ITVR20010098A1

ITVR20010098A1 - Procedimento per l'ottenimento di idrogeli di fibroina di seta.

Info

Publication number: ITVR20010098A1
Application number: IT2001VR000098A
Authority: IT
Inventors: Kemal Kesenci; Claudio Migliaresi; Antonella Motta
Original assignee: Consorzio Per Gli Studi Uni; Claudio Migliaresi; Antonella Motta; Kesenci Remal
Priority date: 2001-09-11
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2003-03-11
Also published as: EP1436346A1; WO2003022909A1; US20040266992A1

Description

Classe Internazionale: C08H 1/00

Descrizione del trovato avente per titolo:

"PROCEDIMENTO PER L'OTTENIMENTO DI IDROGELI DI FIBROINA DI SETA"

CAMPO DI APPLICAZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la preparazione di idrogeli di fibroina di seta, particolarmente seta prodotta da baco da seta (Bombyx Mori).

In particolare l 'invenzione riguarda un procedimento per l'ottenimento di idrogeli di fibroina di seta atti ad essere impiegati come biomateriali da impianto in operazioni chirurgiche e nella ricostruzione sia di tessuti molli che rigidi, nella correzione di imperfezioni e difetti tessutali e come biomateriali che favoriscono la rimarginazione delle ferite.

Ulteriori applicazioni vedono gli idrogeli di fibroina di seta impiegabili come supporti per colture cellulari utilizzabili in applicazioni di ingegneria tessutale e di biologia cellulare, come matrici per l'immobilizzazione e il rilascio controllato di farmaci, dì composti biologicamente attivi o della loro associazione.

Gli idrogeli di fibroina di seta secondo la presente invenzione possono inoltre essere impiegati come materiali di rivestimento per sistemi d'impianto od altri sistemi con il fine di migliorare la biocompatibilità e/o la risposta cellulare e tessutale.

STATO DELLA TECNICA

Gli idrogeli sono delle forme semisolide costituite da sostanze di natura polimerica che possono essere sìa di origine naturale sia di origine sintetica e che sono caratterizzati dalla capacità di incorporare notevoli quantità d'acqua rispetto alla loro massa iniziale.

Le caratteristiche chimico-fisiche degli idrogeli dipendono dal grado e dalla natura dei legami presenti all'interno della struttura polimerica, dal suo grado di cristallinità, dalle interazioni tra le molecole di polimero e le molecole del solvente, dai sali presenti o degli eventuali composti chimici adsorbiti nel gel.

Altri fattori fondamentali che regolano la stabilità e le caratteristiche di un gel sono l'invecchiamento, la temperatura, il pH, la polarità dei solventi, i salì presenti e la formazione di eventuali complessi.

Un eventuale cambiamento di uno dei fattori sopra menzionati modifica le caratteristiche del gel che può' anche perdere il suo caratteristico stato: si dice in questo caso che il gel collassa.

Le modificazioni che avvengono possono essere, in funzione della natura del materiale e del parametro che viene modificato, reversibili o non reversibili.

L'equilibrio tra i gruppi idrofilici ed idrofobici del gel è il fattore chiave che regola le sue caratteristiche e che lo rende utilizzabile quale materiale innovativo in diversi settori.

Le caratteristiche essenziali richieste ad un idrogel e con un ruolo chiave in dipendenza del suo utilizzo in campo biomedico sono la biocompatibilità, la non immunogenicità, la facilità di applicazione, la capacità di mantenere la struttura e le caratteristiche chimico- fisiche in un ambiente fisiologico, la possibilità o meno di venire degradato e/o metabolizzato.

Nel caso in cui il gel sia utilizzato come matrice di supporto risulta fondamentale la capacità di trattenere ed eventualmente rilasciare successivamente sostanze diverse tra cui ad esempio dei farmaci o delle sostanze biologicamente attive senza variarne l'attività o causarne la degradazione.

Tra le applicazioni in cui gli idrogeli rivestono un sicuro interesse sono l'utilizzo per il rilascio di sostanze biologicamente attive, ad esempio stimolanti la crescita, in settori come l'ingegneria tessutale e la biologia cellulare, il loro impiego in sistemi di rivestimento per sistemi d'impianto o altri sistemi, come eccipienti o veicoli in formulazioni farmaceutiche e semplicemente come materiali di riempimento per la correzione di imperfezioni o carenze tessutali .

