CN111514372B - CaCO3/MgO纳米复合物及其在骨修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种CaCO3/MgO纳米复合物，本质为MgO纳米颗粒掺杂的蛋壳颗粒，由蛋壳和乙酸镁经浸渍、煅烧制得。该材料具有天然、绿色和环保的特点，不仅可充分利用含有大量CaCO3的废弃蛋壳，还显著降低了镁离子的生物毒性，有利于发挥镁离子对骨再生的促进作用。以本发明的纳米复合物为原料制造的支架等医疗器械，可应用于骨修复。

Description

CaCO3/MgO纳米复合物及其在骨修复中的应用
技术领域
本发明涉及一种由天然物料制备的材料，尤其涉及一种基于蛋壳制备的CaCO3/MgO 纳米复合物，具有骨诱导特性，适用于制成支架等医疗器械。
背景技术
创伤、肿瘤切除和先天性疾病引起的骨缺损严重影响患者的日常生活。组织工程的迅速发展为骨缺损修复领域带来了活力，而支架材料作为骨组织修复的重要组成部分，成为了近年来研究的热点。由于同种异体骨和自体骨移植均存在免疫排斥和供体不足等不可逾越的缺点，以磷酸钙/碳酸钙和一些生物大分子(如：壳聚糖、海藻酸钠和胶原等)为主要原料制备的支架材料成应运而生，并且因其良好的生物相容性和力学性能而受到广泛关注。然而，无骨诱导能力的支架材料造成的不相匹配的成骨和降解速率仍然严重制约骨缺损修复效果，为临床治疗中带来极大考验。
有报道称镁在成骨过程中起着非常重要的作用。此外，镁通过调节活性钙转运和激活吞噬功能刺激成骨细胞增殖、分化和骨矿化。镁缺乏可能与骨骼脆弱和/或骨生长减少有关。因此，适量的Mg掺入有利于新生骨的再生，许多研究证实加入Mg2+能改善支架的成骨诱导性。然而，从支架中骤然释放的Mg2+离子可能带来生物毒性等问题，因此这种方法在很长一段时间内因安全问题被搁置(Acta Biomater.10(2014) 2834-2842)，而未得到应用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种纳米复合物，由蛋壳和乙酸镁经浸渍、煅烧制得，降低镁离子的生物毒性。
本发明的另一个目的在于提供一种纳米复合物，由蛋壳和乙酸镁经浸渍、煅烧制得，含有CaCO3和MgO，具有骨诱导特性，促进骨再生和组织修复。
本发明的再一个目的在于提供一种纳米复合物，含有CaCO3和MgO，使得制得支架的力学性能显著提高。
本发明的又一个目的在于提供一种医疗器械，采用含有CaCO3和MgO纳米复合物为原料制造，具有促进骨再生的作用，适用于骨修复支架等。
一种纳米复合物，由蛋壳和乙酸镁经浸渍、煅烧制得。
另一种纳米复合物，由蛋壳和乙酸镁经浸渍、煅烧制得，每克蛋壳中加入镁离子0.06g。
另一种纳米复合物，由蛋壳和乙酸镁经浸渍、煅烧制得，含有MgO和CaCO3，每克蛋壳中加入镁离子0.06g。
另一种纳米复合物，将蛋壳用乙酸镁经浸渍后，经煅烧(如：600℃加热3小时，升温速率为2℃/min)制得，含有MgO和CaCO3，每克蛋壳中加入镁离子0.06g。
另一种纳米复合物，由如下制备方法得到：
首先将1.2g蛋壳粉和0.05M乙酸镁(50ml)均匀混合(比如：在室温下搅拌3 小时)。然后，用水洗涤数次后干燥。最后，置于600℃下煅烧(升温速率为2℃/min) 3小时即得。
本发明的纳米复合物，所含的MgO和CaCO3是多晶体结构，C、O、Mg和Ca等元素在材料表面均匀分布，氧化镁位于碳酸钙的表面，碳酸钙X射线衍射2θ特征峰以 29.5°为主，还位于23.0°、31.4°、35.8°、39.4°、43.16°、47.2°、47.5°、 57.3°、60.8°和64.6°等。氧化镁X射线衍射2θ特征峰在57.5和63.3°。
本发明的纳米复合物具有促进骨再生的活性，比如：与PLGA、PLA、PEG、环糊精和壳聚糖等任何一种聚合物形成有机/无机复合材料，再制成各种用于骨修复的支架或骨粉。
一种医疗器械，其采用本发明的CaCO3/MgO纳米复合物为原料制得。
一种支架，将CaCO3/MgO纳米复合物和羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)溶解于水中，然后用碳二亚胺(EDC)和N羟基琥珀酰亚胺(NHS)将混合溶液交联，形成水凝胶后，经冻干制得。支架具有多孔结构，孔径为50μm-80μm。
