CN105316284A - 骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用生物衍生骨进行体外培养；在体外培养过程中，用诱导液进行诱导反应。通过采用经处理后的生物衍生骨作为三维培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，提高骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力等，而且利用生物衍生骨良好的骨传导性和骨诱导性，从而提高了骨髓间充质干细胞的诱导转化率及细胞活性，解决了现有技术中，采用二维培养体系诱导培养骨髓间充质干细胞存在的细胞活性差，骨髓间充质干细胞的诱导转化率低等问题。

Description

骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨MSCs体外诱导培养具有深远意义。

目前骨髓间充质干细胞的体外诱导多采用二维培养方式进行的，但二维培养无法满足骨髓间充质干细胞在体内生长的三维环境，且由于骨髓间充质干细胞具有较强的贴壁性，因此，在二维培养体系中，细胞易聚集成团，细胞与培养基及诱导液的接触面积较少，不利于细胞的生长，从而造成细胞活性较差，诱导率低等缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用二维诱导培养体系诱导骨髓间充质干细胞存在细胞活性差，诱导率低等缺陷，提供一种能够提高骨髓间充质干细胞诱导率及细胞活性的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用生物衍生骨进行体外培养；

在体外培养过程中，用诱导液进行诱导反应。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述生物衍生骨的制备过程包括以下步骤：取骨块于H₂O₂中浸泡36～80小时，每24小时换液一次；再浸泡于双蒸水中20～60分钟后，依次于乙醇和丙酮中分别浸泡12～36小时后，再于双蒸水中浸泡20～60分钟后，干燥冷冻，并灭菌。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，进行体外培养之前，还包括对所述生物衍生骨预处理的过程，包括以下步骤：将所述生物衍生骨浸泡于PBS溶液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于无血清培养基中2-4天，再加入FBS浸润1-5小时，获得浸润后的生物衍生骨。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述体外培养过程包括以下步骤：

将骨髓间充质干细胞接种于浸润后的生物衍生骨，静置4-6小时后，加入完全培养基进行扩增培养，获得扩增后的骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述完全培养基中添加有80-120U/ml的青霉素、80-120mg/ml的链霉素、0.15-0.50mg/ml的谷氨酞胺以及1-5mg/ml的HEPES缓冲液。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，用所述诱导液进行诱导反应的过程步骤为：

用所述诱导液对扩增后的骨髓间充质干细胞进行诱导培养7-10天，每2-4天换液一次。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述诱导液包括10^-7-10^-9mol/L的地塞米松、25-75μg/ml的维生素C和5-15mmol/L的β-甘油磷酸钠。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法中，所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行的。

实施本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，可以达到以下有益效果：通过采用经处理后的生物衍生骨作为三维培养支架，不仅能够维持模拟骨髓微环境的三维多孔结构，提高骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力等，而且利用生物衍生骨良好的骨传导性和骨诱导性，从而提高了骨髓间充质干细胞的诱导转化率及细胞活性，解决了现有技术中，采用二维培养体系诱导培养骨髓间充质干细胞存在的细胞活性差，骨髓间充质干细胞的诱导转化率低等问题。

具体实施方式

为解决现有技术中采用二维体系诱导培养骨髓间充质干细胞存在细胞活性差，诱导率低等缺陷，本发明的创新点在于提供一种三维培养体系以模拟骨髓微环境进行诱导培养骨髓间充质干细胞的方法，避免了骨髓间充质干细胞在二维培养体系中易聚集成团，与培养基及诱导液接触面积较少，不利于诱导培养的问题，从而可提高骨髓间充质干细胞的细胞活性，并提高骨髓间充质干细胞的诱导转化率。

具体地，本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，包括以下步骤：

S1、获取骨髓间充质干细胞；

S2、制备生物衍生骨；

S3、预处理生物衍生骨，获得浸润后的生物衍生骨；

S4、将骨髓间充质干细胞接种于浸润后的生物衍生骨内进行扩增培养后，再用诱导液进行诱导反应。

进一步地，步骤S1：获取骨髓间充质干细胞的具体过程为：

采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

可以理解的是，上述骨髓间充质干细胞的获取方式仅为本发明提供的其中一种，本领域技术人员采用其他方式获取的骨髓间充质干细胞同样适用于本发明；另外，也可利用现有技术中骨髓间充质干细胞的分离纯化方法对步骤S1获取的骨髓间充质干细胞作进一步纯化。