Il principale vantaggio di molti idrogeli naturali nei confronti di quelli sintetici è la biocompatibilità, anche in considerazione del fatto che i derivati secondari rilasciati da idrogeli naturali risultano a loro volta biocompatibili .

In riferimento a questa caratteristica la fibroina di seta può essere un materiale per realizzare idrogel naturali con una eccezionale biocompatibilità e non immunogenicità.

La fibroina è una proteina fibrosa ottenuta dalla seta del baco da seta (Bombyx Mori) di cui ne costituisce una percentuale compresa tra il 75 e l'80% in peso allo stato grezzo .

La seta contiene anche tra il 20 e il 25% in peso di un'altra proteina, la sericina, che avvolge i filamenti di fibroina e che può essere rimossa tramite un procedimento di per sé noto e tecnicamente definito come processo di sgommatura.

Facendo riferimento alla struttura secondaria della fibroina, la struttura a foglietto ripiegato sarebbe responsabile della gelificazione

e la formazione di tale struttura dipenderebbe dall'invecchiamento della proteina, dalla temperatura, dal pH, dalla polarità dei solventi e dalla formazione di eventuali complessi come menzionato precedentemente.

L'utilizzo di idrogeli naturali è già ampiamente riportato in letteratura.

Si ha ad esempio l'impiego di idrogeli nella fabbricazione di lenti a contatto, in settori come l'ingegneria tessutale per la sostituzione di tessuti molli

o l'utilizzo come dispositivi per il rilascio di farmaci.

Un processo per la produzione di un idrogel di fibroina di seta atto ad essere utilizzato come muscolo artificiale o come parete artificiale dì un vaso sanguigno viene riportato nel brevetto giapponese JP1308431.

Questo processo impiega la fibroina ricavata dalla seta prelevata direttamente dalle ghiandole dei bachi da seta dopo l'eliminazione della frazione di sericina.

La fibroina di seta ottenuta con questo processo presenta però una scarsa resistenza e ciò la rende inutilizz abile per molte applicazioni come materiale da impianto .

DESCRIZIONE DELL ' INVENZIONE

La presente invenzione ha come principale scopo quello di fornire un procedimento per la produzione di idrogeli dì fibroina di seta prodotta da baco da seta (Bombyx Morì), definiti da caratteristiche proprietà chimico-fisiche, dall'assenza di attività immunogenica e da un'eccezionale biocompatibilità .

Lo scopo sopra riportato è ottenuto grazie alla messa in opera delle caratteristiche descritte alla rivendicazione principale .

Le rivendicazioni dipendenti delineano forme di realizzazione particolarmente vantaggiose del procedimento secondo l'invenzione.

Inoltre, le rivendicazioni 21 e 22 descrivono un idrogel di fibroina di seta.

Ancora, le rivendicazioni 23, 24 e 25 descrivono usi particolarmente vantaggiosi dei geli in fibroina di seta.

Il procedimento secondo la presente invenzione prevede l'iniziale ottenimento di una soluzione acquosa di fibroina di seta ricavata ad esempio dai bozzoli di baco da seta, da materiale tessile in seta oppure da cascami di seta.

La seta è preventivamente sgommata a mezzo di trattamento in acqua bollente con agenti surfactanti come ad esempio sodio dodecil solfato (SDS), sodio carbonato (Na2C03) e calcio carbonato (CaC03) o con una soluzione di enzimi come la papaina o la chemotripsina . Tali metodi sono di per sé noti nella tecnica e descritti nella letteratura scientifica .

Successivamente i filamenti di fibroina così purificati sono trattati in modo tale da ottenere una soluzione salina della proteina con una concentrazione finale preferibilmente compresa tra l'I e il 20% in peso.

Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione, la soluzione acquosa dei sali utilizzata per la preparazione della soluzione di fibroina contiene preferibilmente una miscela dei sali selezionati tra bromuro di litio, cloruro di calcio, cloruro di zinco, cloruro di magnesio, sodio tiocianato e litio tiocianato con una concentrazione in peso dal 40 al 60%. Li processo di dissoluzione della fibroina viene preferibilmente condotto ad una temperatura tra i 20 e 60° C.

