KR102258806B1

KR102258806B1 - 재생의학 재료 및 그의 제조방법과 응용

Info

Publication number: KR102258806B1
Application number: KR1020197008434A
Authority: KR
Inventors: 팡 후
Original assignee: 팡 후
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2021-06-01
Also published as: US20190262505A1; JP2019506985A; EP3505195B1; EP3505195A4; EP3505195A1; KR20190067775A; CN106362214A; US10828397B2; WO2018035773A1

Abstract

본 발명은 연/경조직의 수복을 촉진시키는 재생의학 재료 및 그의 제조방법과 응용에 관한 것으로서, 재생의학 재료는 3차원 네트워크 구조를 가지며 제1 혼합물와 제2 혼합물 성분으로 구성되는 복합 재료이고, 여기에서 제1 혼합물와 제2 혼합물의 질량비는 2:1 내지 4:1이다. 제1 혼합물의 총 질량을 기준으로 제1 혼합물 중에는 12 내지 38%의 SiO₂, 3 내지 5%의 Na₂O, 15 내지 29%의 CaO, 10 내지 32.5%의 P₂O₅, 1 내지 5%의 육인산이노시톨(inositol hexaphosphate), 1 내지 5%의 이노시톨헥사인산(inositol hexaphosphoric acid)이 포함되며 나머지는 불순물이고 불순물의 함량은 0.5%보다 낮다. 제2 혼합물의 총 질량을 기준으로 제2 혼합물 중에는 30 내지 60%의 카르복시메틸키토산(carboxymethyl chitosan), 30 내지 60% 히알론산나트륨(sodium hyaluronate)이 포함된다. 상기 재생의학 재료는 인체에 보다 적합한 성분 및 성질을 가지고 있어 세포 수복과 결합, 세포 증식, 모낭 생장 촉진 등 측면에서 핵심적인 역할을 한다.

Description

재생의학 재료 및 그의 제조방법과 응용

본 발명은 재생의학 분야에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 재생의학 재료 및 그의 제조방법과 응용에 관한 것이다.

생체활성 유리 및 유리 세라믹의 가장 현저한 특징은 인체 이식 후 표면 상황이 시간이 지날수록 동적 변화가 나타나며 표면에 생체활성의 하이드록실 카보네이트 아파타이트(hydroxyl carbonate apatite, HCA)층이 형성되어 조직에 결합 계면을 제공한다. 다수 생체활성 유리는 A류 생체활성 재료로서 골생성성(osteoproductive)은 물론 골전도성(osteoconductive)이 있으며 뼈 및 연조직과 우수한 결합성을 가지고 있어 생체활성 유리(BAG)는 재생 산업에서 우수한 생체 적합 물질로 간주되고 있다. 이러한 수복성 재료의 용도는 상당히 광범위할 뿐만 아니라 많은 부문의 전문성 있는 제품에 있어서 대체 불가능한 신비로운 효능을 가지고 있는데, 예를 들어 스킨 케어, 미백 및 주름 제거, 화상과 열상, 구강궤양, 위장궤양, 피부궤양, 진균 사멸, 골격 수복, 연조직와 골조직의 결합 등이 있으며, 상기 재료의 출현은 인류 건강에 상당히 기여할 것으로 기대된다. 또한 BAG는 표면 반응이 신속하게 일어나며 무정형 2차원 구조로 인해 강도 및 파괴인성이 낮고 탄성계수(30 내지 35MPa)가 낮으며 피질골(cortical bone)에 가깝고 생체활성 유리를 절삭할 수 있어 가공 성능이 우수하다.

그러나 이러한 생체활성 유리에 일부 치명적인 문제가 있다. 1. 분해속도가 느려 완전히 분해되는 데 1 내지 2년이 걸린다. 2. pH값이 불안정하며 그 pH값이 11에 도달하면 강한 염기성이 형성되어 일정한 세포독성을 나타낸다. 3. 상기 생체활성 유리는 채택하는 멜트 ?칭(melt quenching) 반응 온도가 1700 내지 1900℃로 아주 높기 때문에 에너지 소모가 크고 하나의 표준 생산라인을 건설하는 데 10억 위안 이상의 투자가 필요하다. 4. 상기 생체활성 유리는 다공성 물질을 형성할 수 없기 때문에 재료에 대한 고도의 부합 및 확장 기능을 달성하기 어렵다.

따라서 현재 시중에서는 상기 생체활성 유리를 대체할 수 있는 신규한 재생의학 재료에 대한 수요가 높다.
[종래 기술 문헌]
(비-특허 문헌) Phytic acid derived bioactive CaO-P₂O₅-SiO₂ gel-glasses, Ailing Li, et al., J Mater Sci: Mater Med, 2011, 22, 2685-2691
(특허 문헌) CN105169458A (공개일자: 2015년 12월 23일)

상기 기술문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 일측면에서 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료를 제안한다. 상기 재생의학 재료는 3차원 네트워크 구조이며 제1 혼합물과 제2 혼합물로 구성되는 복합 재료인데, 여기에서 상기 제1 혼합물과 상기 제2 혼합물의 질량비는 2:1 내지 4:1이다.

상기 제1 혼합물의 총 질량을 기준으로 상기 제1 혼합물에는 12 내지 38%의 SiO₂, 3 내지 5%의 Na₂O, 15 내지 29%의 CaO, 10 내지 32.5%의 P₂O₅, 1 내지 5%의 육인산이노시톨(inositol hexaphosphate), 1 내지 5%의 이노시톨헥사인산(inositol hexaphosphoric acid)이 포함되며 나머지는 불순물이고 불순물의 함량은 0.5%보다 낮다.

상기 제2 혼합물의 총 질량을 기준으로 상기 제2 혼합물에는 30 내지 60%의 카르복시메틸키토산(carboxymethyl chitosan)와 30 내지 60% 히알론산나트륨(sodium hyaluronate)이 포함된다.

바람직한 실시방안에 있어서, 상기 제1 혼합물과 상기 제2 혼합물의 질량비는 3:1이다. 또한 상기 제1 혼합물 중의 인에 대한 칼슘의 중량비는 1.5 내지 1.8이고, 바람직하게는 1.67이다.

바람직한 실시방안에 있어서, 상기 제1 혼합물은 졸-겔법(sol-gel method)을 통해 대두 껍질 추출액을 인 전구체로 삼아 300 내지 700℃ 항온에서 소결시켜 수득한다.

본 발명의 다른 일측면에 있어서, 세포 성장 매개체를 제안하며, 여기에는 상기 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료가 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포 생장 매개체는 의료 장치이며 특히 임플란트(implant)의 적어도 한 부분이다.

본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 연/경조직 수복을 촉진시키는 방법을 제안하며, 여기에는 본 발명 중 상기 재생의학 재료를 사용한다.

본 발명의 기타 측면에 있어서, 의학조성물, 의료장치, 구강케어제품, 성형외과용품 또는 화장품 제조용 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료를 제안한다.

