NL1026712C2

NL1026712C2 - Bioresorbeerbaar botimplantaat.

Info

Publication number: NL1026712C2
Application number: NL1026712A
Authority: NL
Inventors: Paulus Ignatius Jozef Wuisman; Martinus Nicolaas Helder
Original assignee: Technologiestichting Stw
Priority date: 2004-07-23
Filing date: 2004-07-23
Publication date: 2006-01-24
Also published as: JP2008507321A; WO2006009452A2; EP1773419A2; WO2006009452A3; WO2006009452A9; US20090054983A1

Description

Titel: Bioresorbeerbaar botimplantaat

GEBIED VAN DE UITVINDING

De uitvinding heeft betrekking op kunstmatig botimplantaat ter conservering, reparatie, en regeneratie van het humaan musculo-skeletaal apparaat, middels orthopedische, tandheelkundige, en craniofaciale 5 implantatie. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op toepassing van osteo-inductieve samenstellingen omvattende uit vetweefsel afkomstige stamcellen en osteoconductieve calciumfosfaten in bioresorbeerbare poly-L-lactide en poly-L,D-lactide kooien als onderdeel van een kunstmatig botimplantaat ter stabilisatie en hernieuwde oplijning van 10 wervelkolomsegmenten.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Instabiliteit, spondylolisthese (verschuiving of afglijding van wervels), en degeneratieve pathologie van de Iendewervelkolom leidt bij veel 15 patiënten tot ernstige tussenwervelschijf-gerelateerde pijn. Wanneer conventionele behandeling zoals medicatie, rust of fysiotherapie bij dergelijke patiënten niet doelmatig is, is lumbale wervelfusie de algemeen geaccepteerde chirurgische werkwijze om deze patiënten te behandelen. Deze lumbale wervelfusie, die in het vakgebied "posterior lumbar interbody 20 fusion" (PLIF) wordt genoemd, omvat een lendewervelkolom-operatie die vanaf de rugzijde van de patiënt wordt uitgevoerd en waarbij een fusie (aanééngroeiing) van ten minste twee wervellichamen tot stand wordt gebracht. Het klinisch resultaat van de PLIF operatie wordt als geslaagd beschouwd als daadwerkelijk fusie optreedt. Echter, bij een groot aantal 25 patiënten treedt deze fusie niet of in onvoldoende mate op.

In het kort omvat de PLIF operatie het operatief vrijleggen van de betreffende wervelkolomsegmenten en het corrigeren van de afwijking van de wervelkolom, bijvoorbeeld middels laminectomie (het verwijderen van de 1026712 2 wervelboog om het wervelkanaal te verruimen), foraminotomie (verruimen van de tussenwervelopening), en/of uitruimen van de tussenwervelschijf. Eventueel wordt bij de operatie fixatiemateriaal (schroeven of platen) aangebracht. Om een fusie tussen de twee wervellichamen tot stand te 5 brengen wordt botmateriaal (spongiosa) uit het dorsale gedeelte van de bekkenkam verwijderd middels een aparte operatie. Dit botmateriaal wordt toegepast in combinatie met een tussenwervel fusiekooi die in het algemeen niet-resorbeerbaar is. De kooien kunnen verschillende samenstelling, vorm, en flexibiliteit hebben. Een veel toegepaste vorm heeft een "open doos" 10 structuur die wordt gevuld met het autoloog bot (bot van de patiënt zelf), dat voorafgaand optioneel wordt gemengd met een synthetisch dragermateriaal (meestal calciumfosfaat) en/of een botgroeifactor.

Het primaire doel van de kooien is gericht op het herstel van de mechanische eigenschappen van de wervelkolom, d.w.z. het ontwerp van de 15 kooien is zodanig dat de oorspronkelijke ruimte van de tussenwervelschijf wordt hersteld, dat het sagittaalvlak wordt uitgelijnd, en dat de draagkracht van de anterieure kolom wordt hersteld. Om die reden worden bij de gebruikelijke procedure veelal metalen (bijvoorbeeld titanium) kooien toegepast die voor deze functie sterk genoeg zijn.

20 De stijfheid en sterkte van dit soort fusiekooien leidt echter tegelijkertijd tot het optreden van zogenaamde "stress-shielding" van het implantaatmateriaal dat zich binnen in de kooi bevindt, een fenomeen waarbij het implantaatmateriaal geen druk van de wervelkolom ondervindt hetgeen de snelheid en mate van botvorming en de daaropvolgende fusie 25 negatief beïnvloedt. "Stress-shielding" is één van de redenen dat fusies in veel gevallen niet succesvol zijn en dat de PLIF operatie niet slaagt.

Een ander probleem dat zich bij de PLIF operaties voordoet is dat een significant aantal patiënten (10-50%) serieuze problemen ondervindt van de wegname van het donorbot uit de bekkenkam. De problemen 30 variëren van haematoom en blijvende donor morbiditeit ter plaatse van de 1026712 3 botafname, hetgeen met veel pijn gepaard gaat, tot instabiliteit en zelfs fracturen van het bekken. Om deze problemen te voorkomen en het succes van PLIF operaties te vergroten zijn alternatieve materialen voor kooien en bottransplantaten wenselijk.