Il procedimento secondo la presente invenzione prevede quindi la rimozione del sale dalla soluzione in cui si trova discìolta la fibroina. Tale operazione è preferibilmente condotta mediante un processo di dialisi con l'utilizzo di membrane semipermeabili solitamente in cellulosa.

Forme di realizzazione dell'invenzione comprendono esempio, la formazione dell'idrogel di fibroina di seta tramite un processo di dialisi di una soluzione di fibroina contro soluzioni acquose di polimeri solubili, acidi, solventi polari o soluzioni contenenti dei composti costituenti legami incrociati (crosslinkers). Il processo di dialisi viene condotto fino a precipitazione della fibroina.

L'ottenimento di geli di fibroina di seta in riferimento all'invenzione può essere raggiunto con procedimenti diversi, facenti parte dell'invenzione, e di seguito riportati:

Attraverso l'utilizzo di polimeri idrosolubili come, a titolo d'esempio, il glicole polietilenico, il polivinil alcol, il polivinil pirrolidone o l'acido poliacrilico.

La soluzione di fibroina viene trattata in un processo di dialisi con una soluzione di uno o più polimeri idrosolubili. In seguito ad un'interazione molecolare tra le catene di fibroina e il polimero, si ottiene la formazione dell 'idrogel.

- Con l'utilizzo di soluzioni acide come ad esempio soluzioni di acido solforico concentrato o di altri acidi come acido nitrico, acido fosforico o acido acetico in acqua. Dializzando così una soluzione di fibroina di seta con una soluzione acida fino ad ottenere un pH della soluzione inferiore a 4, ci si abbassa al di sotto del punto isoelettrico della fibroina di seta pari a un pH di' 4.7 consentendo la formazione di nuovi legami deboli e legami a ponte idrogeno che determinano la formazione del gel .

Con l'impiego di solventi polari miscibili con l'acqua tra cui a titolo d'esempio il metanolo, 1'etanolo , 1 'etilacetato, 1'isopropanolo . Attraverso un processo di dialisi di una soluzione di fibroina di seta contenuta in un involucro semipermeabile, come quello costituito da un tubo in cellulosa, con una soluzione acquosa ad esempio di metanolo si ha la formazione del gel.

L'uso di composti costituenti legami incrociati (crosslinkers) tra cui la glutaraldeide e l'epicloridrina in soluzione acquosa. Tali composti consentono di creare dei legami inter- ed intramolecolari attraverso la reazione con i gruppi amminici ed idrossilici della proteina, nonché la formazione di nuovi legami idrogeno o altri tipi di legami non covalenti che portano alla formazione del gel di fibroina di seta.

La fibroina di seta è stato dimostrato essere un materiale biocompatibile, non immunogenico e che quindi non interferisce con la risposta immunitaria mediata a livello cellulare. Un altro vantaggio presentato dalla fibroina di seta è la sua comprovata azione mitogenica, come riportato nella domanda di brevetto italiano n° VR2000A000096, nei confronti di cheratinociti , fìbroblasti cellule endoteliali umane.

Gli idrogeli di fibroina di seta da baco da seta (Bombyx Mori) ottenuti secondo l'invenzione possono essere realizzati con un'ampia gamma di proprietà chimico-fisiche e sono caratterizzati da una struttura omogenea a pori aperti che ne consentono l'impiego come supporti per l'ingegneria tessutale, supporti per culture cellulari, come materiale di rivestimento per ferite od ustioni, come materiale da impianto per tessuti molli, come riempimento osseo e come matrice per il supporto di farmaci o di sostanze biologicamente attive.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Altri vantaggi e caratteristiche dell'invenzione risulteranno più evidenti dalla descrizione seguente con l'ausilio dei disegni allegati. Gli esempi proposti non sono da intendersi limitativi all'invenzione.

La figura 1 rappresenta una fotografia di un campione di idrogel di fibroina di seta come preparato (a destra) ed essiccato (a sinistra).

La figura 2 rappresenta due fotografie realizzate tramite un microscopio elettronico a scansione (ESEM<®>) di un campione di fibroina di seta completamente idrato (sulla sinistra -A) e dopo che ha cominciato a perdere acqua (sulla destra-B) ; le fotografie di cui alla figura 2 sono state ottenute utilizzando un microscopio elettronico a scansione ESEM<®>, Philips, su campioni non essiccati e non metallizati.

