JP4412537B2 - 骨の再生方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
技術分野
本発明は、新規な骨の再生方法およびかかる方法により得られた正常な再生骨組織に関する。また、本発明は得られた再生骨組織を用いた骨治療材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
背景技術
再生医学の分野においては、細胞を媒介した方法により損傷した組織または疾患に冒された組織を修復させることが提唱されている。特にこの手法は骨組織および軟骨組織の修復に最も適用しうると考えられている。組織の修復のための細胞供給源としては、胚の幹細胞、胎児の細胞または骨髄間質細胞などの成人の細胞を使用することができるが、いずれの細胞も利点と欠点を有しており、一概にどの細胞が良いかは決められない。
【０００３】
ところが、近年、成人の骨髄間質（間充織）から多分化能を有する間葉系幹細胞が単離された。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、筋肉、靱帯、腱、脂肪および間質などの間充織組織系の再生に有用な役割を果たしている。また、該幹細胞は、生体の骨髄および骨膜から容易に単離することができ、幹細胞として安定な表現型・細胞形態を示し、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞はインビトロ培養では単層の性質を保持している（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ Ｍ．Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，１４３−１４７，１９９９年）。さらに間葉系幹細胞は、サイトカインや増殖因子によりインビトロで骨芽細胞、軟骨細胞および筋芽細胞などの多様な細胞に分化させることができる。特に、骨芽細胞への分化は骨形成因子（例えばＢＭＰ−２，ＢＭＰ−７）を作用させることにより誘導することができ、コラーゲン基質をＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７と共にヒトに移植すると正常な骨組織が形成されることが知られている。
【０００４】
このため、間葉系幹細胞または骨芽細胞を用いて形成させた骨組織や、骨形成因子を含有するコラーゲン基質を移植体として、骨形成不全症や骨粗鬆症などの骨疾患を有する患者の移植治療に用いることが提案された。しかしながら、コラーゲン基質は生体親和性にも優れた材料であるが、特定な形状を付与させることは難しく、且つ骨組織としての機械強度も有していない。同様に、インビトロで分化誘導した骨組織を特定の形状に成形することは困難であり、且つ骨組織としての機械強度に欠けている。さらに、移植片として使用しうる大きさまで骨組織をインビトロで形成させるためには、非常に長い培養時間が必要である。そこで、骨組織としての機械強度を有する移植治療のための骨組織を短期間で再生させる方法が求められている。
【０００５】
従って、本発明は、移植治療に使用しうる機械強度、形状および大きさを有する骨組織を迅速に形成させる方法を提供する。また、本発明は、得られた正常な再生骨組織およびこれを用いた骨治療材を提供することを目的とする。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
発明の開示
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、多分化能を有する間葉系幹細胞または骨芽細胞を当該細胞の足場となりうる繊維性および／または多孔性材料中にて増殖させることにより、特定の形状および大きさ、そして移植治療に適する骨組織を迅速に形成・再生させ得ることを見出し本発明を完成させた。従って、本発明は、間葉系幹細胞を当該細胞の足場となりうる繊維性および／または多孔性材料中にて増殖させることを特徴とする骨の再生方法を提供する。
【０００７】
前記材料は、移植治療に耐えうる機械強度を有するものであるのが好ましい。また、増殖する細胞の足場となるためおよび移植されて長期間体内に保持されるため、生体に影響を及ばさない性質としての生体不活性、経時的に分解・吸収される生分解性および／または生体親和性であるのが好ましく、故に本発明における繊維性および／または多孔性材料は、生体親和性を有する材料と機械強度を有する生分解性高分子との組合せからなるのが好ましい。従って、本発明は、間葉系幹細胞または骨芽細胞を、当該細胞の足場となりうる、生体親和性を有する材料と機械強度を有する生分解性高分子との組合せからなる繊維性および／または多孔性材料中にて増殖させることを特徴とする骨の再生方法に関する。
本発明における繊維性および／または多孔性材料は、所望の形状および大きさに容易に成形することができ、成形した材料に細胞を添加・増殖させることにより移植治療に必要な形状および大きさの再生骨組織を得ることができる。故に、本発明は、移植治療に必要な形状および大きさの再生骨組織を容易に得る方法、当該方法により得られる再生骨組織およびこれを用いた移植のための骨治療材に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
