CN115463263A - 一种可注射双网络水凝胶体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可注射双网络水凝胶体系及其制备方法和应用，制备方法包含以下步骤，S1，丝蛋白水溶液的制备；S2，海藻酸钠水溶液的制备：S3，取介孔生物玻璃粉末加入所述丝蛋白水溶液中，搅拌至混合均匀，得到介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液；S4，取维生素C粉末加入到所述海藻酸钠水溶液中，搅拌至混合均匀，得到维生素C/海藻酸钠混合溶液；S5，将所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液和维生素C/海藻酸钠混合溶液混匀，得到所述可注射双网络水凝胶体系。所述可注射双网络水凝胶体系具有快速成胶、成骨成血管活性、较高的生物相容性的优点，可应用于腔隙性骨缺损的修复。
Description
技术领域
本发明涉及水凝胶生物材料领域，具体涉及一种可注射双网络水凝胶体系及其制备方法和应用。
背景技术
目前临床上，肿瘤、外伤和先天性畸形等多种原因均可导致软、硬组织缺损，不仅严重破坏患者的容貌外形、直接影响咀嚼、吞咽、言语等重要生理功能，还给患者的身心健康造成了巨大创伤。
口腔颌面部常见的骨缺损如拔牙创、上颌窦骨腔缺损等均为腔隙性骨缺损或骨量不足，常用骨粉材料进行填充修复，而骨粉类材料在使用时面临操作不便，手术创伤大等问题。丝蛋白(SF)水凝胶具有可注射性，由于其良好的生物相容性，已被广泛应用于组织工程中，但是单一的丝蛋白水凝胶的孔隙较小，不利于细胞的长入与增殖，且没有良好的骨诱导性能。此外，制备丝蛋白水凝胶时需要额外的操作，如超声等以诱导丝蛋白成胶，不利于临床应用。
因此，亟需一种自身具有成骨/成血管诱导功能，可自发、原位、快速成胶的生物相容性好的可注射水凝胶生物材料，用于腔隙性骨缺损的修复。
发明内容
本发明的目的是克服现有的生物材料对于骨缺损的再生修复和诱导效果不佳、制备方法复杂的缺陷。
为了达到上述目的，本发明提供了一种可注射双网络水凝胶体系及其制备方法和应用。
本发明提供了一种可注射双网络水凝胶体系的制备方法，所述制备方法包含以下步骤：
S1，丝蛋白水溶液的制备：
将冻干丝素蛋白配制成丝蛋白水溶液；
S2，海藻酸钠水溶液的制备：
将海藻酸钠配制成海藻酸钠水溶液；
S3，介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液的制备：
取介孔生物玻璃粉末加入所述丝蛋白水溶液中，搅拌至混合均匀，得到介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液；
S4，维生素C/海藻酸钠混合溶液的制备：
取维生素C粉末加入到所述海藻酸钠水溶液中，搅拌至混合均匀，得到维生素C/海藻酸钠混合溶液；
S5，可注射双网络水凝胶体系的制备：
将所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液和维生素C/海藻酸钠混合溶液混匀，得到所述可注射双网络水凝胶体系。
较佳地，S1中，所述丝蛋白水溶液的质量浓度为3％～6％。
较佳地，S2中，所述海藻酸钠水溶液的质量浓度为1％～2％。
较佳地，维生素C/海藻酸钠混合溶液中，所述维生素C的浓度为0.5％～2.5％。
较佳地，S5中，按照质量比，所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液：所述维生素C/海藻酸钠混合溶液＝1:1～4:1。
本发明还提供了一种可注射双网络水凝胶体系，所述可注射双网络水凝胶体系由上述任意一项所述制备方法制备得到。
本发明还提供了一种可注射双网络水凝胶体系在骨缺损的修复和再生中的应用。
较佳地，所述可注射双网络水凝胶体系作为细胞或分子载体，负载细胞、药物，以促进骨缺损的修复。
较佳地，所述细胞至少包含骨髓间充质干细胞。
本发明的有益效果：