一种骨粉，将CaCO3/MgO纳米材料与胶原蛋白(或生长因子)复合，用于制备人工骨粉。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明提供的含有钙离子和镁离子的材料，在蛋壳中加入的镁离子的方式制得，具有天然、绿色和环保的特点，不仅可充分利用含有大量CaCO3的废弃蛋壳，还显著降低了镁离子的生物毒性，有利于发挥镁离子对骨再生的促进作用。
以本发明提供的含有钙离子和镁离子的材料制得的支架材料，其力学强度显著提高。
以本发明提供的含有钙离子和镁离子的材料制得的骨粉材料，其具有良好的骨再生能力。
本发明提供的CaCO3/MgO纳米复合物，由蛋壳和乙酸镁经浸渍、煅烧制得，不仅具有天然绿色环保的特点，有效提高Mg2+在骨诱导中的生物活性，使得Mg2+作为一种具有相对的化学稳定性、生物活性和生物相容性等特性的无机物被应用于骨修复。
附图说明
图1为本发明的CaCO3/MgO纳米复合材料的XRD光谱结果图；
图2为本发明CaCO3/MgO纳米复合材料表征图；其中，图A为在低倍率下的SEM 图像，图B和图C为在高倍率下的SEM图像，图D为材料中CaCO3/MgO的定量EDS图谱；
图3为本发明CaCO3/MgO纳米复合材料的结构表征图；其中，图A、B为TEM，图C 为HRTEM，图B中插图为SAED图像；
图4为本发明CaCO3/MgO/CMC支架的制备过程实样图；
图5为本发明制得的CaCO3/MgO/CMC支架的形态学和物理特性表征图；其中，图 A为与游离细胞共培养的CaCO3/MgO/CMC支架的SEM图像，图B为支架的应力应变曲线，图C为支架的杨氏模量，图D为抗压强度；(***p＜0.001)
图6为CaCO3/MgO纳米复合材料制成的支架的生物相容性；其中，图A为细胞在CaCO3/MgO/CMC上增殖72小时；图B为细胞在CaCO3/MgO和CMC支架上孵育3d后的活 /死染色和扫描电镜图像；(*p＜0.05，**p＜0.01，**p＜0.001)
图7为CaCO3/MgO纳米复合材料制成的支架的骨诱导作用；其中，图A为细胞在支架上培养14天后的ALP染色；图B为细胞在支架上培养21天后的ARS染色。
图8为大鼠颅骨的组织染色图；其中，图A为反应血管化的HE染色；图B为反应I型胶原沉积情况的马松染色。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下：
1)CaCO3/MgO纳米复合材料的制备
首先将1.2g蛋壳粉和0.05M乙酸镁(50ml)溶于烧杯中，在室温下搅拌3h，以实现均匀混合。将均匀混合的溶液用超纯水洗涤数次并干燥。最后将产品放入马弗炉中，在600℃下煅烧3小时。升温速率为2℃/min。
2)CaCO3/MgO/CMC支架的制备
将2％(W/V)的羧甲基壳聚糖(CMC)溶于5％(W/V)CaCO3/MgO溶液中，然后向溶液中加入0.1m EDC和0.025m NHS。将混合物在室温下孵育30分钟，使其完全交联。将混合溶液改性为水凝胶后，通过冷冻干燥和超声清洗获得多孔CaCO3/MgO/CMC支架。
3)细胞实验方法
将获得的人脂肪组织切成小块，用0.1％胶原酶I(Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)消化，消化后的组织在37℃孵育，同时轻轻摇晃过夜。最后，将沉淀的细胞重新悬浮在α-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，加入10％FBS(Gibco，USA)和100单位/ml的青霉素链霉素(Invitrogen)，并在37℃和5％CO2的气氛中培养。培养基每3d更换一次，用第3～5代细胞进行实验。
以每孔100μl培养基中1×104细胞的密度将细胞接种于支架中，培养0、24、48和72小时后，用CCK-8细胞计数试剂盒(Dojindo，Japan)检测细胞的增殖情况。用活/ 死法(Invitrogen)检测细胞活力，并在支架中培养3天后用扫描电镜观察细胞活力和支架的矿化度，将细胞及支架共培养3天，然后用2.5％戊二醛固定支架，在梯度乙醇系列中脱水，最后用JFC-1200细涂层机在30mA下用金溅射。在高真空模式下，用扫描电镜(SEM)在5kv下对试样进行了观察。