본 발명의 재생의학 재료는 재료의 분해속도를 더욱 탁월하게 제어할 수 있기 때문에 생체활성 유리의 분해속도를 제어할 수 있으며, 인공뼈 재료 응용 분야에서는 신생뼈(neonatal bone) 임플란트 재료의 분해속도의 보조를 맞춰주기 때문에 신생뼈가 골 구조, 형태, 기능의 삼중 수복의 효과를 내지 못하는 단점을 극복할 수 있다. 뼈 수복, 척추와 골 손상, 구강골(oral bone) 이식 등 측면에 응용할 경우 본 발명의 재생의학 재료는 상당히 중요한 의미를 가진다.

본 발명에서는 대두 추출액에서 인을 도입해 재생의학 재료의 분해속도를 향상시킬 수 있으나, 종래의 제조방법으로 제조한 재료는 생체활성의 성분 범위가 비교적 작으며 통상적으로 인 함량을 줄여 분해속도를 제한하고 있다. 원래 종래의 방법으로 제조한 재료는 통상적으로 인산, 인산에틸(ethyl phosphate) 등을 사용하나 이는 칼슘 전구체(예를 들어 질산칼슘)와의 상용성이 비교적 떨어져 침전이 일어나며 분리되기 쉽다. 독성이 비교적 큰 에틸렌글리콜(ethylene glycol)을 선택해 전구체의 농도를 떨어뜨릴 경우, 이러한 용매 처리 과정에서는 대량의 에너지와 시간이 소요되어 표준화, 대량생산 등이 어려운 단점이 있다.

본 발명의 인 전구체는 질산칼슘과 같은 칼슘 전구체와 함께 효과적으로 용해시킬 수 있으며, 용매가 물, 에탄올 또는 그 혼합물이라 독성이 비교적 적고 용매 제거 온도가 비교적 낮으며 칼슘, 나트륨 등 전구체 변경을 통해 실온 환경에서 겔을 형성하고, 600℃ 내에서 생체활성 유리의 각 물리화학적 지표를 구현할 수 있다. 따라서 종래 방법의 단점을 극복해 표준화, 규모화 생산이 가능하다.

본 발명의 재생의학 재료에 있어서, 1 내지 10%의 실리콘 원자는 5 이상의 고배위수를 가지며 이러한 고배위 실리콘은 상압에서 형성된다. 고배위 실리콘은 재료의 구조와 성능에 대해 모두 일정한 영향을 미치는데, 예를 들어 고배위 실리콘은 자외선 흡수 피크를 전이시킬 수 있다.

용액 합성에 있어서, 현재 대다수 고배위 실리콘은 주로 N, F 또는 CI와 배위하며 O와 배위하는 경우는 극히 적다. 온도, 용매와 조사강도 등과 같은 외부 자극을 변경시킴으로써 실리콘 원자의 배위수를 바꿀 수 있는데, 승온은 5배위의 실리콘을 증가시킬 수 있고, 조사 환경에서는 5배위 실리콘과 6배위 실리콘 사이에 상호 전환이 일어날 수 있다. 다가 알코올을 도입하면 고배위 실리콘의 형성 확률을 높이는 데 유익한데, 다가 알코올은 O와 실리콘 원자의 배위를 촉진시킴으로써 고배위 실리콘을 형성한다. 고배위 실리콘은 일반적으로 유리 재료의 고온 처리 시 실리콘 배위수가 4에서 6으로 전환되는데, 주로 Si-O-P 또는 Si-O-Si의 형태로 존재하며 P의 함량이 증가할수록 6배위 실리콘이 증가하고, 열처리를 거치면 유리 재료에 결정이 생기며 중저온, 상압 환경에서 고배위 실리콘 원자를 함유한 실리콘의 고체 재료는 현재까지 공개된 바가 없다.

본 발명의 재생의학 재료는 생체활성 유리보다 물리화학적 지표 및 생물 지표가 우수하다. 상기 재료는 생산 시 600℃ 저온에서 에너지 절약이 가능하며 품질 제어가 가능한 상황에서 대규모로 생산할 수 있고 1700 내지 1900℃ 하소(calcination)에 의한 높은 에너지 소모, 낮은 제품 합격률 등 종래기술의 단점을 극복할 수 있다. 상기 재생의학 재료를 모체로 삼아 기타 의료용 물질을 첨가하면 생물요법 분야에 광범위하게 응용할 수 있다.

본 발명의 재생의학 재료에 있어서, 바람직하게는 인에 대한 칼슘의 비율이 인체 골격과 상대적으로 일치하는데 예를 들어 1.67가량이다. 형성하는 3차원 네트워크 구조 및 공경은 인체 골격 및 연조직 공경과 일치시킬 수 있다. 재료의 생체활성, 안정성 및 분해속도는 제어 가능하다. 상기 재료는 제조 온도가 낮아 단백질, 항생제, 화학치료약물과 같은 생체활성분자를 이식할 수 있으며 다공성의 특성을 갖고 있어 약물 담지 및 방출 제어에 사용할 수 있다. 또한 선택하는 인 전구체가 천연 물질이기 때문에 종래의 인 전구체보다 상대적으로 독성이 극히 적어 재료의 생체적합성을 향상시킬 수 있다. 재료는 유사체액(SBF) 내에서 표면에 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 신속하게 형성한다. 상기 재료는 종래에 사용하는 생체활성 유리의 가소성이 떨어지는 단점을 극복할 수 있다. 또한 조절 가능한 무정형의 재료를 형성하며 비결정질 구조이다. 기타 생체활성 유리는 기본적으로 결정질이나 본 발명의 재생의학 재료는 비결정질이며, 재료의 입자가 균일하고 재료의 생체적합성이 안정적이며 분산성이 비교적 우수하고 안정성이 강하다. 인공뼈 내에서 압축강도, 분해속도를 모두 제어할 수 있다.

본 발명의 재생의학 재료는 Si, Ca, Na, P 이온을 포함하며, 각 이온의 비율이 인체 골조직의 이온과 같다. 이러한 이온은 고온 하소의 SiO₂ 다공경 내에 균일하게 분포하기 때문에 자연스럽게 재료와 체액이 8단계의 표면 반응을 일으키도록 만든다.

단계 1: 재료 중의 Na⁺와 K⁺ 이온을 다공경의 SiO₂ 내에 균일하게 분포시키면(그 공경은 인체골격 공경과 거의 일치함) 체액과 만나 H⁺ 및 H₃O⁺ 이온과 신속하게 교환하는데, 예를 들어 이하와 같다.

Si-O-Na⁺+OH^-→ Si-OH⁺+Na⁺+ OH^-

여기에서 OH^-는 음의 전하이며 골조직 및 연조직 세포, 성장인자, 콜라겐 등 물질의 공경 내에 흡착되어 질서 있게 성장하여 인체구조 성장 메커니즘 블록을 형성한다. 재생세포 유전자를 발현시켜 질서 있게 성장시켜 골유도, 골전도 능력을 형성한다.

단계 2: Si-O-Si 사슬이 용액에 의해 끊어지며 계면 외에서 많은 Si-OH를 형성한다.