発明を実施するための最良の形態
細胞
本発明において、間葉系幹細胞は骨髄および／または骨膜由来であり、且つ間充織組織系の組織、例えば脂肪組織、軟骨組織または骨組織に分化しうる多能性を有する未分化な細胞である。間葉系幹細胞は、該細胞を有する任意の骨髄または骨膜から採取することができるが、胸骨、上腕骨、大腿骨、脛骨および骨盤（腸骨）から採取するのが好ましい。ヒト以外の哺乳動物については、腸骨および脛骨などからも間葉系幹細胞を採取することができる。
【０００９】
骨髄由来の間葉系幹細胞の採取方法としては、公知の方法、例えば医療において用いられている任意の採取方法を用いることができる。ヒト以外の哺乳動物について骨髄から該幹細胞を採取する際には、実験室的方法として例えば骨（大腿骨、脛骨）の両端を切断し、間葉系幹細胞の培養に適する培地で骨内を洗浄して、洗い出された該培養液から間葉系幹細胞を得ることができる。具体的には、下記のように採取する：
（１）ウサギの大腿骨、脛骨の両端を切断する。次いで、培地（例えばＤＭＥＭ培地）、所望する場合には抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）、およびヘパリンをさらに添加した培地で骨髄内を洗浄する。
（２）洗い出された培地を遠心分離して、凝固塊などを沈殿として除去し、上清中の細胞を間葉系幹細胞として計測し、適する培地にて適当な濃度に希釈する。
【００１０】
また、骨膜から該幹細胞を採取するには、公知の方法、例えばＭ．Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２，１６０３−１６０８（１９９３）；Ｊ．Ｆａｎｇ ＆ Ｂ．Ｋ．Ｈａｌｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌ．１８０，７０１−７１２（１９９６）；Ｓ．Ｂａｈｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ ２５９，１２４−１３０（２０００））に従って得ることができる。
【００１１】
このような方法により、所望の数の間葉系幹細胞を得ることができる。単離された間葉系幹細胞は、そのまま播種して培養に供することができるが、通常は適当な培地中にて培養してから使用することもできる。また、該細胞を凍結保存することもできる。
【００１２】
また、間葉系幹細胞から骨芽細胞を得るためには、該幹細胞をトリプシン処理、次いで遠心分離などにより単離した後、骨形成を促進する成長因子、例えば骨形成因子（ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−７）を包含する培地にて培養する。骨分化誘導に適する方法および培地は、例えばＭ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４，ｐ１４３−１４７，１９９９年に詳細に開示されている。
【００１３】
繊維性・多孔性材料
本発明における繊維性および／または多孔性材料の形態は、三次元的構造を形成しうるもの、例えばスポンジ等の多孔質、織物等のメッシュ、織布、不織布、綿状とすることができるが、多孔性の材料の使用は、間葉系幹細胞または分化した骨芽細胞が材料に容易に接着するとともに内部に浸透し、骨組織の再生を促進することが可能となるため好ましい。また、間葉系幹細胞および／または骨芽細胞が足場として増殖しうるため、移植後に組織との親和性のために、生体親和性材料が含有、結合または被覆されているのが好ましい。
【００１４】
本発明の態様おいて、生体親和性を有する材料は生体高分子であればいずれのものでもよいが、例えばコラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ型コラーゲン）、ポリエチレンオキシド、フィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンからなる群から選択される１つ以上の生体材料であるのが好ましく、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶ型コラーゲンがより好ましい。
【００１５】
また、機械強度を有する生分解性高分子は、例えばポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリリンゴ酸、キチン、キトサン、ポリアルギン酸、ヒアルロン酸、セルロース、ポリアミノ酸、ω−ヒドロキシカルボン酸からなる群から選択される１つ以上の生分解性高分子であるのが好ましく、ポリグリコール酸、ポリ乳酸または乳酸−グリコール酸共重合体がより好ましく、乳酸−グリコール酸共重合体が最も好ましい。
【００１６】
機械強度を有する生分解性合成高分子構造体の気孔率とポアサイズは、大きくなればなるほど機械強度は低下するものの、ポアとポアの繋がりが良くなり、細胞の播種が行われ易いので、構造体における播種細胞数を増大させることができ、骨組織の再生が効率的になる。従って、構造体の気孔率とポアサイズは、移植される生体内の場所等に応じて、所望される機械強度、弾力性または骨組織の再生速度等を勘案して適宜定めることができる。好ましくは気孔率は７０％以上で、ポアサイズは２５０μｍ以上である。
