CN112641997B - 髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术与组织工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，包括：将髓核间充质干细胞植入胶原复合支架，得到髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。本发明采用Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架，不仅最大程度地还原了真实的细胞环境，且构建的支架结构规整，孔径尺寸均匀，具有适宜的降解速率以及抗压强度，同时具有更好的生物相容性。通过使用I型胶原凝胶作为外环，II型胶原凝胶作为中心的复合支架，具有更好的支架形态结构、力学性能，更有利于孔隙率的增加和结构的规整。本发明制备得到的复合胶原支架有利于髓核间充质干细胞的增殖分化。

Description

髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术与组织工程技术领域，更具体地，本发明涉及髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法。
背景技术
腰椎间盘髓核退变和突出是临床常见疾患，目前人们对腰腿痛的确切病因还不清楚，但普遍认为椎间盘退变是腰腿痛的主要原因。临床常用的保守治疗和手术治疗方法主要针对的是患者的临床症状，不能从根本上逆转椎间盘细胞的退变,在长期疗效方面仍存在许多并发症和问题。因此，旨在抑制髓核退变、恢复髓核细胞数量和质量的治疗方法已成为椎间盘再生领域的研究热点，组织工程则应运而生。
间充质干细胞最早于1968年由德国科学家Frieden Stein在骨髓中发现，随后还发现存在于人体多种组织器官中，并可在体外培养扩增，且能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞在内的多类细胞，还在多种人体重要功能中起重要调节作用。目前应用较多的是骨髓来源的间充质干细胞。然而，植入后渗漏以及分化缺乏控制是其难以解决的问题。所以单有细胞是不够的，还需要能够使其发挥功能的支架。因此迫切需要构建一个优良的细胞支架。
已经有研究证明，可注射支架具有传递细胞潜能的作用，但缺乏所需的机械稳定性。而那些具有机械稳定性能的外源性支架却因为整合不良、受力不均、异物排斥等原因导致植入材料的挤出或排出。因此需要构建一个既能避免了上述缺点，又与人椎间盘体积相当、成分匹配且更加接近真实的细胞环境的细胞支架。其中熟知纤维胶原、蛋白多糖和水是椎间盘的三个主要结构成分,且髓核中主要为Ⅱ型胶原，纤维环中主要为Ⅰ型胶原。已经有研究证明，髓核间充质干细胞与Ⅰ型、Ⅱ型胶原支架共培养能够促进髓核间充质干细胞的增殖，但其具有孔隙率低、结构不规整的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，包括：将髓核间充质干细胞植入胶原复合支架，得到髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。
作为本发明一种优选的技术方案，所述髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法还包括胶原复合支架的制备：将I型胶原凝胶作为外环，在外环中央置入II型胶原凝胶，冰冻后，放入交联剂溶液中交联、冲洗、冻干后，得到胶原复合支架。
作为本发明一种优选的技术方案，所述I型胶原凝胶的制备方法包括：将I型胶原加入酸溶液、混合、调节pH在6.5～7.5、冻干、静置得到I型胶原凝胶。
作为本发明一种优选的技术方案，所述II型胶原凝胶的制备方法包括：将II型胶原加入酸溶液、混合、调节pH在6.5～7.5、冻干、静置得到II型胶原凝胶。
作为本发明一种优选的技术方案，所述交联剂溶液中的交联剂包括戊二醛、京尼平、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、2-吗啉乙磺酸中的至少一种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述交联剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、2-吗啉乙磺酸中。
作为本发明一种优选的技术方案，所述髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法还包括髓核间充质干细胞的培养：将髓核组织加入酶消化后，加入MSC培养基离心，得到的细胞机构过完全培养基重悬培养，得到髓核间充质干细胞。
作为本发明一种优选的技术方案，所述髓核间充质干细胞的培养后，经过髓核间充质干细胞的定向分化的检测。