4)成骨相关基因的检测
在细胞融合度达60-70％左右，更换培养基并记录为成骨分化的开始。在成骨细胞培养7d后，用实时qPCR法检测骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和骨丝(osterix)等成骨分化相关基因mRNA的相对表达。所有实验均进行了三次测试，所有数据均以GAPDH表达量进行归一化处理。使用的引物序列见表1。
表1
Figure BDA0002456455150000041
5)动物模型
术前将细胞与支架共培养3天，选用8周龄雄性SD大鼠，对其腹腔注射戊巴比妥(Nembutal 3.5mg/100mg)进行麻醉，头皮中央1.0cm矢状切口暴露颅骨。使用直径为 5mm的环钻(Nouvag，Goldach，Switzerland)在头皮两侧造成两个临界大小的缺损，然后将支架/细胞复合物植入缺损中。最后，关闭切口并清理干净。15只大鼠随机分为 3组：CaCO3/MgO/CMC、CMC、空白对照组。术后8周处死动物，收集颅骨，用4％PFA固定。脱钙处理后进行石蜡包埋，并制成切片。
6)染色方法
根据生产说明书分别用苏木精/伊红染色和Masson三色染色对组织切片进行染色。用光学显微镜(Olympus BX51)观察染色结果对组织切片
7)统计分析
除非另有特别说明，本研究中提供的所有数据均显示为平均值±标准差。每个实验至少重复三次。采用单因素方差分析对数据进行统计分析。P＜0.05为统计学意义。
实施例1CaCO3/MgO纳米复合材料的表征
我们对CaCO3/MgO纳米复合材料进行了X射线衍射(XRD)分析以确定样品的晶体结构。如图1所示，X射线衍射2θ特征峰位于23.0°、29.5°、31.4°、35.8°、39.4°、 43.16°、47.2°、47.5°、57.3°、60.8°和64.6°，分别对应于天然蛋壳的(012)， (104)，(006)，(110)，(11-3)，(202)，(024)，(018)，(122)，(208) 和(300)晶面(CaCO3，JCPDS No.47-1743)。衍射特征峰分别位于与方镁石(101) 晶面和(103)晶面相对应的57.5°和63.3°(MgO，JCPDS编号87-0653)。此外，从 XRD图谱中没有观察到其它衍射峰，表明CaCO3/MgO纳米复合材料只具有MgO和CaCO3晶体结构。结果表明，浸渍焙烧法制备的MgO纳米粒子在蛋壳表面结合良好。
为了进一步确定CaCO3/MgO纳米复合材料的详细形貌和晶体结构，我们对其进行了 FE-SEM、TEM和HR-TEM分析。如图2A所示，CaCO3/MgO纳米复合材料粉体粒径分布在 10-100μm范围内，CaCO3/MgO纳米粉体放大结果(参见图2B)显示其表面微观结构为孔径从200纳米到400纳米不等的多孔结构，这些天然漏斗状的孔道结构有助于物质和能量(如氢、氧、磷、钙、金属等离子成分或生物分子)的传递和交换，为组织的生长提供养分。图2C中可以很清晰地看到约5nm大小且分散均匀的MgO纳米颗粒均匀地固定在CaCO3粉体表面，相应的定量EDS图谱(参见图2D)也说明了C、O、Mg和Ca在CaCO3/MgO 复合材料表面的均匀分布，这表明MgO纳米粒子与CaCO3混合均匀。样品的TEM和HRTEM 图像(图3A和3B)也清楚地显示了MgO纳米粒子(约5nm)在蛋壳表面的成功涂布。在此，蛋壳作为支撑物提供了刚性平台，从而减少MgO纳米粒子的团聚。图3C为具有晶格间距的典型HRTEM图像，0.26nm的平面间距与CaCO3的(112)面很好地对应，0.24nm的平面间距对应于MgO的(101)平面。此外，选区电子衍射(SAED，图3B插图)图显示为点环图，证实本合成多晶体结构的特性。
实施例2基于CaCO3/MgO制备的支架具有较好的生物相容性和机械性能
采用化学交联法制备CaCO3/MgO/CMC复合支架：将CaCO3/MgO纳米复合材料和CMC溶解于ddH2O中，利用超声分散形成均匀的混合溶液，随后然后用EDC和NHS将混合溶液交联，并在30分钟内固化形成水凝胶，最后通过冻干水凝胶制备复合支架(参见图4)。该复合支架具有相互连接的多孔结构，孔径在50μm-80μm之间，与细胞共培养3d后，支架表面产生了许多直径近10μm、孔径近1μm的花状微球，提示支架发生矿化。在对复合支架进行进一步的EDS分析后，除了碳、氧、钠、镁和钙等基本元素外，矿化组中还存在15.17％的磷，这表明支架中可能存在磷酸钙盐的组分(图5A)。这些结果表明，碳酸钙可能为骨化过程中矿化提供活性位点。