【００１７】
機械強度を有する生分解性高分子の多孔性構造体（例えばスポンジ）は、相分離法、粒子溶出法（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ−ｌｅａｃｈｉｎｇ）または発泡成形法を用いて製造することができる。また、生分解性高分子の繊維（例えばメッシュ、織布、不織布、綿等）は、溶融紡糸法、延伸法等を用いて製造することができる。いずれの方法においても生分解性高分子を溶媒に溶解し、その三次元的構造体を形成させる。当該高分子を溶解させる溶媒には、クロロホルム、四塩化炭素、ジオキサン、トリクロロ酢酸、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトン、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルアセトアミド、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、酢酸、ギ酸、水等が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
また、生分解性高分子の溶液に界面活性剤、安定剤、酸化防止剤等の添加剤を適宜添加してもよい。
【００１９】
また、機械強度を有する生分解性高分子の多孔性構造体（例えばスポンジ）は、水溶性糖類、例えばブトウ糖、果糖もしくは砂糖等の粒子・結晶、または水溶性塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、酒石酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム等の粒子・結晶、二酸化炭素、窒素等の不活性ガスなどを用いて製造することができる。
【００２０】
生体親和性材料は、水溶液、アルコール等の水と相溶性の有機溶媒の溶液またはこれらの混合溶液とすることができるが、水溶液として用いるのが好ましい。生体親和性材料の水溶液は、生分解性高分子の構造体、例えばスポンジ中に容易に浸入して前記構造体の表面を全体的または部分的に被覆または多孔性構造を形成し得る濃度範囲で用いるのが好ましい。前記材料の濃度が低いと生分解性高分子の構造体を被覆または多孔性構造を形成することができない。一方、濃度が高いと、前記材料の溶液の粘度が高すぎるため、生分解性高分子の構造体中に前記材料の溶液が十分に浸入しない。このため、例えばコラーゲンの場合は０．０１〜１５重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％の濃度範囲で使用する。さらに、生体親和性材料の溶液に界面活性剤、安定剤、酸化防止剤、ｐＨ調製剤、抗菌剤等の添加剤を適宜添加することができる。
【００２１】
また、生体親和性材料は、可溶化して液体とした後に架橋処理して材料同士および／または生分解性高分子との間に架橋を形成させることができる。材料を架橋処理するとその機械強度が増し、再生骨組織または骨治療材を生体にステープル等を用いて固定する際に欠損することがないとともに、骨組織が十分に再生するまでの間、必要な強度を保持しながら骨組織または骨治療材を支持することができる。この場合、可溶化した生体親和性材料を生分解性高分子の構造体（例えばスポンジ、不織布、綿）に含浸させ、次いで公知の方法（例えば、紫外線、ガンマ線等の光照射法、グルタールアルデヒド、ビニルスルホン等を用いた化学的架橋法）で材料の分子間および／または生分解性高分子との間に架橋を形成させる。
【００２２】
生体親和性材料を架橋させるために用いることができる架橋剤の例には、グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒド等のアルデヒド、エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテルまたはエチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−４，４，４−トリイソシアネート等のイソシアネートおよびグルコン酸カルシウムが包含される。
【００２３】
本発明の一つの態様において、可溶化したコラーゲン液を生分解性高分子の構造体（例えばスポンジ、不織布、綿）に含浸させ、その後公知の方法でコラーゲン同士および／または機械強度を有する生分解性高分子と架橋させる。コラーゲン液としては、公知の任意のものを使用することができるが、酵素により可溶化したコラーゲン液は、免疫原性を有するテロペプチドが除去されるため特に好ましい。また、コラーゲンを架橋する方法は、例えばＳｔｅｆａｎ Ｎｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．４，ｐ．１７５−１８３（１９９８）に記載されている。
【００２４】