作为本发明一种优选的技术方案，所述髓核间充质干细胞的定向分化的检测包括：将髓核间充质干细胞培养至第三代，接种到分化培养基上培养，检测是否分化成髓核细胞。
本发明第二个方面提供了一种所述的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法制备得到的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本发明采用Ⅰ/Ⅱ型胶原复合支架，不仅最大程度地还原了真实的细胞环境，且加入碳化二亚胺等作为交联剂后所构建的支架结构规整，孔径尺寸均匀，具有适宜的降解速率以及抗压强度，展现了复合支架良好的性能，同时具有更好的生物相容性。
(2)通过使用髓核来源的间充质干细胞，较其他来源的干细胞来说，能够更好地适应髓核特殊的低氧、酸性的环境，对干细胞的增殖分化也更加有利。
(3)通过控制间充质干细胞的培养，有利于髓核组织获得间充质干细胞，并对间充质干细胞的定向分化条件进行调控，可实现间充质干细胞成功分化成髓核细胞。
(4)通过使用I型胶原凝胶作为外环，II型胶原凝胶作为中心的复合支架，具有更好的支架形态结构、力学性能，更有利于孔隙率的增加和结构的规整。
(5)本发明制备得到的复合胶原支架有利于髓核间充质干细胞的增殖分化。
附图说明
图1为退变节段髓核组织的图像。
图2为实施例1提供的胶原复合支架的电镜图像。
图3为实施例1提供的胶原复合支架的电镜图像。
图4为髓核间充质干细胞在胶原复合支架上培养的图像。
图5为髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的力学测试结果图。
图6为胶原复合支架的降解结果图。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
本发明第一个方面提供了一种髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，包括：将髓核间充质干细胞植入胶原复合支架，得到髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。
髓核间充质干细胞
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，存在于骨髓、骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。间充质干细胞的迁移、定植、增殖与分化，需要从外界获取信息，其分化方向取决于所在的微环境。当前使用较多的干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，但是骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：①随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；②制备过程不容易质控；③取材时对人体有损伤，有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓，而且髓核内部的低氧、酸性的环境势必不利于骨髓间充质干细胞的增殖分化。本发明选用髓核来源的间充质干细胞，较其他来源的干细胞来说，能够更好地适应髓核特殊的低氧、酸性的环境，对干细胞的增殖分化也更加有利。
在一种实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法还包括髓核间充质干细胞的培养：将髓核组织加入酶消化后，加入培养基离心，得到的细胞机构过完全培养基重悬培养，得到髓核间充质干细胞。
本发明髓核间充质干细胞的培养中，消化用的酶可包括胰蛋白酶，胶原酶，如II型胶原酶等，不做具体限定，等到酶消化一段时间，细胞团块基本散开后可加入培养基终止消化，所述MSC培养基为本领域熟知的间充质干细胞培养基，如达科为生物技术股份有限公司的MSC专用基础培养基、上海微科生物技术有限公司的MSC无血清培养基等，并进行离心，得到细胞经过完全培养基重悬培养，得到髓核间充质干细胞。
基础培养基添加血清、抗生素等物质后，叫完全培养基，也叫(血清)细胞培养基。基础培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需添加天然培养基，常用的是牛血清，因为牛血清中含有促细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素。本发明不对完全培养基做具体限定，可实现间充质干细胞培养的功能，如联科生物的StemXVivoTM Mesenchymal Stem CellExpansion Media、StemXVivoTM Serum-Free Human MSC Expansion Media、StemXVivoTMXeno-Free Human MSC Expansion Media、StemXVivo Serum-Free MSC Freezing Media，南京生航生物技术有限公司的10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基等。
