CN102145194A - 具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医用材料领域。要解决的主要技术问题是现有的磷酸钙生物活性涂层的成骨活性有待进一步提高。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种能有效促进细胞粘附、增殖、分化，且兼具良好力学性能的具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料及其制备方法。本发明方在多孔磷酸钙涂层表面直接复合胶原表面层得到新的生物医用材料。其既能加速骨的形成，促进植入体的早期固定，还可在胶原表面层装载促进成骨的生长因子及多肽，进一步增进其诱导成骨能力及促进骨的早期长入。本发明工艺简单，生产成本低，可大幅度提高现有植入器械的安全性和成功率，加速病人早期康复。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种能有效地促进细胞粘附、增殖、分化，加速新骨形成且兼具良好力学性能的有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料及其制备方法。
背景技术
在钛合金表面制备磷酸钙生物陶瓷涂层，因其兼具金属基体材料优良力学性能和磷酸钙涂层良好生物活性，被广泛用于人工关节、牙种植体等承载用骨修复替换材料。随着关节置换病人的年轻化，对植入器械表面成骨活性提出更高的要求，以加速骨的早期长入，促进假体与骨的早期愈合。
胶原是天然骨的主要有机物组成成分，同时也是细胞外基质的主要成分，在骨修复中起到重要的作用。研究证实，胶原可以显著改善涂层表面的生物活性，促进成骨细胞在材料表面的黏附，增殖和分化。同时，胶原可以作为生长因子(M.Murata，B-Z.Huang，T.Shibataet al.Bone augmentation by recombinant human BMP-2and collagen on adult rat parietalbone，Oral Maxillofacial Surgery，1999；28；232-237)和多肽(Myles JL，Burgess B T，Dickinson BT.Modification of the adhesive properties of collagen by covalentgrafting with RGD peptides.J Biomater Sci Polymer Edn，2000，11(1)：69-86)良好的载体。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，作为整合素和其配体相互作用的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，如GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro)多肽。
现有研究多集中在胶原和磷酸钙复合形成的材料。如模拟生理环境浸泡法，前驱液矿化沉积法(Roveri N，Falini G，Sidoti MC.Biologically inspired growth of hydroxyapatitenanocrystals inside self-assembled collagen fibers.J Mater Sci Eng，2003，23：441-446)，共沉淀法，羟基磷灰石/胶原的交联与固化(John A，Liu H，IKada Y，etal.A trial to prepare biodegradable collagen-hydroxyapatite composites for bonerepair.J Biomater Sci Polymer Edn，2001，12(6)：689-705)等。通过仿生技术反应得到的HA晶体沉积于胶原的纳米材料类似于骨的结构，但其力学性能存在不足，不能用于承载部位。在金属材料表面上，多是采用将金属依次浸泡于Na2HPO4，Ca(OH)2过饱和溶液中预钙化，再在模拟体液中引入胶原，形成羟基磷灰石/胶原复合涂层(杨贤金，崔振铎，蔡彦丽等，镍钛合金表面羟基磷灰石/胶原复合涂层的化学制备方法专利公开号：200510133632.6)，或是将Ca(NO3)2，NH4H2PO4和I型胶原通过电化学方法在金属表面形成羟基磷灰石/胶原复合涂层(S.Manara，F.Paolucci，B.Palazzo et al.Electrochemically-assisted depositionof biomimetic hydroxyapatite-collagen coatings on titanium plate.J InorganicaChimica Acta，2008；361；1634-1645)但其缺点是制备过程复杂且界面的韧性较差，涂层厚度不够，在冲击载荷或热冲击作用下，容易发生脆性断裂或剥落。
本领域目前急需复合能有效地促进细胞粘附、增殖、分化，加速新骨形成且兼具良好力学性能的多孔磷酸钙-胶原复合涂层材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效地促进细胞粘附、增殖、分化，加速新骨形成且兼具良好力学性能的生物医用材料。