(1)结合海藻酸钠水凝胶、丝蛋白水凝胶自身的优势，引入具有特殊形貌结构及成分的介孔生物玻璃，形成一种可注射双网络水凝胶体系。海藻酸钠(SA)具有良好的生物相容性，能够在Ca2+的存在下发生交联形成水凝胶，丝蛋白(SF)具有可注射性和良好的生物相容性，介孔生物玻璃(MBG)具有功能可调节性，可作为致孔剂和交联剂。形成的丝蛋白/介孔生物玻璃/海藻酸钠可注射双网络水凝胶体系具有良好的生物相容性，可促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)碱性磷酸酶的表达和矿化结节的形成，从而促进BMSCs的增殖及成骨方向分化，具有较好的骨再生效果。
(2)在溶液中，介孔生物玻璃SiO2-CaO-P2O5可以释放Ca2+、Si2+等离子，一是可以通过控制介孔生物玻璃对Ca2+的释放来调控海藻酸钠分子的交联，实现海藻酸钠水凝胶的可控制备；二是通过Ca2+、Si2+的释放提高水凝胶体系的成骨/成血管诱导能力；三是Ca2+通过诱导丝蛋白分子自身的β折叠，加速丝蛋白向水凝胶的转化。
(3)由于介孔生物玻璃降解时的局部微环境呈碱性，通过引入天然弱酸性分子维生素C，一方面可以促进介孔生物玻璃的降解和控制介孔生物玻璃释放Ca2+，另一方面可以调节微环境的pH值。
(4)制备方法简单、得到的可注射双网络水凝胶体系具有易操作、创伤小、可减少患者手术痛苦的优势，尤其对于腔隙性骨缺损修复来说，提供了一种微创、高效的治疗材料，可原位成胶，具有成骨成血管活性，在骨缺损修复中具有较高的应用价值。
附图说明
图1为可注射双网络水凝胶体系制备流程图。
图2为制备得到的介孔生物玻璃的透射电镜图。
图3为可注射双网络水凝胶的扫描电镜图。
图4为不同质量浓度的维生素C对成胶时间的影响对比图。
图5为骨髓间充质干细胞的培养流程图。
图6为可注射双网络水凝胶负载骨髓间充质干细胞后的CCK-8检测结果图。
图7为可注射双网络水凝胶对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶表达的检测结果图。
图8为使用茜素红染色法观察可注射双网络水凝胶对骨髓间充质干细胞体外矿化结节表达的检测结果图。
图9为本发明构建的兔上颌窦提升模型的示意图。
图10为分别将可注射双网络水凝胶体系和负载有骨髓间充质干细胞的可注射双网络水凝胶体系注射兔体内后，对于体内成骨修复的结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和仪器为本领域常规试剂、方法和仪器。
本发明的水凝胶体系中，丝蛋白水凝胶具有网络结构，海藻酸钠水凝胶也具有网络结构，在介孔生物玻璃的作用下，两种网络结构发生交织，形成所述的双网络水凝胶体系。如图1所示，介孔生物玻璃穿插在丝蛋白分子和海藻酸钠分子之间，丝蛋白分子链与海藻酸钠分子链相互缠绕，同时由于介孔生物玻璃释放的钙离子作用，丝蛋白分子链自身会发生β折叠，而海藻酸钠分子链之间形成钙离子螯合的结构。
(一)可注射双网络水凝胶体系的制备
1.实验材料
蚕茧、海藻酸钠、介孔生物玻璃、维生素C、氯化钙、乙醇、原硅酸四乙酯、P123、磷酸三乙酯、HCl、Ca(NO3)2·4H2O、水。
2.实验方法
本发明的制备流程如图1所示，包含：
S1，丝蛋白水溶液的制备：
(1)将蚕茧置于质量浓度为0.5～1wt％的Na2CO3溶液中，100℃水浴下脱胶30min，重复三次；
(2)所述蚕茧脱胶后留下蚕丝，60℃下进行干燥6h；
(3)按照摩尔比，将氯化钙、水、乙醇按照1:8:2的比例配制成三元溶液，取干燥后的蚕丝称重，按照质量比1:25将所述蚕丝加入到加热至100℃的三元溶液中，搅拌至蚕丝完全溶解，室温下离心去除不溶的杂质；
(4)离心后将上清装入3500分子量的透析袋中去离子水中进行透析2d后得到溶液；
(5)将步骤(4)得到的溶液冻干干燥，得到冻干丝素蛋白；
(6)将所述冻干丝素蛋白配制成质量浓度为3％～6％的丝蛋白水溶液；
S2，海藻酸钠水溶液的制备：
将海藻酸钠配制成质量浓度为1％～2％的海藻酸钠水溶液；
S3，介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液的制备：
