CN113117149B - 一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仿骨羟基磷灰石‑胶原复合支架及其制备方法；所述复合支架包括羟基磷灰石和胶原分子，所述羟基磷灰石与胶原分子重量比例为1.7‑2.3；所述羟基磷灰石为超薄片状结构，长25‑50nm，宽10‑30nm，厚度2‑6nm，最大暴露晶面为(100)晶面；其XRD图谱2θ值30‑35°之间，表现为大包峰，其Ca/P摩尔比为1.5‑1.6。本发明复合支架的胶原具有三螺旋结构，具有生物活性；而且具有17.4‑19.3倍自身重量的吸水率，50‑300μm的孔径，空隙率高达98％‑98.7％，压缩模量也达到0.84‑0.9MPa。

Description

一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于骨组织工程材料和医疗器械领域中的应用，具体涉及一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架及其制备方法。
背景技术
由身体衰老、先天性畸形、外伤感染以及肿瘤切除等引起的骨缺损已经在全球范围内构成了巨大的临床负担。目前，在临床实践中常用的治疗骨缺损的治疗方式包括自体骨、异体骨移植以及骨组织工程材料植入。多年来，自体骨移植一直被认为骨缺损治疗的首选方法，具有优异的生物学优势和力学性能，但是自体骨来源有限，会给患者带来二次伤害，术后还存在炎症、感染等问题。异体骨移植，是从另一个人类捐献者或其他物种移植骨组织进行治疗，此方法供体骨材料来源较广，但是仍存在免疫反应、感染和病原体传播等固有的限制。正因为上述原因的限制，骨组织工程为骨缺损治疗提供了新的思路，已经成为再生医学领域当下研究的热点。在2015年,骨移植和替代品市场价值超过23亿美元,预计在2016和2024之间将达到36亿美元。
骨组织是一种天然的有机/无机复合材料，其是由有机成分(约占骨质量干重的35％)、无机矿物质(约占65％)组成。其中有机成分主要是胶原蛋白(Collagen，简称：COL)，增加了骨骼结构的刚性、韧性以及对细胞的吸附能力，可作为骨矿物沉积和生长的基质；无机矿物质主要是羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)，但其通常缺钙或者富含碳酸根，结晶性较差，并且最大暴露晶面为(100)面，在骨组织中以不规则超薄片状形式存在，尺寸大致是25-50nm长、15-30nm宽、2-5nm厚，嵌入胶原纤维内部或者整齐的排列在胶原纤维表面，无机材料的存在对骨骼结构进一步加固。
鉴于骨骼的成分，羟基磷灰石和胶原蛋白是理想的可用于人造骨替代物的材料，也是当前骨修复领域研究的热门材料。胶原蛋白具有很好的生物相容性,可在体内缓慢降解被吸收，而且其作为细胞外基质重要的组成部分，其天然的网格或纤维结构能为细胞提供良好的黏附位点，此外，COL可以为生物活性分子或药物提供优良的输送系统。HAP有着优秀的机械性能，其超薄片状晶体结构确保骨组织具有强而不脆，硬而柔韧的特性，且其还有良好的生物相容性、骨传导性和生物活性。刘翠莲等以原代骨髓基质干细胞(MSCs)为细胞模型，对比了细胞在纳米超薄片状HAP薄膜和另外两种棒状HAP膜表面上的增殖和分化，发现细胞在纳米超薄片状HAP膜上更好的增殖和成骨分化，其原因是纳米超薄片状HAP暴露(100)晶面可与纤粘连蛋白(FN)选择性吸附，从而提高了细胞在其表面上的贴壁、迁移、增殖和分化能力【Liu C,Zhai H,Zhang Z,et al.Cells Recognize and Prefer Bone-likeHydroxyapatite:Biochemical Understanding of Ultrathin Mineral Platelets inBone[J].ACS Applied Materials&Interfaces,2016:acsami.6b10374.】。
羟基磷灰石-胶原复合支架的制备方法大部分都是采用直接混合法、共沉淀法、模拟生理环境浸泡法和原位矿化法。中国专利公开号CN1526765A公开了“复合骨组织工程支架材料及其制备方法”，其采用直接混合法将胶原与羟基磷灰石进行混合，制备复合支架，该专利由于只是羟基磷灰石和胶原的机械性混合，只能从成分上进行仿生；中国专利公开号CN105597155A公开了“一锅法制备羟基磷灰石-天然高分子纳米复合物的方法”，其采用共沉淀法制备羟基磷灰石-天然高分子纳米复合材料，侧重于方法简单、反应条件温和、耗能小等优点，但是该工艺中主要采用的原料为小分子胶原，不具有三螺旋结构，其生物学性能也大幅度下降，而且该专利制备的羟基磷灰石-天然高分子纳米复合材料中羟基磷灰石为针状结构，其促进细胞增殖分化的能力弱于暴露(100)晶面的片状羟基磷灰石；中国专利公开号CN105358189A公开了“仿生胶原-羟基磷灰石复合材料”,其将纤维化胶原支架浸入饱和Ca2+/HxPO4 (3-x)的饱和水溶液中至少24h制备羟基磷灰石-胶原复合支架，该专利采取模拟生理环境浸泡法进行制备，该方法工艺耗时较长，工业化难度较大，而且有机物与无机物比例不可控；除此之外，只有少数专利采取原位矿化工艺制备复合支架，如中国专利公开号CN102000362A公开的“丝素蛋白/纳米羟基磷灰石多孔支架材料及其制备方法”，该专利主要注重于得到孔隙率较高，孔隙分散均匀且孔与孔之间相互贯通，并且力学性能改善显著的支架材料，其单纯的探究了羟基磷灰石对支架材料的力学性能改进，与本专利的侧重点不同。