本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种新的具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料。该生物医用材料包括基底材料，在基底材料的外表面上复合多孔磷酸钙涂层，多孔磷酸钙涂层上还复合胶原构建成多孔磷酸钙-胶原复合涂层。
其中，上述多孔磷酸钙涂层为磷酸钙材料通过液相等离子喷涂法复合在基底材料上形成的。
其中，上述磷酸钙材料为羟基磷灰石或磷酸三钙。
进一步的，上述胶原装载有促进成骨的生长因子或功能多肽。进一步的，所述的生长因子为人重组骨形态发生蛋白-2；所述功能多肽为RGD肽。
其中，上述的基底材料为生物医用金属材料、生物医用陶瓷材料、含金属的生物医用复合材料或含陶瓷的生物医用复合材料中的至少一种。
其中，上述生物医用金属材料为生物医用钛合金材料、生物医用不锈钢材料、生物医用钴基合金材料中的至少一种。
其中，上述生物生物医用陶瓷材料为氧化铝陶瓷材料或氧化锆陶瓷材料。
本发明还提供了一种制备上述生物医用材料的方法。该方法包括以下步骤：
a、配制磷酸钙悬浮液；
b、将步骤a得到的磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域，将其喷涂至基底材料的表面，生成具有多孔的磷酸钙涂层的生物医用材料；
c、将步骤b得到的具有的多孔磷酸钙涂层的生物医用材料浸入胶原溶液中18～36小时或将胶原溶液滴加在多孔磷酸钙涂层表面；然后将材料在无菌条件下风干，即得。
其中，上述方法步骤a所述的磷酸钙悬浮液的制备方法为：
边搅拌边将摩尔浓度为1.2～3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1～3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30℃～90℃，以氨水控制其pH保持在9～12，反应后静置5～15分钟，再陈化24～48小时。
其中，上述方法中步骤b所述的将磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域是采用雾化喷嘴进行；等离子喷涂功率为20～70千瓦，喷涂距离为80～180mm。
其中，上述方法中步骤c所述胶原溶液为胶原的醋酸溶液。
本发明还提供了使用上述的方法制备的生物医用材料。
其中上述步骤a中多孔磷酸钙涂层的制备采用液相等离子喷涂，利用现有的技术制备磷酸钙液相先驱液，利用磷酸钙先驱液作为喷涂原料，通过雾化喷嘴将液体先驱液原料直接注入等离子火焰高温区域，在极短时间(小于1微秒)完成与火焰的热交换过程，随后经过原料中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后直接喷射在生物医用基底上形成涂层。
其中上述作为多孔磷酸钙涂层基底的材料需要能耐受等离子喷涂的高温。如，生物医用金属材料和生物医用陶瓷材料。作为基底的生物医用金属材料包括生物医用钛，或生物医用不锈钢，或生物医用钴基合金，或其他生物医用金属材料，或含金属的生物医用复合材料。作为基底的生物医用陶瓷材料包括氧化铝陶瓷，或氧化锆陶瓷，或其他生物医用陶瓷材料，或含陶瓷的生物医用复合材料。
其中上述的胶原可为I型胶原，可采用本领域常用的胶原材料。
其中上述b中多孔磷酸钙-胶原涂层的构建采用在磷酸钙涂层表面直接复合胶原表面层的方法，包括浸泡法，滴加法等方法。
本发明产品可使用以下路线进行制备：
A多孔磷酸钙涂层的制备
按羟基磷灰石、磷酸三钙等的钙磷摩尔比，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.2-3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1-3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30-90℃，以质量百分比浓度10％-30％的氨水控制其pH保持在9-12，反应后静置5-15分钟，再陈化24-48小时，加入常用的造孔剂。通过小角度雾化喷嘴将磷酸钙先驱液进行雾化，直接将先驱液注入等离子火焰中心的高温区域，直接在作为基底的生物医用材料表面沉积生成多孔磷酸钙涂层。其中等离子喷涂功率为20-70千瓦，所述作为基底的生物医用材料与等离子喷嘴距离为8-18厘米。涂层空隙结构在较大范围可调(从接近完全致密到～50％孔隙度)。
B优化设计的I型胶原材料的配制
I型胶原的浓度，pH值等因素对涂层成骨活性都有一定的影响。通过调节胶原的浓度，pH值，浓度范围3mg/ml-10mg/ml，pH值3-6.5，进行优化设计，最大限度提高涂层性能。总之，可根据具体临床应用需要，对胶原进行优化设计。
为进一步赋予材料与临床使用密切相关的多种功能，可在胶原装载促进成骨的生长因子及功能多肽，如人重组骨形态发生蛋白-2能有效地促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，诱导骨分化；成骨细胞及骨髓基质干细胞在种植体表面的黏附、增殖、分化是植入体与骨界面有效早期整合的前提和关键，而RGD多肽能粘附在植入体表面，从而提高成骨细胞的黏附和活性，加速骨基质矿化。将生长因子和功能多肽配制成适宜浓度的液体，在直接滴加到胶原溶液中搅拌混匀即可用于多孔磷酸钙-胶原涂层的构建。