为了进一步证明CaCO3/MgO复合材料能够提高支架的力学性能，从应变-应力曲线分析了CaCO3/MgO/CMC支架的杨氏模量和抗压强度(参见图5B)。结果表明，复合支架的杨氏模量和抗压强度(7.267±0.8505Kpa杨氏模量和3.02±0.3158Kpa抗压强度)均高于CMC支架(1.7±0.1732Kpa杨氏模量和0.753±0.0371Kpa抗压强度)，杨氏模量和抗压强度分别比CMC支架高4.27和4.02倍(参见图5C和图5D)。
将人脂肪组织来源干细胞(hADSCs)种植于CaCO3/MgO/CMC复合支架中，培养3天后观察细胞增殖率。CCK-8结果表明，与CMC组相比，CaCO3/MgO/CMC组未显示明显的生物毒性，表现出相对缓慢的增殖速率(参见图6A)，这主要是由于细胞在CaCO3/MgO 刺激下趋向于分化而不是增殖。为了进一步评估CaCO3/MgO/CMC组细胞的存活率，在培养3天后对其用活/死染料染色。结果表明，hADSC在CaCO3/MgO/CMC支架和CMC组中均存活，且无明显差异(参见图6B)。此外，在CaCO3/MgO/CMC支架中培养3天后，利用扫描电镜对hADSC的形态进行观察：CaCO3/MgO/CMC组的细胞呈圆形和梭形，而CMC组的大多数细胞呈梭形(参见图6C)。这些结果充分说明CMC组较CaCO3/MgO/CMC组具有更好的粘附和增殖作用。
实施例3CaCO3/MgO/CMC支架促进骨修复
我们对培养于支架上的hADSCs分别进行了ALP和ARS染色，以求进一步证明支架的成骨诱导性。当hADSCs在支架上培养7天时，与CMC组相比，CaCO3/MgO/CMC组ALP活性增强(图7A)。同时，当细胞在支架上培养21天后，CaCO3/MgO/CMC组显示出明显的钙矿物结节，而CMC组几乎不可见结节(图7B)。这些结果说明CaCO3/MgO/CMC支架具有较好的成骨分化潜能。
采用大鼠颅骨标准缺损修复实验评价CaCO3/MgO/CMC支架的成骨诱导性。将hADSC铺种于支架，体外培养3天后，将细胞/支架复合物移植到大鼠骨缺损中。植入8周后，去大鼠颅骨样品，脱钙处理后制成石蜡切片，并进行HE染色和马松染色。如图8A所示， CaCO3/MgO/CMC组中可见大量新生血管形成，而CMC组和空白对照组(NC)几乎未见血管形成。图8B的马松染色结果显示，CaCO3/MgO/CMC组中有大片胶原沉积，并形成致密的骨结构，而CMC和对照组中胶原纤维数量较少甚至不可见。这些结果充分说明 CaCO3/MgO/CMC支架在体内具有较好的骨修复效果。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120> CaCO3/MgO纳米复合物及其在骨修复中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaggagac aatggagaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaccatttg gagaggttgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgctacct gtatcaatgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcagccaact cgtcacagtc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccgaggtga tagtgtggtt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcctcgct ttccatgtgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacaactctg ggcaaagcag 20
<210> 8