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。所述复合支架与天然骨组织在结构和成分上具有高度相似性，具有17.4-19.3倍自身重量的吸水率，50-300μm的孔径，空隙率高达98％-98.7％，压缩模量也达到0.84-0.9MPa，可满足口腔科、骨外科等骨修复应用的需求。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种上述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的制备方法。该方法采用原位矿化工艺，利用材料学的自组装原理，以胶原分子为模版，诱导钙/磷酸盐的原位矿化沉积，可做到与天然骨组织在结构和成分上高度相似；而且本专利以胶原海绵为原料，并且在反应过程中控制反应条件保留了其生物活性，使其具备完整的三螺旋结构。除此之外本专利采用超重力技术优化的原位矿化工艺，极大缩短了反应时间，具有可连续化生产的优点；除此之外仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架所含成分的比例也接近天然骨组织，而且具有合适的孔径与力学性能。
为解决上述第一个技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，包括羟基磷灰石和胶原分子，所述羟基磷灰石与胶原分子重量比例为1.7-2.3；所述羟基磷灰石为超薄片状结构，长25-50nm，宽10-30nm，厚度2-6nm，最大暴露晶面为(100)晶面；而且结晶性弱，其XRD图谱2θ值30-35°之间，表现为大包峰，其Ca/P摩尔比为1.5-1.6，接近天然骨组织，这些特征均与天然骨组织中羟基磷灰石十分相似。
在本发明的某些实施方式中，所述胶原分子采用圆二色光谱法分析具有三螺旋结构。
为解决上述第二个技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的制备方法，包括如下步骤：
1)将胶原海绵溶解于乙酸水溶液，加入四水合硝酸钙搅拌螯合，制备成胶原-钙离子溶液；再制备十二水合磷酸氢二钠溶液，控制Ca/P摩尔比＝5:2.8-5:3.2；
2)将胶原-钙离子溶液和十二水合磷酸氢二钠溶液在超重力旋转床中原位反应一定时间，得到前驱体；
3)将混合浆料水浴陈化，并同时加入氢氧化钠水溶液，保持溶液pH＝6-8；陈化结束后，进行洗涤离心、冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料；
4)将仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料溶解于均质剂中，转移至模具中，冷冻干燥得到未交联复合支架；
5)将1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺(简称：EDC)和羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)溶解于95v％的乙醇水溶液中，得到复合交联剂乙醇水溶液；然后将未交联复合支架浸泡于复合交联剂乙醇水溶液中交联4-8h，分离固体样品，反复去离子水冲洗后再将样品浸泡于甘氨酸溶液中2-4h，反复去离子水冲洗后冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。
在本发明的某些实施方式中，步骤1)中，所述胶原海绵和四水合硝酸钙的重量比为1：3.4-3.6。
在本发明的某些实施方式中，步骤1)中，乙酸水溶液的浓度为0.1-0.15mol/l。
在本发明的某些实施方式中，步骤1)中，所述胶原海绵的重量份和乙酸水溶液的体积份之比为1g：100-400ml。
在本发明的某些实施方式中，步骤1)中，所述十二水合磷酸氢二钠与四水合硝酸钙的重量比为0.88-0.93。
在本发明的某些实施方式中，步骤2)中，所述的超重力旋转床为外循环旋转床，超重力因子为285-472，反应温度为10-34℃，反应时间为1s-10min；优选地，反应温度为15-25℃，反应时间为0.5-1min。
在本发明的某些实施方式中，步骤3)中，所述陈化时间为1-6h，陈化温度为33-35℃；优选地，所述陈化时间为2-4h。
在本发明的某些实施方式中，步骤4)中，所述均质剂为水或者0.4-0.6mol/l的乙酸水溶液；均质浓度为20-60mg/ml；优选地，均质浓度为为30-40mg/ml。
在本发明的某些实施方式中，步骤4)中，所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料的重量份和均质剂的体积份之比为1g：16.7-50ml；优选地，为25-33.3ml。