5 Zo zijn thans kooimaterialen bekend, zoals de materialen PLLA en poly-L/D-lactide (PLDLA; een mengsel van poly-L-melkzuur met 30% van poly-D-melkzuur), die resorbeerbaar zijn en die een elasticiteitsmodulus bezitten die vergelijkbaar is met die van wervelbot. Deze resorbeerbare kooien verminderen het optreden van "stress-shielding" van het 10 transplantatiemateriaal omdat bij het resorberen van de kooi door het lichaam het nieuw gevormde botmateriaal geleidelijk steeds meer belast zal worden.

Verscheidene materialen en werkwijzen zijn toegepast ter verhoging van de botdichtheid en van het botvolume. De toepassing van 15 autoloog bot is tegenwoordig de meest betrouwbare werkwijze en dit bot is een doelmatig implantaat materiaal. Een nadeel is echter zoals gezegd de afsterving op de donorplaats en de beperkte beschikbaarheid. De toepassing van allo-implantaten en xenogene bot implantaten wordt in toenemende mate dubieuzer als gevolg van immunologische problemen en risico van 20 virale contaminatie.

De toepassing van alleen een synthetisch dragermateriaal (bijvoorbeeld hydroxyapatiet) heeft als nadeel dat een dergelijk dragermateriaal alleen osteo-conductieve eigenschappen en geen osteo-inductieve eigenschappen bezit. Cellen die voor de fusie van de 25 wervelsegmenten moeten zorgen zullen eerst vanuit de omgeving in de scaffold moeten diffunderen dan wel door nieuwe vaatingroei in de scaffold aangevoerd moeten worden.

De uitvinding verschaft nu voor één of meer van de bovenstaande problemen een oplossing.

30 1026712 4

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

In een eerste aspect voorziet de onderhavige uitvinding in kunstmatig botimplantaat, omvattende een resorbeerbare poreuze matrix waarin zich een osteo-inductieve samenstelling omvattende calciumfosfaat 5 en uit vetweefsel afkomstige stamcellen bevindt. Bij voorkeur omvat genoemde poreuze matrix PLDLA en is genoemd calciumfosfaat bicalciumfosfaat. Genoemde osteo-inductieve samenstelling kan voorts een groeifactor gekozen uit de groep bestaande uit TGFp's, BMP's, Osf-1 en LMP-1 omvatten, bij voorkeur Osf-1.

10 In een ander aspect voorziet de onderhavige uitvinding in de toepassing van een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding voor botchirurgische ingrepen, in het bijzonder spinale fusies.

Nog een aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een kunstmatig botimplantaat voor 15 gebruik bij botoperaties, omvattende het samenvoegen van een resorbeerbare poreuze matrix en een osteo-inductieve samenstelling omvattende calciumfosfaat en uit vetweefsel afkomstige stamcellen.

In weer een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het uitvoeren van een botoperatie, bij voorkeur een lumbale 20 wervelfusie, omvattende het implanteren van een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding in een bot van een patiënt.

Ook heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het herstellen van een botdefect in een vertebraat omvattende het verwijderen van vetweefsel uit een vertebraat en het isoleren van stamcellen daaruit, 25 het vervaardigen van een osteo-inductieve samenstelling middels het uitzaaien van genoemde stamcellen op calciumfosfaat, het vullen van een resorbeerbare poreuze matrix met genoemde osteo-inductieve samenstelling ter verschaffing van een kunstmatig botimplantaat en het inbrengen van genoemd botimplantaat in genoemde vertebraat middels een chirurgische 30 operatie.

1026712 5

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Een "synthetisch vulmiddel" of "dragermateriaal" zoals hierin gebruikt is de - vaak poreuze - granulaire, vezelvormige of poedervormige of 5 ten minste tijdelijk mengbare of plastische substantie of vaste substantie die het vermogen heeft om als botondersteunend (osteoconductief) aanhechtingssubstraat voor botvormende cellen of weefsels op te treden.

Het "synthetisch vulmiddel" of het "dragermateriaal" wort in de onderhavige uitvinding toegepast in de vorm van een scaffold (zie 10 hieronder). In uitvoeringsvormen volgens de uitvinding is het osteoconductief dragermateriaal bij voorkeur calciumfosfaat.

Een "scaffold" of "weefselscaffold" zoals hierin gebruikt is de functionele omschrijving van een synthetisch vulmiddel of dragermateriaal in zijn fysisch ondersteunende of dragende hoedanigheid voor individuele 15 botvormende cellen of botvormend weefsel. Van een scaffold wordt gesproken wanneer de botvormende cellen zich aan het dragermateriaal hebben aangehecht en de scaffold bezit bij voorkeur een specifieke architectuur ter bevordering van migratie, verblijf en/of proliferatie van botcellen en ter verschaffing van structurele ondersteuning gedurende de 20 wondheling.

De term "fusiekooi", "kooi" of "matrix" wordt hierin afwisselend gebruikt en is hierin gedefinieerd als een vormvast, in hoofdzaak gesloten, bij voorkeur poreus omhulsel of raamwerk met een interne holte voor het ontvangen van vervangingsmateriaal voor bot, i.e. waarin de scaffold kan 25 worden geladen.

