CN104815356A - 一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用。首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶微载体。本发明以蜂蜡作为致孔剂，利用双乳液法制备明胶微球，在乙醇/水加热处理并干燥后，明胶表面形成一层致密的壳层，加入戊二醛/乙醇溶液使其表面交联；微球干燥后用力挤压，明胶微球内部的蜂蜡小球受力，使表面的交联层破裂，得到具有中空开放壳层结构的明胶微载体；该微载体具有低密度、高比表面积的特点，为细胞大规模的培养提供了可能；具有优良的生物降解性和生物相容性，亦可用于组织工程中骨缺损的填充修复材料。
Description
技术领域
本发明属于组织工程的生物材料技术领域。更具体地，涉及一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用。
背景技术
组织工程和再生医学技术是一种新兴的组织器官再生与修复手段，是建立在化学、材料学、生命科学和工程学等基础上的交叉学科，经过二十余年快速发展，已继外科重建和器官移植后，第三种组织和器官缺损或功能衰竭的治疗手段。组织工程的三个关键因素分别是种子细胞的培养，组织支架的制备以及细胞支架复合体的形成，其中核心是细胞和生物材料所构成的细胞支架复合体。细胞微载体是近二十多年发展起来并得到广泛应用的细胞复合支架，既不改变细胞附着表面生长成单层的特性，又大大提高了培养表面积和容积之比，使细胞得到较大规模的培养。生物降解细胞微载体不仅可以作为细胞的高密度培养微载体，也可以作为组织工程中的可注射型细胞载体用于对组织和器官缺损的修复和再生。
但是，以往研究的生物降解微载体均是微球状载体，在成骨细胞/微载体/水凝胶复合体系体内注射的实验当中表明，该体系输送细胞的效率相对不高，细胞仅能依附于载体表面单层生长，而复合体系中大多数空间被无细胞的载体或水凝胶所占据，不利于大量地高密度输送治疗细胞，为新生组织预留的空间也不足。虽然利用多孔的微球代替实心微球，可以部分解决这一问题，但由于这种材料要满足注射治疗的需要，因此需要这种多孔微球的内部网孔结构非常小，而这么小的网孔使得细胞很难进入微载体球体中心部位。
因此，需要设计制备新型结构的细胞微载体，满足可注射组织修复的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有生物降解微载体的缺陷和技术不足，提供一种即可满足可注射组织修复的需要，又具有很高的细胞输送效率，而且具有很好的生物相容性和生物可降解性的中空开放明胶细胞微载体。
本发明另一目的是提供上述中空开放明胶细胞微载体的制备方法。
本发明再一目的是提供上述中空开放明胶细胞微载体的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种中空开放明胶细胞微载体的制备方法，首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶细胞微载体。
具体地，上述制备方法包括如下步骤：
S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球
S11.明胶水溶液加热至70～80℃，加入蜂蜡，搅拌5～10min，得到蜂蜡/明胶乳液；
S12.将蜂蜡/明胶乳液倒入60℃预热好的食用油中，搅拌、乳化10～15min；然后倒入-20～4℃预冷的冰乙醇中，静置；
S13.二氧六环/丙酮溶液反复清洗（除去食用油），干燥，得到明胶蜂蜡微球；
S2.把明胶蜂蜡微球依次放进乙醇溶液、戊二醛溶液中进行重塑和交联；
S3.最后对明胶蜂蜡微球进行挤压，去掉球内的蜂蜡，即得中空开放明胶细胞微载体。
更具体地，上述制备方法的步骤如下：
S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球
S11.配制1%（w/v）明胶水溶液，加热至70～80℃，在400～700rpm的搅拌下，加入蜂蜡，搅拌3～15分钟；明胶与蜂蜡的用量比为1：1～5；