C多孔磷酸钙-胶原涂层的构建
采用浸泡法，滴加法等在多孔结构磷酸钙涂层表面涂覆I型胶原。
将胶原溶解于醋酸溶液中(醋酸主要用于调节pH值)，配置成胶原溶液。将涂层在无菌条件下浸没于胶原溶液中18-36小时，或胶原溶液滴加在涂层表面，之后在超净台内风干12-36小时。
该制备过程简单，所制得的磷酸钙/胶原复合层材料在能有效的促进细胞在材料表面的粘附，增殖和分化且兼力学特性，并能进一步装载促进成骨的生长因子功能多肽，进一步增进其诱导成骨能力及促进骨的早期长入。
现有技术多为多孔磷酸钙-胶原混合的涂层材料，制备过程复杂且界面的韧性较差，涂层厚度不够，在冲击载荷或热冲击作用下，容易发生脆性断裂或剥落。无法得到能有效地促进细胞粘附、增殖、分化，且兼具良好力学性能的多孔磷酸钙-胶原复合涂层。解决这些问题的一个有效方法是在其涂层表面直接复合胶原表面层，这样既可以进一步提高涂层生物活性和成骨能力，同时胶原又是一种良好的载体，可以装载各种促进成骨的生长因子和多肽，进一步增进其诱导成骨能力及促进骨的早期长入。另外由于使用生物医用材料作为基底，即在植入器械表面直接复合多孔磷酸钙-胶原生物活性涂层，这样作为植入材料具有很好的力学性能，可以应用在承载部位。同时满足对植入器械表面生物活性及力学性能的综合要求，具有很大的临床运用前景。此方法的关键是如何有效地将胶原很好地复合在生物活性涂层表面。现有植入器械表面的生物活性涂层多为致密结构，难以有效地将胶原复合在生物活性涂层表面，且复合层的性能很差。
为解决这一难题，本发明采用液相等离子喷涂技术制备具有多孔结构的涂层，具体方法参见申请号为200910302244.4的公开的中国专利申请。其优点为涂层孔隙结构在较大范围可调(从接近完全致密到～50％孔隙度)。然后在这种多孔涂层上面直接复合胶原表面层得到多孔磷酸钙-胶原涂层，并可以在胶原涂层中装载生长因子和功能多肽以获得更好的性能，此种结构兼具力学性能的同时可以更好的改善材料表面的生物活性及成骨能力。
本发明与现有技术相比具有以下有益技术效果：
1、现有研究多集中在胶原和磷酸钙或其他高分子的复合材料，而这些复合材料的强度较低，往往仅能用在非承载部位，其制备过程往往较为繁复，对其降解速率也很难控制。本发现制备过程通过在医用植入器械的生物活性涂层表面直接复合胶原，方法简单，制作成本低，可直接用于承载植入部位。
2、常规生物活性涂层多为致密结构，不能有效地将胶原装载在生物活性涂层表面。针对植入体早期器械表面活性和骨长入能力，促进成骨临床实际需要，利用液相等离子喷涂新技术制备多孔生物活性涂层，并复合胶原，为细胞的粘附，增殖，扩展和分化提供良好的生物界面，有利于促进植入体在术后的早期固定。而且涂层孔隙率结构在较大范围可调(从接近完全致密到～50％孔隙度)，可对胶原的释放速率进行调控。
3、多孔涂层上面直接复合胶原表面层，胶原表面层再进一步装载生长因子及多肽，这种复合结构更容易牢固吸附生长因子及多肽，降低了其在体内的释放速率，使其在局部发挥更为持久的生物诱导活性作用。而且还提供有利于骨质沉积的支架，避免了生长因子和多肽的快速破坏，减少了用量。
4、本方法制备的材料能有效地促进细胞黏附、增殖、分化，加速新骨形成且兼具力学性能，能广泛的用于骨等硬组织的修复中。
总的说来，表面多孔结构的纳米涂层比现今临床用商业化产品有更好的促进成骨细胞增殖、分化能力，增强材料的组织修复能力。在这种多孔涂层上面直接复合胶原表面层，改变植入器械表面特性，从而使植入器械具有更为优良的生物相容性和细胞亲和性，为细胞的黏附、增殖、扩展和分化提供良好的生物界面，可大幅度提高现有植入器械成功率，加速病人早期康复。
附图说明
图1液相等离子喷涂制备的具有多孔结构羟基磷灰石涂层扫描电镜照片
图2复合胶原的多孔羟基磷灰石涂层扫描电镜照片
图3接种BMSC细胞与涂层表面4天后，多孔磷酸钙涂层(3-A)，磷酸钙-胶原复合涂层(3-B)，磷酸钙-装载人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)胶原复合涂层(3-C)，磷酸钙-装载RGD多肽胶原复合涂层(3-D)表面的细胞粘附情况的扫描电镜照片。
图4MTT法对BMSC细胞在各种涂层表面的增殖情况(2d，4d，6d)OD值的检测。图中每天的柱状图从左至右依次为多孔磷酸钙涂层(HA)，磷酸钙-胶原复合涂层(HA+Col)，磷酸钙-装载人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)胶原复合涂层(HA+Col+BMP)，磷酸钙-装载RGD多肽胶原复合(HA+Col+RGD)。
图5Elisa法对BMSC在各种涂层表面生长过程中的分化早期碱性磷酸酶(ALP)的检测结果，单位ng/ml。图中分别表示2d、4d、6d结果的柱状图从左至右依次为多孔磷酸钙涂层(HA)，磷酸钙-胶原复合涂层(HA+Col)，磷酸钙-装载人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)胶原复合涂层(HA+Col+BMP)，磷酸钙-装载RGD多肽胶原复合(HA+Col+RGD)。
图6Elisa法对BMSC在各种涂层表面生长过程中的分化晚期骨钙素(OCN)的检测结果(2d、4d、6d)，单位ng/ml。