단계 3: Si-OH의 중합반응이 SiO₂의 다공성 사지(limbs)층을 형성할 수 있다. 이는 다른 종류의 단백질과 함께 수소 사슬과 이온 아민(amine) 사슬(-Si-O-H₃N⁺-)을 통해 고밀도의 단백질 흡착을 결합 형성하여 실리카졸(silica sol)층과 하이드록실 카보네이트 아파타이트층을 형성하고, 상기 하이드록실 카보네이트 아파타이트층은 표면적이 넓어 대량의 생체분자를 흡착하기에 적합하기 때문에 세포외 반응을 촉진시킬 수 있다. 비교적 낮은 음 전하를 가진 실리카졸층에 비해 신생골은 더 많은 생체분자를 흡착한다.

단계 4: 고배위 실리콘 원자 6, 실리콘 원자 4는 인체와 칼륨 이온을 교환하여 안정적인 3차원 네트워크 고체상 메커니즘을 형성하며 기존 실리콘 원자를 유리 상태로 바꾼다. 인체 화학성분과 자연 교환이 가능하며 점진 대체(creeping substitution)의 매개체를 형성하고 고배위 실리콘은 자외선 흡수 피크를 전이시켜 항산화 작용을 일으킬 수 있다.

Si-OH+OH-Si→ Si-O-Si-+H₂O

단계 5: Ca² ⁺와 PO₄ ^3-유래 재료 중 또는 유래와 용액 중, SiO₂가 풍부한 사지층 상에 CaO-P₂O₅ 무정형 상 층(phase layer)을 형성한다. P의 비율을 통해 신생세포와 기존 임플란트의 분해가 보조를 맞추도록 제어한다.

단계 6: OH-와 CO₃ ^2-를 용액에서 인출함에 따라 CaO-P₂O₅ 무정형 상 층이 탄소를 포함한 하이드록실 카보네이트 아파타이트(HCA) 다결정체로 전환되고 상처, 궤양 및 연조직 표면에 흡착하여 세포증식 작용을 촉진시킴으로써 상처를 치유하고 상처가 흔적 없이 수복되는 효과를 낸다.

단계 7: 세포증식이 질서 있게 진행되며 모낭이 형성되어 성장하도록 촉진시킴으로써 흉터를 줄이는 효과를 낸다.

단계 8: 궤양 표면, 특히 구강궤양, 자궁질부미란(cervical erosion)은 모두 혐기성 세균으로 인한 것이다. 본 발명의 재생의학 재료는 약염기 환경을 형성해 혐기성 세균을 탈수시켜 사멸시키는 동시에 혐기성 세균의 성장을 억제해 신생세포의 수복, 증식을 촉진시킬 수 있다.

상기 내용을 종합하면, 본 발명의 재생의학 재료는 인체의 각종 성질에 접합할 뿐만 아니라 인체에 더욱 일치하는 성분 및 함량 관계를 갖추고 있기 때문에 조직 수복에 보다 적합하다.

도 1은 본 발명 실시예에 있어서 재생의학 재료의 X선 형광 스펙트럼(XRF)의 원소 분포도(210x210㎛²)이며, 이는 본 발명의 상기 재료가 미소 규모 상의 화학성분(Ca, P와 Si) 분포가 균일하다는 것을 설명한다.
도 2는 본 발명 실시예에 있어서 재생의학 재료와 SBF 용액의 각기 다른 반응 시간의 XRD 스펙트로그램이다.
도 3은 본 발명 실시예에 있어서 재생의학 재료의 SEM-EDXS도이고, 여기에서 a는 침전 전, b는 SBF 침전 후를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명 실시예에 있어서 재생의학 재료 및 그 침출액과 조골세포 상호작용의 MTT값이고, 여기에서 (a)는 재생의학 재료를 1일, 6일 직접 배양한 것을 도시하였고, (b)는 Regesi 재생의학 재료를 다른 시간의 침출액에 24시간 배양한 것을 도시하였다.
도 5는 전조골세포(preosteoblast)(MC3T3)를 생체활성 유리편 상에서 배양한 시간별 SEM도이다.
도 6은 본 발명 실시예에 있어서 재생의학 재료편의 SBF 용액 중의 pH값 변화도이다.
도 7은 본 발명 실시예에 있어서 재생의학 재료의 수중의 중량 변화도이다.
도 8은 Regesi 재생의학 재료를 척추, 분절성 골결손 수복에 응용한 경우의 결과도이다.
도 9는 Regesi 재생의학 재료를 핵심으로 연구한 궤양용 수복 재료(겔)의 치료효과도이다.
도 10은 Regesi 재생의학 재료의 코팅하기 쉬운 실험도이며, 이는 본 발명의 재생의학 재료가 표피 온도에서 녹아 막을 형성할 수 있다는 것을 설명한다.
도 11은 재생의학 재료가 상처 치유에 미치는 영향의 실험도이며, 이는 본 발명의 재생의학 재료가 상처 치유의 속도와 품질을 향상시키고 모낭을 형성한다는 것을 설명한다.
도 12는 재생의학 재료를 복합 해면골로 사용해 다공성 지지체를 충전한 경우의 골결손 부위 재생도이며, 이는 해면골과 역학적 성능이 유사하여 본 발명의 재료가 결손 부위의 골 재생을 촉진시킨다는 것을 설명한다.
도 13은 본 발명의 재생의학 재료와 대조용 45S 재료의 뼈 생성 성능을 비교한 것이며, 이는 45S 분해속도가 과도하게 빨라 뼈를 함몰시킬 수 있고 경도가 너무 강하여 주변 골절을 야기할 수 있다는 것을 설명한다.
도 14는 45S 침출액의 Hacat 세포 증식에 대한 영향을 도시한 것이다.
도 15는 45S 분말의 분해실험을 도시한 것이다.

이하에서는, 본 발명의 예시적인 실시방식을 통해 보다 상세히 설명한다. 이하의 상세한 설명은 본 발명을 제한하지 않으며 본 발명의 특정 측면, 특성 및 실시방안에 대한 보다 상세한 설명으로 이해해야 한다.

본 발명에서 사용하는 전문용어는 특별한 실시방식을 설명하기 위한 것으로서 본 발명을 한정하지 않는다. 또한 본 발명 중의 수치 범위는 상기 범위의 상한과 하한 사이의 각 중간값을 더 구체적으로 공개한 것으로 이해해야 한다. 어느 진술 값 또는 진술 범위 내의 중간값 및 어느 기타 진술 값 또는 진술 범위 내의 중간값 사이의 각 비교적 작은 범위도 본 발명에 포함된다. 이러한 비교적 작은 범위의 상한과 하한은 독립적으로 범위 내에 포함되거나 배제될 수 있다.

별도의 설명이 없는 한 이하에서 사용하는 모든 기술과 과학 용어는 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해할 수 있는 것과 동일한 함의를 가진다. 비록 본 발명에서 바람직한 재료와 응용만을 설명하였으나 본 발명의 실시 또는 시험 중에서도 본 발명의 유사하거나 동일한 임의 재료를 사용할 수 있다. 본 발명의 설명에서 언급한 모든 문헌은 인용을 통해 편입하며 상기 문헌과 관련된 방법 및/또는 재료를 공개하고 설명하는 데에 사용하였다. 편입한 임의 문헌과 충돌할 경우 본 발명의 설명 내용을 기준으로 삼는다.