优选地，本发明所述髓核间充质干细胞的培养包括：无菌条件下获取人退变节段髓核，将髓核组织剪碎并用Ⅱ型胶原酶消化，过滤去除组织残留碎块，离心后再用0.25％胰蛋白酶消化，加入MSC培养基终止消化，再次离心收集细胞，完全培养基重悬细胞，传至第3代备用。其中退变节段髓核组织可通过微创得到，如图1所示。
本发明还对培养得到的髓核间充质干细胞进行鉴定，鉴定的方法包括：显微镜下进行直接细胞计数，部分细胞用于细胞免疫表型检测，CCK-8法对细胞增殖能力进行检测，RT-PCR检测细胞干性基因的表达。
为了证明本发明培养的髓核间充质干细胞培养得到髓核细胞的能力，本发明还进行定向分化的检测。更优选地，本发明所述髓核间充质干细胞的培养后，经过髓核间充质干细胞的定向分化的检测。
进一步优选地，本发明所述髓核间充质干细胞培养至第三代，接种到分化培养基上培养，检测是否分化成髓核细胞。所述检测方法为分别于培养1,3,5,7,14,28天时用1％的阿利新蓝分别于诱导分化前后对细胞进行染色，在显微镜下进行观察，通过对比诱导分化前后的蓝色覆盖面积，判断其分化能力。且申请人发现，通过Western Blot定量检测诱导分化后Collagen II和aggrecan的表达情况，可确定本发明培养的髓核间充质干细胞确定成功分化为髓核细胞。
更进一步优选地，本发明所述分化培养基为间充质干细胞软骨分化培养基(MCDM)，由500ml基础培养基、5ml间充质干细胞软骨分化补充剂(MCDS)，5ml青霉素/链霉素溶液(P/S)组成。用于体外间充质干细胞软骨形成的研究。间充质干细胞软骨分化培养基(MCDM)是一种无菌液体培养基，含有必需和非必需的氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子和微量矿物质，可购自上海中乔新舟生物科技有限公司。
胶原复合支架
申请人发现，I型胶原凝胶作为外环，II型胶原凝胶作为中心，进行交联，不仅可以得到具有高的孔隙率和规整结构的支架结构，提高力学性能，且相对于常见的将两种胶原形成上下两层薄膜进行交联，更有利于促进髓核间充质干细胞的培养和分化。通过使用在一种实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法还包括胶原复合支架的制备：将I型胶原凝胶作为外环，在外环中央置入II型胶原凝胶，冰冻后，放入交联剂溶液中交联、冲洗、冻干后，得到胶原复合支架。在一种实施方式中，所述外环的直径为3.5-4.5cm，本发明部队外环和内环的胶原用量做具体限定，胶原用量可以使支架高度达到8-10mm即可(约为腰椎间盘高度)。
优选地，本发明所述胶原复合支架的制备包括：将I型胶原凝胶作为外环，在外环中央置入II型胶原凝胶，冰冻后取出，用真空冻干机冻干，放入交联剂溶液中交联，立式恒温振荡器中震荡18～24h后，置于37℃恒温箱18～24h，冲洗、冻干后，得到胶原复合支架。
本发明通过酸溶得到胶原凝胶，并通过冻干去除胶原中的气泡(每次抽吸至大部分气泡破裂后，停止抽吸并打开进气阀，反复操作直至得到气泡极少的胶原)。更优选地，本发明所述I型胶原凝胶的制备方法包括：将I型胶原加入酸溶液、混合、调节pH在6.5～7.5、冻干、静置得到I型胶原凝胶。进一步优选地，本发明所述I型胶原凝胶的制备方法包括：将I型胶原加入0.02～0.08mol/L溶液、2～6℃混合20～40min、调节pH在6.5～7.5、冻干、2～5℃静置18～32h后，置于超净台气流下得到I型胶原凝胶。更进一步优选地，本发明所述I型胶原凝胶的制备方法包括：将I型胶原加入0.05mol/L溶液、4℃混合30min、调节pH在7、冻干、4℃静置24后，置于超净台气流下得到I型胶原凝胶。
更优选地，本发明所述II型胶原凝胶的制备方法包括：将II型胶原加入酸溶液、混合、调节pH在6.5～7.5、冻干、静置得到II型胶原凝胶。进一步优选地，本发明所述II型胶原凝胶的制备方法包括：将II型胶原加入0.02～0.08mol/L溶液、2～6℃混合20～40mIIn、调节pH在6.5～7.5、冻干、2～5℃静置18～32h后，置于超净台气流下得到II型胶原凝胶。更进一步优选地，本发明所述II型胶原凝胶的制备方法包括：将II型胶原加入0.05mol/L溶液、4℃混合30mIIn、调节pH在7、冻干、4℃静置24后，置于超净台气流下得到II型胶原凝胶。