介孔生物玻璃的制备：原硅酸四乙酯(6.7g)、P123(4.0g)、磷酸三乙酯(0.36g)、0.5M HCl(1.0g)和Ca(NO3)2·4H2O(1.4g)加入到60mL的乙醇中；在25℃下，搅拌24小时得到溶胶；所得溶胶在真空下干燥24小时得到干燥后的材料；将所得材料以1℃/min的加热速率在600℃的空气中煅烧6小时得到介孔生物玻璃粉末。
按照质量浓度为1％～2％，将介孔生物玻璃粉末加入所述丝蛋白水溶液中，搅拌至混合均匀，得到介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液；
S4，维生素C/海藻酸钠混合溶液的制备：
按照质量浓度为0.5％～2.5％，将维生素C粉末加入到所述海藻酸钠水溶液中，搅拌至混合均匀，得到维生素C/海藻酸钠混合溶液；
S5，可注射双网络水凝胶体系的制备：
按照质量比1:1～4:1，将所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液和维生素C/海藻酸钠混合溶液混匀，得到所述可注射双网络水凝胶体系。
3.实验结果
如图2所示为制备得到的介孔生物玻璃的透射电镜图，透镜电镜图观察可见，介孔生物玻璃具有均匀一致的介孔结构。图3为制备得到的可注射双网络水凝胶体系的扫描电镜图，制备所得的可注射双网络水凝胶体系冻干后具有内部联通的孔隙结构，孔径在100μm-300μm，有利于细胞的长入及营养的交换。如图4所示，介孔生物玻璃在溶液中质量浓度较高的情况下，维生素C的质量浓度越高，所述可注射双网络水凝胶体系成胶的所需的时间越短，说明维生素C对于加速成胶起到了辅助的作用。
实施例1
S1，丝蛋白水溶液的制备：
(1)将蚕茧置于质量浓度为0.5wt％的Na2CO3溶液中，100℃水浴下脱胶30min，重复三次；
(2)所述蚕茧脱胶后留下蚕丝，60℃下进行干燥6h；
(3)按照摩尔比，将氯化钙、水、乙醇按照1:8:2的比例配制成三元溶液，取干燥后的蚕丝称重，按照质量比1:25将所述蚕丝加入到加热至100℃的三元溶液中，搅拌至蚕丝完全溶解，室温下离心去除不溶的杂质；
(4)离心后将上清装入3500分子量的透析袋中进行透析2d后得到溶液；
(5)将步骤(4)得到的溶液冻干干燥，得到冻干丝素蛋白；
(6)将所述冻干丝素蛋白配制成质量浓度为6％的丝蛋白水溶液；
S2，海藻酸钠水溶液的制备：
将海藻酸钠配制成质量浓度为1％的海藻酸钠水溶液；
S3，介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液的制备：
介孔生物玻璃的制备：原硅酸四乙酯(6.7g)、P123(4.0g)、磷酸三乙酯(0.36g)、0.5M HCl(1.0g)和Ca(NO3)2·4H2O(1.4g)加入到60mL的乙醇中；在25℃下，搅拌24小时得到溶胶；所得溶胶在真空下干燥24小时得到干燥后的材料；将所得材料以1℃/min的加热速率在600℃的空气中煅烧6小时得到介孔生物玻璃粉末。
按照质量浓度为2％，将介孔生物玻璃粉末加入所述丝蛋白水溶液中，搅拌至混合均匀，得到介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液；
S4，维生素C/海藻酸钠混合溶液的制备：
按照质量浓度为1％，将维生素C粉末加入到所述海藻酸钠水溶液中，搅拌至混合均匀，得到维生素C/海藻酸钠混合溶液；
S5，可注射双网络水凝胶体系的制备：
按照质量比1:1，将所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液和维生素C/海藻酸钠混合溶液混匀，得到所述可注射双网络水凝胶体系，用于后续实验。
实施例2
S1，丝蛋白水溶液的制备：
(1)将蚕茧置于质量浓度为1wt％的Na2CO3溶液中，100℃水浴下脱胶30min，重复三次；
(2)所述蚕茧脱胶后留下蚕丝，60℃下进行干燥6h；
(3)按照摩尔比，将氯化钙、水、乙醇按照1:8:2的比例配制成三元溶液，取干燥后的蚕丝称重，按照质量比1:25将所述蚕丝加入到加热至100℃的三元溶液中，搅拌至蚕丝完全溶解，室温下离心去除不溶的杂质；
