CN115414527A - 仿生类骨复合支架、制备方法及骨缺损快速修复的应用 - Google Patents

仿生类骨复合支架、制备方法及骨缺损快速修复的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种仿生类骨复合支架、制备方法及骨缺损快速修复的应用，属于生物技术及生物医用材料技术领域。制备方法是将尺寸约1nm磷酸钙寡聚体与0.5wt％的海藻酸钠溶液以1:1的体积比均匀混合得到A液；随后以海藻酸钠溶液和聚乙烯醇溶液的体积比为5:1～2:1的比例，向A液中加入3wt％聚乙烯醇溶液，均匀混合后得到B液；将B液倒入模具使其自然蒸发，并拉伸诱导内部磷酸钙有序化结晶。本发明的制备原料易得、成本低、操作简便、可宏量制备，所得支架具有适宜的力学性能，良好生物安全性及生物相容性，优异的促进骨髓间充质干细胞成骨向分化性能，同时体内实验表明2周内快速实现骨缺损处的修复。所得支架在生物医用材料领域具有巨大的应用前景。

Description

仿生类骨复合支架、制备方法及骨缺损快速修复的应用
技术领域
本发明属于生物技术及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种分级有序化的 仿生类骨复合支架、制备方法及骨缺损快速修复的应用。
背景技术
随着工业的不断发展和人民生活水平的不断提高，世界卫生组织数据调查显 示，全球约有17.1亿人患有肌肉和骨骼疾病。其中因创伤、肿瘤、感染等导致 的大面积骨缺损严重者限制其行动能力，极大降低了生活质量；伴随着人口增长 与老龄化，骨缺损的病人数量日益增加，实现骨缺损快速修复成为目前骨科医生 面临的巨大挑战。临床常用的治疗方法包括自体骨移植、异体骨移植及骨替代材 料。自体骨因无免疫排斥，是公认骨移植的“金标准”，但也存在骨源有限、需开 辟第二术区等不足。同时，现有临床上使用瑞士生产的Bio-Oss骨粉用于牙周骨 组织缺损处的填充，但因难成形、难血管化，常造成无菌性骨坏死，导致临床效 果不佳。此外，该类骨粉材料价格昂贵一盒约1000元/0.25g，临床应用受限。
磷酸钙是天然骨组织的主要无机成分，因其高生物活性、骨传导等性能，使 得基于磷酸钙基有机-无机复合材料的仿生制备成为目前骨组织工程领域研究的 热点。理想的骨再生材料应具备以下：易制备、低成本、多功能、快速完美复制 天然骨有序结构的复合材料。然而，现有技术中快速进行骨修复周期长，修复方 式单一，无法复制天然的骨结构等缺点，无法实现理想化的骨再生修复，究其主 要原因在于人工合成的磷酸钙尺寸约20nm以上，由此所制备的复合材料具有明 显的相分离，这极大的限制了材料的仿生结构及诱导仿生成骨的效能。
近年，中国发明专利申请号为CN201710486463.7公开了一种无机聚离子团 簇及其制备方法，将传统高分子聚合物制备的方法应用到无机材料的制备中，获 得约1nm的磷酸钙寡聚体(Calcium Phosphate Oligmers,CPOs)。已专利公开发表 实现牙釉质修复界面问题，实现高仿真牙釉质的复制(中国发明专利申请号CN201710486462.2)及骨质疏松症的高效治疗(中国发明专利申请号 201910068395.1)；近日中国发明专利申请号为201910412870.2公开了一种高 强度有机-无机均相复合材料及制备方法，利用小尺寸磷酸钙大幅提升有机-无机 复合材料的力学性能。基于以上，将CPOs作为有机-无机复合材料的无机结构 单元，有望实现分级有序化水凝胶的仿生构建，而分级有序化的支架可能更好模拟体内成骨环境，为解决骨缺损的修复效果与周期提供潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种仿生类骨复合支架、 制备方法及骨缺损快速修复的应用，所获得的复合支架具有优异的力学性能及骨 诱导性。通过本发明的制备方法能制备出分级有序化且高度仿生的支架材料，所 制备的有序化仿生类骨支架可以应用在组织工程和口腔修复领域中。
本发明所采用的具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种用于骨缺损快速修复的仿生类骨复合支架的制 备方法，具体如下：