在一种优选的实施方式中，本发明所述交联剂溶液中的交联剂包括戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、2-吗啉乙磺酸中的至少一种。在一种更优选的实施方式中，本发明所述交联剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、2-吗啉乙磺酸中。
将Ⅰ/Ⅱ型胶原复合并加入碳化二亚胺等作为交联剂，60～80wt％乙醇作为溶剂进行交联，所构建的支架结构规整，孔径尺寸均匀，具有适宜的降解速率以及抗压强度，展现了复合支架良好的性能，同时具有更好的生物相容性。在一种进一步优选的实施方式中，本发明所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺在交联剂溶液中的浓度为0.02～0.05mol/L，可列举的有，0.02mol/L、0.03mol/L、0.033mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L；所述N-羟基琥珀酰亚胺在交联剂溶液中的浓度为0.01～0.04mol/L，可列举的有0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L；所述2-吗啉乙磺酸在交联剂溶液中的浓度为0.03～0.07mol/L，可列举的有，0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L。所述交联剂溶液的溶剂为60～80wt％乙醇-水溶液，可列举的有，60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％。
本发明不对I型胶原和II型胶原的提取进行限定，可根据本领域熟知的方法，I型胶原可从牛跟腱、猪跟腱、羊跟腱中提取得到，或者通过基因工程菌株生产得到。Ⅱ型胶原蛋白从牛骨、猪骨、羊骨中提取得到或者所述Ⅱ型胶原蛋白通过基因工程菌株生产得到，不做具体限定。
在一种更进一步优选的实施方式中，本发明所述Ⅰ型胶原的提取包括：取新鲜猪跟腱，超纯水清洗5次，修剪杂质后，超纯水清洗5次；组织剪剪碎后，75％酒精脱脂10min，超纯水清洗5次后置于乙酸溶液(0.05mol/L)，磁力搅拌器，4℃下搅拌24小时；随后加入胃蛋白酶(1g/L)，磁力搅拌器，4℃下搅拌3天；40目钢筛过滤，取清液；低温高速离心机离心(4℃，15000r/m,30min)后加入1/4液体质量的NaCl，磁力搅拌器搅拌，4℃下盐析24h；再低温高速离心机离心(4℃，12000r/m，30min)弃去上清液，收集沉淀放入透析袋(DM-16MWCO：3500)大量超纯水透析36h，每6h更换一次纯水；将透析产物平铺于培养皿，逐级冰冻(4℃冷藏6h后置于-20℃冷冻6h、再-80℃冷冻12h)；取出真空冻干机冻干，即得精制I型胶原。
在一种更进一步优选的实施方式中，本发明所述Ⅱ型胶原的提取：取新鲜猪双膝透明软骨,剔除其余组织，75％酒精浸润脱脂，纯水洗净打碎(去除泡沫)，用4M/L盐酸胍去糖蛋白24h(10倍体积)，搅拌24h；用5倍体积胃蛋白酶消化液和0.5mol/L乙酸洗净离心后(12000，5min--直接清洗不离心)，取固体溶于5倍体积0.5mol/L乙酸，加入1g/L胃蛋白酶24h，用打汁机打碎，继续搅拌5h，待沉淀析出，继续用打汁机打碎，再搅拌，直到软骨碎块完全溶解；用2mol/L NaOH迅速调节上清液至pH7.3；再进行盐析；钢丝网过滤掉残渣后，加入NaCl调节浓度至3mol/L,盐析30min，15000r/min,30min,离心后取沉淀装于透析袋中透析48h；将透析产物低温离心(14000r/min)离心30min，弃上清；以超纯水清洗沉淀物，12000r/min离心30min，重复清洗，离心1次，即得精制Ⅱ型胶原。
本发明可采用SDS-PAGE凝胶电泳法对提取的I、II型胶原进行分子质量分布的测定以及超微量紫外分光光度计测最大吸收峰，判断提取所得是否为Ⅰ、Ⅱ型胶原。以蛋白分子量标准为参照，分别采用8％及7.5％的分离胶，对I、II型胶原蛋白进行电泳，从而对提取的胶原进行鉴定。
髓核间充质干细胞联合胶原复合支架
在一种实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，包括：将髓核间充质干细胞植入胶原复合支架，得到髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。本发明不对髓核间充质干细胞的细胞密度做具体限定，如0.1×104/cm2～10×104/cm2，可列举的有，0.1×104/cm2、1×104/cm2、10×104/cm2。