また、本発明の別の態様において、機械強度を有する生分解性高分子のスポンジ中に生体親和性材料の多孔性構造を導入するために、減圧下にて生分解性高分子のスポンジを生体親和性材料の水溶液に浸漬して、その水溶液を生分解性高分子のスポンジの孔質に十分に含ませる。次いで、凍結した後にこれを真空減圧下で凍結乾燥することにより、機械強度を有する生分解性高分子のスポンジの中に生体親和性材料のスポンジを形成させることができる。
【００２５】
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
【００２６】
【実施例】
実施例
実施例１ 多孔性材料の製造
生分解性高分子として乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）（乳酸：グリコール酸＝７５：２５の共重合体；９０〜１２０ｋＤａ）を、生体親和性材料としてＩ型コラーゲンを用いて多孔性材料を製造した。
第１段階として先ずＰＬＧＡスポンジを粒子溶出法により製造した。ＰＬＧＡポリマーをクロロホルム中に溶解して、ＰＬＧＡポリマー溶液（２０（ｗ／ｖ）％の濃度）を調製した。この溶液５ｍＬに粒径約３５５〜４２５μｍの塩化ナトリウム（９ｇ）を添加して攪拌し、アルミニウムパン中に注いだ。次いでドラフト内で２４時間風乾してクロロホルムを蒸発させた後に、２４時間減圧乾燥させた。脱イオン水で洗浄して塩化ナトリウムを除去した結果、約９０％の気孔率を有するＰＬＧＡスポンジが得られた。
次にＰＬＧＡスポンジを減圧下で、タンパク質分解酵素により可溶化し、抗原性を除去したウシＩ型コラーゲンの酸性溶液（高研株式会社）（ｐＨ３．２，５μｇ／μＬ）に浸して、ＰＬＧＡスポンジの孔をコラーゲン溶液で満たした。次いでこれを−８０℃にて１２時間凍結させ、次いで０．２Ｔｏｒｒの真空下で２４時間凍結乾燥して、ＰＬＧＡスポンジ中にコラーゲンの多孔性構造を形成させた。得られた材料を２５％グルタルアルデヒド飽和水溶液の蒸気で３７℃にて４時間処理して架橋を形成させ、０．１Ｍグリシン水溶液で処理して未反応のアルデヒド基をブロックした。これを脱イオン水で洗浄した後、再度凍結乾燥して架橋したコラーゲンとＰＬＧＡスポンジからなる多孔性材料を得た。
【００２７】
実施例２ 間葉系幹細胞
ＫＵＳＡ／Ａ１細胞の同種であるＣ３Ｈ／Ｈｅマウスをエーテルで麻酔して大腿骨を取り出し、骨髄から間葉系幹細胞を採取した（Ｄｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１（１９７７），ｐ．３３５−３４４）。次いで、採取した細胞は２０％ ＦＢＳ、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）中にて５％ ＣＯ２下で培養した。継代を繰り返して得られた単層の細胞（ＫＵＳＡ／Ａ１細胞）（平成１３年７月１１日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託された受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１４より、平成１４年８月１９日にブタペスト条約に基づく寄託へ移管された、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−８１５６）を１０％ ＦＢＳ、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＩＭＤＭ培地中にて維持した。
【００２８】
次いで得られた細胞（ＫＵＳＡ／Ａ１細胞）および対照として繊維芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）について、その性質、即ちＤＮＡ含量、分裂能（ＤＮＡ含量）、アルカリホスファターゼ活性、Ｃａ含量、オステオカルシン（ＢＧＰ）産生について試験した。
（１）ＤＮＡ含量の測定
各細胞を２４ウェル−プレートに播種して、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＩＭＤＭ培地中にて増殖させた。次いで、細胞をホモゲナイズ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中にてホモゲナイズした。この試料（５０μＬ）にヘキスト３３２５８緩衝液（１μｇ／ｍＬ ヘキスト３３２５８，０．０５Ｍ Ｎａ３ＰＯ４，２．０Ｍ ＮａＣｌ，２．０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４；Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ Ｃｏｒｐ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）を添加して混合し、分光蛍光計にて３５６ｎｍの波長で励起して４５８ｎｍの波長にて蛍光を測定した。その結果、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞共に経時的にＤＮＡ量が増加しており、これは両細胞が正常に増殖していることを示している（図１）。
【００２９】
（２）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の測定
