CN107129969B - 诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法。现有技术中缺乏一种简便、经济、安全、有效的诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方法，本发明提供一种诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法：a、构建多孔磷酸钙支架；b、在步骤a的支架上复合胶原，形成纤维网络结构；c、将骨髓间充质干细胞接种于纤维网络中预培养4～48小时后，置于成骨诱导培养基中培养。本发明构建磷酸钙‑胶原支架，提供了适宜的微环境，再采用胶原复合在磷酸钙支架上，介导细胞间信号的级联放大；再置于成骨诱导培养基中培养，强化成骨相关转录因子的表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

Description

诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法。
背景技术
骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种成体干细胞，能够自我更新，具有多向分化潜能，在适当的诱导条件下可以定向分化成为软骨、成骨、肌肉、脂肪、神经等多种组织细胞。MSCs成为基础医学和临床学组织器官损伤修复以及再生领域研究的热点，但是目前还存在一些技术问题，如分化效率低或非定向分化形成异质细胞甚至异常分化成肿瘤细胞。在骨组织工程应用中，定向诱导MSCs分化为成骨细胞是利用其构建骨组织工程的一个关键步骤。
目前常用的诱导方法主要有：一、引入外源性诱导因子诱导干细胞分化。这种方法的问题为操作繁复，诱导效率低，价格昂贵，释放难控，不利于大规模临床推广应用。二、将某些蛋白或生长因子的重组DNA通过转基因技术导入干细胞，诱导其定向分化。应用转基因技术虽然提高了分化效率，降低了成本，但由于存在安全性、伦理性等问题，距临床应用还有很大的距离。因此，建立一种简便、经济、安全而又有效的诱导方法，是诱导干细胞向成骨方向分化及组织工程化骨构建的关键所在。
MSCs的微环境为启动或维持干细胞分化提供了关键的生化和物理信号。研究表明：激素、生长因子、细胞因子等组成的化学信号转导通路形成的复杂化学微环境能够调控骨髓间充质干细胞的分化命运；同样，适宜的物理微环境，如基体材料的力学性质、表面形貌等在干细胞分化过程中也发挥着不可忽视的调控作用。
培养介质作为细胞外化学微环境的重要调节因子已被公认为是目前体外诱导干细胞定向分化简单、有效的方法之一，常见诱导介质包括成骨、成软骨、成脂和成神经诱导介质等等。目前利用诱导介质调控干细胞定向分化已在各种组织修复中有大量研究报道。Ponticiello等将人骨髓间充质干细胞接种于明胶海绵中，在软骨诱导介质中培养3周，生成了软骨组织[Ponticiello MS,Schinaql RM,Kadiyala S,Barry FP.Gelatin-basedresorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells incartilage regeneration therapy.J Biomed Mater Res 2000；52:246～255.]。在成心肌诱导介质的作用下，间充质干细胞可向心肌细胞分化，这对于临床替代坏死或凋亡的心肌细胞，促进心功能恢复具有十分诱人的临床应用前景。但由于诱导介质主要用于体外培养，有较大的局限性，故而限制了诱导介质在组织工程中的广泛应用。另外，诱导介质对干细胞分化进程的调控机制与人体自然过程相比，有着较大的差异。
除了诱导介质中的外源性化学信号外，组织工程中必不可少的基质材料作为干细胞微环境的重要组成部分，对干细胞的分化命运同时起着重要的调控作用。当干细胞与基质材料相互作用时，基质材料直接影响干细胞的黏附和凝集，而凝集的干细胞之间通过交互应答的协同作用刺激周围细胞分泌特定细胞因子或分子信号，导致信号级联放大，从而影响干细胞的分化途径及命运。材料的生物活性基团同样可以影响干细胞的分化，尤其当采用细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)作为基质材料时，对干细胞的基本行为更是起着决定性的影响。麻省理工的Richard O.Hynes教授在Science的一篇综述文章详述了细胞外基质通过生物化学信号影响干细胞行为及分化进程的潜在机制：细胞外基质通过锚定整合蛋白，介导由内向外生化信号传递(inside-out signaling)和由外向内生化信号传递(outside-in signaling)，从而影响相关基因的表达，调控细胞分化[Hynes RO.Theextracellular matrix:Not just pretty fibrils.Science 2009；326:1216～1219]。