De term “poreus” in de context van de onderhavige uitvinding is gedefinieerd als het hebben van holten (poriën) van een voldoende dimensie om een cel te herbergen en om een celsuspensie door de holten in het materiaal te laten indringen. De holten kunnen het interstitiele volume 1026712 6 tussen vezels of deeltjes van de scaffold of de kooi zijn of de gaten (ook wel cellen genoemd in een in hoofdzaak homogene, open-vaste structuur.

Een "osteo-inductieve scaffold" zoals hierin gebruikt omvat een combinatie van de osteogene stamcellen uit vet met een osteoconductieve 5 drager.

Een "osteogene stamcel" is een stamcel die tot differentiatie via de osteogene route is aangezet, of een stamcel die het vermogen heeft om zich via de osteogene route te differentiëren als gevolg van de aanwezigheid van een recombinant gen coderend voor een botgroeifactor in die stamcel welk 10 gen tot expressie kan worden gebracht, of een stamcel die zich in een omgeving bevindt waarin tevens een botgroeifactor aanwezig is in een concentratie die tot inductie van differentiatie van genoemde stamcel leidt, of een stamcel die het vermogen heeft om zich via de osteogene route te differentiëren na inductie met een botgroeifactor.

15 De uitdrukking "herstellen van een botdefect" zoals hierin gebruikt is niet beperkt tot handelingen gericht op het herstellen van botschade of verlies aan bot, maar tevens op handelingen die zijn gericht op het aanvullen van botmateriaal op plaatsen waar dit gewenst is, zoals uitgevoerd in plastische, reconstructieve en esthetische chirurgie.

20 Een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding omvat een resorbeerbare poreuze matrix of kooi. De kooi kan iedere gewenste vorm aannemen en dient in eerste instantie voor het conserveren van de vorm van het implantaat en het positioneren van het implantaat op de gewenste positie. Bij voorkeur is de kooi een fusiekooi zoals deze wordt toegepast voor 25 het fuseren van twee wervels, maar essentieel is dit niet. Ook ander kooien, bijvoorbeeld die welke kunnen worden toegepast in botoperaties als schedeloperaties, kaakoperaties, heupoperaties of ander botoperaties kunnen door de vakman worden ontwikkeld, zolang stevigheid of ondersteuning aan de osteo-inductieve samenstelling kan worden geboden 1026712 i 7 en positionering met en, indien gewenst tevens, van de nog aanwezige botelementen middels de kooi mogelijk wordt.

Kooimaterialen die in uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding worden toegepast zijn bioresorbeerbare materialen. Zeer geschikt 5 zijn materialen als PLLA of PLDLA, bij voorkeur wordt PLDLA toegepast. Deze materialen hebben een elasticiteitsmodulus die lijkt op die van wervelbot. Bijkomend voordeel is dat deze materialen radiolucent zijn, zodat follow-up middels röntgenopnames en/of CT- en MRI-scans goed mogelijk is. Van PLLA en PLDLA is aangetoond dat zij geresorbeerd worden via 10 natuurlijke routes, waardoor op de lang termijn geen lichaamsvreemd materiaal in de fusiesegmenten achterblijft.

Een voordeel van de toepassing van bioresorbeerbare materialen als kooimateriaal is dat de zogenoemde "stress shielding" van het implantaat materiaal, zoals die voorkomt bij de gebruikelijk toegepaste 15 metalen kooien, in sterk verminderde mate optreedt of zelfs achterwege blijft. Voorts is een voordeel van bioresorbeerbare kooien, zoals PLLA en PLDLA kooien, dat deze resulteren in verhoogde snelheden en aantallen van botfusies in vergelijking met titanium kooien. Daarbij vertonen deze kooien een geringe immunogeniciteit.

20 Voor het vervaardigen van bioresorbeerbare kooien van bijvoorbeeld PLLA wordt melkzuur omgezet in dilactide waarna door verestering poly-(L-lactide) (PLLA) kan worden bereid en verwerkt tot een kooi, bijvoorbeeld zoals beschreven in EP 1 138 285.

Naast PLLA of PLDLA kan eventueel ook polyglactin 910 (Vicryl) 25 of een andere geschikte resorbeerbaar materiaal worden toegepast.

Een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding omvat voorts een osteo-inductieve samenstelling omvattende calciumfosfaat en stamcellen.

Van calciumfosfaten is aangetoond dat zij een goede interactie met 30 levend bot vertonen. Als osteoconductief dragermateriaal voor autologe 1026712 8 stamcellen kan daarom zeer geschikt calciumfosfaat worden toegepast. De meest uitgebreid bestudeerde calciumfosfaat configuraties zijn hydroxyapatite (HA) en bi- en tricalciumfosfaten (BCP en TCP). BCP en TCP zijn biodegradeerbaar, terwijl HA, in het bijzonder in de gesinterde 5 vorm, als niet-resorbeerbaar wordt beschouwd. Door het variëren van de verhoudingen tussen BCP, TCP, en andere bestanddelen zoals hieronder genoemd kan een meer of minder poreus en/of kristallijn cement worden vervaardigd. Van biocompatibele calciumfosfaat scaffold zijn geen immunologische reacties te verwachten 10 Bij voorkeur hebben de poriën van de scaffold een diameter van 200-1000 μιη, bij groter voorkeur 400-600 pm. De tussenverbindingen hebben bij voorkeur een diameter van 50-200 pm, bij grotere voorkeur 120-150 pm. De verhouding tussen oppervlakte en volume is aldus dat een porositeit van ten minste 60%, bij voorkeur te minste 70%, bij grotere 15 voorkeur ten minste 80%, bij nog groter voorkeur ten minste 90% wordt bereikt.