在本发明的某些实施方式中，步骤5)中，所述复合交联剂乙醇水溶液中，1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺的浓度为48-52mmol/l，所述羟基琥珀酰亚胺的11-13mmol/l。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
通过本发明的制备方法制备得到的复合支架所含的羟基磷灰石与天然骨组织中羟基磷灰石十分相似，而且其所含的胶原具有三螺旋结构，具有生物活性；除此之外仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架所含成分的比例也接近天然骨组织，而且具有合适的孔径与力学性能。所述复合支架具有17.4-19.3倍自身重量的吸水率，50-300μm的孔径，空隙率高达98％-98.7％，压缩模量也达到0.84-0.9MPa。本发明条件温和，容易实现、能耗少，引入超重力设备做反应器进行生产，极大缩短了反应时间，具有可连续化生产的优点。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明
图1是实施例1获得的样品实物图和扫描电镜图；
图2是实施例1获得的4种均质浓度不同的仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的扫面电镜图，从左到右依次为30、40、50、60mg/ml均质浓度；
图3是实施例1和实施例2获得的样品的圆二色光谱图；
图4是实施例3和实施例4获得的样品的透射电镜图；
图5是实施例3和实施例4获得的样品的X射线衍射图谱；
图6是实施例3获得的样品的热重分析图；
图7是实施例3获得的样品的力学性能测试图；
图8是实施例5获得的样品的原子力显微镜表征图(a)和晶格分析图(b)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
作为本发明的一个方面，本发明一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，包括羟基磷灰石和胶原分子，所述羟基磷灰石与胶原分子重量比例为1.7-2.3；所述羟基磷灰石为超薄片状结构，长25-50nm，宽10-30nm，厚度2-6nm，最大暴露晶面为(100)晶面；而且结晶性弱，其XRD图谱2θ值30-35°之间，表现为大包峰，其Ca/P摩尔比为1.5-1.6，接近天然骨组织，这些特征均与天然骨组织中羟基磷灰石十分相似。
其中，所述胶原分子采用圆二色光谱法分析具有三螺旋结构。
作为本发明的又一个方面，本发明一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的制备方法，其包括将胶原-钙离子溶液和磷酸氢二钠溶液在超重力旋转床中原位反应得到前驱体，经过陈化、洗涤、冻干过程得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料，再经过均质、冻干、交联、再冻干得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。具体包括如下步骤：下述步骤中体积份与质量份对应的关系为ml与g；具体的，
本发明一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的制备方法，包括如下步骤：
1)将胶原海绵溶解于乙酸水溶液，加入四水合硝酸钙搅拌螯合，制备成胶原-钙离子溶液；再制备十二水合磷酸氢二钠溶液，控制Ca/P摩尔比＝5:2.8-5:3.2；
2)将胶原-钙离子溶液和十二水合磷酸氢二钠溶液在超重力旋转床中原位反应一定时间，得到前驱体；
3)将混合浆料水浴陈化，并同时加入氢氧化钠水溶液，保持溶液pH＝6-8；陈化结束后，进行洗涤离心、冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料；
4)将仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料溶解于均质剂中，转移至模具中，冷冻干燥得到未交联复合支架；
5)将1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺(简称：EDC)和羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)溶解于95v％的乙醇水溶液中，得到复合交联剂乙醇水溶液；然后将未交联复合支架浸泡于复合交联剂乙醇水溶液中交联4-8h，分离固体样品，反复去离子水冲洗后再将样品浸泡于甘氨酸溶液中2-4h，反复去离子水冲洗后冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。
本发明的具体合成机理主要分为三步：
(1)螯合阶段：胶原与Ca2+进行螯合；
(2)成核阶段：在胶原上生成二水合磷酸氢钙沉淀；
Figure BDA0002368086680000061
(3)生长阶段：长时间放置后，胶原上的CaHPO4·2H2O与剩余的Ca2+作用，可逐渐转化更稳定的羟基磷灰石，搅拌、保持溶液ph中性有利于反应发生。