步骤S2：生物衍生骨的制备具体包括以下步骤：

取1cm×0.5cm×0.5cm骨块于H₂O₂溶液中浸泡36～80小时，每隔一段时间换液一次，对骨块进行杀菌脱蛋白；再浸泡于双蒸水中20～60分钟后，依次于乙醇和丙酮中分别浸泡12～36小时，去除骨组织中残留的蛋白，再于双蒸水中浸泡20～60分钟后，干燥冷冻，并灭菌，即获得生物衍生骨，密封保存。

经过上述物理、化学处理后获得的生物衍生骨，去掉了骨块中的细胞成分及抗原性，基本保持了原来生物体内的孔隙网架结构，有利于细胞粘附、生长并为细胞外基质分泌提供充分的空间及表面积，同时还具有良好的骨传导性和骨诱导性，有利于促进骨髓间充质干细胞转化成成骨细胞。

步骤S3：预处理生物衍生骨，以增强生物衍生骨表面的细胞亲和性，有利于细胞贴附，并使培养基中的细胞因子和营养因子部分融入到生物衍生骨内，有利于骨髓间充质干细胞的生长，具体过程为：

将S2中获得的生物衍生骨浸泡于PBS溶液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于无血清培养基2-4天，再加入FBS(胎牛血清)浸润1-5小时，获得浸润后的生物衍生骨，以使生物衍生骨中融有无血清培养基及FBS，更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁生长。

步骤S4：将步骤S1获取的骨髓间充质干细胞接种于步骤S3中预处理的生物衍生骨上并进行多次扩增培养后，加入诱导液进行诱导培养；

需要说明的是由于骨髓间充质干细胞主要定居于骨髓的干细胞龛内，而氧气体积百分比在干细胞龛内血供较差的部位仅为1％，而在血窦附近的则有6％，因此，本发明步骤S4全程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行的，以模拟骨髓微环境，从而更有利于骨髓间充质干细胞的生长和增殖，该步骤具体过程为：

S41、将骨髓间充质干细胞与步骤S3中获得的浸润后的生物衍生骨混合，静置4-6小时后，待骨髓间充质干细胞与生物衍生骨充分贴附后加入完全培养基于体积百分比为0.5％～6％O₂条件下进行第一次扩增培养，2-4天后，将生物衍生骨转移至新的孔板中，以剔除死细胞，添加完全培养基继续进行第二次扩增培养；当然也可根据实际情况进行三次以上扩增培养，以获取足够量的骨髓间充质干细胞。

其中，完全培养基为含有10％FBS、0.15-0.50mg/ml谷氨酞胺、80-120U/ml青霉素、80-120mg/ml链霉素和1-5mg/ml的HEPES的L-DMEM培养基。

其中，胎牛血清中含有丰富的细胞生长所必须的营养成份，能够提供对维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物、以及主要的低分子营养物，是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子来源；并且能够提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

谷氨酞胺是细胞生长的必须氨基酸，为骨髓间充质干细胞提供重要的能量来源；脱掉氨基后，谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢，促进细胞分裂，因此能够促进骨髓间充质干细胞的生长和增殖。

HEPES能够防止培养基pH迅速变动，并维持培养基的pH值在7.0左右。

青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间充质干细胞的生长及活性造成的不良影响。因此，采用该血清培养基培养间充质干细胞不仅可以促进骨髓间充质干细胞生长和增殖，而且可避免培养过程中产生的细菌对细胞活性造成的影响。

因此，本发明中采用该完全培养基结合生物衍生骨三维孔隙结构，不仅能够保证骨髓间充质干细胞在扩增阶段能够保持细胞活性，而且能够促进骨髓间充质干细胞的分裂，促进细胞生长增殖，以获取更多的骨髓间充质干细胞。

S42、待骨髓间充质干细胞第二次扩增培养2-4天后，再加入成骨诱导培养基于氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行诱导培养7-10天，每2-4天半量换液一次；