除了生物化学信号外，细胞内外的力学微环境以及细胞机械力产生的机械信号也可直接影响干细胞的自我更新和分化。力学刺激可以激活干细胞表面受体和黏着斑，进而触发细胞内信号级联放大转化为生物学信号，引起一系列的生物学反应，最终影响干细胞的分化命运，MSC对材料表面的弹性尤为敏感。2006年Cell的一篇经典文章就曾报道基底弹性模量对干细胞分化命运起决定性作用：Engler等人研究发现在不存在化学诱导因子的条件下，将干细胞培养在25～40kPa(模拟类骨质硬度)的基质上，干细胞呈现与成骨细胞相似的多角形，并且成骨细胞标志分子Runx2表达水平上调[Engler AJ,Sen S,Sweeney HL,DischerDE.Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.Cell 2006；126:677～689.]。
MSCs的分化与其生长的微环境密切相关，但目前还没有一种简便、经济、安全而又精准有效的诱导方法能将其定向诱导为成骨细胞。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有技术中缺乏一种简便、经济、安全、有效的诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方法。
本发明提供一种诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，包括以下步骤：
a、构建多孔磷酸钙支架；
b、在步骤a的支架上复合胶原，形成磷酸钙-胶原纤维网络；
c、将骨髓间充质干细胞接种于步骤b中所述的磷酸钙-胶原纤维网络中预培养4～48小时后，加入成骨诱导培养基培养，得到成骨细胞。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤a中所述磷酸钙为磷酸二氢钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙或双相磷酸钙中的至少一种。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤a中所述的磷酸钙支架为磷酸钙陶瓷支架或磷酸钙涂层支架中的一种。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤a中所述磷酸钙支架的力学强度要求≥50kPa；孔隙率10～90％，优选30～60％；孔径10～500μm，优选50～200μm。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤b中所述的胶原为I型胶原，胶原浓度为1～15mg/ml，胶原的pH值为4～6.5。
优选的，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤b中所述的胶原浓度为7～9mg/ml，pH值为5～6.5。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤b中所述的复合胶原的操作为：采用物理吸附的方法将胶原直接复合在磷酸钙支架表面，在室温下风干12～36小时。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤b中所述的磷酸钙-胶原纤维网络中纤维直径为50～600nm，优选为100～300nm。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤c中所述的预培养时间优选为4～24小时。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤c中所述的成骨诱导培养基组成主要为：地塞米松10-5～10-2mmol/L，β-甘油磷酸钠5～20mmol/L，抗坏血酸0.02～0.05mmol/L；优选为地塞米松10-4mmol/L，β-甘油磷酸钠10mmol/L，抗坏血酸0.05mmol/L。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，通过构建磷酸钙-胶原支架，为干细胞成骨分化提供了一个适宜的微环境。采用具有特定力学强度、孔隙率和孔径的磷酸钙支架作为基体，为干细胞成骨分化提供适宜的力学微环境，引发细胞骨架重排，驱动细胞运动，触发分化信号的激活。再采用胶原复合在磷酸钙支架上，自组装形成特定直径大小的纤维网络结构，促使间充质干细胞在材料表面有效的锚定，加速了细胞与细胞及细胞与基体之间的交互作用，介导细胞间信号的级联放大。将骨髓间充质干细胞接种后，置于成骨诱导培养基中培养，成骨诱导培养基作为外源性诱导因子，强化成骨相关转录因子的表达，与磷酸钙-胶原协同作用，二者有效的启动并维持骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。本发明方法操作简单、经济、安全，精准有效的调控骨髓间充质干细胞向成骨分化，在骨疾病治疗、骨移植技术中有重要的临床应用价值。
