가 제조가 완료된다.
다음으로, 본 발명의 골대체재의 제조방법의 효과를 확인하기 위하여 상기 방법에 의해 제조된 골대체재의 구조와 성분을 분석하는 실험예 1 내지 실험예 3을 제시하고자 한다.
(실험예 1)
실험예 1은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘을 X선 회절 분석하여 결정상 변화와 이차상 생성의 유무를 확인하는 것이다. 여기서, 비교군은 순수한 이상인산칼슘으로 하였다.
상세하게는, X선 회절분석기(DMAX-2500, Rigaku Co. Ltd., Japan)로, 파장이 1.5418Å인 CuKα선을 이용하여, 5°/min의 속도로, 10° 내지 60°의 범위를 측정하였다.
도 2는 실험예 1의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 회절 분석 그래프이고, 도 2b는 실험예 1의 비교군인 순수한 이상인산칼슘의 X선 회절 분석 그래프이다. 이때, 피크의 각 지점에 나타낸 수치는 X선 회절피크 강도값(CPS)이다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 상기 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재와 순수한 이상인산칼슘 골대체재 모두 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-TCP)의 비율이 6:4 내지 7:3으로 적절하게 이루어진 것으로 확인되었다. 이에 따라 콜라겐을 이상인산칼슘에 결합하는 과정에서 결정상의 변화는 없는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실험군 및 비교군 모두에서 이상인산칼슘의 피크(Peak) 외에 다른 피크는 발견할 수 없으므로 본 발명의 골대체재의 제조과정에서 이차상이 생성되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
다시 말해, 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법은 콜라겐을 이상인산칼슘의 표면에 부착하는 과정에서 이상인산칼슘 자체에는 어떠한 변성도 일으키지 않으므로 기존의 이상인산칼슘이 가지는 골대체재로서의 이점을 그대로 가질 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
(실험예 2)
실험예 2는 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재 표면의 미세구조를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰하는 것이다. 이때, 비교군은 순수한 이상인산칼슘 골대체재로 하였다.
다공성의 생체재료의 경우, 기공의 크기가 최소 100㎛ 이상은 되어야 섬유조직, 혈관조직, 골조직이 그 기공 내에서 성장할 수 있다는 보고가 있다. 따라서 본 발명의 골대체재는 그 구조의 내부로 각종 영양소들이 원활하게 공급될 수 있어야 하므로 다공질의 구조를 가져야할 필요가 있다
도 4는 실험예 2의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재 표면의 주사전자현미경 상 이미지이다. 이때, (a)는 ×10,000 배율로, (b)는 ×20,000 배율로 관찰한 것이다. 또한, 도 5는 실험예 2의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재 표면의 주사전자현미경상 이미지이다. 이때, (a)는 ×10,000 배율로, (b)는 ×20,000 배율로 관찰한 것이다.
도 4 및 도 5를 참조하면, 실험군의 골대체재는 400 내지 500㎛ 직경을 갖는 매크로포어(Macro-pore)와 10 내지 50㎛의 마이크로포어(Micro-pore) 들이 연결된 다공질로 이루어져 있는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 실험군에서 관찰할 수 있는 다공질 구조는 비교군에서의 다공질 구조와 차이점이 거의 발견되지 않았다. 또한, 다공질의 표면에 콜라겐이 부착되어 있는 모습을 확인할 수 있었다.
다시 말해, 본 발명의 제조방법에 의해 이상인산칼슘의 표면에 콜라겐이 성공적으로 결합 되었으며, 전체적인 다공질 구조 또한 잘 유지되어 골대체재로서 최적의 상태를 가지는 제품을 제조할 수 있다는 것을 보여준다.
(실험예 3)
실험예 3은 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 원소분석을 하는 것이다. 그 방법은 X선 광전자 분광법(X-Ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)을 이용하였다. 비교군으로는 상기 실험예 1 및 2와 마찬가지로 순수한 이상인산칼슘으로 하였다.
도 6은 실험예 3의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼을 나타낸 그래프이고, 도 7은 실험예 3의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼(Photoelectron Spectrum)을 나타낸 그래프이다.
아래의 표 1 및 표 2는 도 6 및 도 7의 광전자 스펙트럼에서 피크(peak)를 나타내는 주요원소의 원소비율을 나타낸 것이다.