将粒径为1nm的磷酸钙寡聚体与质量分数为0.5wt％的海藻酸钠溶液以1:1 的体积比均匀混合，得到第一混合液，第一混合液为均匀的乳液，在该过程中， 通过离子间形成第一层网络结构；随后以海藻酸钠溶液和聚乙烯醇溶液的体积比 为5:1～2:1的比例，向第一混合液中加入质量分数为3wt％的聚乙烯醇溶液，均 匀混合后得到第二混合液，在该过程中，通过氢键网络形成第二层网络结构；将 第二混合液加入模具中并自然蒸发获得透明薄膜，再将透明薄膜通过拉伸诱导使 磷酸钙有序化，得到具有仿生骨有序化结构的有机-无机复合支架。
作为优选，所述磷酸钙寡聚体得制备方法具体如下：
将110mL的三乙胺、11.76g的二水合氯化钙和800mL无水乙醇均匀混合 后得到溶液A，将111.79mL的三乙胺与4.18mL、质量浓度为85％的磷酸溶液、 800ml无水乙醇均匀混合后得到溶液B；随后将溶液B在搅拌条件下加入溶液A 中，在800rpm的搅拌速度下继续搅拌3h；在8000rpm的搅拌速度下离心分离 10min，利用无水乙醇清洗所得沉淀，得到粒径为1nm的磷酸钙寡聚体。
作为优选，所述海藻酸钠溶液和聚乙烯醇溶液的体积比为5:1。在该比例下 制备得到的复合支架的力学性能、生物安全性与成骨能力等方面具有最优效果。
作为优选，所述磷酸钙寡聚体和海藻酸钠溶液的混合反应时间为30min，且 期间应当保持剧烈搅拌。第一混合液和聚乙烯醇溶液的混合反应时间为3h，且 期间应当保持剧烈搅拌。
作为优选，所述自然蒸发过程中不断搅拌溶液使其保持均匀状态。
作为优选，所述模具为10×10cm皿。
作为优选，通过拉力100％以诱导磷酸钙有序化。
第二方面，本发明提供了一种利用第一方面任一所述制备方法得到仿生类骨 复合支架。通过上述方法制备得到的仿生类骨复合支架，无机物的含量高达65-40 wt％，有机物为35-60wt％，几乎与骨的有机无机组分相似。
第三方面，本发明提供了一种第二方面所述仿生类骨复合支架在制备能修复 硬组织的医用仿生材料中的应用。
作为优选，所述硬组织为颅骨或牙槽骨。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
1)本发明的制备方法，通过添加粒径1nm超小尺寸磷酸钙寡聚体到聚乙烯 醇与海藻酸钠溶液中，混合后自然蒸发诱导磷酸钙结晶，利用聚乙烯醇与海藻酸 钠之间的氢键，磷酸钙与海藻酸钠之间的离子键的双网络复合体系，提升材料的 力学性能。能有效抵抗口腔湿环境下材料的降解，给予稳定持久的空间维持能力， 有效促进细胞的增殖与黏附。同时，通过拉伸力诱导磷酸钙晶体有序化，仿生重 构出骨的多级有序结构；此外，在组成上也与天然骨相似(约65％的无机物， 35％有机物)，多维度提高材料的仿生度，可实现极限骨缺损快速修复。
2)本发明中所制备仿生类骨有机-无机复合支架(即仿生类骨复合支架)材 料的原料为聚乙烯醇、海藻酸钠与磷酸钙寡聚体，均具有良好的生物安全性、生 物相容性与骨诱导性。同时这些原料廉价易得、制备方法简单、成本低，进一步 保障了材料的宏量制备与材料的无毒副作用。
3)本发明所制备的高强度多级有序化仿生类骨有机-无机复合支架，具有优 异的机械性能、稳定性、生物安全性、仿生度，骨诱导性等多功能于一体。该复 合支架可用于牙槽骨、颅骨等硬组织缺损修复治疗，具有快速修复骨组织的优点 (2W)，并且能复制天然骨的有序化结构，实现真正意义上的骨修复，对提升 修复后骨的结构与强度具有重要意义，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所得仿生类骨复合支架的制备方法示意图及光学图像。
图2为实施例1所得仿生类骨复合支架的热重(a)、XRD(b)及红外全反射(c) 表征结果。
图3为实施例1所得仿生类骨复合支架冷冻干燥后扫描电子显微镜图(a)及 元素分析(b)。
图4为实施例1所得仿生类骨复合支架浸泡在PBS溶液中第0、3、7天的 光学图像(a)及仿生类骨复合支架的力学性能中应力应变曲线(b)、拉伸强度(c)和 断裂韧能(d)表征结果。
图5为实施例1所得仿生类骨复合支架生物安全性CCK8实验结果。
图6为实施例1所得仿生类骨复合支架诱导成骨的能力，体外培养大鼠骨髓 间充质干细胞(BMSCs)的ALP染色结果图。
图7为体内实验的时间轴图(a)、植入四种材料的光学图(b)、四种材料对大 鼠颅骨面缺损进行修复后的两周的CT图(c)和四周的CT图(d)；其中，四种 材料分别为聚乙烯醇/海藻酸钠组、聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石组和本发明用 于骨缺损修复的聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体仿生类骨复合支架、临床上公 认的自体骨。