附图说明
图1多孔羟基磷灰石涂层扫描电镜照片；
图2A、B分别为不同视野下胶原自组装的纤维结构图；
图3Elisa法对在成骨诱导条件下，BMSC在磷酸钙-胶原支架表面生长过程中的分化早期碱性磷酸酶(ALP)，和分化晚期骨钙素(OCN)的检测结果，单位ng/ml；图中分别表示2天、4天、6天、14天结果的柱状图从左至右依次为磷酸钙-胶原复合涂层+普通培养基，磷酸钙-胶原复合涂层+成骨诱导培养基；
图4Elisa法对在成骨诱导条件下，BMSC在磷酸钙-胶原支架表面生长过程中的成骨分化早期转录因子的检测结果，单位ng/ml。A.Dlx5；B.Osterix.图中分别表示2天、4天、6天、14天
结果的柱状图，从左至右依次为磷酸钙-胶原复合涂层+普通培养基，磷酸钙-胶原复合涂层+成骨诱导培养基；
图5骨髓间充质干细胞在磷酸钙-胶原复合涂层+普通培养基，磷酸-胶原复合涂层+成骨诱导培养基培养14天后的碱性磷酸酶染色的照片；从左至右依次为磷酸钙-胶原复合涂层+普通培养基(A)，磷酸钙-胶原复合涂层+成骨诱导培养基(B)；
图6磷酸钙-胶原体内异位成骨；
图7在致密羟基磷灰石涂层(A)和50％多孔羟基磷灰石图(B)表面胶原自组装形成的胶原纤维形貌图；
图8骨髓间充质干细胞在致密羟基磷灰石涂层-胶原和50％多孔羟基磷灰石涂层-胶原培养2，4，6，14天的碱性磷酸酶的检测结果，单位ng/ml；
图9骨髓间充质干细胞在磷酸钙-胶原+普通培养基和磷酸钙-胶原+成骨诱导介质培养2，4，6，14天的骨钙素的检测结果，单位ng/ml。
具体实施方式
本发明提供一种诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，包括以下步骤：
a、构建多孔磷酸钙支架，所述多孔磷酸钙支架为磷酸钙陶瓷或磷酸钙涂层中的一种；
b、在步骤a的支架上复合胶原，形成磷酸钙-胶原纤维网络；
c、将骨髓间充质干细胞接种于步骤b中所述的磷酸钙-胶原纤维网络中预培养4～48小时后，加入成骨诱导培养基培养，得到成骨细胞。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤a中所述磷酸钙为磷酸二氢钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙或双相磷酸钙中的至少一种。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤a中所述磷酸钙支架的力学强度要求≥50kPa；孔隙率10～90％，优选30～60％；孔径10～500μm，优选50～200μm。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤b中所述的胶原为I型胶原，胶原浓度为1～15mg/ml，胶原的pH值为4～6.5。
优选的，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤b中所述的胶原浓度为7～9mg/ml，pH值为5～6.5。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤b中所述的复合胶原的操作为：采用物理吸附的方法将胶原直接复合在磷酸钙支架表面，在室温下风干12～36小时。
为了更好的诱导干细胞向成骨细胞分化，本发明步骤b中所述的磷酸钙-胶原纤维网络中纤维直径为50～600nm，优选为100～300nm。
为了使干细胞更好的黏附在基体上，需要将骨髓间充质干细胞接种于纤维网络中进行预培养，优选的预培养时间为4～24小时。
其中，上述诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法中，步骤c中所述的成骨诱导培养基组成主要为：地塞米松10-5～10-2mmol/L，β-甘油磷酸钠5～20mmol/L，抗坏血酸0.02～0.05mmol/L；优选为地塞米松10-4mmol/L，β-甘油磷酸钠10mmol/L，抗坏血酸0.05mmol/L。