图中分别表示2d、4d、6d结果的柱状图从左至右依次为多孔磷酸钙涂层(HA)，磷酸钙-胶原复合涂层(HA+Col)，磷酸钙-装载人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)胶原复合涂层(HA+Col+BMP)，磷酸钙-装载RGD多肽胶原复合(HA+Col+RGD)。
图7肉眼观察多孔磷酸钙-装载人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)胶原复合涂层植入动物体内异位成骨情况
图8多孔磷酸钙-装载人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)胶原复合涂层植入动物体内异位成骨的显微镜观察结果。
具体实施方式
以下结合附图通过具体实施方式的描述说明本发明。
本发明提供一种具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备方法，该方法是以等离子喷涂为基础，制备出多孔磷酸钙涂层，直接在多孔涂层表面上复合胶原表面层。
具体操作步骤为：
A多孔磷酸钙涂层的制备
按羟基磷灰石、磷酸三钙等的钙磷摩尔比，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.2-3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1～3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30-90℃，以质量百分比浓度10％-30％的氨水控制其pH保持在9-12，反应后静置5-15分钟，再陈化24-48小时，加入常用的造孔剂(如去离子水)。通过小角度雾化喷嘴将羟基磷灰石先驱液进行雾化，直接将先驱液雾化注入等离子火焰中心的高温区域，喷涂原料的熔融，直接在作为基底的生物医用材料表面沉积生成多孔磷酸钙涂层。涂层空隙结构在较大范围可调(从接近完全致密到～50％孔隙度)。
B胶原材料的设计
胶原不同浓度，pH值等因素对涂层生物活性都有一定的影响。通过调节胶原浓度，pH值，浓度范围3mg/ml-10mg/ml，pH值3-6.5，进行优化设计，最大限度提高涂层生物活性。在浓度范围3mg/ml-10mg/ml内，当胶原浓度增大到7mg/ml时，pH 5-6.5，综合各方面因素，细胞增殖效果最好。
为了进一步增进其诱导成骨能力及促进骨的早期长入，可在胶原装载促进成骨的生长因子或多肽，将生长因子或多肽配制成适宜浓度的液体，在直接滴加到胶原溶液中搅拌混匀。
C多孔磷酸钙-胶原涂层的构建
在涂层表面直接复合I型胶原表面层，采用浸泡法，滴加法在多孔结构羟基磷灰石涂层表面涂覆胶原。将胶原溶解于醋酸溶液。再将无菌胶原1-2次滴加在涂层上，每次在超净台内风干12-36小时。形成多孔磷酸钙-胶原复合涂层，得到具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料。
以下通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述，但不应理解为是对本发明的限制。凡基于本发明上述思想做出的修改，替换，变更均属于本发明。
实施例一 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将2.8mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液70℃，以质量百分比浓度25％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置10分钟，再陈化24小时，即得固含量为34％的羟基磷灰石悬浮液。然后将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为17％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，在直径15mm，厚度1.5mm的生物医用钛合金基底上(Ti-6Al-4V，西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4，下同)形成厚度为120微米的涂层。涂层表面形貌采用扫描电镜进行观察。扫描电镜照片见图1。将胶原(以下实验所用胶原全部购于成都普川生物医用材料有限责任公司)溶解于醋酸溶液，浓度为7mg/ml，pH 6，再将胶原溶液0.2ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干12小时。再次将0.2ml的胶原溶液滴加在涂层上。之后在超净台内风干12小时。复合涂层表面形貌采用扫描电镜进行观察。扫描电镜图片见图2。