图8为空白组(拔牙后未做处理)、本发明用于骨缺损修复的聚乙烯醇/海 藻酸钠/磷酸钙寡聚体仿生类骨复合支架与临床上Bio-OSS骨粉分别对比格犬牙 槽骨缺损进行修复后的CT截面图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个 实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
实施例1
如图1所示为本发明提供的仿生类骨复合支架制备方法示意图，该仿生类骨 复合支架能抵抗湿环境降解、内部结构有序化、可用于骨缺损快速修复，制备方 法具体如下：
称取11.76g二水合氯化钙溶解在800mL无水乙醇中，同时加入110mL三 乙胺，搅拌速度800rpm，时间30min，获得均匀A溶液，随后将4.18mL磷酸 分散于800mL无水乙醇溶液中111.79mL三乙胺搅拌，速度800rpm，时间30 min，获得均匀B溶液，缓慢的逐滴滴加B液至上述溶液A中，在800rpm的搅 拌速度下继续搅拌3h，最终得到磷酸钙寡聚体溶液。
将上述磷酸钙寡聚体溶液静置过夜，溶液分层，将上清液吸出，并取20mL 10mg/mL磷酸钙寡聚体溶液以8000rpm离心5min，并用无水乙醇洗三次，随 后将获得的乳白色类凝胶加入20mL海藻酸钠溶液(0.5wt％)剧烈搅拌1h， 形成海藻酸钠/磷酸钙寡聚体乳液；之后将4mL的聚乙烯醇溶液(3.0wt％)添 加至上述乳液中，再剧烈搅拌3h，获得的聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体混合 溶液加入到方形培养皿(10cm×10cm)中，25℃下自然干燥，获得复合材料，将 复合材料浸泡在水中，同时隔天更换双蒸水，以清除材料中残余的无机离子和三 乙胺毒性物质成品，取出后定向拉伸50％、75％和100％，以获得不同有序 度的仿生类骨有机-无机复合支架(即聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体)，以备 后续使用。
聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石组材料制备方法：称取一定质量分数为65-40wt％，粒径为60-80nm羟基磷灰石颗粒加入20ml海藻酸钠溶液(0.5wt％)剧 烈搅拌1h，形成海藻酸钠/羟基磷灰石乳液，之后将4mL的聚乙烯醇溶液(3.0 wt％)添加至上述乳液中，再剧烈搅拌3h，获得的聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰 石混合溶液，将溶液倒入到方形培养皿(10cm×10cm)中，25℃下自然干燥，获 得复合材料。
聚乙烯醇/海藻酸钠组材料制备方法：将4mL的聚乙烯醇溶液(3.0wt％) 添加至20mL海藻酸钠溶液(0.5wt％)剧烈搅拌3h，将获得的聚乙烯醇/海藻 酸钠混合溶液倒入到方形培养皿(10cm×10cm)中，25℃下自然干燥，获得复合 材料。
为了验证本实施例所得仿生类骨复合支架的性能和效果，进行了如下实验与 表征。
一、对仿生类骨复合支架进行理化性能表征。
如图2所示，优选体积比1:5:5聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体进行后续 的理化及力学表征。图2中，PAC指的是聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体，PAH 指的是聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石，PA指的是聚乙烯醇/海藻酸钠。通过热 重分析仪、全反射傅立叶变换红外光谱仪、X射线衍射对三组复合支架材料进行 理化性能表征，热重分析仪表明聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体含有65％的无 机物，与骨的无机物含量相似，而聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石组的无机物含 量仅47％；全反射傅立叶变换红外光谱测试结果表明，材料含有磷酸根典型的 弯曲振动(557cm-1)与伸缩振动峰(1027cm-1)，同时弯曲振动峰劈裂，证实 内部磷酸钙已相变，同时X射线衍射图也证实聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体 支架中HAP晶体(002)、(211)和(112)的晶面。
将聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体复合支架，置于-30℃的冰箱中冷冻1h， 利用断面脆性获取材料横截面，放入冷冻干燥机中48h取出，如图3所示，通 过扫描电镜观察到材料有序的多孔结构，并且Mapping与元素分析结果证实， 该复合支架含有钙、磷元素，并均匀分布于支架内部。
二、对仿生类骨复合支架进行拉伸性能测试
称取0.02g的不同有序度的三组材料分别放在培养皿中，加入2ml的PBS 缓冲液，同时为了防止霉菌生长，加入0.02mg NaN3，同时共培养3天和7天后， 如图4证实，聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体组相对其他两组材料(即聚乙烯 醇/海藻酸钠/羟基磷灰石组和聚乙烯醇/海藻酸钠组)能抵抗湿环境材料的降解， 并保持长期稳定的力学性能。通过万能试验机分别测定三组材料的拉伸强度分别 为：1.976±0.659MPa；2.196±0.257MPa；22.735±2.533MPa，力学性能断裂 能0.399±0.100MJ/cm3；0.491±0.114MJ/cm3；27.870±1.20MJ/cm3，再次证实 聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体组材料具有优异的拉伸性能，为后续材料缺损 处植入提供基础。
三、对仿生类骨复合支架进行生物安全性测试
将104个BMSC/孔接种在24孔板上，放置在37℃含有5％CO2的无菌培养 箱中培养24h，使得细胞贴壁。随后将不同组别的材料利用Co60照射灭菌后， 放入孔径为8μmtranswell板的上室，并用10％血清的α-MEM培养1、3、5 天后，加入50μl CCK-8溶液孵育1h，用酶标仪在450nm处测量OD值。所有 实验重复3次。如图5所示，聚乙烯醇/海藻酸钠组、聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷 灰石组、聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体组三组材料细胞存活率均高于100％， 证实该材料均具有良好的生物安全性，可用于后续体内骨组织修复。
四、对仿生类骨复合支架进行促成骨能力测试
将材料利用Co60照射灭菌后，用于培养大鼠BMSCs细胞，每隔一天更换 诱导矿化液，并于7、14天时进行ALP染色。如图6结果ALP染色图表明，聚 乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体组的碱性磷酸酶表达均明显高于聚乙烯醇/海藻 酸钠组、聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石组，证实该材料具有良好的促成骨能力。
五、对仿生类骨复合支架进行颅骨缺损体内对比实验效果验证
如图7所示，准备30只8周龄雄性SD大鼠分为三组即：聚乙烯醇/海藻酸 钠；聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石；聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体，每组5 只。两个时间点：2周，4周。首先建立极限骨缺损模型，利用3％0.15ml/100g 无巴比妥钠将大鼠麻醉后，手术刀片在大鼠颅骨皮肤形成约1cm的切口，切口 直达骨面。骨膜剥离器剥离骨膜与皮肤，使用慢机及取骨环转在大鼠矢状缝两侧 制造两个直径约5mm的圆孔，左侧作为空白对照，右侧放入材料，随后骨膜与 皮肤缝合观察材料的骨修复情况，如图7(c)所示，术后2周后，利用小动物 活体断层扫描仪器Micro-CT检测结果为，聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体缺 损处有更多的新生骨形成，骨体积与骨密度都较明显高于聚乙烯醇/海藻酸钠组 与聚乙烯醇/海藻酸钠/羟基磷灰石组。植入后4周，如图7(d)CT图显示，聚 乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体缺损边缘部分紧密融合，与周围的正常骨组织结 合为一体，而对照组修复效果较差。