S12.将S11所得乳液倒入60℃预热的食用油中，在200～600转/分的转速下乳化5～30分钟；
S13.将S12所得混合液倒入-20℃预冷的冰乙醇中，静置15～30分钟；
S14.用二氧六环/丙酮溶液反复清洗，干燥，得到明胶蜂蜡微球（明胶蜂蜡微球的直径为200～400μm，适用于制备大小合适的微载体）；
S2.重塑：将S1所得明胶蜂蜡微球置于70～85%乙醇/水溶液中，70℃重塑3～8分钟，干燥得到重塑后的明胶蜂蜡微球；
S3.戊二醛交联：将重塑后的明胶蜂蜡微球放置在戊二醛/乙醇溶液中，4℃交联10～24h，乙醇反复清洗，真空干燥得到交联后明胶蜂蜡微球；
S4.挤压去蜡：用力挤压交联后明胶蜂蜡微球，所有微球均被挤破后，浸泡在正己烷溶液中，过夜，乙醇清洗多次，干燥即得中空开放明胶微载体。
其中，优选地，步骤S2的具体操作如下：
S21.取明胶蜂蜡微球置于细胞培养板（如24孔板）中，细胞培养板在桌面上轻轻敲打，使微球颗粒紧密堆积，表面平整；
S22.用注射器将85%的乙醇溶液注射入微球中，明胶蜂蜡微球和乙醇的用量比为1g/mL；
S23.将细胞培养板移至70℃烘干5～8min，取出细胞培养板，以滤纸轻压明胶蜂蜡微粒表面，使粒子之间紧密粘连，并吸走多余的乙醇溶液；
S24.把细胞培养板放置在-20℃冷冻20min后取出，并真空干燥，得到重塑后的明胶蜂蜡微球（明胶微球重塑的时间以轻轻碰触，表面刚粘连成片为准）。
优选地，步骤S3所述戊二醛/乙醇溶液中戊二醛：乙醇=5：95（即5%的戊二醛溶液）。
优选地，步骤S4具体是将交联后明胶蜂蜡微球均匀铺张在锡箔纸上，用研磨棒均匀用力挤压，观察所有微球均被挤破后，放置于正己烷溶液中浸泡过夜，无水乙醇清洗三次，干燥即得中空开放明胶微载体。
优选地，S12所述食用油的用量按照水油相比为1：5进行。
优选地，S12所述食用油为花生油。
按照上述制备方法制备得到的中空开放明胶细胞微载体及其应用也在本发明的保护范围之内。
所述制备得到的中空开放明胶细胞微载体可应用于细胞培养，尤其是细胞大规模培养，还可应用于组织工程中骨缺损的填充修复材料。
本发明首次利用蜂蜡作为致孔剂，利用双乳液法制备明胶微球，并通过大量的研究和探索，制备出了一种中空开放的明胶细胞微载体。本发明采用的技术、表征手段及应用方式包括明胶蜂蜡微球制备、明胶蜂蜡微球重塑、中空开放明胶微载体制备、倒置荧光显微镜和扫描电子显微镜观察、中空开放明胶微载体表面细胞修饰和评价及体内修复胫骨缺损实验。
为验证技术的有效性，本发明主要采用以下方法进行检测：1）倒置荧光显微镜观察制备中空开放明胶微载体过程中载体形状变化情况；2）扫描电子显微镜监测中空开放明胶微载体制备情况；3）层层自组装法提高中空开放明胶微载体表面生物相容性；4）把P4代骨髓间充质干细胞接种在灭菌后的中空开放明胶微载体上，培养5天后，进行死活细胞染色；5）把接种细胞后的微载体填充在兔胫骨缺损部位，修复一个月后，取胫骨进行苏木精/伊红染色，评价中空开放明胶细胞微载体修复骨缺损的能力。具体分析步骤如下：
（1）通过倒置荧光显微镜观察明胶蜂蜡重塑前后及中空开放明胶微载体的外观；
（2）通过扫描电子显微镜观察明胶微球重塑前后、交联后及中空开放明胶微载体的形貌，判断最终制备的微载体是否具备中空开放壳层结构；
（3）通过层层自组装技术，在中空开放明胶微载体表面接上生物大分子（胶原、生长因子、肝素及酪蛋白），使其获得适宜于成骨再生的材料界面；
（4）Dead/Live荧光染色分析骨髓间充质干细胞在中空开放明胶微载体的生长情况；
（5）对填充细胞微载体一个月后的胫骨进行HE染色，检测缺损位置新生组织生长情况，从而分析中空开放明胶细胞微载体在组织工程骨缺损的填充修复材料中的应用前景。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次使用蜂蜡作为致孔剂，利用双乳液法制备明胶微球，在乙醇/水加热环境下处理一定时间后，进行干燥，是明胶表面形成一层致密的壳层，加入一定浓度的戊二醛/乙醇溶液使其表面交联。微球干燥后，用力挤压，明胶微球内部的蜂蜡小球受力，使表面的交联层破裂，从而得到具有中空开放壳层结构的明胶微载体，可以用于所以贴壁细胞的大规模培养，亦可以于可注射细胞微载体/水凝胶复合支架修复骨缺损。