实施例二 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.8mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液70℃，以质量百分比浓度25％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置10分钟，再陈化24小时，即得固含量为34％的羟基磷灰石悬浮液。将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为17％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，最后在生物医用钛合金基底上形成厚度为120微米的涂层。将胶原溶解于醋酸溶液，pH 6，将人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)溶于超纯水中，浓度为1mg/ml，滴加到胶原溶液中混匀，最终浓度为25μg/ml(rhBMP-2/7mg/ml胶原)。装载rhBMP-2的胶原溶液0.2ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干12小时。再次将0.2ml的胶原溶液滴加在涂层上。之后在超净台内风干12小时。
实施例三 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.8mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液70℃，以质量百分比浓度25％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置10分钟，再陈化24小时，即得固含量为34％的羟基磷灰石悬浮液。将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为17％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，最后在直径15mm，厚度1.5mm的生物医用钛合金基底上(Ti-6Al-4V，西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4，下同)上形成厚度为120微米的涂层。将胶原溶解于醋酸溶液，pH6，将多肽GRGDSP(SEQ ID No 1，RGD中的一种)溶于超纯水中，浓度为5mg/ml，滴加到胶原溶液中混匀，最终浓度为0.5mg/ml(GRGDSP/7mg/ml胶原)。装载GRGDSP的胶原溶液0.2ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干12小时。再次将0.2ml的胶原溶液滴加在涂层上。之后在超净台内风干12小时。
实施例四 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.5mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.1mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液65℃，以质量百分比浓度20％的氨水控制其pH保持在11，反应后静置7分钟，再陈化30小时，即得固含量为31％的羟基磷灰石悬浮液，将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为15.5％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，在直径15mm，厚度1.5mm的生物医用钛合金基底上(Ti-6Al-4V，西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4，下同)上形成涂层，喷涂厚度为150微米。将胶原溶解于醋酸溶液中，浓度为7mg/ml，pH 5在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于胶原溶液中24小时，之后在超净台内风干15小时。
实施例五 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.7mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液65℃，以质量百分比浓度23％的氨水控制其pH保持在11.5，反应后静置12分钟，再陈化35小时，即得固含量为21％的羟基磷灰石悬浮液，将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为10.5％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，在直径15mm，厚度1.5mm的生物医用钛合金基底上(Ti-6Al-4V，西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4，下同)上形成涂层，喷涂厚度为130微米。将胶原溶解于醋酸溶液，浓度为5mg/ml，pH 4.5再将胶原溶液0.3ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干20小时。再次将0.3ml的胶原溶液滴加在涂层上，之后在超净台内风干20小时。