本发明所述的多孔磷酸钙支架的强度对干细胞向成骨分化具有重要的影响，力学强度低于40kPa时，会促进干细胞向其他方向分化，不利于干细胞向成骨分化，为了实现定向调控干细胞向成骨细胞分化，本发明的多孔磷酸钙支架力学强度要求≥50kPa。
同样的，多孔磷酸钙支架的孔隙率也对干细胞向成骨分化具有重要的影响。孔隙率过大时，力学强度难以达到要求，孔隙率过小时，不利于胶原纤维网络的形成，本发明要求孔隙率为10～90％，优选30～60％；孔径10～500μm，优选50～200μm。
只要满足上述要求的多孔磷酸钙支架，都可以用来和本发明的胶原进行复合，制备成多孔磷酸钙-胶原复合材料，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞。该多孔磷酸钙支架可以够买得到，也可以自备得到。
现提供一种制备本发明多孔磷酸钙支架的方法，但并不表示将制备方法局限于此。
制备多孔磷酸钙支架，步骤如下：
A、磷酸钙粉体制备
磷酸钙粉体为磷酸二氢钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙或双相磷酸钙的至少一种；在不断搅拌下将1.2～3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到1～3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30～90℃，以质量百分比浓度10％～30％的氨水控制其pH保持在9～12，静置5～15分钟，再陈化24～48小时；经过过滤、洗涤、干燥、煅烧得到磷酸钙粉体；
或市购磷酸钙粉体成品；
B、磷酸钙支架制备
将步骤A所得的磷酸钙粉体压片，成型后置于真空烧结炉中烧结，得到磷酸钙陶瓷；或
采用等离子喷涂的方式，将步骤A所得的磷酸钙粉体喷涂于基底材料表面，形成多孔磷酸钙涂层。
其中，所述的基底材料为生物医用金属材料、生物医用陶瓷材料、含金属的生物医用复合材料或含陶瓷的生物医用复合材料中的一种。
下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中，所述的普通培养基组成为：每100ml普通培养基中含有89ml的α-MEM培养基，10ml的胎牛血清和1ml的双抗。
所述的成骨诱导培养基组成为：每100ml的成骨诱导培养基中含有的87.4mlα-MEM培养基，10ml的胎牛血清和1ml的双抗，500ul维生素C(50umol/L)，1ml的甘油磷酸钠(100mmol/L)，10ul地塞米松(100nmol/L)。
实施例1采用本发明方法诱导骨髓间充质干细胞
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将2.8mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液70℃，以质量百分比浓度25％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置10分钟，再陈化24小时，即得固含量为34％的羟基磷灰石悬浮液。然后将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为17％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，在生物医用金属基底Ti-6Al-4V上形成厚度为120微米，孔隙率为50％，孔径在50～200微米的涂层。涂层表面形貌采用扫描电镜进行观察。扫描电镜照片见图1。将胶原溶解于醋酸溶液，浓度为7mg/ml，pH值为6，再将胶原溶液0.2ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干12小时。再次将0.2ml的胶原溶液滴加在涂层上。之后在超净台内风干12小时。胶原在磷酸钙涂层表面形成直径为100～300nm纤维网络结构，形成磷酸钙-胶原纤维网络。磷酸钙-胶原纤维网络采用扫描电镜进行观察。扫描电镜图片见图2(A、B)。将骨髓间充质干细胞接种在磷酸钙-胶原纤维网络表面后，加入普通培养基，培养14天后，考察其向成骨分化的情况。
实施例2采用本发明方法诱导骨髓间充质干细胞