同时，本发明方法操作工艺简单、实施条件温和，所使用的明胶是一种来源丰富的天然高分子材料，具有很好的生物降解性和细胞相容性，并创造性地使用无毒性、可食用的蜂蜡作为致孔剂，蜂蜡熔点为62～67℃，可溶于有机溶剂，所得微载体无毒，因而得到的中空开放明胶微载体具有优良的生物相容性。而且由于内部具有空腔结构而表现出低密度、高比表面积等特点，其中空开放壳层结构使得细胞不仅能在表面生长，还很容易的可以进入微载体内部生长，增大了生长面积，同时又为细胞的增值提供了三维空间和新陈代谢的环境，细胞能够有效地粘附、生长以及增值，为细胞大规模的培养提供了可能。这种生物可降解细胞微载体既可以作为细胞的高密度培养微载体，亦可用于组织工程中骨缺损的填充修复材料，作为组织工程中的可注射型细胞载体/水凝胶复合体用于对组织和器官缺损的修复和再生，具有非常好的应用前景。
另外，本发明提供的中空开放明胶细胞微载体还可以通过层层自组装的方法对其表面生物相容性进行进一步的改性，使其具有更好的生物降解性和细胞相容性。
附图说明
图1 为本发明制备的重塑前的明胶蜂蜡微球的光镜观察图。
图2为本发明制备的重塑后的明胶蜂蜡微球光镜观察图。
图3为本发明制备的交联后明胶蜂蜡微球光镜观察图。
图4为本发明制备的重塑前的明胶蜂蜡微球SEM观察图。
图5为本发明制备的重塑后的明胶蜂蜡微球SEM观察图。
图6为本发明制备的交联后的明胶蜂蜡微球SEM观察图。
图7为本发明制备的中空开放明胶微载体的SEM观察图。
图8为本发明中空开放明胶微载体上骨髓间充质干细胞Dead/Live染色情况。
图9为本发明填充细胞微载体一个月后的胫骨外观图。
图10为本发明填充细胞微载体一个月后的胫骨HE染色图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 本发明中空开放明胶细胞微载体的制备
1、制备方法
S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球
S11.称量4mg明胶，溶于40mL的纯水中，加热到80℃；
S12.在700rpm转速下，向S11的明胶溶液中加入4mg的蜂蜡，700rpm转速下，搅拌5min；
S13.将S12得到的溶液倒入60℃预热好的食用花生油中，400rpm转15min；
S14.将S13得到的溶液倒入-20℃预冷的冰乙醇中，静置15min，然后用二氧六环/丙酮溶液清洗三次，放进60℃烘箱烘干，得到明胶蜂蜡微球；
得到的明胶蜂蜡微球在光镜下观察到的形态如附图1所示。
S2.明胶蜂蜡微球重塑
S21.取明胶蜂蜡微球0.5g，置于24孔板中，在桌面上轻轻敲打，使微球颗粒紧密堆积，表面平整；
S22.用注射器将0.5mL 85%的乙醇溶液小心地注射入微球中；
S23.将24孔板移至70℃烘箱中，5～8min，取出24孔板，以滤纸轻压明胶蜂蜡微粒表面，使粒子之间紧密粘连，并吸走多余的乙醇溶液；
S24.把24孔板放置在-20℃冰箱中，20min后取出，并放进真空干燥箱中干燥；得到重塑后的明胶蜂蜡微球；
重塑后的明胶蜂蜡微球在光镜下观察到的形态如附图2所示。
S3.戊二醛交联明胶蜂蜡微球
S31.取0.5g重塑后的明胶蜂蜡微球置于24孔板中，缓慢加入1mL 5%的戊二醛溶液（戊二醛：乙醇=5：95），把24孔板放置于4℃冰箱中，过夜；
S32.无水乙醇清洗三遍，真空干燥箱干燥，得到交联后明胶蜂蜡微球；
交联后明胶蜂蜡微球在光镜下观察到的形态如附图3所示。
S4.挤压去蜡制备中空开放明胶微载体
S41.取0.5g交联后明胶蜂蜡微球均匀铺张在锡箔纸上，用研磨棒用力挤压，注意用力均匀，观察所有微球均被挤破后，放置于正己烷溶液中，浸泡过夜；
S42.无水乙醇清洗多次，干燥即得中空开放明胶微载体。
2、扫描电镜观察