Bij voorkeur wordt een BCP composiet (bestaande uit bicalciumfosfaat en 40% hydroxy-apatiet) als dragermateriaal toegepast. Bij nog grotere voorkeur wordt het BCP BiCalPhOS® (Medtronic Sofamor 20 Danek Memphis, Tn, USA) toegepast. De optimalisatie van de keuze is daarin gelegen dat middels toepassing van dit materiaal een snellere resorptie/hermodellering plaatsvindt in vergelijking met andere dragers.

Andere bestandelen die kunnen worden toegevoegd aan een osteoconductief dragermateriaal zijn bijvoorbeeld biocompatibele polymeren 25 ter eventuele verhoging van de dichtheid en sterkte van het materiaal, stoffend die de adhesie van cellen bevorderen, groeifactoren en antimicrobiële stoffen.

Als stamcellen worden in de onderhavige uitvinding stamcellen uit vetweefsel toegepast. Een voordeel van de toepassing van stamcellen uit 30 vetweefsel boven de toepassing van stamcellen uit beenmerg is dat voor het 1026712 9 verkrijgen van eerstgenoemde voorafgaand aan de eigenlijke wervelkolomoperatie geen aparte operatieve handeling, d.w.z. een zeer pijnlijke en ongerieflijke beenmergafname noodzakelijk is en tevens geen arbeidsintensieve, risicovolle, dure, en tijd-consumerende vermeerdering 5 van stamcellen in het laboratorium ter in vitro expansie van de beenmergstamcellen.

Een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding omvat daarom een osteo-inductieve samenstelling omvattende uit vetweefsel afkomstige stamcellen. Er komen steeds meer aanwijzingen dat stamcellen 10 aanwezig in verscheidene weefsels een brede plasticiteit hebben.

Pluripotente stamcellen zijn geïdentificeerd in embryoweefsel en in volwassen weefsel. De toepassing van embryostamcellen is echter onderhevig aan brede ethische discussies en alleen klein hoeveelheden kunnen worden verkregen.

15 Het ontwikkelings- en differentiatiepotentieel van stamcellen verkregen uit beenmerg van volwassen individuen blijkt verder te reiken dan de hematopoietische lijn en zowel de vasculogene, mesenchymale, niet-mesenchymale en endodermale richting te omvatten. Daarnaast werd gevonden dat stamcellen met brede ontwikkelingsmogelijkheden ook van 20 niet-hematopoietische oorsprong konden zijn, met inbegrip van neuronen of spieren. Hoewel deze laatste een nieuwe onderzoeksterrein hebben geopend met in potentie een breed scala aan toepassingen heeft de rol van het beenmerg als een bron van stamcellen met differentiatiemogelijkheid naar mesenchymale cellen en weefsels een langere geschiedenis. In de laatste 25 tien jaar is aangetoond dat uit beenmerg verkregen mesenchymale stamcellen (MSC) de mogelijkheid hebben om zich te differentiëren tot zowel chondrocyten, adipocyten, myeloblasten en osteoblasten.

Het mesenchymale differentiatiepotentieel heeft geleid tot enkele successen in een klinische trial die ten doel had de differentiatie in de 30 osteoblast cellijn te herstellen in kinderen met "osteogenesis imperfecta" en 1026712 10 leidde tot verder onderzoek naar MSC gebaseerde therapieën. Het belangrijkste obstakel voor de toepassing van uit beenmerg verkregen MSC cellen, afgezien van het ongemak voor patiënten, is echter de lage frequentie (ongeveer 1 MSC per 105 aanhechtende stromale cellen), die cel-expansie 5 noodzakelijk maken met alle bekende nadelen van tijdsduur, kosten en contaminatie risico's en het risico van stamcel differentiatie in plaats van expansie.

Het is bekend dat stromale cellen van humaan vetweefsel in vitro enkele kenmerken vertonen van osteoblast differentiatie. Net als uit 10 beenmerg verkregen MSC hebben uit vetweefsel verkregen cellen, het vermogen om te differentiëren tot zowel chondrocyten, adipocyten, myeloblasten en osteoblasten indien geïnduceerd met de juiste cellijn-specifieke inductiefactoren. Vetweefsel stamcellen missen veel van de bovengenoemde nadelen van uit beenmerg verkregen cellen.

15 Vetweefsel stamcellen kunnen worden verkregen uit liposuctie aspiraten, die met minimaal ongemak kunnen worden verkregen, zonder langdurige zuiveringsprocedures en met hoge opbrengst (300 cc aspirate levert een opbrengst van 2 tot 6 x 108 cellen). Dit neemt de noodzaak weg voor in vitro expansie met de bijkomende risico's zoals dat voor 20 beenmergcellen nodig is.