(4)离心后将上清装入3500分子量的透析袋中进行透析2d后得到溶液；
(5)将步骤(4)得到的溶液冻干干燥，得到冻干丝素蛋白；
(6)将所述冻干丝素蛋白配制成质量浓度为3％的丝蛋白水溶液；
S2，海藻酸钠水溶液的制备：
将海藻酸钠配制成质量浓度为2％的海藻酸钠水溶液；
S3，介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液的制备：
介孔生物玻璃的制备：原硅酸四乙酯(6.7g)、P123(4.0g)、磷酸三乙酯(0.36g)、0.5M HCl(1.0g)和Ca(NO3)2·4H2O(1.4g)加入到60mL的乙醇中；在25℃下，搅拌24小时得到溶胶；所得溶胶在真空下干燥24小时得到干燥后的材料；将所得材料以1℃/min的加热速率在600℃的空气中煅烧6小时得到介孔生物玻璃粉末。
按照质量浓度为1％，将介孔生物玻璃粉末加入所述丝蛋白水溶液中，搅拌至混合均匀，得到介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液；
S4，维生素C/海藻酸钠混合溶液的制备：
按照质量浓度为2％，将维生素C粉末加入到所述海藻酸钠水溶液中，搅拌至混合均匀，得到维生素C/海藻酸钠混合溶液；
S5，可注射双网络水凝胶体系的制备：
按照质量比2:1，将所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液和维生素C/海藻酸钠混合溶液混匀，得到所述可注射双网络水凝胶体系，用于后续实验。
(二)骨髓间充质干细胞的培养
1.实验材料
兔、肝素、PBS溶液、DMEM完全培养液、胰蛋白酶。
2.实验方法
如图5所示的细胞培养流程图，S1：兔髂骨区域备皮、消毒、铺巾，使用骨髓穿刺针抽取5mL左右骨髓，置于含有肝素的50mL离心管中，加入15mL的PBS溶液；
S2：室温下进行离心1500rpm离心15分钟；
S3：小心吸弃上方血清层，保留薄薄的单核细胞层以及下方的红细胞；使用20mL的DMEM完全培养液重悬沉淀物，将重悬后的细胞悬液接种于培养瓶或培养皿中；
S4：在细胞培养箱(37℃、5％CO2、100％饱和湿度环境)中静置培养5天后，首次换液，以后隔天换液；
S5：大约10天后骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)生长至90％左右汇合，吸弃培养液，使用PBS清洗两遍，使用0.25％的胰蛋白酶消化，以1.0×105/mL的细胞密度进行传代，利用第二代至第四代的细胞用于后续实验。
(二)生物相容性的检测
1.实验材料
骨髓间充质干细胞、丝蛋白水凝胶、可注射双网络水凝胶体系、Cell CountingKit-8(CCK-8试剂盒)。
2.实验方法
S1：将BMSCs负载在可注射双网络水凝胶体系中，对BMSCs进行消化计数后，与可注射双网络水凝胶体系溶液混合后，放入96孔板中，待凝胶完全后，加入DMEM完全培养液，置于37℃，5％的CO2培养箱中进行培养(每孔5000个细胞)。以丝蛋白水凝胶负载BMSCs组作为对照组，以直接培养在无凝胶的培养板上的BMSCs组作为空白对照组，每孔5000个细胞；
S2：每三天更换一次培养基；
S3：培养至1d、3d、7d后，移除培养小室，加入含CCK-8工作液的培养基，在37℃下孵育2h后，在490nm处测定其溶液吸光度；
所有实验分为三个组：可注射双网络水凝胶体系组(SF/MBG/SA，SMS)、丝蛋白水凝胶组(SF)、空白对照组(CON)，所有实验组均设置三个平行，以平均值±标准偏差的形式表达(mean±SD)。
3.实验结果
如图6所示，三组分别负载BMSCs进行CCK-8检测实验，在细胞培养至第1天、第3天、第7天，空白对照组CON和丝蛋白水凝胶组SF的细胞增殖相似，但是可注射双网络水凝胶体系组SMS的细胞增殖具有显著性差异，说明BMSCs负载在可注射双网络水凝胶体系中，细胞的增殖作用相较于其他组更加明显，本申请的可注射双网络水凝胶体系具有较佳的生物相容性。
(三)可注射双网络水凝胶在体外对BMSCs分化的影响实验
A.碱性磷酸酶染色
1.实验材料