La figura 3 rappresenta un grafico relativo al tipico andamento della perdita d'acqua in funzione del tempo da parte di idrogel di fibroina di seta ottenuti attraverso il procedimento con polimeri idrosolubili (A), acido solforico (B), metanolo (C) e glutaraldeide (D).

La perdita d'acqua dell 'idrogel è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:

Perdita d'acqua percentuale (%)= (1-(Ms/Md))*100 (1) ;;dove Ms è la massa dell' idrogel umido e Md è la massa del gel dopo essiccamento. ;La figura 4 rappresenta i risultati ottenuti dalle analisi termogravimetriche eseguite sui campioni di fibroina di seta ottenuti rispettivamente attraverso il metodo che utilizza polimeri idrosolubili (A), acido solforico (B), metanolo (C) e glutaraldeide (D) . Le analisi sono state eseguite sotto un flusso di azoto pari a 100 ml/minuto e con una velocità di riscaldamento di 10°C/minuto, in un intervallo di temperature compreso tra 30° e 450°C sufficiente a volatilizzare il campione. Per le analisi è stato utilizzato uno strumento Mettler, modello TG 50. Con tali analisi si è valutato il contenuto in acqua dei campioni nonché il comportamento alla degradazione termica. ;La figura 5 rappresenta i risultati ottenuti dalle analisi di calorimetria differenziale a scansione (DSC) eseguite sui campioni di fibroina di seta ottenuti rispettivamente attraverso il metodo che utilizza polimeri idrosolubili (A), acido solforico (B), metanolo (C) e glutaraldeide (D). Le analisi sono state eseguite sotto flusso di azoto e con una velocità di riscaldamento pari a 10° C/minuto in un arco di temperature compreso tra 20°C e 320°C utilizzando uno strumento Mettler, modello DSC 30. ;La figura 6 rappresenta degli spettri di assorbimento all'infrarosso tipici per i geli di fibroina di seta ottenuti rispettivamente attraverso il metodo che utilizza polimeri idrosolubili (A), acido solforico (B), metanolo (C) e glutaraldeide (D) nella loro forma idrata (grafici A). ;DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE ;Come più sopra indicato, allo scopo di ottenere fibroina di seta, è possibile utilizzare seta in forma di bozzolo da baco da seta, materiale tessile in seta, oppure cascami di seta. ;Inoltre, poiché la bava di seta grezza presenta uno strato esterno di sericina, la seta deve essere dapprima sgommata allo scopo di eliminare il suddetto strato di sericina . ;Il processo di sgommatura può essere uno qualsiasi di quelli noti nella tecnica e descritti nella letteratura scientifica come, secondo la presente forma di realizzazione dell'invenzione, a mezzo di trattamento con una soluzione di carbonato di sodio (Na2C03) e sodio dodecil solfato (SDS) a caldo . ;Conformemente all'invenzione, la seta sgommata viene quindi dìsciolta in una soluzione acquosa di bromuro di litio (LiBr) o in altre soluzioni saline tra quelle note allo stato dell'arte ottenendo in fine una soluzione limpida, viscosa e di colore giallognolo di fibroina di seta . ;Il sale presente in soluzione viene quindi eliminato attraverso un processo di dialisi comprendente diversi passaggi in acqua nell'arco di oltre 20 ore di tempo ottenendo in fine una soluzione di fibroina di seta in acqua ad una concentrazione del 10% in peso circa. ;La caratterizzazione del gel in fibroina di seta è stata effettuata utilizzando un microscopio elettronico a scansione (ESEM) , l'analisi termogravimetrica (TGA) e la calorimetrìa differenziale a scansione (DSC), la spettrofotometria a raggi infrarossi, oltre a test di tipo meccanico . ;Di seguito verranno riportati alcuni esempi di realizzazione di idrogeli secondo la presente invenzione. ;;ESEMPIO 1 ;Una soluzione acquosa di fibroina di seta preparata per dialisi come riportato precedentemente e ancora conservata nel suo tubo di cellulosa, viene immersa in una soluzione di glicole polietilenico (PM: 1000) in acqua al 50 % in peso. In un intervallo di tempo compreso tra le 2 e le 3 ore, mantenendo il sistema sotto leggera agitazione, la fibroina di seta precipita gradualmente nel tubo di cellulosa fino a dare alla fine una massa gelificata. A questo punto la fibroina gelificata viene estratta dal tubo lavata e conservata in acqua distillata. ;Quando si è andati a determinare la perdita d'acqua secondo il metodo riportato in precedenza si è riscontrato che il gel di fibroina come conseguenza della disidratazione si contrae, con una corrispondente variazione del suo colore (fig. 1) da bianco opaco a giallognolo. ;L'idrogel di fibroina presenta una struttura omogenea caratterizzata nella sua forma idrata da pori aventi una dimensione apparente tra i 50 e i 100 pm (fig.2). Il gel, tenuto all'aria, perde l'87% in peso di acqua. ;L 'idrogel di fibroina di seta sottostà a due fasi principali di decomposizione termica: la prima consiste in una repentina evaporazione dell'acqua dalle molecole della fibroina e si verifica ad una temperatura compresa tra i 50 e i 1 50°C ; la seconda che costituisce la fase di decomposizione dai 250 ai 350°C. ;Il valore della perdita dell' 87% in peso riportato dall'analisi termogravimetrica (TGA) , riscaldando 1'idrogel oltre i 120°C, conferma l'evaporazione d'acqua associata all' idrogel di fibroina di seta riscontrata (fig. 4A) per essiccamento . ;La temperatura del picco relativo alla degradazione della fibroina di seta è pari a 294°C. Gli idrogeli di fibroina di seta, in relazione al processo di preparazione, possono esibire anche una temperatura di degradazione più bassa pari a 273°C (fig. 5A). ;La caratterizzazione coniormazionale dei geli di fibroina di seta è stata ottenuta attraverso l'utilizzo della spettroscopia all'infrarosso in trasformata di Fourier FTIR (fig. 6A). ;Tabella. 1 ;Bande caratteristiche dell'analisi FTIR per gli ìdrogeli di fibroina . ;; ;; *OH derivanti dall'acqua sono stati osservati solamente in campioni umidi.