De vetweefsel stamcellen kunnen voor langere tijd in vitro worden gehandhaafd zonder schijnbare afsterving en zijn als autologe stamcellen van nature immunocompatibel.

Het aspireren van vetweefsel (liposuctie) kan worden uitgevoerd 25 middels toepassing van iedere daartoe bekende werkwijze, bijvoorbeeld middels procedures die recentelijk zijn beschreven, waarbij tevens wordt verwezen naar procedures voor het verkrijgen van stamcellen daaruit (Halvorsen et al., 2001, Tissue Eng 7:729-41; Mizuno et al., 2002, Plast Reconstr. Surg. 109:199-209; Zuk et al., 2001 Tissue Eng7:211-228). Het 30 aspiraat kan worden verkregen van verschillende delen van het lichaam 1026712 11 zoals uit abdomen, dij of billen. De vakman zal gemakkelijk kunnen vaststellen dat de hoeveelheid en kwaliteit van de geoogste stamcellen kan variëren met de plaats van afname en diepte van de aspiratie van het vetweefsel. Ook kan het minimale aspiratievolume worden bepaald om een 5 voldoende hoeveelheid van stamcellen te verkrijgen. Aspiraten kunnen direct verder worden verwerkt, of kunnen korte tijd worden opgeslagen. De vakman zal in staat zijn om opslagomstandigheden zo te kiezen dat een voldoende hoeveelheid en kwaliteit van stamcellen na opslag uit het aspiraat verkregen kan worden. Bij voorkeur wordt het aspiraat direct 10 verwerkt.

Een osteo-inductieve samenstelling kan vervolgens worden bereid door het calciumfosfaat en de stamcellen samen te voegen door deze bijvoorbeeld te mengen in een geschikte verhouding of bijvoorbeeld door passieve impregnatie van het calciumfosfaat met suspensies van stamcellen. 15 Deze stap wordt ook wel het uitzaaien van stamcellen op calciumfosfaat genoemd. Gewichtsverhoudingen van stamcellen:calciumfosfaat in genoemde osteo-inductieve samenstelling bedragen bij voorkeur 1:10000 tot 1:10.

Een osteo-inductieve samenstelling kan voorts therapeutische 20 stoffen omvatten zoals antibiotica, adhesiestoffen, groei bevorderende stoffen, antibiotica of botgroei stimulerende eiwitten (botgroeifactoren) om de stamcellen aan te zetten tot differentiatie via de osteogene route.

Optioneel kunnen de stamcellen voorafgaand aan het mengen met het dragermateriaal worden aangezet om te differentiëren tot osteoblasten. 25 Een geschikte inductiemedium dat hiervoor kan worden toegepast is bijvoorbeeld Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084) met 10% Fetal Bovine Serum (FBS; GibcoBRL-Cat# 10437-028), verder aangevuld met 0,1 mM dexamethason, 50 mM ascorbaat-2-fosfaat, 10 mM glycerofosfaat, en 1 gew. % antibioticum of antimycoticum. De 30 differentiatie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd bij incubatie van de 1026712 12 stamcellen bij 37°C in 5% CO2 gedurende een hiervoor nader te bepalen optimaal aantal dagen.

Bij voorkeur worden de stamcellen voorafgaand of na het mengen met het dragermateriaal, of zelfs na het vullen van de matrix met de osteo-5 inductieve samenstelling aangezet om te differentiëren tot osteoblasten middels toepassing van botgroeifactoren.

De botgroeifactoren kunnen daartoe o.a. aan de osteo-inductieve samenstelling worden toegevoegd teneinde de differentiatie van de stamcellen tot osteoblast daarin te induceren. Ook kunnen de vetstamcellen 10 eerst in contact met botgroeifactoren worden gebracht en daarna worden gemengd met het dragermateriaal ter verschaffing van de osteo-inductieve samenstelling. In alternatieve uitvoeringsvormen kan de inductie van de differentiatie van de stamcellen middels botgroeifactoren worden uitgevoerd aan het botimplantaat voorafgaand aan operatieve implantatie of zelfs 15 nadat het implantaat in de patiënt is ingezet.

Botgroeifactoren zijn specifieke eiwitten die opbouw en afbraakprocessen in het lichaam beïnvloeden door het reguleren van celgroei en celfunctie. De groeifactoren die betrokken zijn bij de vorming van bot zijn onder te verdelen in twee groepen, de botinducerende en de bot-20 producerende. De botinducerende (nieuwe botontwikkeling in een botvrije omgeving) groeifactoren, waaronder de bot morfogenetisch eiwitten (BMFs), kunnen een ongedifferentieerde stamcel doen differentiëren tot voorloper botcel (pre-osteoblast). De bot-producerende, waaronder transformerende groeifactor-β ("Transforming Growth Factor β"; TGF-β), insuline-achtige 25 groeifactor ("Insulin-like growth factor"; IGF), en uit plaatjes verkregen groeifactor ("platelet-derived growth factor"; PDGF), kunnen het aantal gedifferentieerde bot-cellen doen toenemen in aantal (prolifereren) of verder laten differentiëren tot een botmatrix vormende cel (osteoblast).