표 1
원소 표면원소비율(%)
C 26.54
Ca 14.4
N 4.02
O 40.02
P 12.11
Si 2.9
표 2
원소 표면원소비율(%)
C 22.23
Ca 18.12
O 46.99
P 12.66
도 6, 도 7 및 상기 표를 참조하면, 실험군의 광전자 스펙트럼은 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재의 광전자 스펙트럼과 비교할 때, 질소(N)에 해당하는 부분에서 피크(peak)가 뚜렷하게 나타남을 확인할 수 있다.
다시 말해, 본 발명의 골대체재 제조방법에 의한 골대체재의 표면은 순수한 이상인산칼슘 골대체재와 비교하여 볼 때. 질소(N) 성분이 상당히 증가하였고, 반면에 규소(Si) 성분은 감소함을 확인할 수 있다. 질소는 아미노산을 구성하는 주요 원소이고, 생체 단백질인 콜라겐에 대량 함유된 원소이다. 또한, 규소는 무기질인 이상인산칼슘에 다량 포함되어 있는 원소이다.
따라서, 상기 골대체재 표면의 성분분석결과는 본 발명의 실시예에 의한 제조방법에 의해 이상인산칼슘 표면에 콜라겐의 결합이 성공적으로 이루어졌음을 의미하는 것이다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 생체 적용시의 효과를 입증하기 위한 실험예들을 제시하고자 한다.
(실험예 4)
실험예 4는 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 골대체재의 세포초기부착능력에 관한 실험이다. 이때, 비교군은 순수한 이상인산칼슘 골대체재로 하였다.
본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 골대체재(실험군)와 순수한 이상인산칼슘 골대체재(비교군)를 각각 조골세포인 MC3T3-E1 세포와 섞고, 로테이터(Rotator)에서 약 3시간 동안 회전시키면서 상기 골대체재를 세포에 부착하는 실험을 수행하였다. 이후, 탈수 과정을 거치고, 주사전자현미경(SEM)으로 그 표면을 관찰하였다.
도 8은 실험예 4의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이고, 도 9는 실험예 4의 비교군인 순수한 이상인산칼슘의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이다. 이때, 배율은 각각 ×1000, ×3000으로 하여 관찰하였다.
도 8 및 도 9를 참조하면, 상기 실험군에서는 세포가 골대체재 내부까지 침투되어 이상인산칼슘의 전면에 부착된 것을 볼 수 있는 반면, 상기 비교군에서는 세포가 골대체재 내부로 침투되지 못하고 표면에만 부착되어 있는 것을 볼 수 있었다.
따라서 본 발명의 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 골대체재는 순수한 이상인산칼슘 골대체재에 비하여 세포의 초기 부착능력이 더 우수함을 확인할 수 있다.
(실험예 5)
실험예 5는 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 세포증식에 관한 실험이다.
실험방법은 24 웰 배양 플레이트(24 well culture plate)에 웰 마다 MC3T3-E1 세포 2×104개와 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘을 20㎎을 넣고, 10%의 우혈청을 포함하는 α-MEM 배지에서 1일 및 3일 동안, 37℃, 5%의 이산화탄소(CO2) 농도의 조건 하에서 배양하였다.
이때, 배양용기에 MC3T3-E1 세포만을 접종한 것을 대조군(Control)로 하고, 순수한 이상인산칼슘 골대체재 20㎎을 MC3T3-E1 세포와 함께 접종한 것은 비교군으로 하였다.
위와 같은 방법으로 배양된 세포는 MTT 분석(MTT assay)하여 570nm 파장에서의 흡광도(Optical Density, OD)를 측정하였다.
도 10은 실험예 2에 의한 실험군, 비교군, 대조군의 세포증식력을 비교한 MTT분석(MTT assay) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10을 참조하면, 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재(실험군)에서의 흡광도가 순수한 이상인산칼슘 골대체재(비교군)에서의 흡광도에 비하여 높게 나타났다.
따라서 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재에서의 세포증식력이 순수한 이상인산칼슘 골대체재에서의 세포증식력에 비하여 우수한 것을 확인할 수 있다.
(실험예 6)
실험예 6은 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 세포분화에 관한 실험이다.
실험방법은 24 웰 배양 플레이트(24 well culture plate)의 웰 마다 MC3T3-E1 세포 2×104개와 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재 20㎎을 넣고, 10%의 우혈청을 포함하는 α-MEM 배지에서 1일 동안, 37℃의 온도, 5%의 이산화탄소 농도 조건 하에서 배양하였다. 다음으로, 조골세포분화배지(10% FBS, 50㎍/㎕ α-ascorbic acid, 10mM β-glycerophosphate와 antibiotics가 첨가된 α-MEM)를 넣어 7일 동안 더 배양하였다.