分别将重塑前后和交联后的明胶蜂蜡微球，以及最终制备得到的具有中空开放壳层结构的明胶微载体（中空开放明胶细胞微载体）固定于样品台上，喷金处理，置于热场发射扫描电镜的真空室内，15kV电压下观察，SEM观察，结果分别如附图4、5、6、7所示。可见本发明双乳液法制备的明胶蜂蜡微球表面皱缩、不光滑，球形清晰可见。经过85%的乙醇重塑后，明胶蜂蜡微球表面变得光滑、紧凑。接着，经过戊二醛溶液交联后，明胶蜂蜡微球表面略显粗糙。SEM图像下明胶微载体的中空开放结构清晰可见，证实了双乳液法和挤压去蜂蜡两步结合，确实能够成功制备中空开放的明胶微载体。
实施例2 层层自组装改性中空开放明胶微载体表面生物相容性
本实施例对实施例1所制备的中空开放明胶细胞微载体进行表面生物相容性的改性，以更进一步地提高微载体表面生物相容性。
1、称80mg中空开放明胶细胞微载体置于75%乙醇溶液中，浸泡灭菌4h，无菌PBS清洗三次，放置在12孔板中；
2、配制含有0.2 mg/mL酪蛋白和4 mg/mL肝素混合溶液作为负电大分子组装溶液，配制1.0 mg/mL胶原和10 g/mL的碱性成纤维细胞生长因子混合溶液作为正电大分子组装溶液；
3、往放置微载体的12孔板中加入4mL酪蛋白/肝素溶液，浸泡15分钟，使得微载体表面获得一层酪蛋白/肝素大分子，吸走液体，缓冲溶液HEPES漂洗三次；
4、加入4mL碱性成纤维细胞生长因子混合溶液，静置15分钟，以吸附单分子层胶原和bFGF，去掉液体，缓冲溶液HEPES漂洗三次；
5、重复步骤3～4，可获得表面具有更好生物相容性能力的中空开放明胶微载体。
实施例3中空开放明胶微载体接种骨髓间充质干细胞
1、方法
（1）把实施例2获得的中空开放明胶微载体移置在离心管（EP管）中；
（2）用0.25%胰酶，把P3代骨髓间充质干细胞消化下来，细胞计数，将0.5mL 50万个/mL的细胞悬浮液加入到装有中空开放明胶微载体的EP管中，然后把EP管置于37℃、5%的CO2培养箱中培养8h；
（3）将0.5mL 50万个/mL的细胞悬浮液加入到装有中空开放明胶微载体的EP管中，然后把EP管置于37℃、5%的CO2培养箱中培养8h；
（4）把中空开放明胶细胞微载体转移到6孔板中，采用基础培养基（α-MEM，10% FBS，100 U/mL 青霉素，100 g/mL 链霉素，0.25 g/mL二性霉素B）进行培养，隔天换液。
实施例4 Dead/Live染色检测微载体上细胞的活性
1、方法
（1）将实施例3接种了骨髓间充质干细胞的中空开放明胶细胞微载体培养5天；
（2）吸走培养基，用PBS清洗三遍，加入4mL PBS，加入8μL钙黄绿素储液（活细胞染色溶液），再加入12μL碘化丙啶储液，混匀，孵育30分钟；
（3）用PBS轻柔清洗三次，置于倒置荧光显微镜下观察、拍照。
2、结果如附图8所示，荧光照片中出现极少数的红色死细胞，中空开放明胶微载体表面显示均匀的绿色荧光，即支架表面覆盖一层活细胞，表明微载体没有任何细胞毒性，而且经过层层自组装改性后，具有更好的生物相容性。
实施例5 中空开放明胶细胞微载体填充兔胫骨缺损
1、取125μL纤维蛋白原溶液和实施例3所得接种了骨髓间充质干细胞的中空开放明胶细胞微载体共混；
2、在96孔板中，每孔加入25μL二倍浓度的凝血酶，再加入75μL纤维蛋白原与微球的混合液，室温放置30min成型；
3、以3%戊巴比妥钠按麻醉新西兰大白兔，在胫骨近心端内侧制造直径4.5mm与骨髓腔相通的圆形骨缺损；
4、把2所得的中空开放明胶微载体和纤维蛋白原混合物填充在缺损位置，缝合；
5、术后单笼饲养，自由饮食。
实施例6 HE染色评价细胞微载体修复胫骨缺损能力
1、方法
（1）实施例5所得新西兰大白兔，饲养1月后处死；
（2）观察植入材料与骨组织及周围组织的反应情况，缺损处有无成骨（图9）；
（3）把骨缺损处的植入材料连同附近胫骨一并取出，4%多聚甲醛固定；
（4）脱钙，常规石蜡包埋，切片；
（5）对（4）所得切片进行HE染色，置于光学显微镜下观察、拍照。
2、结果
结果如附图9和10所示，图9为填充细胞微载体一个月后的胫骨外观图，未发现肉芽组织形成，缺损变小，被植入物所填充，植入物与周围骨组织边界模糊、结合紧密，修复良好。