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.8mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液70℃，以质量百分比浓度25％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置10分钟，再陈化24小时，即得固含量为34％的羟基磷灰石悬浮液。将造孔剂去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为17％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，最后在生物医用金属基底Ti-6Al-4V上形成厚度为120微米，孔隙率为50％，孔径在50～200微米的涂层。将胶原溶解于醋酸溶液，浓度为7mg/ml，pH 6，再将胶原溶液0.2ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干12小时。再次将0.2ml的胶原溶液滴加在涂层上。之后在超净台内风干12小时。之后在超净台内风干12小时，形成胶原纤维直径为100～300nm的磷酸钙-胶原纤维网络(见图7B)。将骨髓间充质干细胞接种在磷酸钙-胶原纤维网络表面预培养24小时后，加入成骨诱导培养基，培养14天后，考察其向成骨分化的情况。
实施例3采用本发明方法诱导骨髓间充质干细胞
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.8mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液70℃，以质量百分比浓度25％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置10分钟，再陈化24小时，即得固含量为34％的羟基磷灰石悬浮液。将羟基磷灰石悬浮液在70～100℃干燥24h。采用大气等离子喷涂的方法，最后在生物医用金属基底Ti-6Al-4V上形成厚度为120微米，致密的羟基磷灰石涂层。将胶原溶解于醋酸溶液，浓度为7mg/ml，pH 6，再将胶原溶液0.2ml滴加在涂层上，之后在超净台内风干12小时。再次将0.2ml的胶原溶液滴加在涂层上。之后在超净台内风干12小时，形成胶原纤维直径为40～80nm的磷酸钙-胶原纤维网络(见图7A)。将骨髓间充质干细胞接种在磷酸钙-胶原纤维网络表面预培养24小时后，加入成骨诱导培养基，培养14天后，考察磷酸钙支架孔隙率及胶原纤维网络结构对干细胞向成骨分化的影响，结果见图8。
实施例4采用本发明方法诱导骨髓间充质干细胞
按Ca3(PO4)2的钙磷摩尔比(1.5)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1.7mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液75℃，以质量百分比浓度20％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置15分钟，再陈化40小时，即得固含量为25％的磷酸三钙悬浮液备用。将磷酸三钙悬浮液抽滤、洗涤、干燥、煅烧得到磷酸钙粉体。添加造孔剂，取10g磷酸三钙粉体用压片机压制成型后，置于真空烧结炉中，以3℃/分钟升温至300℃保温20min，然后以5℃/分钟的速度升温至1000℃/分钟保温3小时，继后随炉冷却至室温即得到磷酸三钙陶瓷支架。磷酸钙支架的孔隙率为75％，孔径100～200微米，抗压强度71±18kPa，将胶原溶解于醋酸溶液，配置成浓度为8mg/ml，pH 5.5的胶原溶液，将磷酸钙支架浸泡在溶液中12小时，之后在超净台内风干14小时，形成胶原纤维直径为100～300nm的磷酸钙-胶原纤维网络。将骨髓间充质干细胞接种在磷酸钙-胶原纤维网络表面后预培养4小时后，加入成骨诱导培养基培养14天，其成骨效果见图9。
效果验证试验
细胞分化
将实施例1和实施例2制备的磷酸钙-胶原纤维网络置于24孔培养板中。取第三代生长旺盛的SD大鼠的骨髓间充质干细胞制得2*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于纤维网络表面，实施例1在普通培养基中培养，实施例2在成骨诱导培养基中培养。分别培养2天，4天，6天和14天后取出，每孔加10ul裂解液(Triton X-100)，反复吹打，并放置于37℃孵育箱中过夜，镜下观察有无完整细胞，按ELisa试剂盒(蓝基，中国)说明操作，在450nm下测量其吸光度，根据标准曲线计算Dlx5、Osterix、ALP和OCN值。结果见图3、4。
图3考察的是骨髓间充质干细胞在磷酸钙-胶原纤维网络表面的碱性磷酸酶和骨钙素的表达情况。由图3可看出：实施例2中加入成骨诱导介质，能促进碱性磷酸酶和骨钙素的表达，表明成骨诱导介质的加入能够与磷酸钙-胶原纤维网络协同作用，进一步加强磷酸钙-胶原纤维网络的成骨诱导能力。
图4考察的是不同培养方法对早期成骨相关转录因子Dlx5和Osterix的影响。由图4可知，实施例2加入的成骨诱导介质能显著促进Dlx5和Osterix的表达，进一步证明磷酸钙和成骨诱导介质对干细胞成骨分化具有协同促进作用。