实施例六 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1.3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液50℃，以质量百分比浓度22％的氨水控制其pH保持在9，反应后静置5分钟，再陈化45小时，即得固含量为20％的羟基磷灰石悬浮液，将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为10％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，在直径15mm，厚度1.5mm的生物医用钛合金基底上(Ti-6Al-4V，西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4，下同)上形成涂层，喷涂厚度为150微米。将胶原溶解于醋酸溶液，浓度为9mg/ml，pH 6.5再将胶原溶液0.1ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干22小时。再次将0.1ml的胶原溶液滴加在涂层上，之后在超净台内风干22小时。
实施例七 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca3(PO4)2的钙磷摩尔比(1.5)，在不断搅拌下将摩尔浓度为3.0mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为3.0mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液55℃，以质量百分比浓度35％的氨水控制其pH保持在9.5，反应后静置5分钟，再陈化25小时，即得固含量为25％的磷酸三钙悬浮液，将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为12.5％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，在直径15mm，厚度1.5mm的生物医用钛合金基底上(Ti-6Al-4V，西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4，下同)上形成涂层，喷涂厚度为110微米。将胶原溶解于醋酸溶液中，浓度为5mg/ml，pH3.5在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于胶原溶液中30小时，之后在超净台内风干15小时。
实施例八 本发明具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的制备
按Ca3(PO4)2的钙磷摩尔比(1.5)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1.7mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液75℃，以质量百分比浓度20％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置15分钟，再陈化40小时，即得固含量为25％的磷酸三钙悬浮液，将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为12.5％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在直径15mm，厚度1.5mm的生物医用钛合金基底上(Ti-6Al-4V，西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4，下同)上形成涂层，喷涂厚度为150微米。将胶原溶解于醋酸溶液，浓度为8mg/ml，pH 5.5再将胶原溶液0.25ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干14小时。再次将0.25ml的胶原溶液滴加在涂层上，之后在超净台内风干14小时。
试验例一 本发明具多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的细胞粘附实验
取磷酸钙-胶原生物活性涂层(实施例1制备的羟基磷灰石-胶原复合涂层材料)，及装载rhBMP-2(实施2例制备的涂层材料)的活性涂层，装载RGD的活性涂层(实施例3制备的涂层材料)，磷酸钙涂层(按实施例1方法制备的仅有羟基磷灰石涂层材料)，置24孔培养板中。取第三代生长旺盛的幼兔的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)制得2×104/ml的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养4天后取出后，PBS冲洗一次。在4℃的条件下，用2.5％的戊二醛固定过夜。在临界点干燥前先用酒精(30％，50％，70％，80％，90％，95％，100％)梯度脱水，每次15分钟。喷金后500倍电镜(SEM)观察，结果见图3。
复合胶原的多孔磷酸钙和复合rhBMP-2/胶原的多孔磷酸钙，贴附在材料表面的细胞数量较为类似，并有大量伪足粘附在材料表面，显示出细胞对材料的较好的粘附作用。复合RGD/胶原的多孔磷酸钙，有大量细胞粘附在材料的表面，且细胞呈扁平状铺展开。而未经胶原表面修复的磷酸钙涂层表面，贴附的细胞数量很少，表示明复合胶原的各组比未复合组能更促进细胞的粘附。
试验例二 本发明具多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的细胞增殖试验