본 발명에 있어서, 이하에서 별도의 설명이 없는 한 명사 용어에는 단수와 복수 형식이 포함된다. 본 발명의 설명에서 “적어도 하나” 또는 “적어도 한 종류”라는 함은 “하나” 또는 “한 종류”의 상황을 포함할 뿐만 아니라 더 중요한 것은 “복수개” 또는 “복수개 종류”의 상황을 포함할 수도 있다는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “재생의학 재료”라 함은 연/경조직 수복 기능을 촉진시키는 3차원 네트워크 구조의 유기-무기 복합 재료를 말하며, 종종 Regesi 재생의학 재료를 칭하거나 또는 Regesi 등을 칭할 수도 있는데, 이러한 칭호는 본 발명에서 동일한 함의를 가진다. 바람직하게는, 재생의학 재료 중 상기 제1 혼합물과 상기 제2 혼합물의 질량비는 2:1 내지 4:1이다. 만약 상기 질량비가 2:1보다 작을 경우 수득한 재생의학 재료의 경도가 떨어지기 때문에 세포생장을 위한 좋은 매개체가 될 수 없다. 또 다른 측면에서 만약 상기 질량비가 4:1보다 크면 제1 혼합물 중 각 원소의 함량이 인체조직, 특히 경조직에서 예를 들어 골격 중 각 원소의 함량과의 격차가 비교적 커지기 때문에 조직, 특히 경조직의 수복에 유익하지 않다. 바람직하게는 제1 혼합물와 제2 혼합물의 질량비는 2.5:1 내지 3.8:1이며, 더욱 바람직하게는 2.6:1 내지 3.5:1이고, 나아가 더욱 바람직하게는 2.8:1 내지 3.4:1인데 예를 들어 3:1 등이 있다.

본 발명에 있어서, 제1 혼합물의 총 질량을 기준으로 제1 혼합물 중의 SiO₂ 함량은 12 내지 38%이고, 바람직하게는 15 내지 35%이고, 더욱 바람직하게는 16 내지 33%이고, 더 나아가 바람직하게는 18 내지 30%인데, 예를 들어 20%, 25%, 28%, 29% 등이다. 제1 혼합물 중의 Na₂O 함량은 3 내지 5%이고, 바람직하게는 3.5 내지 4.5%이고, 더욱 바람직하게는 3.6 내지 4.2%이고, 더 나아가 바람직하게는 4%이다. 제1 혼합물 중의 CaO 함량은 15 내지 29%이고, 바람직하게는 16 내지 27%이고, 더욱 바람직하게는 18 내지 25%이고, 더 나아가 바람직하게는 20 내지 22%이다. 제1 혼합물 중의 P₂O₅ 함량은 10 내지 32.5%이고, 바람직하게는 12 내지 30%이고, 더욱 바람직하게는 14 내지 28%이고, 더 나아가 바람직하게는 16 내지 26%이고, 더 나아가 더욱 바람직하게는 18 내지 24%, 20 내지 22%이다. 본 발명에 있어서, 육인산이노시톨의 함량은 1 내지 5%이고, 바람직하게는 2 내지 4%이고, 더욱 바람직하게는 3%이다. 본 발명 중 이노시톨헥사인산의 함량은 1 내지 5%이고, 바람직하게는 2 내지 4%이고, 더욱 바람직하게는 3%이다. 제1 혼합물 중 상기 각 성분의 함량이 너무 낮거나 너무 높으면 재생의학 재료 중 각 원소의 함량과 유기체, 예를 들어 인체 중 경조직인 골격의 원소 함량이 일치하지 않게 되어 조직 재생 또는 수복을 촉진시키는 데에 불리해진다.

본 발명의 있어서, 육인산이노시톨과 이노시톨헥사인산을 단독 성분으로 첨가할 수 있으며, 대두 추출액에 포함하거나 제조과정에서 혼합하여 첨가할 수도 있다.

본 발명의 있어서, 제1 혼합물 중 상기 각 성분을 제외하고는 모두 본 발명의 제조과정에서 생성되는 것을 피할 수 없는 불순물이며, 불순물의 함량은 통상적으로 0.5질량%보다 낮고, 바람직하게는 0.4질량%보다 낮고, 더욱 바람직하게는 0.2질량%보다 낮고, 특히 바람직하게는 0.1질량%보다 낮고, 가장 바람직하게는 0이다.

본 발명의 있어서, 제2 혼합물의 총 질량을 기준으로 제2 혼합물 중 카르복시메틸키토산의 함량은 30 내지 60%이고, 바람직하게는 40 내지 55%이고, 더욱 바람직하게는 45 내지 50%이고, 더 나아가 바람직하게는 48%이다. 제2 혼합물 중 히알론산나트륨의 함량은 30 내지 60%이고, 바람직하게는 40 내지 55%이고, 더욱 바람직하게는 45 내지 50%이고, 더 나아가 바람직하게는 48%이다.

본 발명의 있어서, 바람직하게는 상기 제1 혼합물 중의 인에 대한 칼슘의 중량비는 1.5 내지 1.8이고, 바람직하게는 1.67이고, 상기 범위 내의 인에 대한 칼슘의 비율은 유기체인 인체 내의 인에 대한 칼슘의 비율에 부합한다.

본 발명에 있어서, 재생의학 재료 중 성분의 함량 및 그 성분 간의 비율은 인체의 경조직 중 각 성분의 함량 및 비율에 따라 배합 제조하여 수득한 것이다. 각기 다른 인체, 성별 및 연령에 따라 경조직 중 각 원소의 함량은 다르다. 따라서 본 발명의 재생의학 재료 중 각 성분의 함량 및 비율도 달라질 수 있으나, 전체 상기 함량 및 비율은 상기에서 언급한 범위를 벗어날 수 없다.

예를 들어, 노인 그룹의 경우 바람직한 성분 함량 및 비율은 이하와 같다.

SiO₂ 36%

Na₂O 3%

CaO 25%

P₂O₅ 28%

육인산이노시톨 4%

이노시톨헥사인산 4%

제1 혼합물의 총 질량을 기준으로 한다.

카르복시메틸키토산 50%

히알론산나트륨 50%

제2 혼합물의 총 질량을 기준으로 한다.

노인 그룹의 경우, 바람직한 인에 대한 칼슘의 질량비는 1.67이다.

청년 그룹의 경우, 바람직한 성분 함량 및 비율을 적절하게 조정할 수 있다.

본 발명의 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료의 제조방법에 있어서, 특정한 식물 추출액을 선택하여 본 발명의 재생의학 재료의 상기 유익한 기술효과를 구현할 수 있는데, 예를 들어 7.4까지 낮은 pH값, P의 방출 제어가 있다. 본 발명의 상기 식물 추출액은 바람직하게는 대두 추출액이다. 일부 실시방안에 있어서, 대두 추출액의 제조방법에는 대두 껍질 분쇄 → 분쇄 재료 산 침출(acid leaching), 여과 → 침출액 염기 중화 → 칼슘염 침전 침출 → RH⁺ 수지 이온 교환 → 증발 농축 → 대두 추출액을 포함하고, 여기에서 대두 추출액 중 하이드록시아파타이트의 함량은 40 내지 60중량%가 필요하다.