将实施例3制备的磷酸钙-胶原纤维网络置于24孔培养板中。取第三代生长旺盛的SD大鼠的骨髓间充质干细胞制得2*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料表面，在成骨诱导培养基中培养。分别培养2天，4天，6天和14天后取出，每孔加10ul裂解液(Triton X-100)，反复吹打，并放置于37℃孵育箱中过夜，镜下观察有无完整细胞，按ELisa试剂盒(蓝基，中国)说明操作，在450nm下测量其吸光度，根据标准曲线计算ALP，将其与实施例2所得结果进行对比，如图8所示。
由图8可看出：实施例2中采用孔隙率为50％的磷酸钙-胶原纤维网络诱导骨髓间充质干细胞相比实施例3中采用致密磷酸钙-胶原纤维网络诱导骨髓间充质干细胞，ALP值更高，尤其是当诱导14天后，ALP值达到显著差异，说明磷酸钙支架的孔隙率对干细胞的成骨分化息息相关，多孔的磷酸钙支架更能促进干细胞的成骨分化。
碱性磷酸酶染色
将实施例1和实施例2制备的磷酸钙-胶原纤维网络置于24孔培养板中。取第三代生长旺盛的SD大鼠的骨髓间充质干细胞制得2*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于网络表面，分别在普通培养基(实施例1)和成骨诱导培养基(实施例2)中14天培养。之后材料表面的细胞进行碱性磷酸酶活性染色，所有过程均严格按照南京建成碱性磷酸酶染色试剂盒说明书指定操作流程进行，在荧光显微镜下观察，结果见图5。
由图5可知：磷酸钙-胶原表面骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶成阳性，成骨诱导介质的加入，碱性磷酸酶的活性增强(B)，表明磷酸钙-胶原纤维网络及成骨诱导介质构建的细胞微环境能有效的促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。
体内成骨实验
取成年新西兰大白兔5只，体重2.0～2.5kg，雌雄不限，清洁级。实验过程对动物的处置符合动物伦理学标准。将实施例1中装载磷酸钙-胶原纤维网络植入兔的背部肌肉以观察材料的骨诱导性。在术后4周处死动物，取材后，立即将标本置于10％甲醛中固定24h，制成石蜡标本。标本垂直向切片，切片厚度5μm，HE染色，光镜下观察。图6为在光境下能观察到大量的骨细胞，表明磷酸钙-胶原纤维网络在体内具有良好的骨诱导性。

Claims (6)

1.诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、构建多孔磷酸钙支架；所述磷酸钙支架的力学强度要求≥50kPa；孔隙率10～90％；孔径10～500μm；所述的磷酸钙支架为磷酸钙陶瓷支架或磷酸钙涂层支架中的一种；所述磷酸钙为磷酸二氢钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙或双相磷酸钙中的至少一种；
b、在步骤a的支架上复合胶原，形成磷酸钙-胶原纤维网络；所述的胶原为I型胶原，胶原浓度为1～15mg/ml，胶原的pH值为4～6.5；
c、将骨髓间充质干细胞接种于步骤b中所述的磷酸钙-胶原纤维网络中预培养4～48小时后，加入成骨诱导培养基培养，得到成骨细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，其特征在于：步骤b中所述的胶原浓度为7～9mg/ml，pH值为5～6.5。
3.根据权利要求1所述的诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，其特征在于：步骤b中所述的复合胶原的操作为：采用物理吸附的方法将胶原直接复合在磷酸钙支架表面，在室温下风干12～36小时。
4.根据权利要求1所述的诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，其特征在于：步骤b中所述的磷酸钙-胶原纤维网络中纤维直径为50～600nm。
5.根据权利要求1所述的诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，其特征在于：步骤c中所述的预培养时间为4～24小时。
6.根据权利要求1所述的诱导骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，其特征在于：步骤c中所述的成骨诱导培养基组成主要为：地塞米松10-5～10-2mmol/L，β-甘油磷酸钠5～20mmol/L，抗坏血酸0.02～0.05mmol/L。
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