- I campioni sono stati essiccati e analizzati direttamente con uno spettrofotometro FTIR della Bio-Rad modello FTS165.

Come presentato nella tabella 1, la regione dello spettro da 3000 a 2800 cm <1 >è tìpica per la struttura primaria dello scheletro costituito dagli atomi di carbonio del polipeptide e i segnali in questa regione derivano dalle vibrazioni simmetriche e antisimmetriche dei gruppi CH3 o CH2.

L'assorbimento a 1618 cm<-1 >si verifica in una regione che è caratteristica per strutture β a foglietto ripiegato antiparallele, mentre alle zone dello spettro a 1655 eh<1 >e 1685 cm<-1 >appartengono strutture come β-turns e altri ripiegamenti della struttura secondaria della fibroina di seta .

TABELLA . 2

Valori di durezza Shore A per idrogeli di fibroina di seta

Stato Umido.

La tabella 2 riporta la durezza dell'idrogel allo stato umido .

ESEMPIO 2

Una soluzione acquosa di fibroina dì seta è stata preparata dalla soluzione di fibroina con lìtio bromuro per dialisi contro acqua distillata per un periodo superiore alle 24 ore e come descritto in precedenza. La soluzione così preparata è stata mantenuta nel suo involucro semipermeabile in cellulosa ed immersa in una soluzione dì acido solforico 0.1 N.

L' idrogel di fibroina di seta formatosi è stato estratto, lavato più volte in acqua distillata e conservato sempre in acqua.

Anche questo gel ha presentato un struttura porosa omogenea, con le dimensioni dei pori nello stato rigonfiato compresi tra i 50 e i 100 pm. La perdita totale d'acqua in condizioni atmosferiche è stata di un valore intorno al 92% (fig. 3B). La decomposizione termica si è verificata ad una temperatura di 300°C (fig. 4B). La temperatura dei picchi endotermici è stata di 212°C e 273°C (fig. 5B).

L'idrogel di fibroina nello stato umido ha presentato un valore di durezza Shore A pari a 5 ± 1 grammi dì carico.

ESEMPIO 3

Una soluzione acquosa di fibroina di seta è stata preparata dalla soluzione dì fibroina con litio bromuro per dialisi contro acqua distillata per un periodo superiore alle 24 ore e come descritto in precedenza. La soluzione cosi preparata è stata mantenuta nel suo involucro semipermeabile in cellulosa ed immersa in una soluzione metanolo/acqua contenente l'80% in peso di metanolo.