구체적으로 본 발명의 대두 추출액의 제조단계는 이하와 같다.

분쇄한 후 선별한 약 20메쉬의 대두 껍질을 취하여 6배량의 물을 첨가한다. 7%의 염산을 이용해 pH를 1.5 내지 2까지 조절하고 실온에서 교반하여 침지시킨다. 추출 여과하여 1.2% 염산으로 세정하고 찌꺼기를 버린 후 여과액을 합친다. 침출액에 석회를 첨가해 pH값이 약 6.5가 될 때까지 중화시켜 칼슘염을 수득하며 침전시켜 1시간 동안 정지 상태에 두다가 추출 여과를 진행하고 여과액을 버린 뒤 다시 증류수로 세정하여 침전물을 2 내지 3회 수득하며 이를 정화시켜 칼슘염을 수득한다. 수득한 칼슘염에 소량의 묽은 염산을 첨가해 슬러리 형태로 만들며 잠시 후 2/3배량의 H형 강한 산성 양이온 교환 수지를 첨가한다. 30분간 약하게 교반하여 칼슘염을 녹여 가용성 염용액으로 전환한다. 조추출액을 추출 여과, 세정, 분리한다.

용융 전환하여 수득한 가용성 칼슘염 용액을 이온 교환 칼럼에 넣고 유속을 제어하며 이온 교환을 진행한다. 이때 용액 중의 Mg² ⁺, Ca² ⁺ 등 불순물 이온은 RH⁺ 수지 상에 교환되어 H⁺이온이 교환된다. 약 1% 양의 활성탄을 이용해 1 내지 2회 탈색시키고 분리한 후 다시 탈색액을 감압 증발 농축시키고 병 내용액이 걸쭉한 상태가 될 때까지 온도를 70 내지 80℃가량으로 제어하여 본 발명의 대두 추출액을 수득한다. 여기에서 하이드록시아파타이트의 함량은 40 내지 60중량%가 필요하다.

본 발명의 상기 식물 추출액에서 본 발명의 상기 특정 재생의학 재료를 생산할 수 있는 원인이 상당히 명확한 것은 아니나, 식물 추출액과 칼슘의 전구체(예를 들어 질산칼슘)의 상용성이 증가되어 침전이 발생하지 않기 때문인 것으로 추측할 수 있다. 또한 식물 추출액은 천연 성분이며 독성이 없다. 또 다른 원인으로는, 대두 추출액에 함유된 각종 기타 원소가 본 발명의 기타 원료와 상호작용을 일으켜 예측불가한 효과를 내는 것으로 볼 수 있다. 그 외 대두 추출액 중 각종 원소의 함량 성분이 인체 각 원소의 성분과 유사해 유기체 성분과 유사한 재생의학 재료를 용이하게 획득할 수 있다.

또한 식물 추출액에 재료에 3차원 구조를 부여할 수 있는 각종 성분이 있고 다양한 성분 사이에 상호작용이 일어나 저온에서 재생의학 재료를 제조하는 목적을 구현할 수 있다. 따라서 종래 방법의 단점을 극복해 표준화, 규모화 생산을 구현할 수 있다.

본 발명 중 실리콘 전구체, 칼슘 전구체는 본 발명이 속한 기술분야에서 통상적으로 사용하는 전구체를 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 제조방법에서 물 및/또는 에탄올을 반응매질로 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 물질을 배합 제조한 겔 전구체 졸 용액은 비교적 낮은 온도에서 소결시켜야 하는데, 예를 들어 300 내지 700℃ 항온에서 소결시킬 수 있고, 상기 온도는 더욱 바람직하게는 400 내지 600℃일 수 있는데 예를 들어 500℃ 등일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 “세포 성장 매개체”라 함은 세포에 적합한 골세포, 진피세포 성장, 증식의 기질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 재생의학 재료는 직접 그 자체를 매개체로 삼을 수 있다. 선택적으로 본 발명의 재생의학 재료와 본 발명이 속한 기술분야에서 통상적으로 사용하는 기타 재료를 조합/복합해 매개체로 삼을 수 있다.

실시예

Regesi 재생의학 재료의 제조방법

이하 성분의 함량에 따라, 상대적으로 대응하는 함량의 전구체를 배합하여 겔 전구체 용액을 제조한다(칼슘 니트레이트 테트라하이드레이트(calcium nitrate tetrahydrate)를 염화칼슘 또는 질산칼슘으로 전환하는 것은 결과에 영향을 미치지 않음).

SiO₂ 36%

Na₂O 3%

CaO 25%

P₂O₅ 28%

육인산이노시톨 4%

이노시톨헥사인산 4%

제1 혼합물의 총 질량을 기준으로 한다.

먼저, 본 발명의 대두 추출액 30ml을 취하여 50ml의 샘플병에 넣은 후 순서대로 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS), 에탄올과 물(체적비는 약 1:1이며, 상기 전구체를 용해시킬 수 있는 정도의 양을 첨가하면 됨)을 첨가하고 30분간 교반한다. 교반 과정에서 Ca(NO₃)_2·4H₂O(염화칼슘 또는 질산칼슘)를 첨가해 겔 전구체 졸 용액을 수득한다. 배합 제조한 겔 전구체 졸 용액은 겔이 될 때까지 실온에 거치하며(통상적으로 2 내지 10일이 걸리며 각 전구체 간의 비율에 따름), 겔을 60℃ 오븐에 넣고 하루 이상 숙성시킨 후 다시 120℃ 오븐에 넣고 1주일간 구워 포함된 용매를 완전히 휘발시키고 온도를 실온까지 강하시킨다. 공기 중의 튜브형 노(tube furnace)의 온도는 실온에서 5℃/min의 승온 속도로 300 내지 400℃까지 올리며, 건조한 겔은 300 내지 400℃ 하의 튜브형 노에서 항온으로 10분 이상 소결을 진행한 후 자연 냉각하여 Regesi 재생의학 재료 중의 제1 혼합물 분말을 수득한다.

비율에 따라 카르복시메틸키토산, 히알론산나트륨을 상기 분말 배합과 혼합하고 45℃까지 가열한다. 용해를 거쳐 균일하게 교반하여 혼합물을 수득한다. 100g의 의료용 글리세롤을 80℃까지 예열한 후 상기 혼합물을 의료용 글리세롤 내에 용해시키고 균일하게 교반한다(의료용 글리세롤과 생체 물질의 질량비는 55:45). 불순물을 제거하고 24시간 생성시키고 조사 및 멸균을 진행하여 본 발명의 Regesi 재생의학 재료를 수득한다.

Regesi 재생의학 재료의 성질 연구

1. 물리화학적 성질

X선 형광 스펙트럼(XRF)을 통해 재료의 화학성분에 대한 분석을 진행하였으며 그 결과 재료는 미소 규모 상의 화학성분(Ca, P와 Si) 분포가 균일하였다. 이는 도 1에서 도시하는 바와 같다.

