CN106606805B - 一种纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜及其制备方法和用途，该纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜包括图案化电纺纤维膜和均匀涂敷于图案化电纺纤维膜表面的Ca‑Mg‑Si生物玻璃涂层。本发明将具有良好生物活性和生物相容性的Ca‑Mg‑Si生物玻璃均匀涂敷于图案化电纺纤维膜表面，该Ca‑Mg‑Si生物玻璃由于离子释放而在纤维表面形成活性离子微环境，从而刺激以及促进皮肤组织细胞的生长以及促创面愈合相关因子的表达来提高创面修复材料表面的生物活性促进创面愈合，同时图案化电纺纤维膜具有微纳米级别的结构，对皮肤组织细胞的生长分化行为进行引导和调控，使得复合材料具有更高的生物活性，适合用作创面修复材料。

Description

一种纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜及其制备方法和 用途

技术领域

本发明涉及一种新型的纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜及其制备方法和用途，属生物材料领域。

背景技术

大面积的皮肤缺损能导致体内水分、电解质和蛋白质等大量丢失，破坏人体内环境稳定，并且易导致微生物侵入引起局部和全身感染，从而出现各系统复杂和严重的病理生理变化，继而对人的生命构成威胁^[1]。研究表明，任何直径大于4cm的全层皮肤缺损，人体无法通过自身来完全愈合，必须借助皮肤创面修复材料来进行治疗^[2]。传统的皮肤创面修复材料通常采用：①自体组织移植；②异体组织移植。自体皮肤组织移植虽然具有良好的修复治疗效果，但面临供体来源缺乏、需二次手术并且会造成新的创伤等条件的制约；异体、异种皮肤组织移植不仅面临供体来源少的限制，而且存在引起免疫排斥反应、传播病原等风险；因此上述两种皮肤创面修复材料均存在一定程度的缺陷，无法满足临床的需要。近些年兴起的皮肤组织工程为解决这些问题提供了一种优越的方法。这种方法的核心是在体外利用人工合成的皮肤支架材料，结合皮肤组织细胞及生长因子来构建工程化皮肤，有效治疗和修复大面积皮肤缺损。然而，在皮肤组织工程的研究中，一个最突出和最具挑战性的问题是人工修复材料往往生物活性较差，不能有效地促进以及诱导皮肤组织细胞的增殖、分化以及促创面愈合相关因子的表达^[3]。

为了解决这个问题，由静电纺丝技术制备的纳米纤维材料，由于具有同天然人体细胞外基质(ECM)相似的纤维结构以及较大的比表面积，能够促进皮肤组织细胞在其上的粘附与生长，并且其良好的孔连通性也有利于创伤区域细胞的呼吸作用以及增加组织液的吸收，使其能够保持理想的润湿程度，这些优点使得静电纺丝作为一种理想的组织工程修复材料的制备技术在皮肤组织工程领域受到了越来越多的关注和青睐^[4]。然而，目前由静电纺丝技术制备的创面修复材料普遍存在活性较低等缺点。为了解决这个问题，近些年来，研究者员通过在人工高分子中添加天然高分子如胶原蛋白等进行混合电纺，或者通过对已制得的电纺纤维材料表面进行改性接枝一些生物活性因子如bFGF等等，期望能够制备出具有较好生物活性的复合纤维材料，但这些天然高分子以及生物活性因子往往来源有限，价格昂贵，并且在制备过程中容易失活，导致其在皮肤组织工程的应用中受到了较大的限制^[5]。与此同时，生物活性玻璃由于具有良好的生物活性以及生物相容性，能够与皮肤等软组织形成良好的结合，还能够促进成纤维细胞增殖，以及刺激血管内皮生长因子(VEGF)的表达和蛋白分泌，并且基因芯片研究发现其还能激活具有造血功能的CD44抗原形成前体、成纤维母细胞生长因子受体(N-sam)和血管细胞粘附蛋白(V-CAM1)等对创面修复起关键作用的基因上调，因此，生物活性玻璃在创面修复中受到了广泛的关注[6,7]。因此，如果能运用一种新的方法均匀稳定地将生物活性玻璃涂敷于电纺纤维表面，这种生物活性玻璃涂层将会由于离子释放而在纤维表面形成活性离子微环境，从而刺激以及促进皮肤组织细胞的生长以及促创面愈合相关因子的表达来提高创面修复材料表面的生物活性促进创面愈合，并且如果还能够进一步结合静电纺丝微图案技术，从微纳米级别的结构上对皮肤组织细胞的生长分化行为进行引导和调控，那么这种结构和成分上的协同作用将会使得复合材料具有更高的生物活性，这将对于促进大面积创面愈合具有很高的研究价值。近年来，脉冲激光技术(PLD)被广泛应用于材料制备中[8]。Ca-Mg-Si体系陶瓷，比如说镁黄长石(Akermanite,AKT)，是一种含钙、镁、硅的生物陶瓷，具有优异的骨诱导能力，被广泛应用组织工程领域中[7]。