이때, 배양용기에 MC3T3-E1 세포만을 접종한 것을 대조군(Control)로 하고, 순수한 이상인산칼슘 골대체재 20㎎을 MC3T3-E1 세포와 함께 접종한 것은 비교군으로 하였다.
도 11은 실험예 6에 의한 대조군(a), 비교군(b), 실험군(c)의 ALP 염색정도를 나타낸 사진이다.
세포분화능력을 검증하기 위한 방법으로는 ALP(Alkaline Phosphate) 염색법을 사용하였다. 상기 ALP 염색법은 효소인 ALP가 뼈세포 분화시 발현량이 증가하는 원리를 이용한 것으로서, BCIP, NPT와 침전 반응을 일으킨 후 보라색 침전이 나타나는 것을 관찰함으로써 뼈세포 분화 정도를 알 수 있다.
도 11을 참조하면, 실험군에서의 염색 정도가 비교군에 비해 다소 진한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 순수한 이상인산칼슘 골대체재에 비하여 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재에 있어서의 세포분화능력이 더 우수함을 확인할 수 있다.
(실험예 7)
실험예 7은 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 동물실험으로서, 토끼 두개골 결손부에 본 발명의 골대체재를 이식하는 실험에 관한 것이다. 이때, 비교군은 순수한 이상인산칼슘 골대체재로 하였다.
실험방법은, 먼저 실험용 토끼에 케타민(Ketara, 유한양행)과 질라진(Rompun, 유한양행)을 근육주사하여 전신마취를 시행 후, 수술부위를 면도하고 소독하였다. 이때, 케타민은 44㎎/㎏, 질라진은 7㎎/㎏의 양만큼 투여하였다.
다음으로, 2% 농도의 리도카인(유한양행)을 이용하여 부가적인 국소마취를 시행하고, 두개골의 정중부를 절개한다. 이후, 전층판막(mucoperiosteal flap)을 거상하고, 외경 8㎜, 내경 7㎜인 골편채취기(Trephine bur)를 이용하여 두개골 시상봉합(Sagittal suture)의 양측으로 골결손부를 형성하였다.
상기 형성된 양측의 골결손부에는 각각 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재 및 순수한 이상인산칼슘 골대체재를 이식하고, 봉합사로 봉합하였다. 수술 후에는 0.2㎖/㎏ 농도의 항생제(baytril, Bayer Korea)와 0.44㎖/㎏ 농도의 안정제(Nobin, Bayer Korea)를 근육주사 하였다.
상기 수술 4주 후, 실험 동물을 희생하고, 원래의 결손부를 포함한 블록시편을 채취하고, 통상적인 방법에 의한 탈회시편을 제작한다. 여기에 마슨스 트리크롬 염색(Masson`s trichrome staining)을 시행하여 조직시편을 제작하고, 조직계측학적 평가를 시행하였다.
도 12는 실험예 4에 의한 순수한 이상인산칼슘 골대체재를 이식한 조직시편(비교군, a) 및 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재를 이식한 조직시편(실험군, b)의 현미경 상 이미지를 나타낸 사진이다. 또한, 도 13은 상기 비교군 및 실험군의 조직계측학적 평가를 나타낸 그래프이다.
도 12 및 도 13을 참조하면, 비교군에 비하여 실험군에서의 새로운 골 형성이 더욱 활발히 이루어졌음을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.