六、对仿生类骨有机-无机复合支架进行牙槽骨缺损体内对比实验效果验证
选取1只健康雄性比格犬，体重10.1～15.0kg，用牙龈分离器分离牙龈，超 声骨刀将前磨牙分成近中、远中两部分，微创牙挺挺松后，牙钳拔出，共计需形 成9个拔牙窝位点，随机分为三组：(1)空白对照组(拔牙后不做处理)；(2) 聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体组；(3)Bio-oss骨粉组。将水凝胶材料或Bio-oss 骨粉置入拔牙创内，空白对照组拔牙后不做处理，采用可吸收缝线拉拢缝合拔牙 创，压迫止血。观察时间点为植入材料的4周。4周后取材，采用Micro-CT分 析观察术区牙槽骨骨吸收及新生骨组织形成情况。植入后4周，如图8的CT截 面图所示，聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体组，牙槽窝内有大量的新生骨生成，并且维持原有的牙槽骨高度；而Bio-oss骨粉与空白组内出现少量新生骨，且牙 槽骨的高度有一定下降，再次证实聚乙烯醇/海藻酸钠/磷酸钙寡聚体仿生类骨有 机-无机复合材料具有优异的快速修复缺损的性能。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发 明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还 可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术 方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种仿生类骨复合支架的制备方法，其特征在于，具体如下：
将粒径为1nm的磷酸钙寡聚体与质量分数为0.5wt％的海藻酸钠溶液以1:1的体积比均匀混合，得到第一混合液；随后以海藻酸钠溶液和聚乙烯醇溶液的体积比为5:1～2:1的比例，向第一混合液中加入质量分数为3wt％的聚乙烯醇溶液，均匀混合后得到第二混合液；将第二混合液加入模具中并自然蒸发，再通过拉伸诱导使磷酸钙寡聚体相变后的羟基磷灰石有序化，得到仿生类骨有机-无机复合支架。
2.根据权利要求1所述仿生类骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述磷酸钙寡聚体得制备方法具体如下：
将110mL的三乙胺、11.76g的二水合氯化钙和800mL的乙醇均匀混合后得到溶液A，将111.79mL的三乙胺与4.18mL、质量浓度为85％的磷酸溶液均匀混合后得到溶液B；随后将溶液B在搅拌条件下加入溶液A中，在800rpm的搅拌速度下继续搅拌3h；在8000rpm的搅拌速度下离心分离10min，利用乙醇清洗所得沉淀，得到粒径为1nm的磷酸钙寡聚体。
3.根据权利要求1所述仿生类骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液和聚乙烯醇溶液的体积比为10:3。
4.根据权利要求1所述仿生类骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述磷酸钙寡聚体和海藻酸钠溶液的混合反应时间为30min，第一混合液和聚乙烯醇溶液的混合反应时间为3h。
5.根据权利要求1所述仿生类骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述自然蒸发过程中不断搅拌溶液使其保持均匀状态。
6.根据权利要求1所述仿生类骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述模具为10×10cm皿。
7.根据权利要求1所述仿生类骨有机-无机复合支架的制备方法，其特征在于，通过拉力100％以诱导磷酸钙结晶有序化。
8.一种利用权利要求1～7任一所述制备方法得到的仿生类骨复合支架。
9.一种权利要求8所述仿生类骨复合支架在制备能修复硬组织的医用仿生材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的仿生类骨复合支架在制备能修复硬组织的医用仿生材料中的应用，其特征在于，所述硬组织为颅骨或牙槽骨。
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