（１）と同様に培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌの０．９％ ＮａＣｌに移し、氷上でホモゲナイズした。次いでＡＬＰ Ｂ−試験 Ｗａｃｏキット（和光純薬（株）製）を用いて各試料のＡＬＰ活性を４０５ｎｍの波長で分光蛍光計にて測定した。その結果、骨組織で活性が高いことが知られているＡＬＰ活性は、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞ではＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の約１００倍であり、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞が骨芽細胞の性質を有していることが示された（図２）。
【００３０】
（３）Ｃａ含量およびオステオカルシン（ＢＧＰ）産生
（１）と同様に培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ホモゲナイズ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で超音波処理した。ここで、Ｃａ含量は、得られた試料をＣａｌｃｉｕｍＣ 試験（和光純薬（株）製）を用いて測定した。また、オステオカルシン産生は、マウス・オステオカルシン・アッセイキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）を使用してＲＩＡにより測定した。その結果、Ｃａ含量（図３）およびオステオカルシン産生（図４）について、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞より顕著に高く、このことからもＫＵＳＡ／Ａ１細胞が骨芽細胞の性質を有していることが示される。
【００３１】
実施例３ 成形された多孔性材料中における骨再生
ＫＵＳＡ／Ａ１細胞（１×１０７個／ｍｌ）を１ｍｌの培養液に懸濁し、この懸濁液を実施例１で調製したコラーゲンとＰＬＧＡスポンジからなる多孔性材料の立方体（約０．８×０．８×０．８ｃｍ）の上に、数日にわたり５回（細胞数の合計：５×１０７個）重ねて塗布した。次いでこれをマウスの皮下組織と腹腔に移植した。移植後６週間または１１週間、移植した立方体をＸ線で観察すると共にこれを取り出して骨再生について組織学的に確かめた。
【００３２】
その結果、６週間後でＸ線による観察および組織学的観察共に上記多孔性材料中において骨再生が観察された（図５）。図５において、Ａは再生骨（移植後６週）の軟Ｘ線写真であり、上述の多孔性材料をマウス腹腔内に移植後６週間で、多孔性材料と同様の形状の再生骨（矢印）が形成された。Ｂは再生骨の組織像（ヘマトキシリン・エオジン染色）であり、明らかな再生骨が見られた。６週の時点においては、多孔性材料が残存しており、これは染色されない領域として抜けた像（白く抜けた像）として認められる。１１週間後では上述の多孔性材料が骨組織に置き換わり、骨組織が完全に再生していることが示された（図６）。図６において、Ａは再生骨（移植後６週）の軟Ｘ線写真であり、上述の多孔性材料をマウス腹腔内に移植後１１週間で、多孔性材料と同様の形状の完全な再生骨（矢印）が形成された。Ｂは再生骨の組織像（ヘマトキシリン・エオジン染色）であり、密な骨梁を伴う完全な再生骨が見られた。１１週の時点においては、多孔性材料は吸収されていた。
【００３３】
一方、コラーゲンとＰＬＧＡスポンジからなる多孔性材料のみを移植した場合には全く骨の再生が観察されなかった（図７）。図７はその組織像であり、骨形成は全くなく、上述の多孔性材料内および周囲に異物反応が認められた。
【００３４】
実施例４ 扁平骨欠損マウスへのＫＵＳＡ／Ａ１細胞播種材料の移植
市販のグリコール酸と乳酸を９：１の割合で重合した共重合体によりできているＶｉｃｒｙｌＲニットメッシュ（ＰＬＧＡメッシュ、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社）をウシＩ型コラーゲン酸性水溶液（ｐＨ＝３．２、５μｇ／μＬ）に浸漬し、−８０℃で１２時間凍結した。次にこの凍結物を、真空減圧下（０．２Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、さらに、３７℃で、２５ｗｔ％のグルタルアルデヒド水溶液で飽和したグルタルアルデヒド蒸気で４時間架橋処理した後、０．１Ｍグリシン水溶液に４時間浸漬した。これを脱イオン水で洗浄した後、再度凍結乾燥し、架橋したコラーゲンとＰＬＧＡメッシュからなる繊維性材料を作成した。
次いで、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞を１×１０７／．で上述の架橋したコラーゲンとＰＬＧＡ
メッシュからなる繊維性材料へ播種し、１週間恒温器内で培養した。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの頭蓋骨を麻酔下に展開し、径４．３ｍｍの円形ドリルにて骨を掘削し、骨欠損を作製した（図８（Ａ））。欠損部へ上述の細胞播種繊維性材料を欠損部を覆うように設置、皮膚を縫合し飼育を継続した。４週間後にマウスより頭蓋骨を摘出し、Ｘ線による観察を行った。対照として細胞を播種しない繊維性材料のみを設置した骨欠損マウスを作製した。