参考文献

1.E.S.Gil,B.Panilaitis,E.Bellas and D.L.Kaplan,Adv Healthc Mater,2013,2,206-217.

2.D.N.B.Herndon,R E；Rutan,R L,Annals of surgery,1989,209,547-552.

3.W.Zhong,M.M.Xing and H.I.Maibach,Cutan Ocul Toxicol,2010,29,143-152.

4.R.Sridhar,S.Sundarrajan,J.R.Venugopal,R.Ravichandran andS.Ramakrishna,J Biomater Sci Polym Ed,2013,24,365-385.

5.J.S.Choi,K.W.Leong and H.S.Yoo,Biomaterials,2008,29,587-596.

6.I.D.E.Xynos,A J；Buttery,L D,J Biomed Mater Res,2001,55,151-157.

7.W.Zhai,H.Lu,L.Chen,X.Lin,Y.Huang,K.Dai,K.Naoki,G.Chen and J.Chang,Acta Biomater,2012,8,341-349.

8.H.Kim,R.P.Camata,S.Chowdhury,Y.K.Vohra,Acta Biomater,2010,6,3234-3241.。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有良好的生物活性及促创面愈合能力的纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜及其制备方法和用途。

在此，一方面，本发明提供一种纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜，其包括图案化电纺纤维膜和均匀涂敷于所述图案化电纺纤维膜表面的Ca-Mg-Si生物玻璃涂层。

本发明将具有良好生物活性和生物相容性的Ca-Mg-Si生物玻璃均匀涂敷于图案化电纺纤维膜表面，该Ca-Mg-Si生物玻璃由于离子释放而在纤维表面形成活性离子微环境，从而刺激以及促进皮肤组织细胞的生长以及促创面愈合相关因子的表达来提高创面修复材料表面的生物活性促进创面愈合，同时图案化电纺纤维膜具有微纳米级别的结构，对皮肤组织细胞的生长分化行为进行引导和调控，这种结构和成分上的协同作用使得复合材料具有更高的生物活性，适合用作创面修复材料。

本发明中，所述纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜呈多级微纳米结构，包括微米级图案结构、纳米级纤维结构、和纤维表面的纳米Ca-Mg-Si生物玻璃颗粒结构。

较佳地，图案的尺寸为100～800μm，纤维的直径为500～1000nm，Ca-Mg-Si生物玻璃颗粒的粒径为20～40nm，所述Ca-Mg-Si生物玻璃涂层的厚度为30～100nm。

较佳地，所述Ca-Mg-Si生物玻璃为镁黄长石、白硅钙石、透灰石、和镁蔷薇辉石中的至少一种。

另一方面，本发明还提供上述纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜的制备方法，采用脉冲激光沉积技术，以Ca-Mg-Si生物陶瓷为靶材，在图案化电纺纤维膜表面沉积Ca-Mg- Si生物玻璃涂层。

本发明中，通过采用脉冲激光沉积法，可以制得涂层均匀、稳定性好的Ca-Mg-Si生物玻璃涂层，从而使制得的纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜具有更好的生物活性。而且该方法工艺简单、条件易于控制、可重复性好。另外，可以通过控制工艺参数来控制涂层厚度、结晶度及晶粒大小等。