6CaHPO4·2H2O+4Ca2+＝Ca10(OH)2(PO4)6↓(HAP)+10H2O+8H+。
根据本发明的某些实施例，步骤1)中，所述胶原海绵和四水合硝酸钙的质量比为1:(3.4-3.6)；所述胶原海绵和四水合硝酸钙的重量比为1：3.4-3.6。
根据本发明的某些实施例，步骤1)中，乙酸水溶液的浓度为0.1-0.15mol/l。
根据本发明的某些实施例，步骤1)中，所述胶原海绵的重量份和乙酸水溶液的体积份之比为：1g：100-400ml。
根据本发明的某些实施例，步骤1)中，所述十二水合磷酸氢二钠与四水合硝酸钙的重量比为0.88-0.93。
根据本发明的某些实施例，步骤2)中，所述的超重力旋转床为外循环旋转床，超重力因子为285-472，反应温度为10-34℃，反应时间为1s-10min；优选地，反应温度为15-25℃，反应时间为0.5-1min。
根据本发明的某些实施例，步骤3)中，所述陈化时间为1-6h，陈化温度为33-35℃；优选地，所述陈化时间为2-4h。
根据本发明的某些实施例，步骤4)中，所述均质剂为水或者0.4-0.6mol/l的乙酸水溶液。
根据本发明的某些实施例，步骤4)中，所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料的重量份和均质剂的体积份之比为：1g：16.7-50ml；优选地，为25-33.3ml。
根据本发明的某些实施例，步骤5)中，所述复合交联剂乙醇水溶液中，1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺的浓度为48-52mmol/l，所述羟基琥珀酰亚胺的11-13mmol/l。
实施例1
一种应用超重力技术制备仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的方法，包括如下步骤：
1)称取1g胶原海绵，在20℃恒温水浴溶于200ml，0.125mol/l的乙酸水溶液。待胶原海绵溶解后，加入3.5g的四水合硝酸钙固体，在转速为1000rpm的搅拌5min，使Ca2+与胶原螯合。称取3.185g十二水合磷酸氢二钠固体，常温溶解于50ml去离子水中；
2)将胶原-钙离子溶液和十二水合磷酸氢二钠溶液在超重力旋转床中混合反应一定时间，得到混合浆料。其中超重力旋转床为外循环旋转床，超重力因子为285，反应温度为34℃，反应时间为0.5min；
3)将混合浆料在300rpm、34℃恒温水浴下陈化，陈化6h。陈化的同时加入氢氧化钠水溶液，保持溶液pH＝7；陈化结束后，进行洗涤离心、冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料；
4)称取5份质量为1g的仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料，在300rpm常温水浴分别溶解于50、33.33、25、20、16.67ml的0.5mol/l乙酸水溶液中；待复合材料溶解后，转移至模具中，冷冻干燥，得到未交联复合支架；
5)配制200ml的含1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)的体积分数95％的乙醇水溶液，其中EDC浓度为50mmol/l，NHS浓度为12.5mmol/l，浸泡交联4h，反复冲洗至无乙醇味后，再将样品浸泡于含质量分数5％的甘氨酸水溶液中，浸泡2h，反复冲洗后冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。
图1是实施例1获得的样品实物图和扫描电镜图，其所示样品微观形貌呈蜂窝状多孔结构，实物无掉渣现象、不易碎、样品韧性很好。图2是实施例1获得的4种均质浓度不同的仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的扫面电镜图，从左到右依次为30、40、50、60mg/ml均质浓度。由于1g仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料溶解于50ml的0.5mol/l乙酸水溶液时，容易出现分层的现象，故舍弃。均质浓度为30、40mg/ml的样品微观结构呈蜂窝状多孔结构，孔间连通性较好，采用Nano Measure软件测量孔径大小，30mg/ml的样品孔径在50-300μm范围内，平均孔径为147μm；40mg/ml的样品孔径在30-160μm范围，平均孔径为96μm。图3(RPB 34℃线)是实施例1获得的样品的圆二色光谱图，其在220nm附近的正吸收峰和205nm附近的负吸收峰表明复合材料中的胶原具有三螺旋结构。
实施例2
将实施例1步骤二的反应温度改为10℃、20℃。
图3(RPB 10℃20℃线)是实施例2获得的样品的圆二色光谱图，其在220nm附近的正吸收峰和205nm附近的负吸收峰表明复合材料中的胶原具有三螺旋结构。
实施例3
一种应用超重力技术制备仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的方法，包括如下步骤：