細胞を播種しない場合は欠損部は肉芽形成のみで骨再生は見られなかった。これに対しＫＵＳＡ／Ａ１細胞を播種した場合は骨形成は良好で欠損部は骨にて完全に被覆された（図８（Ｂ））。
【００３５】
実施例５ 長管骨欠損マウスへのＫＵＳＡ／Ａ１細胞播種材料の移植
実施例４と同様にＫＵＳＡ／Ａ１細胞を播種した繊維性材料を１週間恒温器にて培養した。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの大腿骨を展開し、骨幹部中央に４．３ｍｍドリルにて骨欠損を作製、欠損による不安定性を補うため骨髄腔中央にステンレス棒を設置した（図９（Ａ））。欠損部周囲を上述の細胞播種繊維性材料にて被覆した。４週間の飼育後、大腿骨のＸ線および組織学的観察を行った。
Ｘ線にて移植片の良好な骨形成を確認した（図９（Ｂ））。組織学的に繊維性材料周囲に炎症所見や強い異物反応は認められなかった。また、移植４週間後の時点では正常骨断端との癒合は確認できなかった。
【００３６】
産業上の利用可能性
本発明によれば、多分化能を有する間葉系幹細胞または骨芽細胞を当該細胞の足場となりうる繊維性および／または多孔性材料中にて増殖させることにより、特定の形状および大きさ、そして移植治療に適する骨組織を迅速に形成・再生させ得る方法および当該方法により得られる再生骨治療材が提供される。本方法は自家移植および他家移植のための骨組織の再生に適し、得られる再生骨治療材は拒絶反応の心配が無く有用である。故に、本発明の方法および再生骨治療材は、特に骨損失、骨折、骨接着に関連する疾病の治療を可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 培養中のＫＵＳＡ／Ａ１細胞のＤＮＡ含量を示すグラフであり、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞が正常に増殖していることを示す。
【図２】 培養中のＫＵＳＡ／Ａ１細胞のＡＬＰ活性を示すグラフであり、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞が骨芽細胞の性質を有していることを示す。
【図３】 培養中のＫＵＳＡ／Ａ１細胞のＣａ含量を示すグラフであり、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞が骨芽細胞の性質を有していることが示される。
【図４】 培養中のＫＵＳＡ／Ａ１細胞のオステオカルシン産生・放出量を示すグラフであり、ＫＵＳＡ／Ａ１細胞が骨芽細胞の性質を有していることが示される。
【図５】 マウスに移植後６週間のＫＵＳＡ／Ａ１細胞＋コラーゲンとＰＬＧＡスポンジからなる多孔性材料をＸ線（Ａ）および組織学的（Ｂ）に調べた写真であり、移植片において骨組織が再生されていることが示される。
【図６】 マウスに移植後１１週間のＫＵＳＡ／Ａ１細胞＋コラーゲンとＰＬＧＡスポンジからなる多孔性材料をＸ線（Ａ）および組織学的（Ｂ）に調べた写真であり、移植片において骨組織が完全に再生されていると共にＰＬＧＡが骨組織に置き換わっていることが示される。
【図７】 コラーゲンとＰＬＧＡスポンジからなる多孔性材料のみをマウスに移植したものであり、骨組織が全く再生されていないことが示される。
【図８】 頭蓋骨に骨欠損を作製したマウス（Ａ）にＫＵＳＡ／Ａ１細胞＋コラーゲンとＰＬＧＡメッシュからなる細胞播種繊維性材料を移植した、移植後４週間（Ｂ）のＸ線写真である。
【図９】 大腿骨に骨欠損を有するマウス（Ａ）にＫＵＳＡ／Ａ１細胞＋コラーゲンとＰＬＧＡメッシュからなる細胞播種繊維性材料を移植した、移植後４週間（Ｂ）のＸ線写真である。

Claims (2)

1. 機械強度を有する生分解性高分子の多孔性三次元構造体と、
   該構造体の表面を被覆した、生体親和性を有する生体高分子とからなる足場および間葉系幹細胞を含んでなる骨再生用移植片であって、
   前記生体高分子間および／または前記生体高分子と前記生分解性高分子間に架橋を形成して前記足場の機械強度を増強させ、また前記間葉系幹細胞を該足場に接着させ、さらに該間葉系幹細胞を該足場上で増殖させて、骨を再生するものであり、
   前記生体親和性を有する生体高分子が、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンからなる群から選択される１つ以上のものであり、且つ、
   前記機械強度を有する生分解性高分子が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリリンゴ酸、キチン、キトサン、ポリアルギン酸、セルロース、ポリアミノ酸およびω−ヒドロキシカルボン酸からなる群から選択される１つ以上のものであることを特徴とする骨再生用移植片。
2. 再生骨の形状に合致させて、足場を成形した、請求項１に記載の骨再生用移植片。

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