本发明将髓核间充质干细胞植入胶原复合支架后，对得到的组织工程髓核进行观察，包括：①大体观察：观察组织工程髓核的色泽、质地、光滑程度和连续性，并与正常髓核进行对比。②三维结构观察：以扫描电镜分析组织工程髓核的三维结构、髓核间充质干细胞的分布情况。③组织学观察：将标本常规固定，脱水，包埋切片后，进行形态学分析。④生物力学性能测定：以万能力学测试仪测定组织工程髓核的生物力学性能，并与正常髓核做对比。髓核的生物力学性能检测包括单轴拉伸试验和限制压缩蠕变试验(详见关节软骨生物力学测试，曹谊林，组织工程学原理与实践:104-5)。单轴拉伸，取工程髓核，做成1mm×4.25mm×0.3mm平板带状试件，做单轴拉伸试验；限制压缩蠕变试验，取一圆形试样做一维限制压缩试验(Dacry法)。本发明运用自体细胞原位移植，发生排异反应的可能性将降到最低。
本发明第二个方面提供一种如上所述的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法制备得到的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。
实施例
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本例提供一种髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，包括：
(1)髓核间充质干细胞的培养和定向分化检测：
(a)无菌条件下获取人退变节段髓核，将髓核组织剪碎并用Ⅱ型胶原酶消化，过滤去除组织残留碎块，离心后再用0.25％胰蛋白酶消化，加入MSC培养基终止消化，再次离心收集细胞，完全培养基重悬细胞，传至第3代备用；
(b)髓核间充质干细胞培养至第三代，接种到间充质干细胞软骨分化培养基上培养，检测是否分化成髓核细胞；
(2)胶原复合支架的制备：
(a)I型胶原凝胶的制备方法：将I型胶原加入0.05mol/L溶液、4℃混合30min、调节pH在7、冻干、4℃静置24后，置于超净台气流下得到I型胶原凝胶；
(b)II型胶原凝胶的制备方法：将II型胶原加入0.05mol/L溶液、4℃混合30mIIn、调节pH在7、冻干、4℃静置24后，置于超净台气流下得到II型胶原凝胶；
(c)I型胶原凝胶和II型胶原凝胶的交联：将I型胶原凝胶作为外环，在外环中央置入II型胶原凝胶，冰冻后取出，用真空冻干机冻干，放入交联剂溶液中交联，立式恒温振荡器中震荡24h后，置于37℃恒温箱24h，冲洗、冻干后，得到胶原复合支架；所述交联剂溶液包括0.033mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺、0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺和0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸(MES)，溶剂为75wt％乙醇水溶液；
(3)将髓核间充质干细胞植入胶原复合支架，得到髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。
本例还提供如上所述的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法制备得到的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。
对比例1
本例提供一种髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，其制备方法同实施例1，不同之处在于，所述I型胶原凝胶和II型胶原凝胶的交联：将I型胶原凝胶作为外环，在外环中央置入II型胶原凝胶，冰冻后取出，用真空冻干机冻干，放入交联剂溶液中交联，立式恒温振荡器中震荡24h后，置于37℃恒温箱24h，冲洗、冻干后，得到胶原复合支架；所述交联剂溶液包括0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺和0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸(MES)，溶剂为75wt％乙醇水溶液。
对比例2
本例提供一种髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，其制备方法同实施例1，不同之处在于，所述I型胶原凝胶和II型胶原凝胶的交联：将II型胶原凝胶平铺在I型胶原凝胶上，冰冻后取出，用真空冻干机冻干，放入交联剂溶液中交联，立式恒温振荡器中震荡24h后，置于37℃恒温箱24h，冲洗、冻干后，得到胶原复合支架；所述交联剂溶液包括0.033mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺和0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸(MES)，溶剂为75wt％乙醇水溶液。