较佳地，在所述脉冲激光沉积技术中，激光器频率为5～20Hz，基体与靶材之间的距离为5～10cm，激光束与靶材表面成30～60度角，沉积温度为10～50℃，气氛压强为 10～50Pa，沉积时间为5～40分钟。

较佳地，沉积过程中靶材以1000～3000转/小时的速度旋转。

较佳地，所述Ca-Mg-Si陶瓷的制备包括如下步骤：按Ca-Mg-Si陶瓷的化学计量比称取正硅酸乙酯、可溶性钙盐和可溶性镁盐为原料，经溶胶凝胶法制得干凝胶；以及将所得干凝胶在1000～1400℃下煅烧得到Ca-Mg-Si陶瓷。

较佳地，所述图案化电纺纤维膜的制备包括如下步骤：以具有编织结构的导电模板作为静电纺丝收集器，将电纺溶液或熔体进行静电纺丝，静电纺丝过程中电压为6～12kv，收集距离为10～15cm，电纺流量为0.01～0.06ml/分钟，收集时间为15～60分钟。

又一方面，本发明还提供上述纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜在制备创面修复材料中的应用。

附图说明

图1为无涂层的图案化电纺纤维膜(PT)、生物玻璃涂覆的无纺纤维膜(NW-NBG)以及生物玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)的SEM(扫描电镜)图，其中，图案结构为微米级别(100～800μm)，纤维结构为纳米级别(500～1000nm)，生物活性玻璃颗粒为纳米级别(约为30nm)；

图2A为无涂层图案化纤维膜的EDS(能谱分析)图；

图2B为生物活性玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)的EDS图；

图2C为生物活性玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)及无涂层图案化纤维膜的XRD(X- 射线衍射)图；

图2D为生物活性玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)及无涂层图案化纤维膜的水接触角图；

图3为将不同类型的创面修复材料植入实验鼠背部创伤区域随着时间的变化情况；

图4为3天以及7天后经过不同创面修复材料处理后的创伤区域组织的组织染色观察情况；

图5为3天以及7天后经过不同创面修复材料处理后的创伤区域组织的组织荧光染色 (CD31)观察情况以及内皮生长因子(VEGF)的表达情况；

图6为7天后经过不同创面修复材料处理后的创伤区域组织的Masson’s三色染色情况，其中蓝色代表胶原纤维；图中C为利用Western blotting对COL 1和COL 3进行表达分析。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明一方面提供一种纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜，其包括图案化电纺纤维膜和均匀涂敷于所述图案化电纺纤维膜表面的Ca-Mg-Si生物玻璃涂层。该Ca-Mg-Si生物玻璃涂层呈现纳米级别的颗粒，其粒径可为20～40nm。该Ca-Mg-Si生物玻璃涂层的厚度可为30～100nm。

本发明的纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜呈多级微纳米结构，包括微米级图案结构、纳米级纤维结构、和纤维表面纳米颗粒结构。其中微米级图案结构的图案形状可为正方形、圆形、条纹状、菱形等任意形状。图案大小可为100～800μm。构成图案的纳米级纤维结构的直径可为500～1000nm。位于纤维表面的Ca-Mg-Si生物玻璃颗粒如上所述粒径可为20～40nm。该图案具有三级微纳米结构，从大孔微米级，到几百纳米纤维，再到几十纳米的颗粒。

这种多级微纳米结构与生物活性玻璃涂层能够显著提高材料的生物活性。并且采用体内实验鼠背部创面愈合实验证明了这种多级微纳米结构与纳米生物活性玻璃涂层能够协同促进创面的修复，提高创面修复速率以及快速上皮化，并且还能够促进创伤区域血管新生以及胶原沉积，在一定程度上还能够减少疤痕组织的形成。

本发明中，Ca-Mg-Si生物玻璃涂层是含有Ca、Mg和Si的三元组分的生物玻璃，包括但不限于镁黄长石、白硅钙石、透灰石、镁蔷薇辉石。

在一个优选的实施方式中，Ca-Mg-Si生物玻璃涂层通过脉冲激光沉积法制得。由此可以使Ca-Mg-Si生物玻璃涂层涂敷均匀、结构稳定，有利于提高其生物活性，而且易于获得纳米级别的生物玻璃颗粒。