Regesi 재생의학 재료를 유사체액(SBF)에 침전시켜 침적 실험을 진행하였으며 X선 회절(XRD)을 통한 연구에서 침적 7일째 되는 날 재료 표면에 하이드록시아파타이트(HA) 회절 피크가 현저하게 나타나는 것이 발견되었다(도 2에서 도시하는 바와 같음). 또한 시간에 따라 연장되는 HA의 회절 피크가 강화되었다는 것은 재료 표면에 더 많은 하이드록시아파타이트가 형성된다는 것을 설명해 준다. 침적 14일째 이후 HA의 회절 피크는 변화가 크지 않았는데 이는 형성되는 HA가 이미 재료 표면을 완전히 덮었다는 것을 설명해 준다.

주사전자현미경-에너지분선 x선 에너지 스펙트럼(SEM-EDXS)을 통해 재료의 표면 형상을 분석한 결과는 도 3에서 도시하는 바와 같다. 그 결과에 따르면 SBF 용액에 침적되기 전에 재료 표면은 편평하였으며 EDXS 에너지 스펙트럼 분석에서 그 주요 성분이 Si, P와 Ca라는 것이 증명되었다. SBF 용액에 침적시킨 지 14일 이후 재료 표면에 구형 입자가 나타났다. 구형 입자를 확대했을 때 상기 입자가 침상(needle-like)의 HA로 구성되었다는 것을 발견하였으며, EDXS 에너지 스펙트럼 분석에서 Si 함량이 감소하고 Ca, P 함량(Ca/P~1.65)이 증가한 것으로 나타났는데, 이는 HA의 형성을 더욱 증명해 준다. 이러한 결과는 전술한 XRD 결과와 일치한다.

2. 생물학적 평가

2.1 세포독성 시험

1%의 Regesi 재생의학 재료 분말을 직접 10%의 DMEM/F12 배양액과 혼합한 후 이를 96홀 플레이트에 첨가하고 다시 전조골세포(MC3T3) 1x10⁴개/mL를 96홀 플레이트 내에 접종하며 DMEM/F12 배양액을 대조군으로 삼고 CO₂ 배양상자 내에서 각각 1일, 6일 배양한 후 MTT 시험을 진행한다. MTT를 첨가한 후 DMSO를 첨가하고 진동을 주며 효소면역측정법으로 570nm 파장에서 흡광도(Absorbance)를 측정하였는데 측정결과는 도 4(a)에서 도시하는 바와 같다. 결과에 따르면 Regesi 재생의학 재료는 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 배양 1일째에 재료의 흡광도는 블랭크 샘플보다 약간 낮았는데(약 그의 92%), 이것은 Regesi 재생의학 재료에 세포독성이 없다는 것을 설명해 준다. 배양 6일째에 재료의 흡광도는 블랭크 샘플과 동일하였는데 이는 Regesi 재생의학 재료에 세포 독성이 없다는 것을 설명해 준다.

Regesi 재생의학 재료를 5mg/ml의 비율로 10%의 DMEM/F12를 함유한 배양액에 각기 다른 시간(1일, 2일, 3일) 동안 함침시킨 후 원심분리를 이용해 상청액을 취한다. 24홀 플레이트 추출액을 블랭크 대조군으로 삼고 모두 4℃ 조건에서 보존하며 전조골세포(MC3T3) 1x10⁴개/mL를 96홀 플레이트 내에 접종하며 CO₂ 배양상자 내에서 배양한 후 다른 조건의 침출액을 첨가하고 24시간 후 MTT 실험을 진행한다. MTT를 첨가한 후 DMSO를 첨가하고 진동을 주며 효소면역측정법으로 570nm 파장에서 흡광도를 측정하였는데 측정결과는 도 4(b)에서 도시하는 바와 같다. 결과에 따르면 Regesi 재생의학 재료는 다른 시간의 침출액과 블랭크 샘플의 흡광도가 기본적으로 동일하였는데, 이는 Regesi 재생의학 재료 침출액에 여전히 세포 독성이 없다는 것을 설명해 준다.

2.2 세포 점착 성능 시험

Regesi 재생의학 재료를 분말로 연마한 후 박편(직경 13mm, 두께 2mm)으로 만든다. Regesi 재생의학 재료에 대해 멸균, 소독 처리를 진행한 후 24홀 플레이트 내에 거치하고 다시 전조골세포(MC3T3) 1x10⁴개/mL를 24홀 플레이트 내에 접종하여 1일, 3일 배양한다. 그 후 2.5%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 이용해 4℃에서 24시간 고정시키고 PBS로 3회 세정하며 에탄올을 이용해 기울기 용리(50%, 75%, 95%, 100%)를 진행하며 자연건조를 거친 후 금 스퍼터링(gold sputtering)을 진행하고 SEM 관찰을 하는데 이는 도 5에서 도시하는 바와 같다. 그 결과에 따르면 생체활성 유리 표면은 조골세포가 잘 부착되며 1시간 배양 시 세포가 길어지고 사상위족(filopodia)이 출현하는 것으로 나타났다. 배양 3시간 시 세포가 더 연장되기 시작하면서 커졌으며 위족이 더욱 선명해졌다. 이는 Regesi 재생의학 재료에 우수한 세포 상용성이 존재해 Regesi 재생의학 재료 표면에 세포가 부착하는 데 유리하다는 것을 증명해 준다.

3. 분해 실험

Regesi 재생의학 재료편(PSC, 45S5와 S70C30)을 SBF 용액에 넣고 그 pH값의 변화를 측정하였으며 그 결과는 도 6에서 도시하는 바와 같다. 도면에서 알 수 있듯이, 45S5와 S70C30(모두 이미 공개된 제품)의 샘플 pH값은 초기의 168시간 동안 모두 상승하였으나, PSC 샘플(본 발명의 재생의학 재료)의 pH값은 상기 시간 구간 내에 불변하였으며(~7.4, 생리 pH값) 이는 도 6에서 도시하는 바와 같다. 앞서 연구한 결과에 따르면 pH값 상승은 세포 성장에 불리하며 일반적으로 45S5와 S70C30 샘플의 세포 상용성 테스트의 경우 모두 샘플을 인산염 완충용액에 넣고 24시간 함침시켜 샘플 표면의 일부 이온을 제거해 이것이 세포를 사멸시키는 것을 방지할 필요가 있었다. 그러나 PSC 샘플은 안정적인 pH값 변화 덕분에 일반적으로 사전처리 없이 곧바로 세포 상용성 실험을 진행할 수 있었으며, 상기 실험 결과에 따르면 PSC는 우수한 세포 상용성을 가지고 있어 세포의 점착, 증식 및 분화에 유익한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 PSC가 소독, 멸균 후 곧바로 체내에 응용할 수 있다는 것을 의미한다.