骨髓间充质干细胞、丝蛋白水凝胶、可注射双网络水凝胶体系、PBS溶液、4％多聚甲醛、BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒。
2.实验方法
S1：首先，在24孔板中接种第二代的BMSCs，接种密度为1×105/孔，预培养24h。在细胞培养小室(孔径0.4μm)中制备200μL可注射双网络水凝胶和丝蛋白水凝胶，利用transwell系统将生物材料与细胞一起共培养。每3天换一次液，共培养3天后，对BMSCs细胞碱性磷酸酶的表达情况进行检测；
S2：吸弃孔板内原有的培养液，每孔加入1mL PBS溶液润洗，5min/次，进行3次；使用4％多聚甲醛于室温下固定细胞30min；
S3：每孔加入200μL配制好的BCIP/NBT碱性磷酸酶染色工作液，37℃恒温箱中避光孵育30min；
S4：吸弃孔板中的BCIP/NBT碱性磷酸酶染色工作液。向孔板各孔加入200μL蒸馏水终止反应。在体式显微镜下观察各组碱性磷酸酶表达情况。
实验分为三个组：可注射双网络水凝胶体系组(SF/MBG/SA，SMS)、丝蛋白水凝胶组(SF)、空白对照组(CON)，所有实验组均设置三个平行，以平均值±标准偏差的形式表达(mean±SD)。
3.实验结果
碱性磷酸酶的表达活性是成骨分化、成熟的一个非常明显的特征。如图7所示，可注射双网络水凝胶体系组的碱性磷酸酶表达活性明显较空白对照组、丝蛋白水凝胶组增高，说明可注射双网络水凝胶可以明显促进成骨分化。
B.茜素红染色
骨代谢是破骨细胞骨吸收与成骨细胞骨形成的动态平衡过程。成骨细胞负责骨基质的合成、分泌、矿化，是骨重建激活或终止的控制者，它在骨组织的创伤修复、骨组织的生产发育、骨量平衡中起着重要作用。成骨细胞分化是其主导骨形成的前提与基础。在成骨分化过程中，其基本的生物学特征是骨基质合成、分泌、矿化及成熟，而矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志，同时也是成骨细胞行使成骨功能的主要形态学表现，观察成骨细胞的矿化结节是研究成骨细胞分化的常用手段之一。
使用茜素红染液对成骨细胞染色，茜素红可与钙离子螯合，产生深红色的复合物，可用于鉴定干细胞是否已成功向成骨细胞分化。
1.实验材料
骨髓间充质干细胞、丝蛋白水凝胶、可注射双网络水凝胶体系、PBS溶液、4％多聚甲醛、茜素红染液(Alizarin Red，ARS，pH＝4.2)。
2.实验方法
S1：在24孔板中接种第二代的BMSCs，接种密度为1×105/孔，预培养24h。在细胞培养小室(孔径0.4μm)中制备200μL复合水凝胶和丝蛋白水凝胶，利用transwell系统将材料与细胞一起共培养。每3天换一次液，共培养14天；
S2：吸弃培养液后，细胞于4％多聚甲醛中室温下固定30分钟；
S3：用1％的茜素红染液进行染色；
S4：最后用超纯水清洗细胞，洗去表面未结合的染液，在倒置显微镜下观察并拍照记录；
实验分为三个组：可注射双网络水凝胶体系组(SF/MBG/SA，SMS)、丝蛋白水凝胶组(SF)、空白对照组(CON)，所有实验组均设置三个平行，以平均值±标准偏差的形式表达(mean±SD)。
3.实验结果
如图8所示，可注射双网络水凝胶体系组的茜素红染色明显较空白对照组、丝蛋白水凝胶组深，说明可注射双网络凝胶体系可以明显促进干细胞向成骨细胞的分化。
(四)可注射双网络水凝胶对体内上颌窦提升的成骨实验
1.实验材料
新西兰大白兔、可注射双网络水凝胶、注射器、手术刀。
2.实验方法
S1：新西兰大白兔全麻条件下，于鼻面部沿中线做长度为2.5cm的垂直切口，切开皮肤，并完全剥离骨膜，充分暴露鼻骨、及双侧鼻骨结合处；
S2：在鼻额缝前2cm、中线外0.5cm用磨头在双侧各制备一个直径为1cm的骨窗，操作时注意少量多次地磨骨以避免破坏上颌窦膜；
S3：暴露上颌窦膜，用钝头探针随着呼吸节律将上颌窦膜向后上方轻轻推开；
S4：分别将100μL可注射双网络水凝胶体系和负载有BMSCs的可注射双网络水凝胶体系用注射器填充于此空间，骨膜拉拢缝合，缝合切口；
S5：术后12周micro-CT观察体内成骨结果。
3.实验结果