本发明中，图案化电纺纤维膜的材料没有特别限制，只要是能够通过静电纺丝技术制备成图案化电纺纤维膜的高分子聚合物都可以适用，包括但不限于聚己内酯、聚乳酸、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、壳聚糖等。优选为具有生物相容性的高分子聚合物。

可以采用Ca-Mg-Si体系生物陶瓷为原材料(靶材)，在具有微米级图案结构的静电纺丝纳米纤维膜(图案化电纺纤维膜)上，利用脉冲激光沉积法制备上述纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜。

作为靶材的Ca-Mg-Si陶瓷可以通过溶胶凝胶法制备。在一个示例中，按Ca-Mg-Si陶瓷的化学计量比称取正硅酸乙酯、可溶性钙盐和可溶性镁盐为原料，经溶胶凝胶法制得干凝胶；以及将所得干凝胶在1000～1400℃下煅烧得到Ca-Mg-Si陶瓷。其中可溶性钙盐包括但不限于硝酸钙、氯化钙等。可溶性镁盐包括但不限于硝酸镁、氯化镁等。

图案化电纺纤维膜通过静电纺丝法制备。具体方法可参见现有技术例如CN101182650等。在一个示例中，电纺液可以是适合电纺的高分子聚合物的溶液或熔体。电纺溶液的浓度可为3～10％,w/v。作为静电纺丝收集器，可以采用具有编织结构的导电模板，其编织结构和尺寸可根据所需的图案化电纺纤维膜的结构和尺寸来选择，例如可为边长为100-800μm的正方形。在一个示例中，电纺过程中电压为6～12kv，收集距离为10～15cm，电纺流量为0.01～0.06ml/min，收集时间为15～60min，制得具有正方形编织结构(图案大小为100-800μm)的图案化电纺纤维膜。

在脉冲激光沉积法中，例如可以采用KrF激光器(波长248nm，脉冲宽度20ns)。激光器频率可为5～20Hz。基体与靶材之间的距离可为5～10cm。激光束与靶材表面可成 30～60度角。气氛压强可为10～50Pa。沉积温度可为10～50℃。沉积时间可为5～40分钟。可以通过调控沉积温度、气氛压强、靶基距、以及沉积时间来控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。为提高沉积薄膜的均匀性以及防止靶材被击穿,沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷可以 1000～3000r/hr的速度旋转。

以下，作为示例，说明本发明的一个实施方式。在该实施方式中，通过脉冲激光沉积法制备了纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜；通过系统研究生物纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜是否具有良好的生物活性及促创面愈合能力等性能来确定其是否能够用作新型的创面修复材料。具体如下。

1.激光脉冲沉积法制备纳米生物玻璃及表征

试验用脉冲激光沉积薄膜的基体材料为图案化静电纺丝材料，实验采用金属平板以及具有编织结构的导电模板作为静电纺丝收集器(边长为100-800μm)(筛网，市场购买所得)，将聚己内酯/聚乳酸(1/9～9/1,w/w)溶于DMF/THF(1/1～5/1,v/v)中配得电纺溶液(3～10％, w/v)，电纺过程中电压为6～12kv，收集距离为10～15cm，电纺流量为0.01～0.06ml/min，收集时间为15～60min，由此制得具有无纺结构纤维膜(NW)以及正方形编织结构(图案大小为100-800μm)的图案化电纺纤维膜(PT)。并且将一部分所得到的无纺纤维膜以及图案化纤维膜分别用于下一步的激光脉冲表面沉积纳米生物活性玻璃颗粒。

用于脉冲激光沉积薄膜的靶材为Ca-Mg-Si体系生物陶瓷。采用正硅酸乙酯(TEOS)、四水合硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O]和六水合硝酸镁[Mg(NO3)2·6H2O]为原料, 经溶胶、凝胶、陈化、干燥等过程,并在1300℃下煅烧得到纯的Ca-Mg-Si陶瓷粉体。