Regesi 재생의학 재료편을 탈이온수(5편/50ml)에 넣고 분해 실험을 진행하였다. 각 간격을 둔 시간 지점에 그 내부의 탈이온수를 완전히 치환하고 5편의 샘플을 취한 후 종이로 그 표면의 수분을 제거하여 진공 건조기에 넣고 건조시켰으며 중량을 측정해 평균값을 취하였는데 그 결과는 도 7에서 도시하는 바와 같다. 그 결과에 따르면 재료는 6일째부터 분해되기 시작했으며 9일째에는 분해가 가속화되었고 70일째에는 분해가 원래의 40%에 도달하면서 분해속도가 느려졌다.

Regesi 재생의학 재료을 SBF 용액 내에서 분해 시험을 진행하였는데 재료 중 이온이 방출됨에 따라 재료 표면에 HA가 형성되었다. 1개월째부터 원래의 ~80%로 분해되었으나 1개월 후 재료 표면이 HA로 완전히 뒤덮였고 그 중량변화가 크지 않아 Regesi 재생의학 재료의 분해는 그 체내 신진대사 하의 분해속도를 기준으로 삼아야 한다. 종래에 공개된 45S5 생채활성 유리는 그 분해가 주로 식물체내에서 관찰되었으며 완전히 분해되는 데에 약 1 내지 2년이 소요되었다.

Regesi 재생의학 재료를 척추 및 분절성 골결손 수복에 응용하는 전임상연구

1. 재료학

Regesi 생체활성 유리를 유사체액에 함침시킨 후 그 pH값 변화를 측정하고, 생체역학 실험으로 그 체외 최대 압축강도를 검출하며, 전자현미경으로 재료의 미세조직, 표면접촉각을 관찰하고 재료 표면에 금막(gold film)을 도금하여 재료 표면의 형상, 미세구멍 구조를 스캔하여 관찰한다.

2. 세포학

조골세포 배양액에 각각 Regesi 생체활성 유리를 첨가해 실험군으로 사용하고 Gsk 재료는 대조군으로 사용한다. 실시간으로 정량의 PCR을 이용해 상기 재료가 조골세포 I형 콜라겐, 오스테오칼신(osteocalcin), 염기성 포스파타아제(phosphatase) 유전자 발현에 미치는 영향을 측정함으로써 상기 재료가 조골세포 증식을 촉진시킬 때의 가능한 메커니즘을 검토한다. 또한 상기 두 가지 재료의 추출액을 이용해 조골세포를 배양한 후 MTT법으로 세포 성장 곡선을 측정하고 6레벨 독성 분급에 따라 상대 증식도(RGR=(실험군/대조군)x100%)를 계산하여 독성 평가를 진행한다. 조골세포를 체외배양한 후 각각 상기 두 가지 재료 상에 접종하여 세포 점착률과 세포 점착력을 측정하는데, 점착률=점착 세포수/총 세포수x100%이고, 마이크로피펫 호흡(micropipette aspiration)법을 이용해 세포의 점착력을 체계적으로 측정하여 주사전자현미경 관찰을 진행한다. 세포와 재료 복합 시험을 진행하며 각각 1.0cm x 1.0cm x 0.5cm 크기의 재료를 취해 배양 플레이트 내에 거치하고, 세포 현탁액을 재료 표면에 접종하여 복합 배양을 진행하며, 도립 위상차 현미경으로 재료 표면에서 세포의 성장 상황을 관찰한다.

3. 동물 실험

1) 평균 체중이 75kg인 수컷 양 60마리를 선별해 한 그룹당 20마리를 배당해 세 그룹으로 나눈다. 전신마취 무균 조건에서 요추 전방 허리 2 척추체 절제술을 진행하여 척추 분절성 골결손 모형을 제작한다. 동시에 척골 중간 구간 4.5cm 뼈 및 뼈막 결손 모형을 제작하고 원기둥형 RegeSi 생체활성 유리, Gsk 재료, PMMA를 각각 추체를 절제한 후의 간극 및 척골 결손 지점에 이식하고, 세 종류의 수복 재료를 각각 티타늄 플레이트를 이용해 이웃하는 분절의 상하 추체 및 척골 골결손 수복 지점에 고정한다. 수술 후 1, 6, 12주째에 척골 및 요추 정측위 X선 검사를 진행해 뼈 치유 및 결손 수복 상황을 관찰한다. 또한 3개 관찰군의 5마리 동물을 각각 죽여 수술로 티타늄 플레이트를 제거하고 재료를 포함한 이웃하는 추체 및 결손 지점 이웃 척골을 취하여 다음 연구를 진행한다. a. 절편을 제작하여 현미경으로 재료 충전 부위의 신생골 성장 및 재료 분해 상황을 관찰한다. b. 생물역학적 방식으로 표본의 압축 및 인장 강도를 테스트한다. c. 표본을 Micro-CT 시스템에 놓고 3차원 재건 관찰을 진행하며 Microview ABA 소프트웨어를 이용해 골 이식 지점의 신생 골조직 광물질 함량(TMC), 골부피분율(BVF)에 대한 정량 분석을 진행한다. d. Overlay 적층 방법을 이용해 다른 색깔로 각 표본 골이식 영역 내의 분해 잔여 재료와 신생골을 복합적으로 표시한다. 수술 후 24주째에 남은 5마리 동물을 전신마취 무균 조건에서 수술을 진행하여 추체 및 척골을 고정한 티타늄 플레이트를 꺼내고 상처를 봉합한다. 수술 후 양의 사지 운동 및 보행 능력을 관찰하고 수술 후 32주째에 동물을 죽여 수복된 추체 및 척골 표본을 취하고 상응하는 생물역학적 검출 및 조직학적 분석을 진행한다.

2) 80마리 뉴질랜드 흰 토끼를 60마리의 거세군과 20마리의 가짜수술군으로 나누고 난소절제술을 통해 토끼 골다공증 모형을 만든다. 거세군은 Regei군, PMMA군, 블랭크 대조군으로 나누고 각 군에 20마리를 배정하며 모의 추체성형술을 진행한다. Regei군 토끼의 L1, L2 추체에는 주입 가능한 RegeSi 생체활성 유리를 주사하고, PMMA군 토끼의 L1, L2 추체에는 PMMA를 주사하며, 각 군은 모두 수술 후 1, 6, 12, 24주째에 5마리의 토끼를 죽여 상응하는 추체를 적출한 후 조직학적 방법, MicroCT 분석, 현미경을 이용해 충전 부위의 신생골 성장 및 재료 분해 상황을 관찰하며, 생물학적 실험을 통해 Regei 생체활성 유리의 압축강도, 인장강도를 평가한다.

상기 실험을 통해 본 발명의 Regei 재료가 Gsk 재료군, PMMA군, 블랭크 대조군보다 압축강도, 인장강도 및 분해상황 등이 우수하다는 것이 증명되었다(도 8에서 도시하는 바와 같음).

종래의 생체활성 유리의 성질 연구

45S 분말상 샘플을 테스트 대상으로 사용하였다.

실험과정

1) 45S를 고온고압에서 멸균한다.

2) 침출액 제조: 멸균한 45S를 상응하는 부피의 MEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 함침시킨다. 질량부피백분율은 각각 0.1%, 1%, 10%이다.

3) 침출액에서 상청액을 취하고, 1M HCI를 이용해 pH를 7.2로 조절한다. 0.22㎛ 필터 헤드를 멸균한다. 4℃에서 보존한다.