图9所示为构建的兔上颌窦提升模型的示意图，如图10所示，图10的a表示可注射双网络水凝胶体系，图10的b表示负载有BMSCs的可注射双网络水凝胶体系在体内成骨修复的结果图。由图可见，当可注射双网络水凝胶体系负载有BMSCs后，体内成骨修复效果更佳，说明负载BMSCs后，进一步促进了成骨的修复。当然可以理解的是，所述可注射双网络水凝胶可作为细胞的载体，负载细胞，也可以作为分子载体，负载药物，以促进骨缺损的修复。
综上所述，本发明通过引入介孔生物玻璃释放钙离子、硅离子的优势，将其作为水凝胶的致孔剂及交联剂，并加入维生素C加速成胶，成功构建出可原位快速成胶的具有成骨成血管活性的可注射双网络水凝胶体系。该体系避免了常规充填材料的大面积创伤以及自体骨移植的二次手术创伤，具有较好的生物相容性。尤其对于腔隙性骨缺损来说，提供了一种微创、高效的生物治疗材料。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (9)
1.一种可注射双网络水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：
S1，丝蛋白水溶液的制备：
将冻干丝素蛋白配制成丝蛋白水溶液；
S2，海藻酸钠水溶液的制备：
将海藻酸钠配制成海藻酸钠水溶液；
S3，介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液的制备：
取介孔生物玻璃粉末加入所述丝蛋白水溶液中，搅拌至混合均匀，得到介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液；
S4，维生素C/海藻酸钠混合溶液的制备：
取维生素C粉末加入到所述海藻酸钠水溶液中，搅拌至混合均匀，得到维生素C/海藻酸钠混合溶液；
S5，可注射双网络水凝胶体系的制备：
将所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液和维生素C/海藻酸钠混合溶液混匀，得到所述可注射双网络水凝胶体系。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述丝蛋白水溶液的质量浓度为3％～6％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述海藻酸钠水溶液的质量浓度为1％～2％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，维生素C/海藻酸钠混合溶液中，所述维生素C的质量浓度为0.5％～2.5％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S5中，按照质量比，所述介孔生物玻璃/丝蛋白混合溶液：所述维生素C/海藻酸钠混合溶液＝1:1～4:1。
6.一种可注射双网络水凝胶体系，其特征在于，所述可注射双网络水凝胶体系由权利要求1～5中任意一项所述制备方法制备得到。
7.一种如权利要求6所述的可注射双网络水凝胶体系的应用，其特征在于，所述可注射双网络水凝胶体系在骨缺损的修复和再生中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述可注射双网络水凝胶体系作为细胞或分子载体，负载细胞、药物，以促进骨缺损的修复。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞至少包含骨髓间充质干细胞。
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|---|---|---|---|
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| KR20140055440A (ko) * | 2012-10-31 | 2014-05-09 | 한림대학교 산학협력단 | 실크 피브로인을 포함하는 화상치료용 하이드로겔조성물 |
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