实验采用KrF激光器(波长248nm，脉冲宽度20ns)。激光器频率5-10Hz，静电纺丝纤维膜与致密陶瓷块体靶材之间的距离为5-10cm，激光束与靶材表面成30-60度角。为提高沉积薄膜的均匀性以及防止靶材被击穿，沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷以2400r/hr的速度旋转，采用分子泵对沉积室抽真空到20Pa，使用机械泵控制其压强。本试验主要通过调控沉积温度(室温10-50℃范围)、气氛压强(10-50Pa)、靶基距(5-10cm)以及沉积时间(5- 40分钟)来控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。由此制得表面涂覆有纳米生物活性玻璃的无纺结构纤维膜(NW-NBG)以及表面涂覆有纳米生物活性玻璃的图案化纤维膜(PT-NBG)。

所获得的涂层通过广角X-射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)及能谱分析(EDS)等对涂层材料的物相组成、表面微观结构进行分析与表征，并对该新型皮肤组织工程支架材料的体内促创面愈合能力进行系统的研究。

本发明采用脉冲激光技术(PLD)在图案化电纺纤维膜表面制备具有结构稳定的生物活性玻璃涂层，提高了图案化纤维膜表面的生物活性。通过脉冲激光沉积方法制备了纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜，具有工艺比较简单，条件易于控制等优点。而含纳米生物玻璃的图案化电纺纤维膜用作创面修复材料具有良好的生物活性、促创面愈合等多功能特性。因此，本发明制备的纳米生物涂敷的图案化电纺纤维膜具有很强的实用意义，是一种新型的具有生物活性的创面修复材料。

本发明还提供由该纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜所制备的医疗产品及其用途，所述医疗产品是皮肤组织工程支架。

本发明的纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜及其医疗产品可用于创面修复。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实例1：纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜的制备

实验采用具有编织结构的导电模板作为静电纺丝收集器，将聚己内酯/聚乳酸(1/1,w/w)溶于DMF/THF(4/1,v/v)中配得电纺溶液(4.8％,w/v)，电纺过程中电压为10kv，收集距离为12cm，电纺流量为0.02ml/min，收集时间为30min，制得具有正方形编织结构(边长为300μm)的图案化电纺纤维膜。实验采用KrF激光器(波长248nm,脉冲宽度20ns)。激光器频率5Hz，图案化纤维膜与陶瓷靶材之间的距离为5.5cm，激光束与靶材表面成45度角。为提高沉积薄膜的均匀性以及防止靶材被击穿，沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷以2400r/hr的速度旋转，采用分子泵对沉积室抽真空到20Pa，使用机械泵控制其压强。本试验主要通过调控沉积温度(室温)、气氛压强(20Pa)、靶基距(5.5cm)以及沉积时间(40分钟)来控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。

实例1-2检测所得涂层的效果

所获得的涂层通过广角X-射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)及能谱分析(EDS)等对涂层材料的物相组成、表面微观结构进行分析与表征。图1为无涂层的图案化电纺纤维膜(PT)、生物玻璃涂覆的无纺纤维膜(NW-NBG)以及生物玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)的SEM图，其中，图案结构为微米级别(100～800μm)，纤维结构为纳米级别(500～1000 nm)，生物活性玻璃颗粒为纳米级别(约为30nm)。在图1中，图1A为生物玻璃涂覆的无纺纤维膜(NW)，图1a为图1A中的单根纤维的形貌图，图1a’为图1a中单根纤维表面形貌的进一步放大细节图。图1B为无涂层的图案化电纺纤维膜(PT)，图1b为图1B中的单根纤维的形貌图，图1b’为图1b中单根纤维表面形貌的进一步放大细节图。图1C为生物玻璃涂覆的正方型微图案结构的纤维膜(PT-NBG)，图1c为图1C中的单根纤维的形貌图，图 1c’为图1c中单根纤维表面形貌的进一步放大细节图。图1D为生物玻璃涂覆的圆型微图案结构的纤维膜。图1E为生物玻璃涂覆的条纹状微图案结构的纤维膜。图1F为生物玻璃涂覆的菱形微图案结构的纤维膜。图2A为无涂层图案化纤维膜的EDS图，图2B为生物活性玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)的EDS图，图2C为生物活性玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)及无涂层图案化纤维膜的XRD图，图2D为生物活性玻璃涂覆的图案化纤维膜(PT-NBG)及无涂层图案化纤维膜的WCA图。EDS结果显示与涂层前相比，涂层后的图案化纤维膜表面具有明显的Ca、Mg、Si等元素峰，但XRD结果显示涂层前后复合纤维膜的晶型未发生变化，均为无定形结构，即图案化纤维膜表面的纳米颗粒为生物玻璃形态。表面润湿性检测结果显示，涂层后的纤维膜表面的亲水性得到了极大的提高，均为0°。