In un intervallo di tempo compreso tra le 2 e le 3 ore, mantenendo il sistema sotto leggera agitazione, la fibroina di seta precipita gradualmente nel tubo di cellulosa fino a dare alla fine una massa gelificata. A questo punto la fibroina gelificata viene estratta dal tubo lavata e conservata in acqua distillata.

Il gel ha presentato un struttura porosa omogenea, con le dimensioni dei pori nello stato rigonfiato compresi tra i 50 e i 100 pm. La perdita totale d'acqua in condizioni atmosferiche è stata di un valore intorno all'80% (fig. 3C).

Questo idrogel di fibroina ha presentato un'acuto picco endotermico a 275°C (fig. 5C). Nello stato umido l'idrogel ha presentato un valore di durezza Shore A pari a 20 ± 5 grammi di carico .

ESEMPIO 4

Una soluzione acquosa di fibroina di seta è stata preparata dalla soluzione di fibroina con litio bromuro per dialisi contro acqua distillata per un periodo superiore alle 24 ore e come descritto in precedenza. La soluzione così preparata è stata mantenuta nel suo involucro semipermeabile in cellulosa ed immersa in una soluzione acquosa di glutaraldeide al 20% in peso.

La perdita totale d'acqua in condizioni atmosferiche è stata dì un valore intorno al 90% (fig. 3D). Questo idrogel di fibroina ha presentato un'acuto picco endotermico a 245°C e a 278°C (fig. 5D) ed una degradazione termica a 290°C (fig.

4D) . Nello stato umido l'idrogel ha presentato rispettivamente un valore di durezza Shore A pari a 15 ± 3.

La descrizione sopra esposta dimostra quindi che gli idrogel di fibroina di seta secondo l'invenzione consentono grazie alle loro proprietà chimico-fisiche ed alla loro caratteristica struttura l'impiego come supporti per l'ingegneria tessutale, supporti per culture cellulari, come materiale di rivestimento per ferite od ustioni, come materiale da impianto per tessuti molli, come riempimento osseo e come matrice per il supporto di farmaci o di sostanze biologicamente attive.

L'invenzione è stata precedentemente descritta con riferimento ad alcune forme di realizzazione preferenziali della stessa.

Tuttavia, appare chiaro che l'invenzione è suscettibile di numerose varianti che rientrano nei propri scopi, nell'ambito delle rivendicazioni di seguito allegate.

A titolo di esempio, appare chiaro che, sulla base del modello più sopra divulgato, altri gel di fibroina di seta possono essere dotati di attributi ad hoc ed essere quindi utilizzati come biomateriali da impianto in operazioni chirurgiche e nella ricostruzione sia di tessuti molli che rigidi, nella correzione di imperfezioni e difetti tessutali e come biomateriali che favoriscono la rimarginazione delle ferite.