In principe kunnen beide typen groeifactoren worden toegepast in 30 uitvoeringsvormen volgens de onderhavige uitvinding. Vele groeifactoren 1026712 13 zoals beschreven in verscheidene overzichtspublicaties (Bonewald, 2002, In Bilezikian et al., (eds) Principles ofBone Biology, Academie Press, San Diego, pp.903-18; Rosen en Wozney, 2002, In Bilezikian et al., (eds) Principles ofBone Biology, Academie Press, San Diego, pp. 919-28; Reddi, 5 2000, Tissue Eng. 6:351-9; Boden, 2000, Tissue Eng. 6:383-99; Deuel et al., 2002 Arch. Biochem. Biophys. 397:162-172) kunnen worden toegepast in uitvoeringsvormen volgens de onderhavige uitvinding. Bij voorkeur worden groeifactoren uit de groep van TGFps (o.a. TGFpi-5) en BMPs toegepast. Bij grote voorkeur worden één of meer van de groeifactoren osteoblast 10 stimulerende factor-1 ("Osteoblast Stimulating factor-1"; Osf-1), recombinant humaan BMP-2 (rhBMP-2) en LIM mineralisatie eiwit-1 ("LIM mineralization Protein-1"; LMP-1) toegepast. Bij nog grotere voorkeur wordt Osf-1 (ook bekend als HB-GAM, pleiotrofine) toegepast. Deze factor, een 18 kDa cytokine dat diverse functies signaleert, verzekert snelle en sterke 15 aanhechting van de Osf-1 getransduceerde stamcellen aan het oppervlak van het dragermateriaal, waardoor de osteoblast differentiatie wordt versneld. Bovendien rekruteert Osf-1 osteoblasten uit de omgeving van het implantaat en bevordert het de angiogenese ter verzekering van verbeterde snelheden van het herstel.

20 Groeifactoren zijn op twee manieren te verkrijgen. Een methode is de extractie uit weefsels of weefselvloeistoffen (autoloog, alloloog of xenoloog), de andere methode is het synthetiseren middels gentranscriptie van gemodificeerd DNA bij sneldelende cellen in kweek (recombinant technieken). Voorbeeld van de eerste methode is PRP (plaatjes rijk plasma), 25 waarbij lichaamseigen groeifactoren (voornamelijk PDGF en TGF-β) worden gewonnen uit bloed.

De toepassing van een osteogene groeifactor ter plaatse van het implantaat om fusie te induceren kan leiden tot hoge diffusiesnelheden en korte halfwaardetijden van de osteogene factor, met hiermee 30 samenhangende korte tijden dat grenswaarden van de osteogene factor op 1026712 14 de plaats waar de inductie moet plaatsvinden gehandhaafd blijven. Daarnaast kan als gevolg van het wegdiffunderen van de groeifactor zelfs botvorming buiten het fusiegebied plaatsvinden. Ook bij deze vorm van fusie-inductie zullen cellen die voor de fusie van de wervelsegmenten 5 moeten zorgen eerst vanuit de omgeving in de scaffold moeten diffunderen dan wel door vaatingroei in de scaffold aangevoerd moeten worden. De kans hierop wordt kleiner naarmate de biologische halfwaardetijden kleiner zijn en/of diffusie snelheden hoger liggen. Een ander nadeel is dat (recombinante) osteogene factoren duur zijn en aanleiding kunnen geven tot sensibilisatie. 10 Het is mogelijk om de toepassing van de bovenvermelde zeer kostbare groeifactoren te vermijden door bijvoorbeeld gebruik te maken van de al dan niet tijdelijke expressie van een recombinant ingebracht gen coderend voor een osteogene factor. Bij voorkeur wordt daarom een stamcel gevormd die in staat is de betreffende groeifactor zelf te produceren, bij 15 voorbeeld zoals beschreven in EP 0 890 639 and US 2002102728. Hiertoe kunnen stamcellen bijvoorbeeld worden getransfecteerd met adenovirale vectoren waarin de betreffende genen voor osteogene groeifactoren zijn ingebracht en welke vector in de stamcel tot expressie kan worden gebracht.

Voor het bereiden van een kunstmatig botimplantaat volgens de 20 uitvinding kan een resorbeerbare poreuze matrix zeer geschikt worden samengevoegd met een osteo-inductieve samenstelling zoals bovenbeschreven ter verschaffing van een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding. Zo kan de poreuze matrix zeer geschikt worden samengevoegd met een osteo-inductieve samenstelling door diffusie, 25 electroforese, centrifugaalkrachten of cross-linking.

Een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding kan eventueel na de vervaardiging daarvan verder worden verwerkt, bijvoorbeeld door slijpen, polijsten, het aanbrengen van be vestigingsmogelijkheden als schroefgaten of haken, of vermalen.