实例2研究创面修复材料中多级微纳米图案结构以及纳米生物活性玻璃对小鼠体内的创面修复速率以及质量的影响及其相关机理

2.1实验鼠体内全皮层创伤修复重建实验

40只18g的雄性BALB/c实验鼠(国家啮齿类实验动物资源中心，中国上海分公司)，利用麻醉呼吸机将小鼠麻醉后，将老鼠背部区域的毛发去除后，建立一个完整的厚度伤口(直径为8mm)。将创面修复材料分别植入小鼠创伤区域，它们分别是：(1)无植入材料(Control)；(2)无纺结构纤维膜(NW)；(3)表面涂覆有纳米生物活性玻璃的无纺结构纤维膜(NW-NBG)；(4)图案化纤维膜(PT)；(5)表面涂覆有纳米生物活性玻璃的图案化纤维膜(PT-NBG)，每组8只老鼠。在植入前，支架材料分别用75％的究竟进行浸泡消毒灭菌 30min，之后在PBS溶液中清洗两遍。植入后老鼠背部创伤区域用医用胶带固定。手术后，老鼠被分别关在无菌环境下的装有充足水以及食物的笼子中。利用数码相机在固定的时间点 (1，3，5，7，9，11天)、固定的距离以及角度记录创伤区域的变化情况，并对其面积进行计算；

面积收缩率(％)＝[A₀-A_t]/A₀×100％

其中A₀和A_t分别是原始的创伤区域面积以及在固定的时间点“t”时的创伤面积；

另外，每组其中4只老鼠在3天和7天的时候被处死，取出创伤区域周围的组织标本(2mm 左右)进行组织分析。

图3为将不同类型的创面修复材料植入实验鼠背部创伤区域随着时间的变化情况。相对于空白对照组(control)以及涂层前后的无纺纤维膜(NW和NW-NBG)，图案化膜(PT)以及涂层后的图案化纤维膜(PT-NBG)能够明显提高伤口的愈合速度。

2.2创伤区域组织形态定量分析

将取得的组织标本用4％的多聚甲醛固定至少12h后，利用分级醇以及二甲苯脱水后，进行石蜡包埋，利用RM2155切片机切取5μm厚切片，采用苏木精和曙红对组织样本进行常规组织染色固定。Masson三色染色用作观察创伤组织处胶原网络的形成情况。采用奥林巴斯倒置显微镜观察创伤区域情况，Image Pro Plus version 6.0(Media Cybernetics,Rockville,MD, USA)进行拍照，其中蓝绿色表示胶原纤维，并且通过计算像素点来统计胶原纤维的形成情况。

图4为3天以及7天后经过不同创面修复材料处理后的创伤区域组织的组织染色观察情况。结果显示，相对于空白对照组(Control)以及植入图案化纤维膜组(PT)，表面涂覆有纳米生物活性玻璃的图案化纤维膜(PT-NBG)能够明显促进皮肤组织的形成。图6中的图A和B为7天后经过不同创面修复材料处理后的创伤区域组织的Masson’s三色染色情况，其中蓝色代表胶原纤维，结果显示PT-NBG同样能够促进胶原纤维的沉积，并且创伤处胶原纤维的排列更为规整。