其中，成骨诱导培养基为包含有10％FBS和诱导液的L-DMEM培养基，诱导液包括10^-7-10^-9mol/L的地塞米松、25-75μg/ml的维生素C、5-15mmol/L的β-甘油磷酸钠。

选择地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠三者联合作为成骨诱导液，是骨髓间充质干细胞成功诱导的关键，而联合应用的原因在于：

地塞米松能够激活位于骨髓间充质干细胞表面的糖皮质激素受体，显著地增加碱性磷酸酶的活性；并能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节细胞的增值，促进细胞功能表达。

抗坏血酸又称维生素C是水溶性维生素的一种，从细胞水平看，它在体内可以参与多种反应，如参与氧化还原过程，在生物的氧化和还原过程以及细胞呼吸作用中扮演重要角色；从组织水平看，抗坏血酸的主要作用与细胞间质的合成有关，主要包括胶原和骨组织的基质；抗坏血酸对成骨细胞分化的促进作用，主要是通过增加胶原的累积，然后增加碱性磷酸酶在成骨细胞中的表达；

β-甘油磷酸钠能够为成骨细胞提供磷酸离子，同时促进生理性钙盐的沉积和钙化，是骨髓间充质干细胞产生矿化结节的必要条件。

因此，本发明所采用的诱导液能够促进骨髓间充质干细胞转化成成骨细胞，提高骨髓间充质干细胞的转化率，并提高细胞活性。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，具体包括以下步骤：

S1a、获取骨髓间充质干细胞；

采集骨髓标本，肝素抗凝。每份标本按1：2的比例加在密度为1.073g/ml的percoll分离液上，2300rpm转速下离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，1000rpm离心10min，洗涤3次，弃上清液，即获得骨髓间充质干细胞。

S2a、生物衍生骨的制备；

取动物长骨干干骺端松质骨加工为1cm×0.5cm×0.5cm骨块，骨块经过质量分数约为30％H₂O₂溶液中于38℃浸泡72h，每24h换液一次，双蒸水室温浸泡30min，然后用乙醇室温浸泡24h，丙酮室温浸泡24h，双蒸水室温浸泡30min，室温干燥8h后，在-80℃冰箱冰冻，再用真空低温冷冻干燥机冻干等处理加工，即得到生物衍生骨，后用环氧乙烷气体熏蒸灭菌，分装在无菌的塑料袋中密封保存。

S3a、预处理生物衍生骨；

将步骤S2a中获得的生物衍生骨置于24孔板，每孔接种一块生物衍生骨，浸泡于PBS中2天，根据骨渣多少适量更换PBS，以去除骨渣；然后，添加无血清L-DMEM培养液浸泡3天后去除培养液，加少量FBS浸润生物衍生骨，并于37℃孵育2小时。

S4a、接种骨髓间充质干细胞扩增培养后进行诱导培养；

取步骤S1a中获得的骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为(1-8)×l0⁶个/ml；并取步骤S3中获得的预处理的生物衍生骨，每块生物衍生骨接种细胞悬液20μL，于37℃、5％CO₂、1％O₂和饱和湿度条件下静置4-6小时，待骨髓间充质干细胞与生物衍生骨充分贴附后添加完全培养基，于37℃、5％CO₂、1％O₂和饱和湿度条件下培养3天，再将生物衍生骨换入新的24孔板，添加完全培养基于37℃、5％CO₂、1％O₂和饱和湿度条件下继续培养3天。其中，完全培养基为含有10％FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素、0.29mg/ml谷氨酞胺、3mg/mlHEPES的L-DMEM完全培养基。

最后，再添加成骨诱导培养基于37℃、5％CO₂、1％O₂和饱和湿度条件下进行培养7天，其中，成骨诱导培养基为含有10％FBS和诱导液的L-DMEM培养基，诱导液包括10^-8mol/L的地塞米松、50μg/ml的维生素C、10mmol/L的β-甘油磷酸钠。

为进一步验证本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。

检测对象

检测组—本发明实施例1诱导骨髓间充质干细胞所获得的细胞；

对照组—与本发明的不同之处在于，该组为采用二维培养体系诱导骨髓间充质干细胞所获得的细胞。

检测一、ELISA试剂盒定量检测ALP(碱性磷酸酶)活性

ALP是骨形成所必需的酶，它在钙化中起着至关重要的作用，ALP活性的增加是成骨细胞分化的早期指标，并表达于成熟期的成骨细胞和前成骨细胞中，且其表达随成骨细胞的成熟而加强，因此，通过检测ALP的活性来间接反应骨髓间充质干细胞向成骨细胞的转化率。