1)称取1g胶原海绵，在20℃恒温水浴溶于200ml，0.125mol/l的乙酸水溶液。待胶原海绵溶解后，加入3.526g的四水合硝酸钙固体，在转速为1500rpm的搅拌10min，使Ca2+与胶原螯合；称取3.209g十二水合磷酸氢二钠固体，常温溶解于50ml去离子水中。
2)将胶原-钙离子溶液和十二水合磷酸氢二钠溶液在超重力旋转床中混合反应一定时间，得到混合浆料。其中超重力旋转床为外循环旋转床，超重力因子为373，反应温度为20℃，反应时间为1min；
3)将混合浆料在500rpm、34℃恒温水浴下陈化，陈化3h。陈化的同时加入氢氧化钠水溶液，保持溶液pH＝7；陈化结束后，进行洗涤离心、冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料；
4)称取1g的仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料，在500rpm常温水浴溶解于33.33ml的0.5mol/l乙酸水溶液中；待复合材料溶解后，转移至模具中，冷冻干燥，得到未交联复合支架；
5)配制200ml的含1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)的体积分数95％的乙醇水溶液，其中EDC浓度为50mmol/l，NHS浓度为12.5mmol/l，浸泡交联6h，反复冲洗至无乙醇味后，再将样品浸泡于含质量分数5％的甘氨酸水溶液中，浸泡2h，反复冲洗后冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。
图4(1min)是实施例3获得的样品的透射电镜图，采用Nano Measure软件测量了片状HAP的长宽尺寸，长约29nm，宽约20nm。图5(1min)是实施例3获得的样品的X射线衍射图谱，其与HAP标准卡片(PDF NO.09-0432)进行对比，表明样品为HAP，而且样品的结晶度很差，也与天然骨组织的XRD图谱相似，在2θ值30-35°之间表现为大包峰。图6是实施例3获得的样品的热重分析图，胶原原料和复合材料均在40-130℃、180-620℃两个温度范围内出现了明显的质量损失现象，第一段主要是水的蒸发，第二段是胶原的热降解过程，可以看出胶原原料在620℃时完全燃烧，此时对于复合材料而言，就只剩下HAP，故样品中HAP占65％、胶原占28％、水占7％，与天然骨组织的成分比例十分接近。图7是实施例3获得的样品的力学性能测试图，(a)是样品的应力-应变图，发现支架材料在压缩过程中存在三个阶段：线性弹性阶段、压力恒定阶段、材料致密化阶段(应力快速上升)。以线性弹性阶段的斜率为压缩模量，计算得到样品的压缩模量如图(b)，样品的压缩模量达到0.87MPa。
实施例4
将实施例3步骤二的反应时间改为1s、5min、10min。
图4(1s、5min、10min)是实施例4获得的样品的透射电镜图，其尺寸分别为1s(长约46nm，宽约26nm)、5min(长约38nm，宽约21nm)、10min(长约43nm，宽约30nm)对比可发现反应时间在0.5-1min时，所得的样品中HAP的尺寸较小。图5(1s、5min、10min)是实施例4获得的样品的X射线衍射图谱。
实施例5
一种应用超重力技术制备仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的方法，包括如下步骤：
1)称取1g胶原海绵，在20℃恒温水浴溶于200ml，0.125mol/l的乙酸水溶液。待胶原海绵溶解后，加入3.526g的四水合硝酸钙固体，在转速为1500rpm的搅拌10min，使Ca2+与胶原螯合。称取3.209g十二水合磷酸氢二钠固体，常温溶解于50ml去离子水中。
2)将胶原-钙离子溶液和十二水合磷酸氢二钠溶液在超重力旋转床中混合反应一定时间，得到混合浆料。其中超重力旋转床为外循环旋转床，超重力因子为472，反应温度为34℃，反应时间为1s；
3)将混合浆料在500rpm、34℃恒温水浴下陈化，陈化3h。陈化的同时加入氢氧化钠水溶液，保持溶液pH＝7；陈化结束后，进行洗涤离心、冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料；
4)称取1g的仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料，在500rpm常温水浴溶解于33.33ml的0.5mol/l乙酸水溶液中；待复合材料溶解后，转移至模具中，冷冻干燥，得到未交联复合支架；
5)配制200ml的含1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)的体积分数95％的乙醇水溶液，其中EDC浓度为50mmol/l，NHS浓度为12.5mmol/l，浸泡交联4h，反复冲洗至无乙醇味后，再将样品浸泡于含质量分数5％的甘氨酸水溶液中，浸泡2h，反复冲洗后冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。
图8(a)是实施例5获得的样品的原子力显微镜表征图，表明样品中HAP的厚度均在2～4nm之间，表现出超薄结构。图8(b)是实施例5获得的样品的晶格分析图，其表现为最大暴露晶面为(100)晶面。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (13)