性能评价
将实施例提供的作为实验组进行下述实验。
1、支架结构规整性：将实施例1提供的胶原复合支架通过电镜观察支架结构的规整性，如图2、3所示，其中图2A和图2B分别是支架不同地方的电镜图，图3为不同放大倍数的电镜图，可发现本发明形成的复合支架结构规整，具有较大的孔径，孔隙均匀。
2、髓核间充质干细胞生长性能：观察实施例1和对比例1、2提供的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架中髓核间充质干细胞的生长情况，可发现相比于对比例2，实施例1的髓核间充质干细胞在胶原复合支架上生长良好，长出伪足，如图4所示。
3、力学性能：将实施例1和对比例1提供的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架根据关节软骨生物力学测试，曹谊林，组织工程学原理与实践:104-5进行力学性能测试，结果见图5，其中图5横坐标control对应的点为对比例1的测试结果，图4横坐标experiment对应的点为实施例1的测试结果，可知相对于对比例，本发明的力学性能有明显提高。
4、降解性能：将实施例1和对比例1提供的胶原复合支架进行降解性能测试，取胶原复合支架称重得初始质量，用PBS溶液配制浓度为70mg/L的Ⅱ型胶原酶溶液，将支架浸入20ml的该溶液中(室温，2小时)，然后加入2ml 0.2mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)混匀，冰浴终止反应，再用去离子水洗净，再次冻干得到剩余质量，降解速率定义为初始质量减去剩余质量。如图6所示，其中图6control对应的点为对比例1的测试结果，图6横坐标experiment对应的点为实施例1的测试结果，可知相对于对比例，本发明提供的胶原复合支架的降解更少，降解率更低。
从上述测试结果可知，本发明提供的胶原复合支架具有高的力学性能和规整结构，且降解速率较低，可以植入髓核间充质干细胞，促进髓核间充质干细胞的培养和定向分化。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (5)

1.一种髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，其特征在于，包括：将髓核间充质干细胞植入胶原复合支架，得到髓核间充质干细胞联合胶原复合支架；
所述髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法还包括胶原复合支架的制备：将I型胶原凝胶作为外环，在外环中央置入II型胶原凝胶，冰冻后，放入交联剂溶液中交联、冲洗、冻干后，得到胶原复合支架；
所述交联剂溶液包括0.033mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺、0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺和0.05mol/L的2-吗啉乙磺酸；
所述I型胶原凝胶的制备方法包括：将I型胶原加入酸溶液、混合、调节pH在6.5~7.5、冻干、静置得到I型胶原凝胶；
所述II型胶原凝胶的制备方法包括：将II型胶原加入酸溶液、混合、调节pH在6.5~7.5、冻干、静置得到II型胶原凝胶。
2.根据权利要求1所述的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，其特征在于，所述髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法还包括髓核间充质干细胞的培养：将髓核组织加入酶消化后，加入MSC培养基离心，得到的细胞经过完全培养基重悬培养，得到髓核间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，其特征在于，所述髓核间充质干细胞的培养后，经过髓核间充质干细胞的定向分化的检测。
4.根据权利要求3所述的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法，其特征在于，所述髓核间充质干细胞的定向分化的检测包括：将髓核间充质干细胞培养至第三代，接种到分化培养基上培养，检测是否分化成髓核细胞。
5.一种根据权利要求1～4任意一项所述的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架的制备方法制备得到的髓核间充质干细胞联合胶原复合支架。
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