1026712 15

Een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding kan van een complexe geometrische vorm zijn. Bijvoorbeeld de vorm kan insnijdingen, interne holten, uitsparingen, of uitstulpingen hebben. Het botimplantaat kan zodanig zijn gevormd dat een specifiek bot of specifieke botten of delen 5 daarvan of ruimten tussen botten of holtes in botten daarmee vervangen of ingevuld kunnen worden. Het botimplantaat kan speciaal voor een bepaalde patiënt voorafgaand aan de operatie gedimensioneerd en gevormd worden. Ook kan het botimplantaat van een eenvoudige vorm zijn, zoals een blok, dat bedoeld is om gevormd te worden door een chirurg gedurende een 10 chirurgische ingreep. Het botimplantaat kan passend gemaakt worden voor het botdefect en kan voor het verhogen van de pasvorm taps toelopend zijn of met schuine kanten zijn afgewerkt of van in elkaar grijpende onderdelen zijn voorzien.

Een kunstmatig botimplantaat volgens de uitvinding waarin 15 stamcellen verkregen uit vetweefsel zijn toegepast biedt een aantal aantrekkelijke voordelen. Vanuit medisch standpunt bezien zijn de voordelen van dit nieuwe botimplantaat en de daaraan verbonden toepassingsmogelijkheden o.a.: (i) een één-staps procedure voor de patiënt 20 (ii) geen belangrijke veranderingen in de chirurgische procedure zelf voor de patiënt (iii) gebruik van resorbeerbaar Röntgen-doorlaatbaar kooi-materiaal, zonder achterlating van vreemd materiaal in het lichaam in de loop van de tijd 25 (iv) alleen inert resorbeerbaar dragermateriaal wordt in de kooi geplaatst, dat onbeperkt kan worden geproduceerd volgens reproduceerbare, verifieerbare industriële standaarden toepasbaar voor medisch gebruik (v) vervanging van autotransplantaat door autologe stamcelpreparaten, verkregen door minimaal invasieve technieken tijdens 1026712 16 dezelfde chirurgische ingreep, waarbij de negatieve bijwerking worden voorkomen die gepaard gaan met oogsten van bekkenkambottransplantaat.

(vi) Autologe stamcellen zijn van nature immunocompatibel en er zijn geen ethische issues aan hun gebruik verbonden, in tegenstelling tot 5 het gebruik van embryonale stamcellen

Vanuit economisch standpunt bezien, zijn de voordelen o.a.: (vi) één-staps chirurgie kan worden uitgevoerd, terwijl het gebruik van beenmerg-verkregen stamcellen gewoonlijk beenmerg aspiratie vooraf vereist, wat meerdere bezoeken aan de kliniek betekent. Daar komt nog bij 10 dat dure beenmergcel zuiverings- en vermeerderingstechnieken (weken) nodig zijn voor de eigenlijke wervelkolomoperatie.

(viii) chirurgische tijd zal niet worden verlengd, maar mogelijk zelfs verkort [6j (ix) het gebruik van zeer dure groeifactoren kan worden vermeden.

15 Een botchirurgische werkwijze volgens de uitvinding omvat iedere werkwijze voor het herstellen van botdefect in een vertebraat, bij voorkeur een lumbale wervelfusie.

Een botchirurgische werkwijze volgens de uitvinding omvat de stap van het verwijderen van vetweefsel uit een vertebraat, bijvoorbeeld middels 20 liposuctie zoals bovenomschreven.

Voorts omvat een botchirurgische werkwijze volgens de uitvinding de stap van het isoleren van stamcellen daaruit. Dergelijke werkwijzen zijn bij de vakman bekend (zie o.a. Halvorsen et al., 2001, Tissue Eng 7:729-41; Mizuno et al., 2002, Plast Reconstr. Surg. 109:199-209; Zuk et al., 2001 25 Tissue Eng7:211-228.

Nadat de stamcellen uit het vetweefsel zijn verkregen kan door de inductie van de differentiatie van deze stamcellen tot osteoblasten middels daartoe bestemde inductiemedia, een populatie osteogene cellen verkregen worden. De inductie heeft ten doel de stamcellen aan te zetten tot 30 ontwikkeling via de osteogene route, d.w.z. de differentiatie van stamcel of 1026712 17 voorloper botcel (osteoprogenitor cel) tot osteoblast. Gebaseerd op in vitro botvorming, wordt het proces van de ontwikkeling van osteoprogenitor cellen van een stamcelstadium tot een volledig functionele botmatrix-synthetiserende osteoblast onderverdeeld in drie stadia of fasen: 1) 5 proliferatie, 2) extracellulaire botmatrix ontwikkeling en rijping, en 3) mineralisatie.

Een botchirurgische werkwijze volgens de uitvinding omvat vervolgens de stap van het vervaardigen van een osteo-inductieve samenstelling middels het uitzaaien van stamcellen op calciumfosfaat, en 10 het vullen van een resorbeerbare poreuze matrix met genoemde osteo-inductieve samenstelling ter verschaffing van een kunstmatig botimplantaat. De chirurgische werkwijze omvat ten slotte het inbrengen van genoemd botimplantaat in genoemde vertebraat middels een chirurgische operatie.

15 Het aanzetten van de cellen tot differentiatie kan in principe op ieder willekeurig moment gebeuren. Bij voorkeur wordt de differentiatie inductiestap uitgevoerd voor het uitzaaien van de stamcellen op het dragermateriaal.