2.3免疫组织荧光染色分析

将同样切片后的组织标本(5μm)在柠檬酸钠缓冲溶液中浸泡20min后，冷却至室温至少一个小时，然后在4℃下进行一抗(rabbit polyclonal to CD31 antibody(Abcam))孵化过夜。之后，将其浸泡在PBS中清洗，在室温下进行两个小时的二抗孵化过程。最后，将4’,6- diamidino-2-phenylindole(DAPI)添加到样品中(避光)。利用荧光显微镜(LeicaConfocal microscope)进行观察分析。

图5中的图A和B分别为3天以及7天后经过不同创面修复材料处理后的创伤区域组织的组织荧光染色(CD31)观察情况。结果显示PT-NBG能够促进CD31的表达，即创伤处血管的新生。

2.4 Real Time-PCR检测细胞样本

主要检测成血管化基因(VEGF)。简要步骤如下：样本处理；细胞样品Total RNA的抽提；用逆转录酶Reverse Transcriptase M-MLV(D2640A,Takara)进行逆转录合成cDNA；Real time PCR扩增体系和反应条件；数据分析。

图5中的图D为内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果显示PT-NBG能够促进 VEGF的高表达。

2.5 Western blotting进行胶原蛋白表达分析

将创伤区域组织浸泡在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲溶液中，通过二辛可宁酸法(Bicinchoninic acid assay(Thermo Scientific))进行蛋白浓度测定，然后将样本煮10min用于蛋白变形。所有的样本被用来制备10％SDS-PAGE凝胶并且转化为聚乙二烯二氟化物膜 (Gibco)，然后利用5％的牛奶进行封闭1h。对其在4℃下进行特定的抗体如COL 1 A2 and COL 3 A1(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA),β-actin(Sigma)孵化过夜。最后通过Odyssey Western blotting detection system进行可视信号检测。

图6中的图C为利用Western blotting对COL 1(I型胶原)和COL 3(III型胶原) 进行表达分析。结果表面PT-NBG以及PT组均能够很好地促进胶原蛋白的表达。

Claims (7)

1.一种采用脉冲激光沉积技术制备用于皮肤创面修复的纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜的方法，其特征在于，所述纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜包括图案化电纺纤维膜和均匀涂敷于所述图案化电纺纤维膜表面的Ca-Mg-Si生物玻璃涂层，所述图案化电纺纤维膜的材料为高分子聚合物，选自聚己内酯、聚乳酸、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、壳聚糖，所述图案化电纺纤维膜中图案的尺寸为100～800 µm，纤维的直径为500～1000 nm，所述Ca-Mg-Si生物玻璃涂层是采用脉冲激光沉积技术，以Ca-Mg-Si生物陶瓷为靶材，在图案化电纺纤维膜表面沉积而得，在所述脉冲激光沉积技术中，激光器频率为5～20Hz，基体与靶材之间的距离为5～10 cm，激光束与靶材表面成30～60度角，沉积温度为10～50℃，气氛压强为10～50 Pa，沉积时间为5～40分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米生物玻璃涂敷的图案化电纺纤维膜呈多级微纳米结构，包括微米级图案结构、纳米级纤维结构、和纤维表面的纳米Ca-Mg-Si生物玻璃颗粒结构。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Ca-Mg-Si生物玻璃颗粒的粒径为20～40nm，所述Ca-Mg-Si生物玻璃涂层的厚度为30～100nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ca-Mg-Si生物玻璃为镁黄长石、白硅钙石、透灰石、和镁蔷薇辉石中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，沉积过程中靶材以1000～3000转/小时的速度旋转。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ca-Mg-Si生物陶瓷的制备包括如下步骤：按Ca-Mg-Si生物陶瓷的化学计量比称取正硅酸乙酯、可溶性钙盐和可溶性镁盐为原料，经溶胶凝胶法制得干凝胶；以及将所得干凝胶在1000～1400℃下煅烧得到Ca-Mg-Si生物陶瓷。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述图案化电纺纤维膜的制备包括如下步骤：以具有编织结构的导电模板作为静电纺丝收集器，将电纺溶液或熔体进行静电纺丝，静电纺丝过程中电压为6～12kv，收集距离为10～15 cm，电纺流量为0.01～0.06 ml/分钟，收集时间为15～60 分钟。

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