본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재는 임플란트 시술 이전에 치조골을 재생하는 치료에 이용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosph)을 포함하는 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)의 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 제1 단계;
    콜라겐을 용해하여 준비하는 제2 단계;
    WSC(Water-Soluble Carbodiimide)용액을 제조하는 제3 단계;
    상기 제2 단계에서의 용해된 콜라겐과 상기 제3 단계에서 제조된 WSC용액을 혼합 반응시켜 상기 콜라겐의 카복실기(-COOH)를 활성화하는 제4 단계; 및
    상기 제1 단계에서 준비된 표면에 아미노기(-NH2)가 생성된 이상인산칼슘과 상기 제4 단계에서 준비된 카복실기(-COOH)가 활성화된 콜라겐을 아미드(amide) 결합시키는 제5 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계의 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)은,
    수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosphate)이 6:4 내지 7:3의 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계는,
    상기 이상인산칼슘 및 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합용액을 교반시켜 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 이상인산칼슘 표면에 아미노기의 생성은,
    상기 이상인산칼슘을 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합용액과 교반시킨 후, 헥산(Hexane)으로 세척하고, 건조하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 이상인산칼슘 및 상기 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합용액과의 교반은,
    상온에서 수행하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단계는,
    상기 콜라겐과 아세트산(acetic acid) 수용액을 교반하여 상기 콜라겐이 용해되도록 하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아세트산 수용액은,
    0.01wt% 내지 0.1wt%의 아세트산을 포함하고,
    상기 콜라겐은,
    상기 아세트산 용액의 중량에 대하여 0.01wt% 내지 1.0wt%를 차지하도록 하여,
    0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 교반하여 콜라겐을 용해하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제3 단계는,
    EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiamide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxy succinimied)를 증류수에 용해시켜 WSC(Water-Soluble Carbodiimide) 용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 EDC 및 NHS는,
    상기 증류수의 중량에 대하여 각기 0.01wt% 내지 1.0wt%의 비율로 용해시키는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제4 단계는,
    상기 혼합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제5 단계는,
    상기 아미드(amide) 결합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제5 단계는,
    상기 아미드(amide) 결합반응을 한 다음, 증류수로 1회 내지 복수 회 세척하여 반응하지 않은 콜라겐을 씻어내고, 초저온에서 동결시킨 후, 동결 건조하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중에 선택된 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재.
PCT/KR2010/009602 2010-04-21 2010-12-30 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재 WO2011132842A2 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2010-0036800 2010-04-21
KR1020100036800A KR20110117382A (ko) 2010-04-21 2010-04-21 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2011132842A2 true WO2011132842A2 (ko) 2011-10-27
WO2011132842A3 WO2011132842A3 (ko) 2011-12-22

Family

ID=44834578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2010/009602 WO2011132842A2 (ko) 2010-04-21 2010-12-30 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20110117382A (ko)
WO (1) WO2011132842A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11357891B2 (en) * 2019-06-14 2022-06-14 Geistlich Pharma Ag Collagen matrix or granulate blend of bone substitute material
CN116036372A (zh) * 2023-03-07 2023-05-02 江苏创英医疗器械有限公司 一种口腔用骨填充物的制备方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101304949B1 (ko) * 2012-04-19 2013-09-06 순천향대학교 산학협력단 히알루론산-젤라틴 용액이 로딩된 이상인산칼슘 지지체의 제조방법
KR101456638B1 (ko) * 2012-06-18 2014-11-03 주식회사 본셀바이오텍 아텔로콜라겐으로 코팅된 골 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 및 이의 제조방법
KR102278665B1 (ko) * 2019-07-30 2021-07-16 주식회사 덴티스 콜라겐 코팅이 된 거대기공을 가진 합성 골이식재 제조방법 및 이에 의해 제조된 합성 골이식재
KR102408363B1 (ko) * 2020-04-21 2022-06-14 연세대학교 산학협력단 약물 방출용 골대체재 및 이의 제조방법
KR102418786B1 (ko) * 2020-06-15 2022-07-08 (주)제일메디칼코퍼레이션 골 유착능이 우수한 피크 임플란트 및 이의 제조방법