Ulteriori applicazioni vedono gli idrogeli di fibroina di seta impiegabili come supporti per colture cellulari utilizzabili in applicazioni di ingegneria tessutale e di biologia cellulare, come matrici per l'immobilizzazione e il rilascio controllato di farmaci, di composti biologicamente attivi o della loro associazone.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di idrogeli di fibroina di seta comprendente le seguenti fasi: a) ottenere bava di seta grezza, ad esempio da bozzolo di baco da seta, da materiale tessile in seta, oppure da cascami di seta; b) ove presente, rimuovere lo strato di sericina che ricopra le fibre di fibroina di seta; c) ottenere una soluzione di fibroina in acqua; d) trattare la fibroina in soluzione con polimeri idrosolubili e/o con soluzioni acide ad un pH inferiore a 4 e/o con solventi polari e/o con composti formanti legami incrociati. e) lavare il materiale risultante dalla detta fase b) ed ottenere quindi un idrogel di fibroina di seta .
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, nel quale la detta fase b) viene effettuata a mezzo di trattamento con soluzione Na2C03 e sodiododecilsolf ato a caldo oppure tramite altri metodi di cosiddetta sgommatura di per sé noti nella tecnica.
3. Procedimento secondo una delle rivendicazioni precedenti, nel quale la detta fase c) avviene tramite dissoluzione della fibroina di seta in una soluzione salina acquosa e successiva eliminazione del sale tramite dialisi. soluzione acquosa viene dotata di una percentuale compresa tra 0,1 e 10% in peso di una miscela di sali selezionati dal gruppo comprendente cloruro di calcio, cloruro di zinco, cloruro di potassio, bromuro di litio, tiocianato di litio, cloruro di magnesio, nitrato di rame e cloruro di sodio. Procedimento secondo la rivendicazione 3 e 4, nel quale per la dissoluzione della fibroina di seta viene impiegata una soluzione di LiBr. Procedimento secondo una delle rivendicazioni dalla 3 alla 5, nel quale la fibroina di seta è presente in una percentuale compresa tra 1 e 20% in peso nella detta soluzione. 8. Procedimento secondo la rivendicazioni 2, in cui la fase c) viene effettuata ad una temperatura non superiore a 60°C. 9 Procedimento secondo una delle rivendicazioni dalla 3 alla 6, in cui la detta fase c) viene effettuata a temperatura ambiente. 10 Procedimento secondo una delle rivendicazioni precedenti, nel quale la detta fase d) avviene trattando la soluzione di fibroina con una soluzione di polimero idrosolubile del gruppo comprendente il glicole polietilenico, il polivinilalcol, il polivinilpirrolidone o l'acido poliacrilico o con una soluzione risultante da una loro miscela. 13 Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui viene utilizzata una soluzione acquosa di glicole polietilenico al 50% in peso. 12 Procedimento secondo una delle rivendicazioni precedenti, nel quale la detta fase d) avviene trattando la soluzione di fibroina con una soluzione acida in modo tale da ottenere un pH inferiore a 4. 13 Procedimento secondo la rivendicazione 12 in cui la soluzione acida è una soluzione acquosa di uno degli acidi o da una loro miscela comprendenti acido solforico acido nitrico, acido fosforico e acido acetico 14 Procedimento secondo la rivendicazione 12 e 13 in cui la soluzione acida è una soluzione acquosa di acido solforico 0.1 N. 15 Procedimento secondo una delle rivendicazioni precedenti, nel quale la detta fase d) avviene trattando la soluzione di fibroina con una soluzione di composti costituenti legami incrociati (crosslinkers) o con una soluzione di una loro miscela tra cui la glutaraldeide e l'epicloridrina. 16 Procedimento secondo la rivendicazione 15 in cui si utilizza una soluzione acquosa di glutaraldeide al 20%. 17 Procedimento secondo una delle rivendicazioni precedenti, nel quale la detta fase d) avviene trattando la soluzione di fibroina con solventi polari miscibili con l'acqua o con una loro miscela comprendenti il metanolo, l'etanolo, l'etilacetato , l'isopropanolo . 18 Procedimento secondo la rivendicazione 17 in cui si utilizza una soluzione acquosa di metanolo all'80% in peso. 19 Procedimento secondo le rivendicazione dalla 10 alla 18 effettuato attraverso un processo di dialisi. 20 Procedimento secondo una delle rivendicazioni precedenti, nel quale la detta fase e) consiste nel lavare ripetutamente il materiale con acqua distillata. 21 Idrogel di fibroina di seta, caratterizzato dal fatto che esso è costituito da una struttura porosa omogenea, in cui pori risultano aperti e di dimensioni comprese tra i 50 e i 100 pm. 22 Tessuto secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che esso è ottenuto mediante un procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 20. 23 Uso di un idrogel di fibroina di seta secondo una delle rivendicazioni 21 e 22 per biomateriali da impianto in operazioni chirurgiche e nella ricostruzione sia di tessuti molli che rigidi, nella correzione di imperfezioni e difetti tessutali e come biomateriali che favoriscono la rimarginazione delle ferite. 24 Uso di varianti del gel secondo una delle rivendicazioni 21, 22 e 23 fornite commercialmente come supporti per colture cellulari utilizzabili in applicazioni di ingegneria tessutale e di biologia cellulare, come matrici per l'immobilizzazione e il rilascio controllato di farmaci, di composti biologicamente attivi e/o della loro associazione. 25 Uso di varianti del gel secondo una delle rivendicazioni dalla 22 alla 25 fornite commercialmente come materiali di rivestimento per sistemi d'impianto od altri sistemi con il fine di migliorare la biocompatibilità e/o la risposta cellulare e tessutale.