4) 세 가지 농도의 침출액에 각각 10% FBS를 첨가한다.

5) CCK-8로 Hacat 세포의 증식능력을 측정한 후 흡광도-시간 곡선을 제도한다.

실험결과

10% 농도의 45S 침출액은 불안정하였으나 보존 과정에서 대량의 응집된 침전물이 석출되었으며 후속 시험을 진행하지 않았다. CCK-8 테스트 과정에서 1%의 침출액을 첨가한 이튿날 세포가 전부 사멸한 것을 발견하였다. 0.1% 농도의 침출액은 세포에 대해 현저한 세포독성을 보이지 않았으나 도 14에서 알 수 있듯이 시험 후기에 세포 성장이 대조군보다 느려진 것으로 나타났다.

보충실험(45S를 증류수에 함침시킬 경우 pH값에 미치는 영향)

실험과정: 45S를 질량부피비 1%의 농도로 증류수에 함침시키고 각기 다른 시간 지점의 pH값을 시험하였다.

실험결과:

결론:

45S 침출액의 pH값은 함침 시간이 증가할수록 계속 높아지는 것으로 나타났으며, 24시간 동안 pH값이 13에 도달했다. pH값의 큰 폭 상승은 CCK-8 테스트 중 아주 강한 세포독성을 유발한 것으로 보인다.

기타 실험

1) 고온고압에서 멸균한 45S를 MEM 배지에 첨가한다. 45S의 부피백분율은 각각 0.1%, 1%, 10%이다. 45S는 MEM 배지에 첨가하자마자 현저한 색깔 변화를 보였는데, 이것은 배지의 pH 변화가 비교적 크다는 것을 설명해 준다. 함침 24시간 후 상청액을 취하여 1M HCI로 pH값을 7.2로 조절하였다. 45S 농도가 증가함에 따라 배지의 염기성이 강해졌으며 필요한 HCI 양도 늘어났다. 실험 결과를 확인하기 위하여 45S를 증류수에 함침시킨 후의 pH값 변화를 측정하였다. 측정 결과 45S가 pH값을 크게 높여 세포독성을 유발한다는 것을 알 수 있었다.

2) 4℃ 얼음박스에서 준비해 놓은 45S 침출액을 꺼내자 10% 농도 샘플에서 대량의 흰 색의 응집된 침전물이 발견되었다. 37℃ 수조를 30분간 가열하였으나 용해되지 않았다. 상기 농도 샘플에는 후속적으로 CCK-8 테스트를 진행하지 않았다. 실온에 2주간 정치한 후 10% 농도의 45S 분말은 MEM 내에서 졸 상태가 되었다. 이것은 45S 분말의 분해속도가 빠르다는 것을 설명해 주며 이는 도 15에서 도시하는 바와 같다.

3) 0.1%와 1% 농도의 침출액에 FBS를 첨가해 CCK-8 테스트를 진행하는 과정에서 1% 농도의 침출액에 아주 큰 세포독성이 있다는 것을 발견하였다. 세포가 전부 사멸했다. 0.1% 농도의 침출액은 비교적 작은 세포독성을 나타냈다.

본 발명의 재생의학 재료는 생물학적 골 수복 치약, 조직공학 재생, 상처 수복 의료용 재료에 사용할 수 있으며, 특히 조직공학, 구강점막, 골 수복 재료, 상처 수복 등 측면에서 중대한 과학적 가치와 의미를 지닌다. 조직공정, 생물요법 분야에 상당한 기여를 할 것이다.

본 발명의 범위 또는 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명이 속한 기술분야의 당업자는 본 발명의 설명에 기재된 구체적인 실시방식은 다양한 방식으로 용이하게 변경 또는 개선할 수 있다. 본 발명의 설명에서 얻은 기타 실시방식은 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 용이하게 고안해낼 수 있다. 본 출원에서 발명의 설명과 실시예는 예시에 불과하다.

Claims

연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료에 있어서,
상기 재생의학 재료는 3차원 네트워크 구조이고, 제1 혼합물과 제2 혼합물로 구성된 복합 재료이고, 여기에서 상기 제1 혼합물과 상기 제2 혼합물의 질량비는 2:1 내지 4:1이고;
상기 제1 혼합물의 총 질량을 기준으로 제1 혼합물 중에는 12 내지 38%의 SiO₂, 3 내지 5%의 Na₂O, 15 내지 29%의 CaO, 10 내지 32.5%의 P₂O₅, 1 내지 5%의 육인산이노시톨(inositol hexaphosphate), 1 내지 5%의 이노시톨헥사인산(inositol hexaphosphoric acid)이 포함되며 나머지는 불순물이고 불순물의 함량은 0.5%보다 낮고;
상기 제2 혼합물의 총 질량을 기준으로 제2 혼합물 중에는 30 내지 60%의 카르복시메틸키토산(carboxymethyl chitosan), 30 내지 60% 히알론산나트륨(sodium hyaluronate)이 포함되고;
상기 제1 혼합물은 졸-겔법(sol-gel method)을 통해 대두 껍질 추출액을 인 전구체로 삼아 300 내지 700℃ 항온에서 소결시켜 수득하는 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료.
제1항에 있어서,
상기 제1 혼합물과 상기 제2 혼합물의 질량비는 3:1인 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 혼합물 중의 인에 대한 칼슘의 중량비는 1.50 내지 1.80인 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 혼합물 중의 인에 대한 칼슘의 중량비는 1.67인 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
pH값이 7.4±1인 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
체내에서의 분해속도가 4 내지 12주인 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료.
제1항 또는 제2항의 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료의 제조방법에 있어서,
대두 추출액을 인 전구체로, 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate)를 실리콘 전구체로, 칼슘 니트레이트 테트라하이드레이트(calcium nitrate tetrahydrate), 질산칼슘, 염화칼슘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 칼슘 전구체로, 물 및/또는 에탄올을 반응매질로 삼고, 상기 각 전구체 및 반응매질을 혼합해 겔 전구체 졸 용액을 제조한 후 300 내지 700℃ 항온에서 소결시켜 제1 혼합물을 수득하는 단계; 및
상기 제1 혼합물을 카르복시메틸키토산, 히알론산나트륨과 혼합한 후 가열 및 용해하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 대두 추출액의 제조방법에 대두 껍질 분쇄 → 분쇄 재료 산 침출(acid leaching), 여과 → 침출액 염기 중화 → 칼슘염 침전 침출 → RH⁺ 수지 이온 교환 → 증발 농축 → 대두 추출액 단계가 포함되고, 여기에서 대두 추출액 중 하이드록시아파타이트의 함량은 40 내지 60중량%인 것을 특징으로 하는 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료의 제조방법.
세포 성장 매개체에 있어서,
제1항 또는 제2항에 따른 연/경조직 수복을 촉진시키는 재생의학 재료가 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 성장 매개체.
삭제
제1항 또는 제2항에 따른 의약 조성물, 의료 장치, 구강 케어 제품, 성형외과 용품 또는 화장품용 재생의학 재료.