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<212> DNA
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caggtgaaag gagcccatta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgacttcaa cagcgacacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgctgtagcc aaattcgttg 20

Claims (17)

1.一种纳米复合物在降低镁离子生物毒性中的应用，其特征在于所述的纳米复合物含有MgO和CaCO3，MgO和CaCO3是多晶体结构；所述的纳米复合物制备方法为：含镁离子溶液和蛋壳混合，然后，用水洗涤数次后干燥，600℃煅烧制得；
每克所述的蛋壳中加入所述的镁离子0.06g。
2.根据权利要求1所述的纳米复合物在降低镁离子生物毒性中的应用，其特征在于所述煅烧的升温速率为2℃/min。
3.根据权利要求1所述的纳米复合物在降低镁离子生物毒性中的应用，其特征在于C、O、Mg和Ca元素在材料表面均匀分布。
4.根据权利要求1所述的纳米复合物在降低镁离子生物毒性中的应用，其特征在于将1.2g蛋壳粉和50mL浓度0.05M乙酸镁均匀混合；然后，用水洗涤数次后干燥；最后置于600℃下煅烧3小时而得，煅烧升温速率为2℃/min。
5.一种纳米复合物在制造医疗器械中的应用，其特征在于所述的医疗器械以纳米复合物为原料制造，降低镁离子生物毒性，所述的纳米复合物含有MgO和CaCO3，MgO和CaCO3是多晶体结构；所述的纳米复合物制备方法为：含镁离子溶液和蛋壳混合，然后，用水洗涤数次后干燥，600℃煅烧制得；
每克所述的蛋壳中加入所述的镁离子0.06g。
6.一种医疗器械，其特征在于以纳米复合物为原料制造，降低镁离子生物毒性，所述的纳米复合物含有MgO和CaCO3，MgO和CaCO3是多晶体结构；所述的纳米复合物制备方法为：含镁离子溶液和蛋壳混合，然后，用水洗涤数次后干燥，600℃煅烧制得；
每克所述的蛋壳中加入所述的镁离子0.06g。
7.根据权利要求6所述的医疗器械，其特征在于所述煅烧的升温速率为2℃/min。
8.根据权利要求6所述的医疗器械，其特征在于C、O、Mg和Ca元素在材料表面均匀分布。
9.根据权利要求6所述的医疗器械，其特征在于将1.2g蛋壳粉和50mL浓度0.05M乙酸镁均匀混合；然后，用水洗涤数次后干燥；最后置于600℃下煅烧3小时而得，煅烧升温速率为2℃/min。
10.一种支架，其特征在于以纳米复合物为原料制造，降低镁离子生物毒性，所述的纳米复合物含有MgO和CaCO3，MgO和CaCO3是多晶体结构；所述的纳米复合物制备方法为：含镁离子溶液和蛋壳混合，然后，用水洗涤数次后干燥，600℃煅烧制得；
每克所述的蛋壳中加入所述的镁离子0.06g。
11.根据权利要求10所述的支架，其特征在于所述煅烧的升温速率为2℃/min。
12.根据权利要求10所述的支架，其特征在于C、O、Mg和Ca元素在材料表面均匀分布。
13.根据权利要求10所述的支架，其特征在于将1.2g蛋壳粉和50mL浓度0.05M乙酸镁均匀混合；然后，用水洗涤数次后干燥；最后置于600℃下煅烧3小时而得，煅烧升温速率为2℃/min。
14.一种骨粉，其特征在于以纳米复合物为原料制造，降低镁离子生物毒性，所述的纳米复合物含有MgO和CaCO3，MgO和CaCO3是多晶体结构；所述的纳米复合物制备方法为：含镁离子溶液和蛋壳混合，然后，用水洗涤数次后干燥，600℃煅烧制得；
每克所述的蛋壳中加入所述的镁离子0.06g。
15.根据权利要求14所述的骨粉，其特征在于所述煅烧的升温速率为2℃/min。
16.根据权利要求14所述的骨粉，其特征在于C、O、Mg和Ca元素在材料表面均匀分布。
17.根据权利要求14所述的骨粉，其特征在于将1.2g蛋壳粉和50mL浓度0.05M乙酸镁均匀混合；然后，用水洗涤数次后干燥；最后置于600℃下煅烧3小时而得，煅烧升温速率为2℃/min。
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