1.一种仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，包括羟基磷灰石和胶原分子；其特征在于：所述羟基磷灰石与胶原分子重量比例为1.7-2.3；所述羟基磷灰石为超薄片状结构，长25-50nm，宽10-30nm，厚度2-6nm，最大暴露晶面为（100）晶面；其XRD图谱2θ值30-35°之间，表现为大包峰，其Ca/P摩尔比为1.5-1.6；
所述胶原分子采用圆二色光谱法分析具有三螺旋结构；
所述复合支架具有17.4-19 .3倍自身重量的吸水率，50-300μm的孔径，空隙率高达98％-98 .7％，压缩模量也达到0 .84-0 .9MPa；
所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架的制备方法，包括如下步骤：
1）将胶原海绵溶解于乙酸水溶液，加入四水合硝酸钙搅拌螯合，制备成胶原-钙离子溶液；再制备十二水合磷酸氢二钠溶液，控制Ca/P摩尔比=5:2.8-5:3.2；
2）将胶原-钙离子溶液和十二水合磷酸氢二钠溶液在超重力旋转床中原位反应一定时间，得到前驱体；
3）将混合浆料水浴陈化，并同时加入氢氧化钠水溶液，保持溶液pH=6-8；陈化结束后，进行洗涤离心、冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料；
4）将仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料溶解于均质剂中，转移至模具中，冷冻干燥得到未交联复合支架；
5）将1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺溶解于95v%的乙醇水溶液中，得到复合交联剂乙醇水溶液；然后将未交联复合支架浸泡于复合交联剂乙醇水溶液中交联4-8h，分离固体样品，反复去离子水冲洗后再将样品浸泡于甘氨酸溶液中2-4h，反复去离子水冲洗后冷冻干燥，得到仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架。
2.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤1）中，所述胶原海绵和四水合硝酸钙的质量比为1:3.4-3.6。
3.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤1）中，乙酸水溶液的浓度为0.1-0.15mol/L。
4.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤1）中，所述胶原海绵的重量份和乙酸水溶液的体积份之比为1g：100-400mL。
5.根据权利要求4所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤1）中，所述十二水合磷酸氢二钠与四水合硝酸钙的重量比为0.88-0.93。
6.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤2）中，所述的超重力旋转床为外循环旋转床，超重力因子为285-472，反应温度为10-34℃，反应时间为1s-10min。
7.根据权利要求6所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：所述反应温度为15-25℃，反应时间为0.5-1min。
8.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤3）中，所述陈化时间为1-6h，陈化温度为33-35℃。
9.根据权利要求8所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：所述陈化时间为2-4h。
10.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤4）中，所述均质剂为水或者0.4-0.6mol/L的乙酸水溶液。
11.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤4）中，所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料的重量份和均质剂的体积份之比为1g：16.7-50mL。
12.根据权利要求11所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合材料的重量份和均质剂的体积份之比为1g:25-33.3mL。
13.根据权利要求1所述仿骨羟基磷灰石-胶原复合支架，其特征在于：步骤5）中，所述复合交联剂乙醇水溶液中，1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺的浓度为48-52mmol/L，所述羟基琥珀酰亚胺的11-13mmol/L。
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