De toepassing van het transplantaat volgens de uitvinding zal 20 leiden tot sneller herstel van de functionaliteit van de wervelkolom zonder de nadelen geassocieerd met autologe bot implantaten.

Verder maakt de uitvinding een één-staps chirurgische procedure mogelijk. Het toepassen van stamcellen verkregen uit vetweefsel brengt namelijk met zich mee dat veel hogere opbrengsten van stamcellen kunnen 25 worden verkregen in vergelijking met uit beenmerg verkregen stamcellen. Hierdoor is het niet noodzakelijk om de stamcellen middels laboratoriumkweek te expanderen. De liposuctie-stap kan worden uitgevoerd binnen de PLIF operatie procedure en de extractie van stamcellen daaruit, de inductie tot differentiatie en het uitzaaien op 30 calciumfosfaat kan worden uitgevoerd binnen 1-1,5 uur.

1026712 18

Een voordeel van de werkwijze en toepassing volgens de uitvinding is dat de bestaande stappen in de operatieve uitvoering kunnen gehandhaafd blijven waardoor geen belangrijke veranderingen in de chirurgische procedure behoeven te worden doorgevoerd. De 5 éénstapsprocedure bespaart bovendien de patiënt een tweede opname en operatie en heeft grote persoonlijke (voor de patiënt) en socio-economische voordelen. Voorts is er geen ethisch probleem te verwachten door gebruikmaking van adulte stamcellen en zijn geen dure groeifactoren benodigd.

10 De werkwijzen en materialen van de onderhavige uitvinding kunnen worden toegepast in alle vakgebieden waar bottransplantatie noodzakelijk is, bijvoorbeeld in orthopedisch en neuraalchirurgisch vakgebied, maar tevens in de tandheelkunde. In het algemeen kunnen de werkwijzen en materialen van de uitvinding worden toegepast om een 15 botdefect als gevolg van bijvoorbeeld trauma, tumor, infectie, en loszittende gewrichtsimplantaten te herstellen.

20 1026712

Claims

1. Kunstmatig botimplantaat, omvattende een resorbeerbare poreuze matrix waarin zich een osteo-inductieve samenstelling omvattende calciumfosfaat en uit vetweefsel afkomstige stamcellen bevindt.

2. Kunstmatig botimplantaat volgens conclusie 1, waarin genoemde 5 poreuze matrix PLDLA omvat.

3. Kunstmatig botimplantaat volgens conclusie 1, waarin genoemde poreuze matrix uit PLDLA bestaat.

4. Kunstmatig botimplantaat volgens één van de conclusies 1-3, waarin genoemd calciumfosfaat bicalciumfosfaat is.

5. Kunstmatig botimplantaat volgens één van de conclusies 1-4, waarbij genoemde samenstelling voorts ten minste één groeifactor gekozen uit de groep bestaande uit TGFp's, BMP's, Osf-1 en LMP-1 omvat.

6. Kunstmatig botimplantaat volgens conclusie 5, met het kenmerk dat genoemde groeifactor Osf-1 is.

7. Kunstmatig botimplantaat volgens één van de voorgaande conclusies, met een porositeit van ten minste 80%.

8. Kunstmatig botimplantaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarin de verhouding resorbeerbare poreuze matrixrosteo-inductieve samenstelling in het gebied van ongeveer 1:10 tot 10:1 ligt.

9. Kunstmatig botimplantaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarin de verhouding uit vetweefsel afkomstige stamcellen:calciumfosfaat in genoemde osteo-inductieve samenstelling in het gebied van ongeveer 1:10000 tot 1:10 ligt.

10. Toepassing van een kunstmatig botimplantaat volgens één van de 25 conclusies 1-9, voor botchirurgische ingrepen, in het bijzonder spinale fusies.

11. Osteo-inductieve samenstelling omvattende calciumfosfaat en uit vetweefsel afkomstige stamcellen. 1026712 »

12. Werkwijze voor het bereiden van een kunstmatig botimplantaat volgens één van de conclusies 1-9, omvattende het samenvoegen van een resorbeerbare poreuze matrix en een osteo-inductieve samenstelling omvattende calciumfosfaat en uit vetweefsel afkomstige stamcellen.

13. Werkwijze voor het uitvoeren van een botoperatie, omvattende het implanteren van een kunstmatig botimplantaat volgens één van de conclusies 1-9 in een bot van een patiënt.

14. Werkwijze voor het herstellen van een botdefect in een vertebraat omvattende het verwijderen van vetweefsel uit een vertebraat en het 10 isoleren van stamcellen daaruit, het vervaardigen van een osteo-inductieve samenstelling middels het uitzaaien van stamcellen op calciumfosfaat, het vullen van een resorbeerbare poreuze matrix met genoemde osteo-inductieve samenstelling ter verschaffing van een kunstmatig botimplantaat en het inbrengen van genoemd botimplantaat in genoemde 15 vertebraat middels een chirurgische operatie.

15. Werkwijze volgens conclusie 13 of 14, waarin genoemde operatie lumbale wervelfusie is. 1026712