KR102384715B1 (ko) * 2021-08-26 2022-04-11 (주)제일메디칼코퍼레이션 골 유착능이 우수한 다공성 생체 임플란트 및 이의 제조방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050020506A1 (en) * 2003-07-25 2005-01-27 Drapeau Susan J. Crosslinked compositions comprising collagen and demineralized bone matrix, methods of making and methods of use
KR20070031846A (ko) * 2003-10-28 2007-03-20 캠브리지 엔터프라이즈 리미티드 칼슘 포스페이트 물질, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸을포함하는 복합 생체물질
KR100713619B1 (ko) * 2005-11-14 2007-05-02 재단법인서울대학교산학협력재단 유도 골재생을 위한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의제조방법
KR100848468B1 (ko) * 2007-04-16 2008-07-24 장기환 고분자-티타니아-하이드록시아파타이트 합성 나노섬유 및그 제조방법과 티타니아-하이드록시아파타이트 합성나노섬유 및 그 제조방법
KR20090043857A (ko) * 2007-10-30 2009-05-07 영남대학교 산학협력단 수산화아파타이트 표면에 콜라겐이 화학결합된 골대체재

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050020506A1 (en) * 2003-07-25 2005-01-27 Drapeau Susan J. Crosslinked compositions comprising collagen and demineralized bone matrix, methods of making and methods of use
KR20070031846A (ko) * 2003-10-28 2007-03-20 캠브리지 엔터프라이즈 리미티드 칼슘 포스페이트 물질, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸을포함하는 복합 생체물질
KR100713619B1 (ko) * 2005-11-14 2007-05-02 재단법인서울대학교산학협력재단 유도 골재생을 위한 콜라겐/아파타이트 복합체 멤브레인의제조방법
KR100848468B1 (ko) * 2007-04-16 2008-07-24 장기환 고분자-티타니아-하이드록시아파타이트 합성 나노섬유 및그 제조방법과 티타니아-하이드록시아파타이트 합성나노섬유 및 그 제조방법
KR20090043857A (ko) * 2007-10-30 2009-05-07 영남대학교 산학협력단 수산화아파타이트 표면에 콜라겐이 화학결합된 골대체재

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11357891B2 (en) * 2019-06-14 2022-06-14 Geistlich Pharma Ag Collagen matrix or granulate blend of bone substitute material
CN116036372A (zh) * 2023-03-07 2023-05-02 江苏创英医疗器械有限公司 一种口腔用骨填充物的制备方法
CN116036372B (zh) * 2023-03-07 2023-11-10 江苏创英医疗器械有限公司 一种口腔用骨填充物的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110117382A (ko) 2011-10-27
WO2011132842A3 (ko) 2011-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011132842A2 (ko) 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재
Ye et al. Three-dimensional electrospun nanofibrous scaffolds displaying bone morphogenetic protein-2-derived peptides for the promotion of osteogenic differentiation of stem cells and bone regeneration
Zou et al. Preparation and characterization of porous β-tricalcium phosphate/collagen composites with an integrated structure
Guo et al. Hybrid nanostructured hydroxyapatite–chitosan composite scaffold: Bioinspired fabrication, mechanical properties and biological properties
EP1327014B1 (en) Method for the preparation of a non-woven silk fibroin fabrics
CN110898253B (zh) 可促进细胞成骨分化的纤维内仿生矿化胶原膜制备方法
CN110639063B (zh) 一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料
WO2022021498A1 (zh) 碱性磷酸酶诱导蚕丝蛋白溶液凝胶化和仿生矿化的方法
CN101474428B (zh) 聚酯增强可降解多孔硅酸钙复合支架材料、制备及用途
CN113416264B (zh) 一种三嵌段多肽、三嵌段多肽自组装形成的胶原蛋白仿生材料
KR101209233B1 (ko) 피브린 결합능을 가진 생리활성 펩타이드가 함유된 피브린 수화젤
WO2012086988A2 (en) Artificial silk membrane having excellent flexibility and suturing ability and method of manufacturing the same
CN107158465B (zh) 一种骨支架复合材料的制备方法
Li et al. In-situ mineralized homogeneous collagen-based scaffolds for potential guided bone regeneration
Li et al. Preparation and characterization of bioactive collagen/wollastonite composite scaffolds
CN114539559A (zh) 适用于电刺激骨再生的电活性钙钛矿水凝胶及其制备和应用
CN110639058A (zh) 用于骨组织工程针状ha/pblg多孔复合微载体材料及其制备方法
KR20210068226A (ko) 실리케이트-쉘화된 하이드로겔 섬유상 스케폴드 및 이의 제조 방법
CN114805888B (zh) 一种提高聚醚醚酮基材表面生物活性和骨整合性能的方法
US8916690B2 (en) Growth-inhibited hydroxyapatite, process for its preparation and use
CN115463263A (zh) 一种可注射双网络水凝胶体系及其制备方法和应用
CN110624129B (zh) 一种耐溶蚀的骨诱导性丝素蛋白/羟基磷灰石/氧化镁凝胶海绵及制备方法
Li et al. Osteoimmunity-regulating nanosilicate-reinforced hydrogels for enhancing osseointegration
CN114796605B (zh) 一种可促进成骨分化的天然超分子水凝胶材料的制备方法
CN111514372B (zh) CaCO3/MgO纳米复合物及其在骨修复中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10850325

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10850325

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2