采用ELISA试剂盒分别对检测组和对照组获得的细胞进行ALP量的检测，检测结果见下表1：

表1：

诱导天数	对照组	检测组
			7d	20.05±2.90mU/mg	76.81±1.08mU/mg
8d	27.31±1.87mU/mg	85.15±2.84mU/mg

10d

29.82±1.66mU/mg

89.79±2.03mU/mg

检测结果：由表1中的数据可知，检测组中ALP量远大于对照组，由此说明，通过本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法获得的成骨细胞数量较多、质量较好，提高了骨髓间充质干细胞的转化率。

检测二、MTT法检测细胞活性

MTT法的检测原理是活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能够使外源性的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐(商品名噻唑蓝，简称MTT)还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜，沉积在细胞中，用二甲基亚砜溶解细胞中的甲臜，最后用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收度值(OD值)，见下表2。由于MTT结晶物形成的量与细胞数成正比关系，因此该检测方法也可以间接反映活细胞的数量。

表2：

诱导天数	对照组OD值	检测组OD值
			7d	0.51±0.12	4.37±0.23
8d	0.54±0.10	4.38±0.30
			10d	0.49±0.10	4.35±0.29

检测结果：OD值越大，代表溶液中甲簪的含量越高，同时也说明，促使MTT酶解为甲簪的琥珀酸脱氢酶越多，分泌琥珀酸脱氢酶活细胞的数量较多。由表2中的数据可知，检测组中测得的OD值均大于对照组，由此说明，检测组所获得的成骨细胞的活性较强，且数量较多。

综上所述，本发明提供的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，通过采用经处理后的生物衍生骨作为三维培养支架，并结合低氧培养环境，实现了模拟骨髓微环境的目的，并且利用模拟骨髓微环境的三维多孔结构，提高了骨髓间充质干细胞的吸附能力及生长增殖能力等；而利用生物衍生骨良好的骨传导性和骨诱导性，又提高了骨髓间充质干细胞的诱导转化率及细胞活性，解决了现有技术中，采用二维培养体系诱导培养骨髓间充质干细胞存在的细胞活性差，骨髓间充质干细胞的诱导转化率低等问题。

以上结合对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用生物衍生骨进行体外培养；

在体外培养过程中，用诱导液进行诱导反应。

2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液。

3.根据权利要求1或2所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，所述生物衍生骨的制备过程包括以下步骤：取骨块于H₂O₂溶液中浸泡36～80小时，每隔一段时间换液一次；再浸泡于双蒸水中20～60分钟后，依次于乙醇和丙酮中分别浸泡12～36小时后，再于双蒸水中浸泡20～60分钟后，干燥冷冻，并灭菌。

4.根据权利要求3所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，进行体外培养之前，还包括对所述生物衍生骨预处理的过程，包括以下步骤：将所述生物衍生骨浸泡于PBS溶液中1-3天，去除骨渣，然后浸泡于无血清培养基中2-4天，再加入FBS浸润1-5小时，获得浸润后的生物衍生骨。

5.根据权利要求4所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，所述体外培养过程包括以下步骤：

将骨髓间充质干细胞接种于浸润后的生物衍生骨，静置4-6小时后，加入完全培养基进行扩增培养，获得扩增后的骨髓间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，所述完全培养基中添加有80-120U/ml的青霉素、80-120mg/ml的链霉素、0.15-0.50mg/ml的谷氨酞胺以及1-5mg/ml的HEPES缓冲液。

7.根据权利要求5所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，用所述诱导液进行诱导反应的过程步骤为：

用所述诱导液对扩增后的骨髓间充质干细胞进行诱导培养7-10天，每2-4天换液一次。

8.根据权利要求7所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，所述诱导液包括10^-7-10^-9mol/L的地塞米松、25-75μg/ml的维生素C和5-15mmol/L的β-甘油磷酸钠。

9.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的三维诱导培养方法，其特征在于，所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行的。