按试验例一的方式取磷酸钙-胶原生物活性涂层材料，及分别装载rhBMP-2、RGD的活性涂层材料，并取磷酸钙涂层材料作为对照，置24孔培养板中。取第三代生长旺盛的幼兔的骨髓间充质干细胞制得2*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养2天，4天，6天。使用MTT法在酶联免疫检测仪490nm处测得各个样品的OD值(结果见图4)。
结果表明，装载胶原及进一步装载功能多肽的磷酸钙涂层材料的OD指在第2、4、6天较磷酸钙涂层有显著性增加。在第4、6天，装载rhBMP-2和装载RGD多肽的胶原磷酸钙涂层相比胶原磷酸钙涂层的OD值有显著性增加。表明装载胶原后能有效地促进细胞增殖，装载生长因子及多肽的胶原能进一步促进细胞的增殖。
试验例三 本发明具多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料的细胞分化试验
按试验例一的方式取磷酸钙-胶原生物活性涂层材料，及分别装载rhBMP-2、RGD的活性涂层材料，并取磷酸钙涂层材料作为对照(同试验例一)，置24孔培养板中。取第三代生长旺盛的幼兔的骨髓间充质干细胞制得2*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在37℃，5％CO2培养箱中培养。分别在2天，4天，6天取出，每孔加10ul裂解液(Triton X-100)，反复吹打，并置37℃过夜，镜下观察已无完整细胞，按碱性磷酸酶和骨钙素试剂盒(BlueGene公司，中国)说明操作，测450nm出吸光度，并按其说明计算ALP和OCN的量。结果见图5、6。
随着时间的增加，胶原-磷酸钙涂层材料和磷酸钙涂层材料的ALP值逐渐增加，且相比与磷酸钙涂层材料有显著性增加。表明表面经胶原修饰后能有效地促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。随着时间的增加，OCN的值平缓增加，且装载胶原的各组相比没装载胶原组有显著性增加，且装载rhBMP-2/胶原组增加最为明显，表明表面经胶原修饰后能有效地促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，本发明更容易牢固吸附生长因子及多肽，降低了其在体内的降解速率，使其在局部发挥更为持久的生物诱导活性作用。
试验例四 本发明生物医用材料的体内成骨实验
成年新西兰大白兔5只，体重2.0-2.5kg，雌雄不限，清洁级。实验过程对动物的处置符合动物伦理学标准。将具有装载rhBMP-2的胶原-磷酸钙涂层的材料(直径为4mm，长度为10mm的一面有内凹的圆柱状钛合金短棒，涂层按实施例二制备，钛合金同实施例，购自西安宝鸡市棋鑫钛业有限公司，牌号TC4)植入兔的背部肌肉以观察材料的骨诱导性。在术后4周处死动物，取材后，立即将标本置于10％甲醛中固定24h，制成石蜡标本。标本垂直向切片，切片厚度5μm，HE染色，光镜下观察。图7，在肉眼观察下，能看到取出材料的红骨髓且皮质骨已经形成。图8在光境下能观察到大量的骨细胞。
Claims (10)
1.生物医用材料，其特征在于：所述生物医用材料包括基底材料，在基底材料的表面上复合多孔磷酸钙涂层，多孔磷酸钙涂层上复合胶原构建成多孔磷酸钙-胶原复合涂层。
2.根据权利要求1所述的生物医用材料，其特征在于：所述多孔磷酸钙涂层为磷酸钙材料通过液相等离子喷涂法复合在基底材料上形成。
3.根据权利要求1所述的生物医用材料，其特征在于：所述磷酸钙材料为羟基磷灰石或磷酸三钙。
4.根据权利要求1所述的生物医用材料，其特征在于：所述胶原装载有促进成骨的生长因子或功能多肽。
5.根据权利要求1所述的生物医用材料，其特征在于：所述的基底材料为生物医用金属材料、生物医用陶瓷材料、含金属的生物医用复合材料或含陶瓷的生物医用复合材料中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的生物医用材料，其特征在于：所述生物医用金属材料为生物医用钛合金材料、生物医用不锈钢材料或生物医用钴基合金材料中的至少一种；所述生物医用陶瓷材料为氧化铝陶瓷材料或氧化锆陶瓷材料。
7.制备权利要求1～6任一项所述的生物医用材料的方法：
a、配制磷酸钙悬浮液；
b、将步骤a得到的磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域，将其喷涂至基底材料的表面，生成具有多孔的羟基磷灰石涂层的生物医用材料；
c、将步骤b得到的具有的多孔羟基磷灰石涂层的生物医用材料浸入胶原溶液中或将胶原溶液滴加在多孔羟基磷灰石涂层表面；然后将材料在无菌条件下风干，即得。
8.根据权利要求7所述的制备生物医用材料的方法，其特征在于步骤b所述的中将磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域是采用雾化喷嘴进行；等离子喷涂功率为20～70千瓦，喷涂距离为80～180mm。
9.根据权利要求7所述的制备生物医用材料的方法，其特征在于所述胶原溶液为胶原的醋酸溶液。
10.使用权利要求7～9任一项所述的方法制备的生物医用材料。
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