图10为填充细胞微载体一个月后的胫骨HE染色图，缺损已经基本愈合，被新生的骨组织填补，周围可见破骨细胞和增生的毛细血管，成骨细胞排列在新生骨小梁表面，皮质可见典型的哈佛氏系统。
Claims (10)
1.一种中空开放明胶细胞微载体的制备方法，其特征在于，首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶细胞微载体。
2. 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球
S11.明胶水溶液加热至70～80℃，加入蜂蜡，搅拌5～10min，得到蜂蜡/明胶乳液；
S12.将蜂蜡/明胶乳液倒入60℃预热好的食用油中，搅拌、乳化10～15min；然后倒入-20～4℃预冷的冰乙醇中，静置；
S13.二氧六环/丙酮溶液反复清洗，干燥，得到明胶蜂蜡微球；
S2.把明胶蜂蜡微球依次放进乙醇溶液、戊二醛溶液中进行重塑和交联；
S3.最后对明胶蜂蜡微球进行挤压，去掉球内的蜂蜡，即得中空开放明胶细胞微载体。
3. 根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤如下：
S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球
S11.配制1%（w/v）明胶水溶液，加热至70～80℃，在400～700rpm的搅拌下，加入蜂蜡，搅拌3～15分钟；明胶与蜂蜡的用量比为1：1～5；
S12.将S11所得乳液倒入60℃预热的食用油中，在200～600转/分的转速下乳化5～30分钟；
S13.将S12所得混合液倒入-20℃预冷的冰乙醇中，静置15～30分钟；
S14.用二氧六环/丙酮溶液反复清洗，干燥，得到明胶蜂蜡微球；
S2.重塑：将S1所得明胶蜂蜡微球置于70～85%乙醇/水溶液中， 70℃重塑3～8分钟，干燥得到重塑后的明胶蜂蜡微球；
S3.戊二醛交联：将重塑后的明胶蜂蜡微球放置在戊二醛/乙醇溶液中，4℃交联10～24h，乙醇反复清洗，真空干燥得到交联后明胶蜂蜡微球；
S4.挤压去蜡：用力挤压交联后明胶蜂蜡微球，所有微球均被挤破后，浸泡在正己烷溶液中，过夜，乙醇清洗多次，干燥即得中空开放明胶微载体。
4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S2具体如下：
S21.取明胶蜂蜡微球置于细胞培养板中，细胞培养板在平面上轻轻敲打，使微球颗粒紧密堆积，表面平整；
S22.将85%的乙醇溶液注射入微球中，明胶蜂蜡微球和乙醇的用量比为1g/mL；
S23.将细胞培养板移至70℃烘干5～8min，取出细胞培养板，以滤纸轻压明胶蜂蜡微粒表面，使粒子之间紧密粘连，并吸走多余的乙醇溶液；
S24.把细胞培养板放置在-20℃冷冻20min后取出，并真空干燥，得到重塑后的明胶蜂蜡微球。
5. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述戊二醛/乙醇溶液中戊二醛：乙醇=5：95。
6. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S4具体是将交联后明胶蜂蜡微球均匀铺张在锡箔纸或滤纸上，用研磨棒均匀用力挤压，观察所有微球均被挤破后，放置于正己烷溶液中浸泡过夜，无水乙醇清洗三次，干燥即得中空开放明胶微载体。
7. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S12所述食用油的用量按照水油相比为1：5进行。
8. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S12所述食用油为花生油。
9. 根据权利要求1～8任一所述制备方法制备得到的中空开放明胶细胞微载体。
10. 权利要求9所述中空开放明胶细胞微载体在细胞培养中的应用或在制备组织工程中骨缺损的填充修复材料方面的应用。
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